CN110559328B - 一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法 - Google Patents

一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药材有效成分提取技术领域，具体涉及一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法。本发明选用枸橼酸、枸橼酸钠的缓冲溶液作为pH值调节剂，精准控制整个提取过程中的pH值在5.2‑5.5之间，保证了在整个提取过程中提取液的pH值稳定。制得提取液；上大孔树脂吸附，高速离心喷雾干燥，得人参果总皂苷粉。在人参果提取过程中达到提取出人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1、Rb2等“原型人参皂苷”的同时生成一定的稀有人参皂苷，提高了人参果总皂苷中含有人参皂苷成分的种类，制备出以11种人参皂苷Re、Rb1、F3、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3为指纹特征成分的人参果总皂苷，保证各批次人参果总皂苷相似度达到0.97以上。

Description

一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备 方法
技术领域
本发明涉及中药领域，即一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法。
背景技术
在现有技术中，人参（Panax ginseng C. A. Meyer）为五加科人参属多年生草本植物，多以地下根茎部分入药，味甘、微苦，性微温，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效，多用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、气血亏虚、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷等病症的治疗。人参是我国重要特产之一，也是驰名中外的珍贵药材，被誉为“百草之王”，其有效成分主要是皂苷类和多糖类物质，现代研究表明，人参中皂苷类成分具有显著的抗肿瘤、抗糖尿病、抗心脑血管疾病、抗炎、抗癫痫和抗氧化等药理活性。
人参果是人参的成熟果实。早在《本草纲目拾遗》中就有入药的记载。初果为绿色，成熟后为鲜红色。 自古就有“宁舍人参一把，不舍参果一粒”，表明人参果的珍贵稀有。中外科学家通过***的现代药学研究发现人参果中含有皂苷、多糖、蛋白质、氨基酸等多种物质，其有效成分为人参皂苷类物质。人参果中含人参总皂苷可达20%以上，是人参根部含量的4倍，居人参植株各个部份之首。基于人参皂苷类物质明确的药理活性，人参果已被作为原料药制成多种药物应用于临床。
人参皂苷属四环三萜类化合物，按其苷元部分的结构不同可分为三种类型，即原人参二醇型皂苷（Protopanaxadiol简称PPD），如人参皂苷Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、 Rb3、Rc、Rg3、F2和Rd；原人参三醇型皂苷（Protopanaxatriol简称PPT），如人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rg2、F1、F3和Rh1等；齐墩果酸（Oleanolic acid）型皂苷，如人参皂苷Ro。人参皂苷经过转化后的次级代谢衍生物具有更强的生物活性。这种次级代谢衍生物被命名为“稀有人参皂苷”，直接从五加科植物中提取出来的人参皂苷称为“原型人参皂苷”。目前，已经发现了60 多种稀有人参皂苷，其中包括Rk2、Rg3、Rh2、Rg5、Rh1、Rh3、Rk1、F1、F2、F3等多种具备不同抗癌活性的稀有人参皂苷。由于稀有人参皂苷为人参皂苷的次级代谢产物，在人参提取物中含量非常低，只能通过诸如化学反应、生物转化等手段获得这些皂苷。
人参果总皂苷是吉林省集安益盛药业股份有限公司独家品种振源胶囊的原料，2018年振源胶囊标准化研究制定了以11种人参皂苷Re、Rb1、F3、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、 F1、Rd 、F2、 Rg3为指纹特征成分的人参果总皂苷指纹图谱测定方法，运用该指纹图谱测定方法对10批人参果总皂苷进行测定，发现10批次人参果总皂苷相似度在0.82-0.91之间，表明批间差异大，通过分析发现主要原因为不同批次人参果总皂苷提取过程中pH值控制存在差异导致，所以我们根据这一发现，对人参果总皂苷的制备方法进行创新改进，研发了全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***，确定了提取过程中pH值最佳控制范围，按此制备方法制备了30个批次人参果总皂苷，30批批次人参果总皂苷相似度均在0.97以上，保证了人参果总皂苷质量的稳定性、可控性。
发明内容
本发明提供一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法,有效控制整个提取过程中的pH值在5.2-5.5之间，保证了在整个提取过程中提取液的pH值稳定，有效提取了人参稀有人参皂苷。
本发明的技术方案是： 一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法，以人参果为原料，其特征在于步骤如下：
(1) 去籽磨浆：取人参果鲜果加水，放入磨浆机分离出人参籽和果肉，收集果肉冷藏备有；
(2) 全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***-热回流提取：取人参果鲜果果肉置于配有全自动在线pH值控制***的热回流提取罐中，加水，加水量为投入物料体积2-5倍，全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***中的DG160在线pH值检测仪自动测定提取液的pH值,通过***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节提取液pH值为pH5.2-5.5，加热至100℃，加热水所产生的蒸汽作为新溶剂回流到提取罐中，搅拌、连续提取1小时，提取过程中通过DG160在线pH值检测仪监控提取液pH值，当提取液pH值偏离pH5.2-5.5时，全自动在线pH值控制***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH值到pH5.2-5.5，冷却，过滤，得提取液；备用；
(3)大孔树脂吸附:取人参果提取液过滤后的澄清滤液，滤液经D101大孔树脂柱吸附人参果皂苷，吸附饱合,吸附完药液的D101大孔树脂柱用饮用水洗至流出液接近无色；水洗完的D101大孔树脂柱用80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；减压浓缩：将乙醇洗脱液导入外循环单效浓缩器中，减压回收乙醇至无醇味并减压浓缩至相对密度为1.05～1.20，温度70℃；
(4) 高速离心喷雾干燥:浓缩液用高速离心喷雾干燥机喷雾干燥进行喷雾干燥，控制进风温度177～187℃，15～25转/分钟，在D级洁净区收集药粉，得人参果总皂苷粉。
上述制备方法中：相比较于原制备工艺创造性在于步骤（2），原制备工艺只是加水加热提取，没有对整个提取过程中pH值监控及控制。步骤（2）运用了全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***，使用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液作为pH值调节剂，精准控制整个提取过程中的pH值在5.2-5.5之间，保证了在整个提取过程中提取液的PH值稳定，制备出以11种人参皂苷Re、Rb1、F3、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、 F1、Rd 、F2、 Rg3为指纹特征成分的人参果总皂苷，制备的人参果总皂苷相似度达到0.97以上。
本发明所提供的制备方法，相比较于人参皂苷酸水解的方法：传统的酸水解法所用的酸为无机酸或有机酸，酸解反应在有机溶剂或水溶液中进行，酸浓度一般为1%-50%，人参皂苷酸水解反应时酸溶液多为一次性加入原料中，酸水解过程中人参皂苷Re、 Rg1、Rf、Rb1、Rb2等“原型人参皂苷”全部水解生成稀有人参皂苷。通过实施例证实在pH值5.0以下可导致人参果总皂苷含量标志性成分人参皂苷Re和其他人参皂苷Rg1、Rf、Rb1、Rb2等“原型人参皂苷”过度分解，导致含量降低，进而导致相似度过低。
通过自动pH值监控我们发现在人参果果肉加水后提取液pH值在5.0-5.8之间、在提取过程中由于受热等因素的影响pH值会降到4.5-5.5之间，而本发明所提供的制备方法是通过全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***对整个提取过程监控并调节控制pH值在5.2-5.5范围内，在此pH值范围内，人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rb1、Rb2等“原型人参皂苷”可适度分解生产稀有人参皂苷，并可保证批间人参果总皂苷的稳定性，保证人参果总皂苷相似度达到0.97以上。
本发明所提供的制备方法中，从安全性、可食用性、缓冲溶液pH值范围考虑，选用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液（pH值3.0-6.2），枸橼酸为有机酸，是一种食用酸，安全无毒，广泛应用于食品、医药、日化等行业。枸橼酸钠为枸橼酸的钠盐，安全无毒。通过调节枸橼酸、枸橼酸钠的用量，可以配制出pH值3.0-6.2的缓冲溶液。
以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷指纹图谱检测
【指纹图谱】色谱条件与***适用性试验 色谱柱：Luna®Omega Polar C18（250mm×4.6mm,5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脱见下表；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：35 ℃；进样量：10µL。洗脱时间60 min。11种人参皂苷Re、Rb1、F3、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3色谱峰分离度应大于1.5。
Figure 637615DEST_PATH_IMAGE001
【参照物溶液的制备】 精密称取11种人参皂苷Re、Rb1、F3、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、F2、Rg3溶解于50 ml甲醇溶液，定容置于4℃冰箱即得。
【供试品溶液的制备】 取人参果总皂苷粉末约20mg，精密称定，置于50ml锥形瓶中。精密加入甲醇20ml，称定，超声30min，补足减失的重量，混匀，0.22μm滤膜过滤。
【测定法】 分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10µL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。
供试品特征峰图谱中应有11个特征峰，应分别于相应的参照物峰保留时间相同，其相对应的保留时间应在参照物峰保留时间的±5%之内。并按中药色谱指纹图谱相似度评价***，人参果总皂苷供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算相似度。
依据本发明所述的制备方法以人参果为原料，运用全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***，选用安全无毒可食用的枸橼酸、枸橼酸钠的缓冲溶液作为pH值调节剂，精准控制整个提取过程中的pH值在5.2-5.5之间，保证了在整个提取过程中提取液的pH值稳定，在人参果提取过程中达到提取出人参皂苷Re、 Rg1、Rf、Rb1、Rb2等“原型人参皂苷”的同时生成一定的稀有人参皂苷，提高了人参果总皂苷中含有人参皂苷成分的种类，制备出以11种人参皂苷Re、Rb1、F3、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、 F1、Rd 、F2、 Rg3为指纹特征成分的人参果总皂苷，保证各批次人参果总皂苷相似度达到0.97以上。
本发明优点是：1、以人参果为原料,运用全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***，选用安全无毒可食用的枸橼酸、枸橼酸钠的缓冲溶液作为pH值调节剂，精准控制整个提取过程中的pH值在5.2-5.5之间，保证了在整个提取过程中提取液的pH值稳定，在人参果提取过程中达到提取出人参皂苷Re、 Rg1、Rf、Rb1、Rb2等“原型人参皂苷”的同时生成一定的稀有人参皂苷，提高了人参果总皂苷中含有人参皂苷成分的种类，制备出以11种人参皂苷Re、Rb1、F3、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、 F1、Rd 、F2、 Rg3为指纹特征成分的人参果总皂苷，保证各批次人参果总皂苷相似度达到0.97以上。2、本发明制备方法工艺技术先进，运用以11种人参皂苷为指纹特征成分的指纹图谱质量检测技术，保证了生产的人参果总皂苷质量的稳定性、可控性，进而保证临床用药安全，有效、可控。
附图说明
图1：全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***。
图2：为人参果总皂苷对照指纹图谱。
图3：为30批按本发明制备方法制备的人参果总皂苷指纹图谱。
具体实施方式
参见图1，零部件标号如下：搅拌器1，pH数值电极2，控制器3，枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液4。
参见图2，峰1：人参皂苷Re；峰2：人参皂苷Rb1；峰3：人参皂苷F3；峰4：人参皂苷Rg2；峰5：人参皂苷Rc；峰6：人参皂苷Rb2；峰7：人参皂苷Rb3；峰8：人参皂苷F1；峰9：人参皂苷Rd；峰10：人参皂苷F2；峰11：人参皂苷Rg3。
实施例1
一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法，取人参果鲜果100公斤加水20公斤，放入磨浆机分离出人参籽和果肉，收集果肉。取人参果鲜果果肉置于配有全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***的热回流提取罐中，加水100公斤，通过***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节提取液pH值为pH5.3，加热至100℃，连续提取1小时，冷却，过滤，取过滤后的澄清滤液，滤液经D101大孔树脂柱吸附人参果皂苷，吸附饱合,吸附完药液的D101大孔树脂柱用饮用水洗至流出液接近无色，水洗完的D101大孔树脂柱用80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液。将乙醇洗脱液导入外循环单效浓缩器中，减压回收乙醇至无醇味并减压浓缩至相对密度为1.10（70℃）。浓缩液用高速离心喷雾干燥机喷雾干燥进行喷雾干燥，控制进风温度177～187℃，15～25转/分钟，在D级洁净区收集药粉，得人参果总皂苷粉。
实施例2
一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法，取人参果鲜果100公斤加水20公斤，放入磨浆机分离出人参籽和果肉，收集果肉。取人参果鲜果果肉置于配有全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***的热回流提取罐中，加水100公斤，通过***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节提取液PH值为pH5.4，加热至100℃，加热水所产生的蒸汽作为新溶剂回到提取器中，连续提取1小时，冷却，过滤，取过滤后的澄清滤液，滤液经D101大孔树脂柱吸附人参果皂苷，吸附饱合,吸附完药液的D101大孔树脂柱用饮用水洗至流出液接近无色，水洗完的D101大孔树脂柱用80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液。将乙醇洗脱液导入外循环单效浓缩器中，减压回收乙醇至无醇味并减压浓缩至相对密度为1.10（70℃）。浓缩液用高速离心喷雾干燥机喷雾干燥进行喷雾干燥，控制进风温度177～187℃，15～25转/分钟，在D级洁净区收集药粉，得人参果总皂苷粉。
按照以上实施例1、2制备方法各生产15批人参果总皂苷，共得30批人参果总皂苷样品。按以11种人参皂苷为指纹特征成分的指纹图谱测定方法对以上30批人参果总皂苷进行测定，供试品指纹图谱中有11个人参皂苷成分特征峰，分别于相应的参照物峰保留时间相同，按中药色谱指纹图谱相似度评价***，30批人参果总皂苷指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度均在0.97以上，具体结果见表1，见图2、图3。
实施例3
一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法，取人参果鲜果100公斤加水20公斤，放入磨浆机分离出人参籽和果肉，收集果肉。取人参果鲜果果肉置于配有全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***热回流提取罐中，加水100公斤，通过***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节提取液pH值为pH5.0，加热至100℃，连续提取1小时，冷却，过滤，取过滤后的澄清滤液，滤液经D101大孔树脂柱吸附人参果皂苷，吸附饱合,吸附完药液的D101大孔树脂柱用饮用水洗至流出液接近无色，水洗完的D101大孔树脂柱用80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液。将乙醇洗脱液导入外循环单效浓缩器中，减压回收乙醇至无醇味并减压浓缩至相对密度为1.10（70℃）。浓缩液用高速离心喷雾干燥机喷雾干燥进行喷雾干燥，控制进风温度177～187℃，15～25转/分钟，在D级洁净区收集药粉，得人参果总皂苷粉，按以上实施例3生产2批产品，具体结果见表1。
实施例4
一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法，取人参果鲜果100公斤加水20公斤，放入磨浆机分离出人参籽和果肉，收集果肉。取人参果鲜果果肉置于配有全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***热回流提取罐中，加水100公斤，通过***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节提取液pH值为pH4.5、加热至100℃，连续提取1小时，冷却，过滤，取过滤后的澄清滤液，滤液经D101大孔树脂柱吸附人参果皂苷，吸附饱合,吸附完药液的D101大孔树脂柱用饮用水洗至流出液接近无色，水洗完的D101大孔树脂柱用80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液。将乙醇洗脱液导入外循环单效浓缩器中，减压回收乙醇至无醇味并减压浓缩至相对密度为1.10（70℃）。浓缩液用高速离心喷雾干燥机喷雾干燥进行喷雾干燥，控制进风温度177～187℃，15～25转/分钟，在D级洁净区收集药粉，得人参果总皂苷粉，按以上实施例4生产2批产品，具体结果见表1。
实施例5
一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法，取人参果鲜果100公斤加水20公斤，放入磨浆机分离出人参籽和果肉，收集果肉。取人参果鲜果果肉置于配有全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***热回流提取罐中，加水100公斤，通过***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节提取液pH值为pH4.0、加热至100℃，连续提取1小时，冷却，过滤，取过滤后的澄清滤液，滤液经D101大孔树脂柱吸附人参果皂苷，吸附饱合,吸附完药液的D101大孔树脂柱用饮用水洗至流出液接近无色，水洗完的D101大孔树脂柱用80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液。将乙醇洗脱液导入外循环单效浓缩器中，减压回收乙醇至无醇味并减压浓缩至相对密度为1.10（70℃）。浓缩液用高速离心喷雾干燥机喷雾干燥进行喷雾干燥，控制进风温度177～187℃，15～25转/分钟，在D级洁净区收集药粉，得人参果总皂苷粉，按以上实施例5生产2批产品、具体结果见表1。
实施例6
取人参果鲜果100公斤加水20公斤，放入磨浆机分离出人参籽和果肉，收集果肉。取人参果鲜果果肉置于热回流提取罐中，加水100公斤，不监控pH值、加热至100℃，连续提取1小时，冷却，过滤，取过滤后的澄清滤液，滤液经D101大孔树脂柱吸附人参果皂苷，吸附饱合,吸附完药液的D101大孔树脂柱用饮用水洗至流出液接近无色，水洗完的D101大孔树脂柱用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液。将乙醇洗脱液导入外循环单效浓缩器中，减压回收乙醇至无醇味并减压浓缩至相对密度为1.10（70℃）。浓缩液用高速离心喷雾干燥机喷雾干燥进行喷雾干燥，控制进风温度177～187℃，15～25转/分钟，在D级洁净区收集药粉，得人参果总皂苷粉，按以上实施例6生产2批产品、具体结果见表1。
实施例7，不添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节提取液pH值制备得人参果总皂苷，按以11种人参皂苷为指纹特征成分的指纹图谱测定方法对实施例6方法制得的人参果总皂苷进行指纹图谱测定，按中药色谱指纹图谱相似度评价***，实施例6的人参果总皂苷指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度在0.90以下。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
注：原1~原10：为原标准制备工艺生产的10批样品。
实1-1~实1-15：为按本发明制备工艺生产的实施例1的15个样品。
实2-1~实2-15：为按本发明制备工艺生产的实施例2的15个样品。
实3-1、实3-2：为实施例3的2个样品。
实4-1、实4-2：为实施例4的2个样品。
实5-1、实5-2：为实施例5的2个样品。
实6-1、实6-2：为实施例6的2个样品。
从上表可见，pH值对相似度的影响。
上面描述，只是本发明的具体实施方式，各种举例说明不对本发明的实质内容构成限制。

Claims (1)

1.一种以11种人参皂苷为指纹特征成分的人参果总皂苷的制备方法，以人参果为原料，其特征在于步骤如下：
(1) 去籽磨浆：取人参果鲜果加水，放入磨浆机分离出人参籽和果肉，收集果肉冷藏备用 ；
(2) 全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***-热回流提取：取人参果鲜果果肉置于配有全自动在线pH值控制***的热回流提取罐中，加水，加水量为投入物料体积2-5倍，全自动在线枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液pH值控制***中的DG160在线pH值检测仪自动测定提取液的pH值,通过***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节提取液pH值为pH5.2-5.5，加热至100℃，加热水所产生的蒸汽作为新溶剂回流到提取罐中，搅拌、连续提取1小时，提取过程中通过DG160在线pH值检测仪监控提取液pH值，当提取液pH值偏离pH5.2-5.5时，全自动在线pH值控制***自动添加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液调节pH值到pH5.2-5.5，冷却，过滤，得提取液；备用；
(3)大孔树脂吸附:取人参果提取液过滤后的澄清滤液，滤液经D101大孔树脂柱吸附人参果皂苷，吸附饱合,吸附完药液的D101大孔树脂柱用饮用水洗至流出液接近无色；水洗完的D101大孔树脂柱用80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；减压浓缩：将乙醇洗脱液导入外循环单效浓缩器中，减压回收乙醇至无醇味并减压浓缩至相对密度为1.05～1.20，温度70℃；
(4) 高速离心喷雾干燥:浓缩液用高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥，控制进风温度177～187℃，15～25转/分钟，在D级洁净区收集药粉，得人参果总皂苷粉；
制备出以11种人参皂苷Re、Rb1、F3、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、 F1、Rd 、F2、 Rg3为指纹特征成分的人参果总皂苷，制备的人参果总皂苷相似度达到0.97以上。
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