CN107012261A

CN107012261A - 鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物

Info

Publication number: CN107012261A
Application number: CN201710444133.1A
Authority: CN
Inventors: 万春和; 黄瑜; 程龙飞; 陈翠腾; 傅光华; 施少华; 陈红梅; 傅秋玲; 刘荣昌
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2017-08-04
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: CN107012261B

Abstract

本发明提供鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑4所示，具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见可基于饱和荧光染料Eva Green可同时对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物

技术领域

本发明提供鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，属于动物传染病学领域。

背景技术

腺病毒基因组全长约为33 kd，基因组为线性双链DNA；该类病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称，其中腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。

当前，腺病毒科下设5个属，分别为富AT腺病毒属、禽腺病毒属、鱼腺病毒属、哺乳动物腺病毒属和唾液酸酶病毒属。其中富AT腺病毒属有5个种，分别为牛腺病毒D型、绵羊腺病毒D型、袋鼠腺病毒A型、蛇腺病毒A型和鸭腺病毒A型（简称DAdV-A）。

鸭腺病毒2型（duck adenovirus 2，DAd V-2）是近年来利用病毒宏基因组学发现的一种鸭源新型腺病毒，该病主要发生在20～30日龄鸭中，以肝和脾肿大、出血为主要特征，死亡率约为7％。核苷酸同源性分析比较发现，鸭腺病毒2型（GR株）和鸭腺病毒A型分离株的核苷酸同源性约为50.0%。通过对其基于Hexon蛋白的遗传进化分析发现，所有鸭腺病毒A型分离株在遗传进化上均处于相同的亚分支，且和绵羊腺病毒D型（OAV287株）均处于富AT腺病毒属遗传进化分支。但鸭腺病毒2型（GR株）和禽腺病毒A型Phelps株（鸡源）与P29株（鹅源）处于同一遗传进化分支，均属于禽腺病毒属遗传进化分支。

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。双重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测两种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。当前，实时荧光定量的在非特异性荧光标记中，荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，分别为：不饱和染料（主要是SYBR GreenⅠ）和饱和染料（主要是EvaGreen）有两种常用的荧光染料。前期研究发现，EvaGreen对实时荧光定量PCR的抑制性远小于 SYBR Green I ，故EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM），该分析正被越来越多的用于实时荧光定量PCR后的基因分型和异源双链分析。此外，EvaGree稳定性极强且因其对细胞膜透性较低，而较SYBR GreenⅠ更加安全。

当前，在鸭群中存在2种腺病毒科但分属于不同腺病毒属的病原：鸭腺病毒A型（属于腺病毒科富AT腺病毒属）和鸭腺病毒2型（属于属于腺病毒科禽腺病毒属）。因此，建立能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的检测方法，既可简化操作程序、节约成本，又对鸭群中2种腺病毒科但分属于不同腺病毒属的病原（鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型）的流行病学调查及开展相关病原学致病机理研究均具有重要的意义。但是，当前国内外尚未见基于饱和荧光染料Eva Green可同时对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明提供鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒, 建立能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型检测的EvaGreen实时荧光定量PCR方法，简化操作程序、节约成本。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，包括如下：

用于检测鸭腺病毒A型：

上游引物DAdVA-SYF：5’- CTAATCCTCAGGTTGGGCAAAG-3’，

下游引物DAdVA-SYR：5’-GGAAAACCAGTAACCTGACT-3’，

目的片段大小为124 bp；

用于检测鸭腺病毒2型：

上游引物DAdV2-SYF：5’- TGAAATAAACATTCCAGCAAT-3’；

下游引物DAdV2-SYR：5’- ACCACCGAGCTCCAATATTT-3’；

目的片段大小为180 bp。

两组引物的目的片段常规PCR琼脂糖凝胶电泳无法有效区分，引物均由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用于检测鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的双重EvaGreen实时荧光定量PCR方法的试剂盒，包括所述的引物。

双重EvaGreen实时荧光定量PCR反应体系为：

双重EvaGreen实时荧光定量PCR方法反应条件为： 95 ℃预变性60 s；95 ℃ 10s，58℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，40个循环；循环结束后，做出溶解曲线。

结果判断：

实时EvaGreen荧光定量PCR反应结束后，观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：若在Tm=（87.86±0.18）℃出现单一的特异性峰判为鸭腺病毒A型阳性；若在Tm=（82.28±0.19）℃出现单一的特异性峰判为鸭腺病毒2型阳性；若Tm=（87.86±0.18）℃和Tm=（82.28±0.19）℃均出现峰值，表明鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型混合感染。

本发明提供检测鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒，具有以下优点和效果：

1、同时检测：建立的方法能够同时对鸭群中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型感染进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其Tm值即可直接对结果进行判断。

2、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需2h，且一次可以同时进行96个样品检测。

3、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据检测待检样品中鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的Ct值，可直接对其感染鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型进行准确定量。

4、灵敏度高：鸭腺病毒A型最低可检测14.5个拷贝；鸭腺病毒2型最低可检测17.3个拷贝，较常规PCR检测灵敏度提高100倍。

5、特异性强：和鸭群中的常见传染病（基因组核酸类型为DNA）如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均无反应信号，仅对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型检测出现荧光信号，存在特异性溶解曲线峰值（Tm值）。

对86份临床送检鸭源病料进行鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型感染的双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的DNA，按照建立双重实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm=（87.86±0.18）℃出现单一的特异性峰的样品有7份（Tm值分别为87.8℃、87.9℃、88.0℃、88.0℃、87.8℃、87.9℃和88.0℃、），即存在鸭腺病毒A型感染阳性样品7份，阳性率为8.14%；在Tm=（82.28±0.19）℃出现单一的特异性峰的样品有3份（Tm值分别为82.3℃、82.4℃和82.4℃），即存在鸭腺病毒2型感染阳性样品3份，阳性率为3.48%；且还有一份样品出现双峰值（Tm值分别为82.4℃和88.0℃），即存在鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型混合感染阳性样品1份，阳性率为1.16%。

附图说明

图1 实时荧光定量引物的特异性试验，M：DL2000分子量标准；1：鸭腺病毒A型；2：鸭腺病毒2型；3：鸭大肠杆菌；4：鸭疫里氏杆菌；5：鸭源禽多杀性巴氏杆菌；6：鸭瘟病毒；7：番鸭细小病毒；8：阴性对照。

图2 鸭腺病毒A型实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。

图3 鸭腺病毒A型实时荧光定量PCR方法的标准曲线。

图4 鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。

图5 鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR方法的标准曲线。

图6 鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2 型双重实时荧光定量PCR方法的特异性试验。

图7 双重EvaGreen实时荧光定量PCR方法的溶解曲线Tm值分析。其中，1：鸭腺病毒2型；2：鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型混合感染；3：鸭腺病毒A型；4：其他的阴性对照（鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均没有特异性Tm值，肉眼无法区分）。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、相关试验病原

试验用病原鸭腺病毒A型、鸭腺病毒2型、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

2、引物和设计

根据GenBank中检索到的鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的特异性Hexon基因编码区序列，设计特异性的针对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的引物，其序列如下：

用于检测鸭腺病毒A型：

上游引物DAdVA-SYF：5’- CTAATCCTCAGGTTGGGCAAAG-3’，

下游引物DAdVA-SYR：5’-GGAAAACCAGTAACCTGACT-3’，

目的片段大小为124 bp；

用于检测鸭腺病毒2型：

上游引物DAdV2-SYF：5’- TGAAATAAACATTCCAGCAAT-3’；

下游引物DAdV2-SYR：5’- ACCACCGAGCTCCAATATTT-3’；

目的片段大小为180 bp。

针对鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的特异性目的片段，经常规琼脂糖凝胶电泳无法有效区分。上述引物均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

3、引物的特异性分析

利用上述引物（DAdVA-SYF/DAdVA-SYR、DAdV2-SYF/DAdV2-SYR）对鸭腺病毒A型、鸭腺病毒2型、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒进行常规PCR扩增，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DAdV-A-F3和DAdV-A-R3，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。

结果可见（见图1），仅DAdVA-SYF/DAdVA-SYR对鸭腺病毒A型、DAdV2-SYF/DAdV2-SYR对鸭腺病毒2型出现特异性目的条带，但上述条带经常规琼脂糖凝胶电泳无法科学有效区分；对其他病原（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒）均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的实时荧光定量PCR试验的相关引物，特异性强。

4、鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型的双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立

4.1 鸭腺病毒A型阳性标准品的构建

根据鸭腺病毒A型（JX2016株）Hexon蛋白编码区基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DAdV-A-F5：5′- CATAGGACAGCTGCCACAAAT -3′和DAdV-A-R5：5′- ATGTTTATATCTATCAGTAAG -3′，用于扩增约582 bp的Hexon基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鸭腺病毒A型（JX2016株）核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DAdV-A-F5和DAdV-A-R5，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DAdV-A-F5和DAdV-A-R5）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T-DAdV-A），分装后置于-20 ℃保存备用。

4.2 鸭腺病毒2型阳性标准品的构建

根据鸭腺病毒2型（FJ20171株）Hexon蛋白编码区基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DAdV-2-F6：5′- TACAAGACAGAAATACCGAATTA -3′和DAdV-2-R6：5′- ACTTTTGTGGAACTTGAATGTGGA -3′，用于扩增约627 bp的Hexon基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鸭腺病毒2型（FJ20171株）核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DAdV-2-F6和DAdV-2-R6，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DAdV-2-F6和DAdV-2-R6）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T-DAdV-2），分装后置于-20 ℃保存备用。

4.3 鸭腺病毒A型EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

以鸭腺病毒A型阳性标准品（T- DAdV-A）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为1.45×10⁶，1.45×10⁵，1.45×10⁴，1.45×10³，1.45×10²和1.45×10¹拷贝/μL），在不同退火温度（54，56，58，60，62和64 ℃）、引物浓度（2.5，5.0，10和20 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

从图2可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为14.5拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸭腺病毒A型实时荧光定量PCR标准曲线（图3），所获得标准曲线斜率为-3.483，Y轴截距为34.95，相关系数为0.998，扩增效率为99.9%，符合实验预期。

观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：在Tm=（87.86±0.18）℃出现单一的特异性峰判为鸭腺病毒A型阳性（图6）。对其他病原（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒）均未见特异性溶解曲线峰值（图6）。

4.4 鸭腺病毒2型EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

以鸭腺病毒2型阳性标准品（T- DAdV-2）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为1.73×10⁶，1.73×10⁵，1.73×10⁴，1.73×10³，1.73×10²和1.73×10¹拷贝/μL），在不同退火温度（54，56，58，60，62和64 ℃）、引物浓度（2.5，5.0，10和20 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。

从图4可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为17.3拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸭腺病毒2型实时荧光定量PCR标准曲线（图5），所获得标准曲线斜率为-3.302，Y轴截距为32.27，相关系数为0.999，扩增效率为99.8%，符合实验预期。

观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：在Tm=（82.28±0.19）℃出现单一的特异性峰判为鸭腺病毒2型阳性（图6）。对其他病原（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒）均未见特异性溶解曲线峰值（图6）。

4.5 反应条件的优化

按照SsoFast EvaGreen SuperMix 试剂盒（172-5201AP，BIO-RAD公司）说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（54，56，58，60，62和64 ℃）、引物浓度（2.5-20 μM）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。

结果：优化出的双重EvaGreen实时荧光定量PCR方法最佳反应体系（20 μL）如下表1。

表1 优化后的双重实时荧光定量PCR反应体系

优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为：95 ℃预变性60 s；95 ℃ 10s，58℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。

4.6 双重EvaGreen实时荧光定量PCR方法结果判断及特异性分析

实时EvaGreen荧光定量PCR反应结束后，观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果（见图7）：若在Tm=（87.86±0.18）℃出现单一的特异性峰判为鸭腺病毒A型阳性；若在Tm=（82.28±0.19）℃出现单一的特异性峰判为鸭腺病毒2型阳性；若Tm=（87.86±0.18）℃℃和Tm=（82.28±0.19）℃均出现峰值，表明鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型混合感染。对其他病原（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒）均未见特异性溶解曲线峰值（图6）。

4.7 临床样品的检测

将相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型Hexon基因片段，和建立的双重EvaGrenn实时荧光定量PCR符合率为100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctaatcctca ggttgggcaa ag 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaaaaccag taacctgact 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaaataaac attccagcaa t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accaccgagc tccaatattt 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cataggacag ctgccacaaa t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgtttatat ctatcagtaa g 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tacaagacag aaataccgaa tta 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acttttgtgg aacttgaatg tgga 24

Claims

1.鸭腺病毒A型和2型双重EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述引物包括如下：

用于检测鸭腺病毒A型：

上游引物DAdVA-SYF：5’- CTAATCCTCAGGTTGGGCAAAG-3’，

下游引物DAdVA-SYR：5’-GGAAAACCAGTAACCTGACT-3’，

目的片段大小为124 bp；

用于检测鸭腺病毒2型：

上游引物DAdV2-SYF：5’- TGAAATAAACATTCCAGCAAT-3’，

下游引物DAdV2-SYR：5’- ACCACCGAGCTCCAATATTT-3’，

目的片段大小为180 bp。

2.一种用于检测鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型双重实时荧光定量PCR方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。