CN108707695A - 一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于禽病学领域。本发明包括特异性引物和探针序列的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化、样本DNA提取及结果检测判定。本发明建立检测鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR的引物和探针的方法，在检测鹦鹉幼雏病病毒上灵敏度高、特异性强、重复性好，最低可检测30.7拷贝/μL，可用于检测临床样本中鹦鹉幼雏病病毒的感染。

Description

一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，属于禽病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标（molecular Beacon）。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

鹦鹉幼雏病病毒（Budgerigar fledgling disease polyomavirus，BFPyV）属于多瘤病毒科（Family: Polyomavirida）、γ-多瘤病毒属（Genus: Gammapolyomavirus）、禽多瘤病毒1型（Species: Aves polyomavirus 1）。该病原可感染多品种鹦鹉雏鸟（1-3周）并导致高致死率（80%左右），感染症状表现为消瘦、呼吸困难、皮下出血和腹泻。BFPyV属于无囊膜、环状双链DNA病毒，基因组全长约为5.0 kb，编码5个主要的开放阅读框（open readingframe，ORF）：结构蛋白（capsid protein） 3个（VP1、VP2和VP3）与T抗原蛋白（T antigen）2个（Large T antigen和T antigen，大T抗原和小T抗原）。基于大T抗原，可将80%的多瘤病毒科成员（100余种）进一步划分为4个属。BFPyV最早于报道于美国和加拿大，随后日本、意大利、匈牙利、德国、澳大利亚和波兰均见有鹦鹉感染BFPyV的报道。我国1994年在湖北云梦和山东青岛首次报道BFPyV，随后该病继续在两地存在散发流行。研究发现，禽类感染多瘤病毒可在多个组织器官中观察到细胞损伤，但是尚未见禽类感染多瘤病毒可导致动物机体出现肿瘤，这和哺乳动物感染多瘤病毒的特点存在很大差异。当前国内外尚未见基于TaqMan探针实时荧光定量PCR检测鹦鹉幼雏病病毒的引物、探针及其方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是填补现有实时荧光定量PCR检测鹦鹉幼雏病病毒的引物和探针的方法相关研究报道的空白，提供一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测30.7拷贝/μL，可用于对临床样本中鹦鹉幼雏病病毒的分子流行病学调查，为明确鹦鹉幼雏病病毒的分子流行病学特点提供检测方法和手段。

为实现上述目的，提供以下方法：

一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含一对引物和探针，所述引物和探针设计如下：

根据鉴定的鹦鹉幼雏病病毒（WF-GM01株，GenBank登录号为GU452537）大T抗原（LargeT antigen）编码的基因序列片段，设计特异性针对鹦鹉幼雏病病毒的引物和探针，其序列如下：

上游引物BFPyV-F：5’- CCATCTAAGAGTTCCTGAA -3’，

下游引物BFPyV-R：5’- CTCACTATTTCTGCACATC -3’；

所述探针序列BFPyV -P为： 5’-AACGCCTATGCCAATGTGCTG-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

PCR最佳反应体系为：Probe qPCR Mix混合液12.5 μL、10 μmol/L 上/下游引物（BFPyV-F和BFPyV-R）各0.6 μL、10 μmol/L探针（BFPyV -P）1 μL、DNA模板1 μL、水（Nuclease-free Water）补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 5 s、60℃ 30s，共40个循环。

有益效果

本发明采用鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR检测的引物和探针进行鹦鹉幼雏病病毒检测，具有以下优点和效果：

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需2h，且一次可同时进行96个样品检测。对临床收集的17份鹦鹉源病料进行检测后发现，检测到3份鹦鹉幼雏病病毒感染阳性，阳性率为17.65%（3/17）。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中鹦鹉幼雏病病毒的Cq值，直接对其感染鹦鹉幼雏病病毒进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测30.7拷贝/μL。

4、特异性强：和鹦鹉常见传染病（如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、鹦鹉圆环病毒、禽流感病毒）均无反应信号，仅对鹦鹉幼雏病病毒检测出现荧光信号。

5、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行鹦鹉幼雏病病毒检测的组内变异系数为0.54%-1.79%，组间变异系数0.62%-2.33%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

附图说明

图1实时荧光定量检测鹦鹉幼雏病病毒的PCR方法的扩增曲线。1：3.07×10⁷ 拷贝/μL；2：3.07×10⁶ 拷贝/μL；3：3.07×10⁵ 拷贝/μL；4：3.07×10⁴ 拷贝/μL ；5：3.07×10³拷贝/μL；6：3.07×10² 拷贝/μL；7：3.07×10¹ 拷贝/μL 。

图2实时荧光定量检测鹦鹉幼雏病病毒的PCR方法的标准曲线。

图3实时荧光定量检测鹦鹉幼雏病病毒的PCR方法的特异性。1：鹦鹉幼雏病病毒；2：试验对照（大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、鹦鹉圆环病毒、禽流感病毒和空白对照，由于均没有扩增，没有阳性荧光信号，无法区分。）。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、相关试验病原

试验用病原鹦鹉幼雏病病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、鹦鹉圆环病毒、禽流感病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

鹦鹉幼雏病病毒的鉴定

2.1 样品处理

2016年福建某地临床送检的病死鸽病料，小心采集其肝脏和脾脏组织，加入灭菌PBS（体积比为1∶5）研磨处理后，反复冻融3次，4 000 r/min离心20 min，吸取上清备用。

2.2 核酸DNA的提取和检测

吸取200μL 2.1中获得的上清加入1.5 mL离心管中，加入200 μL蛋白酶K和200 μL BB5缓冲液（使用前需加入5.6 μg Carrier RNA），震荡混匀后，置于56 ℃水浴30 min后参考北京全式金生物技术有限公司EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒说明书进行操作获得病料的核酸DNA，并按照试剂盒的方法同时提取试验对照毒株核酸，均放置-20℃保存备用。利用BFPyV检测引物，引物序列为：上游引物BFPyV-F1：5＇-CAGGCCTTATATCCTGTTTGCGTC-3＇、下游引物BFPyV-R1：5＇-GATATCAAGACTGCCTATCGTCGC-3＇，预期扩增片段大小为298 bp。PCR反应体系50μL：2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25 μL，上/下游引物（BFPyV-F1/ BFPyV-R1，10 μmmol/L）各1 μL，模板1 μL，灭菌去离子水补至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。反应结束后按照常规琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果检测到BFPyV感染阳性（记为BFPyV FJ-2016株）。

、鹦鹉幼雏病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

3.1 引物和探针

根据鹦鹉幼雏病病毒Large T编码的基因序列片段，设计特异性的针对鹦鹉幼雏病病毒的引物和探针，其序列如下：

上游引物BFPyV-F：5’- CCATCTAAGAGTTCCTGAA -3’，

下游引物BFPyV-R：5’- CTCACTATTTCTGCACATC -3’；

所述探针序列BFPyV -P为： 5’-AACGCCTATGCCAATGTGCTG-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。引物和探针均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

经NCBI数据库进行引物的Primer-BLAST分析。Primer-BLAST分析表明，本发明设计的相关引物特异性强、无交叉干扰，符合试验设计预期。

3.2 阳性标准品的构建

利用大T抗原的基因特征，利用Oligo 7 引物设计软件设计引物，上游引物LTF1：5＇-TGATCGATAGCGCATCCTAGT-3＇、下游引物LTR1：5＇-AATGCAGTATTGATATGAATGTT-3＇，预期扩增片段大小为649 bp。使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液 25 μL、上/下游引物（LTF1/ LTR1）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸(BFPyV FJ-2016株)模板DNA 1 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50 s 、53℃退火35s、72 ℃延伸45s，30个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将鹦鹉幼雏病病毒的Hexon基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（LTF1/ LTR1）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品（P-LT）。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为3.07×10⁷ 拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续10倍倍比稀释，获得的浓度分别为3.07×10⁶ 拷贝/μL、3.07×10⁵ 拷贝/μL、3.07×10⁴ 拷贝/μL、3.07×10³ 拷贝/μL、3.07×10² 拷贝/μL、3.07×10¹ 拷贝/μL。

3.3 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化和标准曲线的建立

按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制25 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（52、54、56、58、60、62和64 ℃）、引物浓度（1.25、2.5、5.0、10和20μmol/L）及探针浓度（1.25、2.5、5.0、10和20 μmol/L）下，对反应条件进行优化。分别以标准品（P-LT）含量为3.07×10⁷ 拷贝/μL-3.07×10¹ 拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）。

最佳反应体系为：Probe qPCR Mix混合液12.5 μL、上/下游引物（BFPyV-F和BFPyV-R）（10 μmol/L） 各0.6 μL、探针（BFPyV -P）（10 μmol/L）1 μL、DNA模板1 μL、水（Nuclease-free Water）补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃ 1 min预变性；95℃ 5 s、60℃ 30s，共40个循环。

从扩增动力学曲线（图1）可以看出，本发明建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为30.7拷贝/μL。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鹦鹉幼雏病病毒TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线（见图2）的线性方程的斜率为-3.198，相关系数为1，扩增效率为105%，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

3.4 特异性检测

用优化后的TaqMan实时荧光定量PCR条件分别对鹦鹉幼雏病病毒及鹦鹉其他常见病原（如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、鹦鹉圆环病毒、禽流感病毒）进行检测。

结果可见，对鹦鹉其他常见病原（如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、鹦鹉圆环病毒、禽流感病毒）均无反应信号，仅对鹦鹉幼雏病病毒检测出现荧光信号。

3.5 重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为3.07×10⁷、3.07×10⁶ 、3.07×10⁵、3.07×10⁴ 、3.07×10³、3.07×10² 、3.07×10¹拷贝/μL的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内（intra-group）变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔7d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间（inter-group）变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行鹦鹉幼雏病病毒检测的组内变异系数为0.54%-1.79%，组间变异系数0.62%-2.33%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

临床应用

使用建立的鹦鹉幼雏病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法，对临床收集的17份鹦鹉源病料进行检测后发现，检测到3份鹦鹉幼雏病病毒感染阳性，阳性率为17.65%（3/17）。将相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用实时荧光定量PCR扩增时的引物对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鹦鹉幼雏病病毒Large T基因片段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

<130> 7

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggccttat atcctgtttg cgtc 24

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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gatatcaaga ctgcctatcg tcgc 24

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgatcgatag cgcatcctag t 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatgcagtat tgatatgaat gtt 23

Claims (1)

1.一种鹦鹉幼雏病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含一对引物和探针，序列如下：

上游引物BFPyV-F：5’- CCATCTAAGAGTTCCTGAA -3’，

下游引物BFPyV-R：5’- CTCACTATTTCTGCACATC -3’；

所述探针序列BFPyV -P为： 5’-AACGCCTATGCCAATGTGCTG-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。