CN110398551B - 一种人参果药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 - Google Patents

一种人参果药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药材指纹图谱技术领域，具体涉及一种人参果药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。本发明提供了一种人参果药材指纹图谱的建立方法，本发明采用甲醇对人参果药材进行提取，之后对所得提取液进行高效液相色谱分析，通过选择合适的流动相并控制梯度洗脱程序，建立HPLC指纹图谱，结合主成分分析以更好地评价人参果药材的质量，确保人参果药材质量一致性；本发明提供的方法操作简便，准确可靠，能够弥补现有质量控制技术的不足之处，使人参果药材质量控制技术更完善，避免了质量控制的单一性和局限性，为人参果药材的质量控制提供科学依据，为提高人参果药材的质量控制水平奠定了基础。

Description

一种人参果药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱
技术领域
本发明涉及中药材指纹图谱技术领域，具体涉及一种人参果药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。
背景技术
人参(Panaxginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物，多以地下根茎部分入药，味甘、微苦，性微温，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效，多用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、气血亏虚、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷等病症的治疗。人参是我国重要特产之一，也是驰名中外的珍贵药材，被誉为“百草之王”，其有效成分主要是皂苷类和多糖类物质，现代研究表明，人参中皂苷类成分具有显著的抗肿瘤、抗糖尿病、抗心脑血管疾病、抗炎、抗癫痫和抗氧化等药理活性。
人参果为人参的成熟果实，有研究表明，其有效成分为人参皂苷类物质，且含量约为地下根茎部分的4倍，同时，基于人参皂苷类物质明确的药理活性，人参果已被作为原料药制成多种药物应用于临床，但《中国药典》尚未收载人参果药材的相关内容，该药材目前没有法定的质量控制标准。因此，急需一种能够全面、客观、科学地评价人参果药材质量的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人参果药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，本发明提供的方法操作简便，准确可靠，能够弥补现有质量控制技术的不足之处，使人参果药材质量控制技术更完善。
本发明提供了一种人参果药材指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
提供混合对照品溶液，所述混合对照品溶液中包括12种皂苷类成分，分别为人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷F3、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Rd、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3和拟人参皂苷Rh2；
采用甲醇对人参果药材进行提取，得到提取液；
将所述混合对照品溶液和提取液分别进行高效液相色谱分析，以混合对照品溶液的色谱峰为基准，得到含有12个共有峰的人参果药材指纹图谱；
所述高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈；流动相B为磷酸水溶液，所述流动相B中磷酸的体积百分含量为0.2％；
梯度洗脱程序：
0～15min，流动相A由15％增加至31％、流动相B由85％减少至69％；
15～25min，流动相A保持31％、流动相B保持69％；
25～35min，流动相A由31％增加至37％、流动相B由69％减少至63％；
35～45min，流动相A由37％增加至45％、流动相B由63％减少至55％；
45～60min，流动相A由45％增加至60％、流动相B由55％减少至40％；
检测器：二级管阵列检测器。
优选地，所述提取在超声条件下进行；所述超声的功率为200～300W，频率为35～45kHz。
优选地，所述提取的时间为30～40min。
优选地，所述甲醇与人参果药材的用量比为(15～25)mL：0.1g。
优选地，所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min。
优选地，进行所述高效液相色谱分析时的检测波长为203nm。
优选地，进行所述高效液相色谱分析时采用的色谱柱为
Figure BDA0002136328830000021
Omega Polar C18色谱柱；所述色谱柱的规格为：长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm。
优选地，进行所述高效液相色谱分析时的柱温为30～35℃。
优选地，进行所述高效液相色谱分析时的进样体积为5～40μL。
本发明提供了上述技术方案所述人参果药材指纹图谱的建立方法得到的人参果药材标准指纹图谱，包括12个共有峰，1号峰为人参皂苷Re；2号峰为人参皂苷Rb1；3号峰为人参皂苷F3；4号峰为人参皂苷Rg2；5号峰为人参皂苷Rc；6号峰为人参皂苷Rb2；7号峰为人参皂苷Rb3；8号峰为人参皂苷F1；9号峰为人参皂苷Rd；10号峰为人参皂苷F2；11号峰为人参皂苷Rg3；12号峰为拟人参皂苷Rh2。
本发明提供了一种人参果药材指纹图谱的建立方法，本发明采用甲醇对人参果药材进行提取，之后对所得提取液进行高效液相色谱分析，通过选择合适的流动相并控制梯度洗脱程序，建立HPLC指纹图谱，结合主成分分析以更好地评价人参果药材的质量，确保人参果药材质量一致性；本发明提供的方法操作简便，准确可靠，能够弥补现有质量控制技术的不足之处，使人参果药材质量控制技术更完善，避免了质量控制的单一性和局限性，为人参果药材的质量控制提供科学依据，为提高人参果药材的质量控制水平奠定了基础。
附图说明
图1为人参果药材对照指纹图谱；
图2为40批人参果药材指纹图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种人参果药材指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
提供混合对照品溶液，所述混合对照品溶液中包括12种皂苷类成分，分别为人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷F3、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Rd、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3和拟人参皂苷Rh2；
采用甲醇对人参果药材进行提取，得到提取液；
将所述混合对照品溶液和提取液分别进行高效液相色谱分析，以混合对照品溶液的色谱峰为基准，得到含有12个共有峰的人参果药材指纹图谱；
所述高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈；流动相B为磷酸水溶液，所述流动相B中磷酸的体积百分含量为0.2％；
梯度洗脱程序：
0～15min，流动相A由15％增加至31％、流动相B由85％减少至69％；
15～25min，流动相A保持31％、流动相B保持69％；
25～35min，流动相A由31％增加至37％、流动相B由69％减少至63％；
35～45min，流动相A由37％增加至45％、流动相B由63％减少至55％；
45～60min，流动相A由45％增加至60％、流动相B由55％减少至40％；
检测器：二级管阵列检测器。
本发明提供混合对照品溶液，所述混合对照品溶液中包括12种皂苷类成分，分别为人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷F3、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Rd、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3和拟人参皂苷Rh2。本发明对于混合对照品溶液中溶剂的种类没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的用于配制所述混合对照品溶液的溶剂即可。在本发明的实施例中，具体采用甲醇作为溶剂。
本发明对于配制混合对照品溶液的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的配制溶液的技术方案即可。在本发明的实施例中，具体是分别取12种皂苷类成分对照品适量，精密称定，用甲醇配制成混合对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，密封4℃保存。
本发明采用甲醇对人参果药材进行提取，得到提取液。在本发明中，所述人参果药材优选以人参果药材粉末形式使用，具体是将人参果药材粉末过40目筛，取筛下部分进行后续提取。在本发明中，所述甲醇与人参果药材的用量比优选为(15～25)mL：0.1g，更优选为(20～25)mL：0.1g。
在本发明中，所述提取优选在超声条件下进行；所述超声的功率优选为200～300W，更优选为250～300W；所述超声的频率优选为35～45kHz，更优选为40～45kHz；所述提取的时间优选为30～40min，更优选为30～35min。
在本发明的实施例中，具体是取人参果药材粉末(过40目筛后的筛下部分)约0.1g，精密称定，置于50mL锥形瓶中；精密加入甲醇15～25mL，称定，在200～300W、35～45kHz超声条件下提取30～40min，静置至室温，用甲醇补足减失的重量，混匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得提取液。
本发明将所述混合对照品溶液和提取液分别进行高效液相色谱分析，以混合对照品溶液的色谱峰为基准，得到含有12个共有峰的人参果药材指纹图谱；
所述高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈；流动相B为磷酸水溶液，所述流动相B中磷酸的体积百分含量为0.2％；
梯度洗脱程序：
0～15min，流动相A由15％增加至31％、流动相B由85％减少至69％；
15～25min，流动相A保持31％、流动相B保持69％；
25～35min，流动相A由31％增加至37％、流动相B由69％减少至63％；
35～45min，流动相A由37％增加至45％、流动相B由63％减少至55％；
45～60min，流动相A由45％增加至60％、流动相B由55％减少至40％；
检测器：二级管阵列检测器。
在本发明中，所述流动相的流速优选为0.8～1.2mL/min，更优选为1.0mL/min。
在本发明中，进行所述高效液相色谱分析时的检测波长优选为203nm。
在本发明中，进行所述高效液相色谱分析时采用的色谱柱优选为
Figure BDA0002136328830000051
OmegaPolar C18色谱柱；所述色谱柱的规格优选为：长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm。
在本发明中，进行所述高效液相色谱分析时的柱温优选为30～35℃，更优选为35℃。
在本发明中，进行所述高效液相色谱分析时的进样体积优选为5～40μL，更优选为10～20μL。
本发明提供了采用上述技术方案所述人参果药材指纹图谱的建立方法得到的人参果药材标准指纹图谱，包括12个共有峰，1号峰为人参皂苷Re；2号峰为人参皂苷Rb1；3号峰为人参皂苷F3；4号峰为人参皂苷Rg2；5号峰为人参皂苷Rc；6号峰为人参皂苷Rb2；7号峰为人参皂苷Rb3；8号峰为人参皂苷F1；9号峰为人参皂苷Rd；10号峰为人参皂苷F2；11号峰为人参皂苷Rg3；12号峰为拟人参皂苷Rh2。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)实验材料：
40批人参果药材为2017年8月采自吉林省白山市不同地区，具体样品信息见表1：
表1 40批人参果药材的样品信息
Figure BDA0002136328830000061
Figure BDA0002136328830000071
(2)仪器与试剂：
高效液相色谱仪：Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters2996PDA二级管阵列检测器(美国Waters公司)；Empower色谱工作站(美国Waters公司)；METTLERAB135-S(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；分析用乙腈为色谱纯(Sigma)。
其余试剂为分析纯(北京化学试剂厂)；水为双蒸水，由Millipore纯水***制备(Millipore,Milford,MA,USA)；人参皂苷Re(Ginsenoside Re，简写为Re，批号：110754-201626)、人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1，简写为Rb1，批号：110704-201627)、人参皂苷Rg2(Ginsenoside Rg2，简写为Rg2，批号：111779-201601)、人参皂苷Rc(Ginsenoside Rc，简写为Rc，批号：11641-201602)、人参皂苷Rb2(Ginsenoside Rb2，简写为Rb2，批号：111715-201626)、人参皂苷Rb3(Ginsenoside Rb3，简写为Rb3，批号：111686-201604)、人参皂苷F1(Ginsenoside F1，简写为F1，简写为F1，批号：111763-201602)、人参皂苷Rd(GinsenosideRd，简写为Rd，批号：11818-201626)、人参皂苷F2(Ginsenoside F2，简写为F2，批号：110804-201604)、人参皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3，简写为Rg3，批号：110804-201604)对照品由中国药品生物制品检定所提供，人参皂苷F3(Ginsenoside F3，简写为F3，批号：MUST-18032311)、拟人参皂苷Rh2(Pseudoginsenoside Rh2，简写为Rh2，批号：MUST-18082801)对照品由成都曼思特生物科技有限公司提供，且上述12种皂苷类成分对照品经HPLC分析其纯度均大于98％。
(3)混合对照品溶液的配制：
分别取12种皂苷类成分对照品适量，精密称定，用甲醇配制成混合对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，密封4℃保存。
(4)提取液(供试品溶液)的制备：
取人参果药材粉末(过40目筛后的筛下部分)约0.1g，精密称定，置于50mL锥形瓶中；精密加入甲醇20mL，称定，在250W、30kHz超声条件下提取30min，静置至室温，用甲醇补足减失的重量，混匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得提取液。
(5)高效液相色谱的色谱条件：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈；流动相B为磷酸水溶液，所述流动相B中磷酸的体积百分含量为0.2％；
梯度洗脱程序：
0～15min，流动相A由15％增加至31％、流动相B由85％减少至69％；
15～25min，流动相A保持31％、流动相B保持69％；
25～35min，流动相A由31％增加至37％、流动相B由69％减少至63％；
35～45min，流动相A由37％增加至45％、流动相B由63％减少至55％；
45～60min，流动相A由45％增加至60％、流动相B由55％减少至40％；
流动相的流速为1.0mL/min；
检测器为二级管阵列检测器；
检测波长为203nm；
色谱柱为
Figure BDA0002136328830000091
Omega Polar C18色谱柱，规格为：长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm；
柱温为35℃；
进样体积为10μL。
(6)精密度考察：
取人参果药材供试品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，测定各组分的峰面积和保留时间，计算其相对保留时间和相对峰面积。结果显示，所有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0％，表明该分析方法的精密度良好。
(7)相似度分析
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价***”(2004A版)软件对人参果指纹图谱进行数据处理。以S1号样品的图谱作为对照指纹图谱(如图1所示)进行匹配，进行相似度评价分析并通过与对照品色谱图中保留时间比对，指认并确定了12个色谱峰为40批样品所共有。图1中，1号峰为人参皂苷Re；2号峰为人参皂苷Rb1；3号峰为人参皂苷F3；4号峰为人参皂苷Rg2；5号峰为人参皂苷Rc；6号峰为人参皂苷Rb2；7号峰为人参皂苷Rb3；8号峰为人参皂苷F1；9号峰为人参皂苷Rd；10号峰为人参皂苷F2；11号峰为人参皂苷Rg3；12号峰为拟人参皂苷Rh2。将40个不同批次的人参果药材指纹图谱(如图2所示)与对照指纹图谱对比，获得相似度结果。
相似度结果分析，40批人参果药材各共有峰面积占总峰面积均大于95％，相似度评价结果较为一致，符合中药指纹图谱标准。
从以上实施例可以看出，本发明提供的方法操作简便，准确可靠，能够弥补现有质量控制技术的不足之处，使人参果药材质量控制技术更完善，避免了质量控制的单一性和局限性，为人参果药材的质量控制提供科学依据，为提高人参果药材的质量控制水平奠定了基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种人参果药材指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供混合对照品溶液，所述混合对照品溶液中包括12种皂苷类成分，分别为人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷F3、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Rd、人参皂苷F2、人参皂苷Rg3和拟人参皂苷Rh2；
采用甲醇对人参果药材进行提取，得到提取液；所述提取在超声条件下进行；所述超声的功率为200~300W，频率为35~45kHz；所述提取的时间为30~40min；所述甲醇与人参果药材的用量比为（15~25）mL：0.1g；
将所述混合对照品溶液和提取液分别进行高效液相色谱分析，以混合对照品溶液的色谱峰为基准，得到含有12个共有峰的人参果药材指纹图谱；
所述高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为乙腈；流动相B为磷酸水溶液，所述流动相B中磷酸的体积百分含量为0.2%；
梯度洗脱程序：
0~15min，流动相A由15%增加至31%、流动相B由85%减少至69%；
15~25min，流动相A保持31%、流动相B保持69%；
25~35min，流动相A由31%增加至37%、流动相B由69%减少至63%；
35~45min，流动相A由37%增加至45%、流动相B由63%减少至55%；
45~60min，流动相A由45%增加至60%、流动相B由55%减少至40%；
检测器：二级管阵列检测器；
进行所述高效液相色谱分析时采用的色谱柱为Luna®Omega Polar C18色谱柱；所述色谱柱的规格为：长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5µm。
2.根据权利要求1所述的人参果药材指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8~1.2mL/min。
3.根据权利要求1所述的人参果药材指纹图谱的建立方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱分析时的检测波长为203nm。
4.根据权利要求1所述的人参果药材指纹图谱的建立方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱分析时的柱温为30~35℃。
5.根据权利要求1所述的人参果药材指纹图谱的建立方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱分析时的进样体积为5~40µL。
6.采用权利要求1~5任一项所述人参果药材指纹图谱的建立方法得到的人参果药材标准指纹图谱，其特征在于，包括12个共有峰，1号峰为人参皂苷Re；2号峰为人参皂苷Rb1；3号峰为人参皂苷F3；4号峰为人参皂苷Rg2；5号峰为人参皂苷Rc；6号峰为人参皂苷Rb2；7号峰为人参皂苷Rb3；8号峰为人参皂苷F1；9号峰为人参皂苷Rd；10号峰为人参皂苷F2；11号峰为人参皂苷Rg3；12号峰为拟人参皂苷Rh2。
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