CN110551847A - 一种禽多瘤病毒检测引物、检测试剂盒、病毒检测方法及应用 - Google Patents

一种禽多瘤病毒检测引物、检测试剂盒、病毒检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物病原分子检测技术领域，具体涉及一种禽多瘤病毒检测引物、检测试剂盒、病毒检测方法及应用。运用特定引物通过PCR合成经地高辛标记的特异性核酸探针，通过斑点分子杂交，该特异性探针可用于检测病料样品中禽多瘤病毒核酸的存在，用于判定是否有禽多瘤病毒感染。利用本发明所涉及的试剂盒，通过提取病料组织样品的DNA进行斑点分子杂交，可在24h～36h内完成检测并报告结果，特异性强，准确性高。

Description

一种禽多瘤病毒检测引物、检测试剂盒、病毒检测方法及应用
技术领域
本发明属于动物病原分子检测技术领域，具体涉及一种禽多瘤病毒检测引物、检测试剂盒、病毒检测方法及应用。
背景技术
禽多瘤病毒（avian polyomavirus，APV）感染，也称为鹦鹉幼雏病（budgerigarfledgling disease，BFD），是由APV病毒引起多个品种鹦鹉雏鸟死亡的急性病毒性传染病。APV主要感染出壳1～3周的鹦鹉，死亡率高达80%，病症表现为厌食、消瘦、皮下出血、腹泻和呼吸困难等症状，嗉囊常饱满，内充满食物。粪便稀薄，常呈淡绿色并略带白色，病鸟常在出现腹泻后1-5天死亡。明显的临床特征还包括羽毛发育障碍，15日龄以内的发病鹦鹉背部与腹部缺乏绒毛，颈部缺乏纤毛；15日龄以上的鹦鹉尾羽和廓羽生长受损；25日龄以上耐过本病的鹦鹉，羽毛又开始发育，但个体瘦小，羽毛始终发育不全，失去观赏价值和经济意义。成鸟感染APV常会有猝死而无临床症状。
禽多瘤病毒（APV），是第一个被发现的禽类多瘤病毒，属于乳多空病毒科、 多瘤病毒属。APV是一种无囊膜的二十面体对称的、直径45-50nm的双链DNA病毒，病毒DNA共有4981bp，病毒对热、冻融和脂溶剂均不敏感，具有较强的稳定性，APV不仅可以感染鹦鹉，还可感染其他多种鸟禽。该病于上世纪八十年代初首先在美国和加拿大报道，随后，此病迅速蔓延到日本、意大利、匈牙利、德国和澳大利亚等地，我国于1994年首次在湖北省云梦县的某集约化鹦鹉养殖基地发生暴发流行，至今该病仍在我国某些地区散发流行，给我国伴侣鸟贸易和鹦鹉养殖业造成不小的经济损失。
目前，该病主要根据临床表现和组织学观察可做出初步诊断，应用电镜观察、病毒中和实验或通过PCR可作出确诊，但现有的检测方法存在一定的局限性及非特异性。因此，需要建立一种快速、灵敏、性质稳定、特异性强的检测APV的方法，以更好的满足工作人员的需求。
发明内容
鉴于现有鹦鹉感染禽多瘤病毒（APV）检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种禽多瘤病毒检测引物、检测试剂盒、病毒检测方法及应用，运用特定引物通过PCR合成经地高辛标记的特异性核酸探针，通过斑点分子杂交，特异性的检测样品中的APV。旨在解决现有的检测方法存在的弊端，在保证高灵敏度和特异性的同时，提高检测准确度。
本发明所涉及的试剂盒是利用APV的VP1基因片段为模板，用特定引物（AP-F和AP-R）通过PCR合成了经地高辛（Digoxiaenin，DIG）标记的特异性核酸探针（序列1）。通过斑点分子杂交，该探针可用于检测病料样品中APV特异性核酸的存在，用于判定是否有APV感染。利用这一方法，在1张8cm×8cm大小的尼龙膜上可同时检测约100份病料的核酸样品。病料在组织样品核酸提取后，斑点分子杂交可在24h～36h内完成检测并报告结果。
1、本发明中一种禽多瘤病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，包括一组用于禽多瘤病毒检测的引物和特异性核酸探针，所述特异性核酸探针为经地高辛标记的有731bp的序列1。引物与特异性核酸探针的序列信息如下：
APV上游引物为AP-F：5’-CAGAACATATCGAAATGG-3’；
APV下游引物为AP-R：5’-TGCAGATATCAAGACTGCC-3’；
序列1（731bp）：
CAGAACATATCGAAATGGTACAGTATTTTTTGCAAAAGTTATGCACAGTCGATATACGCGTCGGTTTTTCTAGCTGTAGCACGAGCAACGCGATCCCAGTCCAATGCGCAAGCATATGTCCCTTTATCCCGAAGTGCTCATAAAGGTGGGCCTTAAGTTGCGGCATTTTGGTAATTGAGGTAATAAGCAAGTGGCAATCAGGGCAGCTCTGCACGGAGCGTGGAGTTAGTAAATAAGCTTCTACCTTTGGGGGTAGCTCATAGTCGGTGGTACCCCTTTTTGGGGGTGTGCTATACTGACTATCCTGAGAGTTGTCATCCTGAGTTGTTTGAGGTTCGGTGCCCTGTAATTAGAACATTTCACTTGTAAAAAAGTCCTCCAGTACCTTCCATGGTACATC
TTGGAAGGCCTTAAACAGCTCGAAATATTCAGGCCTTATATCCTGTTTGCGTCTCTCGTTAACGCTAAAATAGGTTTGCATGCACTTTTTCAGTTTCATGAGTTTAAAGAAGGCCCCATCGATATCGGGTACACTTACATTCTCGAAGGTAGCATAGCCGCTCTCTTCAGGTTCGGGATCGGAGTCCTCTAGGGTCTCATCTGCACGTAGGCCTTCGGTCTCACGGAATTCCTCCATGAGGGTATTCAATTCCTTCATCTTTTCCTCATCCCCTCCTTTGTCGGGATGGTACTTCAGTGCCGTGCGACGATAGGCAGTCTTGATATCTGCA。
特异性核酸探针（地高辛标记APV-VP1特异性核酸检测探针）的制备：
（1）以APV的VP1基因片段pAPV-VP1克隆质粒为模板，用所设计并合成的一对引物AP-F、AP-R扩增出长度为731bp的APV-VP1基因片段（序列1），此段序列为APV特异性的。
（2）特异性核酸探针的PCR标记
表1 特异性核酸探针的PCR反应体系
*PCR DIG探针合成混合物（PCR DIG Probe Synthesis mixture）为含有DIG-11-dUTP的dNTP的混合物，购自Roche公司。
（3）PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，反应30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。由此合成的为有DIG标记的731bp的APV-VP1特异性核酸探针DNA。将APV-VP1特异性核酸检测探针用DNA定量仪测定浓度，将浓度调至20ng/μl。
（4）电泳结果见图1，地高辛标记PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现一条清晰条带。
2、本发明中一种禽多瘤病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，其组分包括，APV反应液、APV阳性对照、阴性对照、尼龙膜、碱基磷酸酶标记的抗地高辛抗体、显色底物NBT/BCIP溶液和其他试剂，所述APV反应液包括PCR缓冲溶液、dNTP、APV引物和特异性核酸探针。各组分制备方法如下：
APV阳性对照，所述APV阳性对照为未经标记的731bp的序列1，其制备方法如下：
（1）以APV的VP1基因片段pAPV-VP1克隆质粒为模板，用所设计并合成的一对引物AP-F、AP-R扩增出长度为731bp的非标记的APV-VP1基因片段（序列1）。
（2）反应程序
表2 PCR反应体系
（3）PCR反应程序为：95℃ 预变性5min；95℃ 变性30s，56℃ 退火30s，72℃ 延伸50s，反应31个循环；72℃ 延伸10min，4℃ 保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。由此合成如序列1所述核酸序列的未标记731bp DNA作为阳性对照，将DNA最终浓度调整至1pg/μl。
（4）电泳结果见图1，地高辛标记PCR产物和未经标记的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现均一条清晰条带，虽都是731bp，但是由于带有地高辛标记的dNTP分子量较大电泳速度较低导致地高辛标记的PCR产物比未经地高辛标记的PCR产物滞后，图1的电泳图表明用PCR合成的地高辛标记的APV-VP1特异性核酸探针有效，而且匀质性较好。
阴性对照，所述阴性对照为经检验合格SPF鸡胚制备的CEF提取的DNA，其制备方法如下：
按现行《中国兽药典》附录方法制备SPF鸡胚成纤维细胞（CEF），将CEF悬液按常规方法（分子克隆实验指南）提取基因组DNA，用70%酒精沉淀后重新溶于TE缓冲液中，将DNA浓度调整至1μg/μl。
碱性磷酸酶标记抗DIG抗体
酶标抗Dig抗体购自罗氏公司。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长。
显色底物NBT/BCIP
显色底物NBT/BCIP购自罗氏公司。性状为淡黄色，无臭、无味，长期静置有沉淀，用前离心取上清，并应无菌生长。
尼龙膜
尼龙膜购自罗氏公司。性状为白色洁净，无折叠无划痕。
其他试剂为变性液、中和液、预杂交液、洗液I、洗液II、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液，其制备方法如下：
变性液的制备
称取2g氢氧化钠、8.775g氯化钠定容至100ml水中。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
中和液的制备
称取6.057g Tris-base、17.532g氯化钠定容至100ml水中，调pH值7.4。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
预杂交液的制备
（1）20×SSC：称取17.53g氯化钠和8.82g柠檬酸钠定容至100ml水中，调pH值7.0。
（2）10%SDS：称取SDS 10g定容至100ml水中，调pH值至7.2。
（3）预杂交液37.5ml 20×SSC和3ml 10%SDS混匀后，加入3g Blocking Reagent，定容至150ml水中。性状为均质的牛奶样乳白色，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量析出，需置37℃充分溶解后使用。
洗液I的制备
15ml 20×SSC和1.5ml 10%SDS定容至150ml水中。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
洗液II的制备
3.75ml 20×SSC和1.5ml 10%SDS定容至150ml水中。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
缓冲液I的制备
称取6.025g Tris-base、4.383g氯化钠定容至500ml水中，调pH值7.5。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
缓冲液II的制备
称取3g Bloking Reagent加入150ml缓冲液中。性状为均质的牛奶样乳白色，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
缓冲液的制备
称取1.8075g Tris-base、0.8766g氯化钠、0.714g氯化镁定容至150ml水中，调pH值9.5。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
3、试剂盒上述各组分的装量如下：
特异性核酸探针
试剂1：地高辛标记的APV-VP1基因片段（序列1）特异性核酸探针，装量为20μL/管，1管/盒。
APV非标记的阳性对照核酸
试剂2：APV-VP1基因（731bp的序列1）PCR扩增的DNA，装量为20μL/管，1管/盒。
阴性对照核酸
试剂3：CEF制备的基因组DNA，装量为20μL/管，1管/盒。
尼龙膜8 cm×8cm，5片/袋，l袋/盒。
其他试剂
试剂4：变性液装量为50ml/瓶，1瓶/盒；
试剂5：中和液装量为50ml/瓶，1瓶/盒；
试剂6：预杂交液装量为100ml/瓶，1瓶/盒；
试剂7：洗液I装量为100ml/瓶，1瓶/盒；
试剂8：洗液II 装量为100ml/瓶，1瓶/盒；
试剂9：缓冲液I 装量为30ml/瓶，1瓶/盒；
试剂10：缓冲液II 装量为100ml/瓶，1瓶/盒；
试剂11：缓冲液装量为100ml/瓶，1瓶/盒；
试剂12：酶标抗DIG抗体装量为10μl/管，1管/盒；
试剂13：显色底物NBT/BCIP 装量为500μl/管，1管/盒。
变性液、中和液、预杂交液、洗液I、洗液II、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液在2～8℃下保存，尼龙膜在常温下保存，有效期为12个月。其他组分在-20℃以下保存，有效期为12个月。
4、本技术方案中的一种禽多瘤病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，特异性强、准确性高可、可同时对100份病料核酸样品同时进行快速准确的检测，本试剂盒操作方法如下：
步骤一： 核酸样品的制备
样品DNA的提取：取待检测组织样品每份0.1g研磨后，加入0.5ml抽提缓冲液（100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl pH值8.0，0.25mmol/L EDTA pH值8.0，0.5% SDS）和终浓度为100μg/ml的蛋白酶K于55℃消化过夜（6～8小时）。加入等体积苯酚/氯仿溶液，充分振荡混匀后，12000r/min离心5分钟，上清液转移至另一离心管中，再加入两倍体积的无水乙醇混匀后置于-20℃冷冻1小时以上，12000r/min离心15分钟，弃去上清。再加入1ml 70%的无水乙醇洗涤1次，沉淀溶解于适量TE缓冲液（10mmol/L Tris-Cl，0.1mmol/L EDTA pH值8.0）中，即为样品DNA。
步骤二：斑点分子杂交及免疫检测
（1）取一张试剂盒中的尼龙膜（不分正反面，使用前正反面均有纸覆盖保护），划好格子（0.75cm×0.75cm），做好标记。
（2）把试剂盒中的阴性对照核酸和APV阳性对照核酸各取1μl及步骤一中提取的样品DNA各取2μl分别点样到（1）中尼龙膜各个格子的中央。
（3）用镊子把（2）中尼龙膜（点样面朝上）放于已用变性液饱和的滤纸上（滤纸提前放于玻璃平皿中）变性10分钟，再用镊子取出放于已用中和液饱和的滤纸上（滤纸提前放于玻璃平皿中）中和5分钟。
（4）将（3）中的尼龙膜用镊子取出，放于平皿中（点样面朝上）室温干燥10分钟，至尼龙膜表面没有明显的水珠即可，在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃干烤2小时固定DNA。
（5）将10ml预杂交液加入平皿中，用镊子将（4）中尼龙膜转移至预杂交液后，在电热恒温水槽中65℃反应2小时，每15分钟摇动1次尼龙膜平皿。
（6）在（5）步骤开始1.5小时后，取10ml预杂交液和4μl APV-VP1特异性核酸探针加入50ml的离心管中，置于沸水中煮沸变性10分钟，取出后立即放于冰浴中速冻5分钟（防止变性后复性），即为杂交液。
（7）将平皿中的（5）预杂交液倒掉，把（6）中的杂交液倒入平皿中，需盖过尼龙膜，后转入65℃杂交6小时以上，最好过夜。
（8）取出平皿，倒掉（7）中杂交液（杂交后可回收杂交液，可用三次），在尼龙膜上加入10ml洗液中，在水平摇床上，室温洗涤15分钟/次，洗涤2次。
（9）倒掉（8）中洗液，在平皿中加入10ml洗液，在电热恒温水槽中，65℃洗涤15分钟/次，洗涤2次，每5分钟摇动1次尼龙膜平皿。
（10）倒掉（9）中洗液，平皿中加入10ml缓冲液，于室温洗涤1分钟。
（11）倒掉（10）中缓冲液，平皿中加入10ml缓冲液，37℃培养箱中反应30分钟。
（12）将2μl抗地高辛抗体的碱性磷酸酶标记物经12000r/min离心5min，加入到10ml缓冲液中，将（11）中的尼龙膜放于其中，37℃培养箱中反应30分钟（不要超过此时间，以免影响酶活性）。
（13）倒掉（12）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液，在水平摇床上，室温洗涤5分钟/次，洗涤5次。
（14）倒掉（13）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液，室温反应2分钟。
（15）倒掉（14）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液和100μl显色底物NBT/BCIP，避光显色2～10小时，观察显色结果。
（16）倒掉显色液，加入水反复冲洗，及时终止显色并拍照记录结果。
步骤三：结果分析与判定
（1）APV阳性对照出现褐色显色，阴性对照无显色，判定试验有效；
（2）样品有显色的为阳性，无显色为阴性。
5、本发明还提供一种所述引物在制备检测禽多瘤病毒物品中的应用。
6、本技术方案中的一种禽多瘤病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒结合目前防控形势与临床情况可以实现以下用途。
(1)用于疑似发病鹦鹉及其他鸟禽的实验室确诊检测；
(2)发病前或发病初期(无明显症状)的早期诊断；
(3)健康鹦鹉及其他鸟禽“体检”，查看是否有APV的存在；
(4)引种过程中的APV病原检测，特别是从国外疫区引种的精准检测；
(5)用于APV致病机制、流行病学等基础研究用途。
本发明的有益效果是：
利用本发明所涉及的试剂盒，提取病料组织样品的核酸后，利用斑点分子杂交可在24h～36h内完成检测并报告结果。在1张8cm×8cm大小的尼龙膜上可同时检测约100份病料的核酸样品。本发明还筛选和优化了新的引物和探针。通过生物信息学预测及实验验证，本技术方案优选的引物和探针敏感性与特异性更好，准确性高。
附图说明
图1：APV-VP1核酸探针标记电泳图；
其中M：DNA Marker（2000DL）；1-3：以APV-VP1基因731bp片段为模板的地高辛标记PCR法扩增的APV特异性核酸探针；4-6：以APV-VP1基因731bp片段为模板的常规PCR法结果；
图2：APV-VP1核酸探针灵敏性检测结果图；
其中1：阴性对照核酸；2-6：0.1、1、10、100、1000pg量的APV基因组DNA；
图3：APV-VP1核酸探针特异性检测结果图；
其中1：阴性对照核酸；2-8：REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV、PBFDV的基因组DNA；9：阳性对照核酸。
具体实施方式
实施例1：本发明试剂盒检测APV的灵敏性试验
（1）样品：APV非标记的阳性对照核酸。
（2）样品处理：将APV非标记的阳性对照核酸稀释至1000、100、10、1、0.1pg/μl，以及阴性对照核酸在尼龙膜上依次点样，做好标记，进行斑点杂交。
（3）用镊子把尼龙膜（点样面朝上）放于已用变性液饱和的滤纸上（滤纸提前放于玻璃平皿中）变性10分钟，再用镊子取出放于已用中和液饱和的滤纸上（滤纸提前放于玻璃平皿中）中和5分钟。
（4）将膜用镊子取出，放于平皿中（点样面朝上）室温干燥10分钟，至膜表面没有明显的水珠即可，在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃干烤2小时固定DNA。
（5）将10ml预杂交液加入平皿中，用镊子将膜转移至预杂交液后在电热恒温水槽中65℃反应2小时，每15分钟摇动1次尼龙膜平皿。
（6）在（5）步骤开始1.5小时后，取10ml预杂交液和4μl APV-VP1核酸探针加入50ml的离心管中，置于沸水中煮沸变性10分钟，取出后立即放于冰浴中速冻5分钟（防止变性后复性），即为杂交液。
（7）将平皿中的预杂交液倒掉，把（6）中的杂交液倒入平皿中，需盖过尼龙膜，后转入65℃杂交6小时以上，最好过夜。
（8）取出平皿，倒掉杂交液（杂交后可回收杂交液，可用三次），在尼龙膜上加入10ml洗液中，在水平摇床上，室温洗涤15分钟/次，洗涤2次。
（9）倒掉洗液，在平皿中加入10ml洗液，在电热恒温水槽中，65℃洗涤15分钟/次，洗涤2次，每5分钟摇动1次尼龙膜平皿。
（10）倒掉洗液，平皿中加入10ml缓冲液，于室温洗涤1分钟。
（11）倒掉缓冲液，平皿中加入10ml缓冲液，37℃培养箱中反应30分钟。
（12）在10ml缓冲液中加入2μl抗地高辛抗体的碱性磷酸酶标记物（用之前12000r/min离心5min），将尼龙膜放于其中，37℃培养箱中反应30分钟（不要超过此时间，以免影响酶活性）。
（13）倒掉（12）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液，在水平摇床上，室温洗涤5分钟/次，洗涤5次。
（14）倒掉（13）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液，室温反应2分钟。
（15）倒掉（14）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液和100μl显色底物NBT/BCIP，避光显色2～10小时，观察显色结果。
（16）倒掉显色液，加入水反复冲洗，及时终止显色并拍照记录结果。（结果见说明书附图2）。
（17）灵敏性结果：
APV特异性核酸片段为1000、100、10、1pg的量时，核酸显色，呈阳性反应；APV特异性核酸片段为0.1pg的量及阴性对照核酸均不显色，呈阴性反应。
表3 APV-VP1探针的灵敏性检测信号强度统计
#：信号极强显色极其明显，有很深的褐黑色斑点；
+++：信号较强显色很明显，有较深的褐色斑点；
++：信号较好显色明显，有明显褐色斑点；
+：有信号呈肉眼可见的褐色斑点；
—：没有信号不显色。
由表3可知采用本发明试剂盒可检测到1pg量的APV特异性核酸片段，表明本检测方法具有较好的灵敏性。
本发明利用特定引物AP-F和AP-R，通过PCR合成的经地高辛标记的特异性核酸探针，通过斑点分子杂交，该特异性核酸探针可用于检测病料品中APV特异性核酸的存在，且具有较高的灵敏性。
实施例2：本发明试剂盒检测APV的特异性试验
（1）样品：本实验室分离鉴定和制备保存的禽网状内皮组增生症病毒（REV）基因组DNA、鸡马立克氏病病毒（MDV）基因组DNA、鸡传染性贫血病毒（CIAV）基因组DNA、鸡白血病病毒（ALV）基因组DNA、鸡呼肠孤病毒（ARV）基因组DNA、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）基因组DNA、鹦鹉喙语病病毒（PBFDV）基因组DNA。
（2）样品处理：把试剂盒中的阴性对照核酸和阳性对照核酸各取1μl和REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV以及PBFDV的基因组DNA各取2μl分别点样到尼龙膜上，做好标记。
（3）用镊子把尼龙膜（点样面朝上）放于已用变性液饱和的滤纸上（滤纸提前放于玻璃平皿中）变性10分钟，再用镊子取出放于已用中和液饱和的滤纸上（滤纸提前放于玻璃平皿中）中和5分钟。
（4）将膜用镊子取出，放于平皿中（点样面朝上）室温干燥10分钟，至膜表面没有明显的水珠即可，在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃干烤2小时固定DNA。
（5）将10ml预杂交液加入平皿中，用镊子将膜转移至预杂交液后在电热恒温水槽中65℃反应2小时，每15分钟摇动1次尼龙膜平皿。
（6）在（5）步骤开始1.5小时后，取10ml预杂交液和4μl APV-VP1核酸探针加入50ml的离心管中，置于沸水中煮沸变性10分钟，取出后立即放于冰浴中速冻5分钟（防止变性后复性），即为杂交液。
（7）将平皿中的预杂交液倒掉，把（6）中的杂交液倒入平皿中，需盖过尼龙膜，后转入65℃杂交6小时以上，最好过夜。
（8）取出平皿，倒掉杂交液（杂交后可回收杂交液，可用三次），在尼龙膜上加入10ml洗液中，在水平摇床上，室温洗涤15分钟/次，洗涤2次。
（9）倒掉洗液，在平皿中加入10ml洗液，在电热恒温水槽中，65℃洗涤15分钟/次，洗涤2次，每5分钟摇动1次尼龙膜平皿。
（10）倒掉洗液，平皿中加入10ml缓冲液，于室温洗涤1分钟。
（11）倒掉缓冲液，平皿中加入10ml缓冲液，37℃培养箱中反应30分钟。
（12）在10ml缓冲液中加入2μl抗地高辛抗体的碱性磷酸酶标记物（用之前12000r/min离心5min），将尼龙膜放于其中，37℃培养箱中反应30分钟（不要超过此时间，以免影响酶活性）。
（13）倒掉（12）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液，在水平摇床上，室温洗涤5分钟/次，洗涤5次。
（14）倒掉（13）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液，室温反应2分钟。
（15）倒掉（14）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液和100μl显色底物NBT/BCIP，避光显色2～10小时，观察显色结果。
（16）倒掉显色液，加入水反复冲洗，及时终止显色并拍照记录结果。（结果见说明是附图3）。
（17）特异性结果：
阳性对照核酸显色，呈阳性反应；REV、MDV、CIAV、ALV、ARV、IBV、PBFDV以及阴性对照核酸均不显色，呈阴性反应。
（18）结果验证
经过斑点检测为阴性的，通过分子生物学方法检测确认均不含APV。表明本检测方法特异性强，检测结果准确可靠。
本发明的试剂盒的试验结果判定是利用APV的VP1基因片段的特异性，作DNA与DNA的斑点分子杂交，根据有无斑点反应，可特异性检测APV。
序列表
<110> 青岛立见诊断技术发展中心
中国动物卫生与流行病学中心
<120> 一种禽多瘤病毒检测引物、检测试剂盒、病毒检测方法及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagaacatat cgaaatgg 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcagatatc aagactgcc 19
<210> 3
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagaacatat cgaaatggta cagtattttt tgcaaaagtt atgcacagtc gatatacgcg 60
tcggtttttc tagctgtagc acgagcaacg cgatcccagt ccaatgcgca agcatatgtc 120
cctttatccc gaagtgctca taaaggtggg ccttaagttg cggcattttg gtaattgagg 180
taataagcaa gtggcaatca gggcagctct gcacggagcg tggagttagt aaataagctt 240
ctacctttgg gggtagctca tagtcggtgg tacccctttt tgggggtgtg ctatactgac 300
tatcctgaga gttgtcatcc tgagttgttt gaggttcggt gccctgtaat tagaacattt 360
cacttgtaaa aaagtcctcc agtaccttcc atggtacatc ttggaaggcc ttaaacagct 420
cgaaatattc aggccttata tcctgtttgc gtctctcgtt aacgctaaaa taggtttgca 480
tgcacttttt cagtttcatg agtttaaaga aggccccatc gatatcgggt acacttacat 540
tctcgaaggt agcatagccg ctctcttcag gttcgggatc ggagtcctct agggtctcat 600
ctgcacgtag gccttcggtc tcacggaatt cctccatgag ggtattcaat tccttcatct 660
tttcctcatc ccctcctttg tcgggatggt acttcagtgc cgtgcgacga taggcagtct 720
tgatatctgc a 731

Claims (8)

1.一种禽多瘤病毒的检测引物，其特征在于，包括如下引物：
APV上游引物为AP-F：5’-CAGAACATATCGAAATGG-3’；
APV下游引物为AP-R：5’-TGCAGATATCAAGACTGCC-3’。
2.一种禽多瘤病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
（1）如权利要求1所述的禽多瘤病毒的检测引物，
（2）特异性核酸探针，所述特异性核酸探针为经地高辛标记的有731bp的序列1。
3.根据权利要求2所述的禽多瘤病毒试剂盒，其特征在于，包括APV反应液、APV阳性对照、阴性对照、尼龙膜、碱基磷酸酶标记的抗地高辛抗体、显色底物NBT/BCIP溶液和其他试剂，所述APV反应液包括PCR缓冲溶液、dNTP、APV引物和特异性核酸探针。
4.根据权利要求3所述的禽多瘤病毒试剂盒，其特征在于，所述APV阳性对照为未经标记的731bp的序列1。
5.根据权利要求3所述的禽多瘤病毒试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为经检验合格SPF鸡胚制备的CEF提取的DNA。
6.根据权利要求3所述的禽多瘤病毒试剂盒，其特征在于，所述其他试剂为变性液、中和液、预杂交液、洗液I、洗液II、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液。
7.一种禽多瘤病毒的检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
步骤一： 核酸样品的制备
样品DNA的提取：取待检测组织样品每份0.1g研磨后，加入0.5ml抽提缓冲液和终浓度为100μg/ml的蛋白酶K于55℃消化过夜；
加入等体积苯酚/氯仿溶液，充分振荡混匀后，12000r/min离心5分钟，上清液转移至另一离心管中，再加入两倍体积的无水乙醇混匀后置于-20℃冷冻1小时以上，12000r/min离心15分钟，弃去上清；
再加入1ml 70%的无水乙醇洗涤1次，沉淀溶解于适量TE缓冲液中，即为样品DNA；
步骤二：斑点分子杂交及免疫检测
（1）取一张试剂盒中的尼龙膜，划好格子，做好标记；
（2）把试剂盒中的阴性对照核酸和APV阳性对照核酸各取1μl及步骤一中提取的样品DNA各取2μl分别点样到（1）中尼龙膜各个格子的中央；
（3）用镊子把（2）中尼龙膜点样面朝上，放于已用变性液饱和的滤纸上变性10分钟，再用镊子取出放于已用中和液饱和的滤纸上中和5分钟；
（4）将（3）中的尼龙膜用镊子取出，点样面朝上放于平皿中室温干燥10分钟，至尼龙膜表面没有明显的水珠即可，在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃干烤2小时固定DNA；
（5）将10ml预杂交液加入平皿中，用镊子将（4）中尼龙膜转移至预杂交液后，在电热恒温水槽中65℃反应2小时，每15分钟摇动1次尼龙膜平皿；
（6）在（5）步骤开始1.5小时后，取10ml预杂交液和4μl APV-VP1特异性核酸探针加入50ml的离心管中，置于沸水中煮沸变性10分钟，取出后立即放于冰浴中速冻5分钟，即为杂交液；
（7）将平皿中的（5）预杂交液倒掉，把（6）中的杂交液倒入平皿中，需盖过尼龙膜，后转入65℃杂交6小时以上；
（8）取出平皿，倒掉（7）中杂交液，在尼龙膜上加入10ml洗液中，在水平摇床上，室温洗涤15分钟/次，洗涤2次；
（9）倒掉（8）中洗液，在平皿中加入10ml洗液，在电热恒温水槽中，65℃洗涤15分钟/次，洗涤2次，每5分钟摇动1次尼龙膜平皿；
（10）倒掉（9）中洗液，平皿中加入10ml缓冲液，于室温洗涤1分钟；
（11）倒掉（10）中缓冲液，平皿中加入10ml缓冲液，37℃培养箱中反应30分钟；
（12）将2μl抗地高辛抗体的碱性磷酸酶标记物经12000r/min离心5min，加入到10ml缓冲液中，将（11）中的尼龙膜放于其中，37℃培养箱中反应30分钟；
（13）倒掉（12）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液，在水平摇床上，室温洗涤5分钟/次，洗涤5次；
（14）倒掉（13）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液，室温反应2分钟；
（15）倒掉（14）溶液，在平皿中加入10ml缓冲液和100μl显色底物NBT/BCIP，避光显色2～10小时，观察显色结果；
（16）倒掉显色液，加入水反复冲洗，及时终止显色并拍照记录结果；
步骤三：结果分析与判定
（1）APV阳性对照出现褐色显色，阴性对照无显色，判定试验有效；
（2）样品有显色的为阳性，无显色为阴性。
8.一种如权利要求1所述引物在制备检测禽多瘤病毒物品中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593509A (zh) * 2015-01-29 2015-05-06 中国水产科学研究院珠江水产研究所 罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒
CN108315492A (zh) * 2018-04-20 2018-07-24 咸阳职业技术学院 一种鸟类多瘤病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法
CN108624721A (zh) * 2018-06-25 2018-10-09 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒
CN108707695A (zh) * 2018-05-17 2018-10-26 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593509A (zh) * 2015-01-29 2015-05-06 中国水产科学研究院珠江水产研究所 罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒
CN108315492A (zh) * 2018-04-20 2018-07-24 咸阳职业技术学院 一种鸟类多瘤病毒pcr诊断试剂盒及其检测方法
CN108707695A (zh) * 2018-05-17 2018-10-26 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN108624721A (zh) * 2018-06-25 2018-10-09 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OGAWA HIROHITO等: "Duplex shuttle PCR for differential diagnosis of budgerigar fledgling disease and psittacine beak and feather disease", 《MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY》 *

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