CN110551230A - 一种黄芪多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄芪多糖的制备方法，所述方法，步骤如下：1)取黄芪加水煎煮，煎液滤过浓缩，浓缩液加乙醇后，室温放置；2)过滤除去上清液，沉淀加乙醇，过滤除去上清液，沉淀加水，溶解；3)溶液加乙醇使含醇量为30‑40％，取上清液加乙醇使含醇量为60‑80％，放置，过滤除去上清液，沉淀加水定容、过滤，滤液加水超滤至定容体积的25％～30％；4)滤液分别通过阳离子交换层析柱和阴离子交换层析柱，以醋酸‑醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱液经过滤膜滤过，再经过超滤***分级超滤，得到两级超滤液，分别超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至保留体积为洗脱液体积的10％～15％；5)两部分滤液分别经‑30至‑70℃冷冻1‑10天后室温复融，离心，上清液浓缩至药液糖度为20％～26％，浓缩液加乙醇使含醇量为85‑95％，滤去上清液，沉淀用乙醇溶解、滤去上清液，干燥、粉碎、混合，即得。

Description

一种黄芪多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药提取物的制备，特别涉及一种黄芪多糖的制备方法

背景技术

黄芪，又名黄耆，为豆科植物黄芪或内蒙黄芪的干燥根。

黄芪和人参均属补气良药，人参偏重于大补元气，回阳救逆，常用于虚脱、休克等急症，效果较好。而黄芪则以补虚为主，常用于体衰日久、言语低弱、脉细无力者。有些人一遇天气变化就容易感冒，中医称为“表不固”，可用黄芪来固表，常服黄芪可以避免经常性的感冒。黄芪产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地，黄芪的药用迄今已有2000多年的历史，中药材黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根。黄芪的功效与作用:

1.益气固表：生用黄芪，有益气固表、利水消肿、脱毒、生肌的功效，适用于自汗、盗汗、血痹、浮肿、痈疽不溃或溃久不敛等症。

2.补气养血：蜜炙黄芪有补气、养血、益中功效，适用于内伤劳倦、脾虚泄泻、气虚、血虚、气衰等症。

3.降血压：现代医学证明，黄芪具有降低血液黏稠度、减少血栓形成、降低血压、保护心脏、双向调节血糖、抗自由基损伤、抗衰老、抗缺氧、抗肿瘤、增强机体免疫力作用，可用来治疗心脏病、高血压、糖尿病等症。黄芪还能扩张血管，改善皮肤血液循环和营养状况，故对慢性溃疡久不愈合者有效。其还能消除肾炎患者的蛋白尿，保护肝脏，防止肝糖原减少。

4.利水消肿：脾脏主运化水湿，脾气虚、则运化不力，黄芪既能补脾益气治本，又能利尿消肿治标，是治疗气血水肿的重要药物之一。

5.生津养血：黄芪本身具有养血的功效，而且通过补气的作用又有助于生血，因此黄芪也常被用于治疗血虚萎黄及气血两虚证。

6.抗肿瘤：黄芪中有效成分黄芪多糖与抗肿瘤药物合用有增效减毒之功，即增强抗癌效果，减轻副作用。

黄芪的营养价值：黄芪含皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素。

黄芪多糖是黄芪的干燥根经提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖。淡黄色，粉末细腻，均匀无杂质，具引湿性。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、***糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。

黄芪多糖提取方法包括：醇除水提法,碱醇提取法,碱水提取法,酶提取法,超声波提取法,温水提醇沉法,微波提取法,水回流提取法,传统水煎煮法等。

现有技术如：文献1：王淑萍，黄芪多糖提取分离纯化工艺的优化研究，分子科学学报2008.2，60-62。采用等量(6倍量)水提。使用氯仿和正丁醇等有机溶剂萃取。大孔树脂柱或聚酰胺柱洗脱。

文献2：郭会青，黄芪粗多糖提取工艺优化，食品研究与开发2015.11,78-80。采用等量(20倍量)水提。纱布过滤后醇沉。离心技术。低温冷冻干燥得粗品。

文献3：倪艳，黄芪多糖水煎提取工艺的优化试验研究，中国中药杂志1998，284-286。采用等量(12倍量)水提。

文献4：刘瑞生，黄芪多糖提取方法研究进展，中国兽药杂志2007，41(3)，35-36。采用等量(12倍量)水提。

中国专利也公开了多种黄芪多糖提取方法，如以下专利中描述的方法：

现有方法有多种缺点，如：黄芪多糖粗品收率低，提取成本高；高温提取副产物多，后续纯化难度大；碱性环境下破坏黄芪多糖大分子机构，导致多糖变单糖；增加辅助物质或溶媒，影响提取物安全性。

本发明在现有技术的基础上，提供了一种全新的黄芪多糖提取方法，克服了现有技术中的问题。

发明内容：

本发明提供一种黄芪多糖的提取方法，本发明的黄芪多糖采用的是豆科植物蒙古或膜荚黄芪的干燥根作为提取原料，经过提取、精制得到多糖组分。

本发明的提供一种黄芪多糖的制备方法，所述方法，步骤如下：

1)取黄芪饮片加水煎煮，煎液滤过浓缩，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量为60-80％，室温放置；

2)过滤除去上清液，沉淀加乙醇至乙醇含量＞94％，过滤除去上清液，沉淀加水，溶解；

3)溶液加乙醇使含醇量为30-40％，取上清液加乙醇使含醇量为60-80％，放置，过滤除去上清液，沉淀加水溶解、过滤，溶液加水超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留体积为原体积的25％～30％；

4)滤液分别通过阳离子交换层析柱和阴离子交换层析柱，以醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱液经过滤膜滤过，再经过超滤***分级超滤，超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留体积为洗脱液体积的10％～15％；

5)滤液经-30至-70℃冷冻1-10天后室温复融，离心，上清液浓缩至药液糖度为20％～26％，浓缩液加乙醇使含醇量为85-95％，滤去上清液，沉淀用乙醇溶解、滤去上清液，干燥、粉碎、按照比例将不同极性及分子量的中间品进行混合，可得黄芪多糖粉末。

优选的，本发明所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取黄芪饮片420kg，加水煎煮三次，第一次10倍量、第二次8倍量、第三次6倍量，煎液合并后滤过，滤液浓缩至25℃相对密度为1.14～1.18％，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量为70％，边加边搅拌，室温放置；

2)除去上清液，沉淀加乙醇至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水溶解沉淀；

3)溶液加乙醇使含醇量约为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量约为70％，放置，除去上清液，沉淀加水溶解、过滤，滤液加水定容到糖度20～26％，超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留液体积为超滤前溶液加水定容体积的25％～30％。

4)保留液分别通过阳离子和阴离子交换层析柱，以20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱液经过三级串联微孔滤膜滤过，滤液经分级超滤***分两级超滤，分别收集不同极性及分子量的超滤保留液I和超滤保留液II，滤液加水超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留液体积为洗脱液体积的10％～15％。

5)分级超滤所得的保留液I和II分别经-30至-70℃冷冻1-10天后室温复融，使用高速离心机离心，上清液在温度35-45℃、真空度小于1000mbar条件下用真空簿膜浓缩机浓缩浓缩至药液糖度为20％～26％，浓缩液加乙醇使含醇量为90％，离心，除去上清液，沉淀用乙醇搅拌至完全溶解、离心、除去上清液，反复2-3次，沉淀低温干燥、粉碎，得到两种不同极性及分子量的黄芪多糖粉末中间品I和黄芪多糖粉末II，将两者混合后，得到分子量分布范围在48000～140000、分布系数不大于23.0的黄芪多糖。

其中，步骤4)保留液分别通过Pharmacia公司生产的Serharose SP Big Beads和Sepharose Q Big Beads规格为GE-G300×500×500的阳离子、阴离子交换层析柱，滤液经Millipore公司生产的型号为PZB008A系列超滤***分级超滤，

其中，步骤5)在温度35-45℃、真空度小于1000mbar条件下，上清液用真空簿膜浓缩机浓缩至药液糖度为20％～26％，混合后，可得黄芪多糖粉末上限为840g(纯度100％)。

收率计算公式：

纯度按照高效液相色谱法以及分子排阻色谱法(《中国药典》2015年版通则0512/0514)测定分子量分布图谱计，除4个多糖色谱峰外无杂质峰。

本发明进一步对本发明制备方法所得黄芪多糖粉末进行了检测，指标如下：

表1

本发明的方法，因本发明所得的提取物为单一的黄芪多糖成分，所以纯度可达100％。

本发明基于传统中药提取“水提醇沉”法基础对工艺进行优化，不使用非药用或生物性工艺助剂；采用阴阳离子交换层析技术，可以精细到选择性收取不同极性特征的黄芪多糖成分；采用微孔滤膜过滤技术，可以精细到选择性收取一定范围分子量的黄芪多糖；采用低温冻融、低温离心和低温干燥等控制手段辅助纯化，确保生产全过程温度的精细化控制，可以精细到选择性收取一定溶解度特性的黄芪多糖成分。所收得的黄芪多糖纯度可高、安全性及疗效更为优越。

本发明的方法，和现有技术相比，各种指标的优越之处如下：

1.现有黄芪多糖的制法技术则不能实现选择性收取不同极性特征的黄芪多糖成分。

本发明中使用的阴阳离子交换层析技术包括阳离子交换层析(SP柱)、阴离子交换层析(Q柱)。将层析柱冲洗平衡后进行上样，用20mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，流速控制在800～1200ml/min时对于多糖组分中不同极性的黄芪多糖分离比最优，黄芪多糖更为稳定。

黄芪多糖稳定性考察的加速试验：本发明制得的黄芪多糖选用温度40℃±2℃、相对湿度75％±5％的条件考察0时及第1、2、3、6个月的质量稳定性。同时进行高温、高湿及强光等影响因素试验：高温试验：本发明制得的黄芪多糖置于适宜的洁净容器中60℃存放，当样品考察含量低于规定限度，则40℃条件同法进行试验，若60℃无明显变化，不在进行40℃试验。高湿试验：本发明制得的黄芪多糖置恒温密闭容器中，在温度25℃、相对湿度90％±5％条件存放。如吸湿重量5％以上，则在相对湿度75％±5％条件下同法进行。强光照射试验：本发明制得的黄芪多糖在装有日光灯的光照箱或其他适宜的光照装置内，于照度为4500lx±500lx条件下存放。

结果：通过对按照本发明中制法制得的黄芪多糖所进行的加速试验以及影响因素试验结果表明，本发明所制得的黄芪多糖稳定、工艺成熟，关键检测指标的波动幅度低于现有技术水平所制得的黄芪多糖。检测结果如下表：

表2

关于溶血实验的说明：当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生，若2支供试品管中的溶液在3小时内均不发生溶血和凝聚，判定供试品符合规定；若有1支供试品管的溶液在3小时内发生溶血和(或)凝聚，应设4支供试品管进行复试，其供试品管的溶液在3小时内均不得发生溶血和(或)凝聚

2.现有黄芪多糖的制法技术则不能实现选择性收取一定范围分子量的黄芪多糖成分。

本发明中使用的分级微孔滤膜过滤技术选用100K及8K的膜包进行超滤，在药液温度25～30℃、超滤循环压力控制在0.8～0.9bar的条件下可收集到重均分子量分布范围在48000～140000、分布系数不大于23.0的特定范围黄芪多糖，而此范围的黄芪多糖不论是功效还是对人体的难易程度都是最优。

3.现有黄芪多糖的制法技术则不能实现选择性收取一定溶解度特性的黄芪多糖成分。本发明中使用的低温冻融、离心和干燥等控制技术选用超低温冻融、35～45℃浓缩、40～50℃干燥温度，更有利于对多糖结构的保护，且可以通过控制不同温度从而筛选出一定溶解性特性的黄芪多糖。

观察不同浓缩温度、不同干燥温度下黄芪多糖溶液溶解性：精密称取实验所得的各黄芪多糖1.00g置于中硼硅玻璃管制注射剂瓶中，分别溶于10ml纯化水后观察溶解性。

实验结果：本发明提供的提取方法(35～45℃浓缩、40～50℃干燥温度)制取的水分均为5％的黄芪多糖在浓缩液颜色及溶解性方面优于其他提取条件。结果统计如下：不同浓缩温度下的黄芪多糖用时、得收率及颜色表(浓缩液糖度25％下测得)

表3

组别	浓缩温度(℃)	浓缩用时(h)	黄芪多糖收率(％)	浓缩液颜色
					1	25	22	0.08	微黄色
2	30	10	0.13	微黄色
					3	35	8	0.16	微黄色
4	40	7	0.20	微黄色
					5	45	6	0.22	微黄色
6	50	5	0.19	棕黄色

不同干燥温度下的黄芪多糖用时、颜色及溶解性表(水分5％下测得)

表4

4.现有黄芪多糖的制法技术则一般不能实现黄芪多糖的纯化及颜色问题。

本发明中使用的关键技术可以去除除目标产物之外的所有杂质及色素，所得的黄芪多糖为单一成分的白色粉末，解决了传统中药提取物的颜色深、成分复杂的难题，确保黄芪多糖的纯度。按照本发明制得的黄芪多糖杂质分析：选择按照本发明制得的黄芪多糖，采用苯酚-硫酸法进行含量检测，使用紫外分光光度计于490nm处记录特征吸收峰通过计算所得。

标准曲线：用中国药品生物制品检定所提供的D-无水葡萄糖对照品，配制成每1ml含0.1mg的溶液，精密称取此液0.2、0.3、0.4、0.5和0.6ml分别置于25nl容量瓶中，加水至2.0ml，然后加入苯酚溶液1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5分钟后置水浴中加热15分钟，取出，迅速冷却至室温，另取2.0ml水同上平行操作作为空白对照，按照《中国药典》标准进行检测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线如下：

表5

浓度(mg)	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06
						吸收度	0.146	0.218	0.286	0.365	0.425

回归方程及相关系数：C＝7.05A+6×10^-3 r＝0.9993。线性范围：0-0.6。测定结果如下表：

表6

实验结果：本发明提供的制法制取的黄芪多糖纯度可达100％，成分单一、解决了由于传统中药提取物成分复杂、杂质不可控的缺陷。

5.药效实验：本发明黄芪多糖对丝裂霉素C化疗小鼠吸收后骨髓及脾脏前体细胞恢复的影响。

实验一方法：实验第0天，给Balb/C小鼠腹腔注射丝裂霉素C(7mg/kg)，每组小鼠3只，于实验第0～4天以不同途径给小鼠按照本发明制得的重均分子量分布范围在48000～140000、分布系数不大于23.0的黄芪多糖100mg/kg，分别于实验第3、7和14天取其股骨和脾脏进行前体细胞计数，对照组选择普通黄芪多糖作对比。实验结果见下表。

表7

实验表明按照本发明制得的重均分子量分布范围在48000～140000、分布系数不大于23.0的黄芪多糖更易被吸收，能促进骨髓及脾脏(最大的免疫器官)的生长，且恢复的水平远高于对照的同等水平。

实验二方法：选择按照本发明制得的重均分子量分布范围在48000～140000、分布系数不大于23.0的黄芪多糖经中国中医研究院广安门医院(***临床药理基地)临床用于年龄在18-50岁之间(除妊娠、哺乳期妇女)，无心、肝肾功能损害。血、尿、便检查无异常的住院患者(提前签署知情同意书)。根据疗程将患者分为A、B两组，每组根据年龄、性别将健康受试者均衡搭配，A组以用药量1/8的剂量为起始量，逐渐递增(即1/8、1/4、1/2、1N、2N、3N……)，每个剂量组6人，用药7天。B组根据年龄、性别将健康受试者均衡搭配，分为1倍临床用药量(250mg/日)组合2倍量(500mg/日)组，每个剂量组3人，用药21天。用药均为静脉点滴，两组均在用药过程中及停药7天后观察，记录血尿便常规、肝肾功能变化数据。血常规(WBC、Hb、PLT)、尿常规(GPT、GOT、A/G)、肾功能(BUN、Cr)数据记录如下表。

表8

表9

表10

表11

表12

表13

表14

表15

实验表明按照本发明制得的重均分子量分布范围在48000～140000、分布系数不大于23.0的黄芪多糖更易被吸收，且对人体无害。

本发明的每一个步骤的技术参数都是经过筛选得到的，有关筛选数据如下：

步骤1的筛选：

1.黄芪多糖水煎提取条件研究：是以黄芪多糖的粗品得率与含量加权平均值为考察指标，对黄芪多糖提取工艺进行了三因素、三水平的正交设计实验，因素水平见下因素水平表。

表16

将正交设计试验结果进行方差分析，结果见下方差分析表。

表17

结果表明，因素A(提取次数)有显著差异，而因素B(提取时间)及因素C(加水量)则无显著性差异，程度依次为A＞C＞B。各因素理论最佳水平为A3B3C3，即提取3次，每次提取3.5小时，每次加12倍量水。按照理论最佳工艺进行验证试验，结果多糖粗品得率为2.0％。根据工业化大生产的实际情况通过预试验，在不影响本品提取效果的前提下，本发明将提取工艺定为提取3次，每次3小时，加水量分别为投料饮片量的10倍、8倍、6倍。然后进行了多批次生产验证，结果统计见下表。

表18

多批生产实验结果表明，发明中的提取工艺其多糖得率均优于理论最佳提取工艺，而且加水量减少了1/3，提取时间共缩短了1.5小时，浓缩时间也减少了1/3，既可以节省能源和水资源，又大大提高了生产效率。

2.药材提取浓缩液的相对密度研究：为了使多糖沉淀完全，药材提取液需经过浓缩至适当浓度后才能进行醇沉，药液过稀则沉淀不完全，过浓则会因沾壁造成损失。因此我们以多糖粗品得率为指标，以含醇量70％为醇沉浓度，针对提取浓缩液的相对密度进行了试验比较，结果见下表。

表19

试验结果表明，提取浓缩液的相对密度对多糖粗品得率有较大的影响，相对密度低于1.13时得率较低，耗用乙醇量较大；相对密度大于1.19时多糖粗品颜色较深，说明含杂质较多。因此选定提取浓缩液的相对密度为1.14～1.18(25℃)。3.70％醇沉乙醇浓度的研究：本发明以多糖粗品得率为主要指标，考察不同醇沉浓度对多糖粗品得率的影响，结果见下表。

表20

乙醇浓度	62％	70％	78％
				多糖粗品得率(％)	4.48	6.80	7.40
多糖粗品色泽	淡黄色	淡黄色	棕色
				耗用乙醇量(L/200kg饮片)	350	500	770

试验结果表明70％醇沉时，随着乙醇浓度的升高，多糖粗品得率也相应增加，乙醇浓度为62％时沉淀并不完全，乙醇浓度为78％时杂质较多且用醇量最大，而70％乙醇浓度下黄芪多糖粗品得率较高且含杂质较少，同时乙醇用量也较少，因此确定次条件。

步骤2的筛选：

醇沉可以去除提取物中的杂质，而本发明中的黄芪多糖溶于低浓度乙醇，所以以多糖粗品得率为主要指标进行考察乙醇处理后上清液醇浓度及加水后浓度条件，结果见下表。

表21

试验结果表明本发明中选用乙醇反复处理沉淀至上清液乙醇含量＞94％，且除去上清液后按照沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，所得多糖粗品得率最高且杂质最少，故选定此条件。

步骤3的筛选：

1.35％乙醇溶解条件的研究：为了进一步对本发明中的黄芪多糖粗品进行纯化，以黄芪多糖粗品质量及多糖粗品得率为指标，对此步骤中乙醇浓度条件进行筛选。结果见下表。

表22

结果表明乙醇浓度为30％是虽然多糖粗品得率较高，但多糖粗品质量不合格；乙醇浓度为38％时多糖粗品质量虽然合格，但是多糖粗品得率较低。因此选定此步骤乙醇浓度为35％，既保证多糖粗品质量合格，又有较高的多糖粗品得率。

2.70％醇沉乙醇浓度的确定：本步骤离心除杂后将上清液进行第二次70％乙醇沉淀使得多糖粗品沉淀完全，同时进一步除去许多可溶于70％乙醇的杂质。通过对70％醇沉步骤不同乙醇浓度进行研究表明，当乙醇浓度低于65％时，沉淀很不完全，呈混悬状，无法统计数据，必须进行二次离心才能得到粗品且得率较低；乙醇浓度为75％时得率于乙醇耗用比例关系劣于70％，故选定此条件。结果统计见下表。

表23

步骤4的筛选：

此步骤进行超滤的目的是出去多糖粗品中的大部分小分子，减轻阴、阳离子交换层析柱的负荷，降低小分子对离子交换层析的干扰，提高阴、阳离子交换层析的分离纯化效果，同时浓缩药液，减少上样体积。后续选择使用阴、阳离子交换层析除去多糖粗品中所含的蛋白、色素等无效成分和杂质。以产品最终收率为指标，将超滤终点定为超滤至原体积(层析收集液体积)的10％～15％的研究，低于10％体积下限后，收集液不易冷冻除杂，多于15％的体积上限后会增加后续超滤难度，故选择此参数。结果见下表。

表24

步骤5的筛选：

1.干燥方式的研究：通过对喷雾干燥及醇沉干燥两种方式进行研究，确定醇沉干燥方式适用于本发明。结果见下表。

表25

2.冻融及浓缩的研究：黄芪多糖在纯度较高时部分组分在氢键的作用下易聚合从而导致产品浑浊，通过对TFF100K-8K超滤***超滤后的药液进行冻融处理可以有效去除这部分组分，保证产品澄明度。同时超滤后的药液其浓度一般在2％～5％之间。为了使多糖沉淀完全，必须将其浓缩至适宜浓度后再进行醇沉。浓度低则多糖沉淀不完全，最终产品收率低。为此，本发明以90％为醇沉浓度，以产品最终收率为指标，对比不同浓度对此步醇沉的影响。结果见下表。

表26

结果表明药液浓度在15％、18％时收率较低，随着浓度增高，产品最终收率也逐渐增加，但因多糖粘度大会随浓缩浓度的提高而起泡、挂壁，故将药液的浓度定为大于20％。

3.80％～90％醇沉醇度研究：浓缩液浓缩至适宜浓度后，进行乙醇沉淀的目的是保证经反复分离纯化后的多糖沉淀完全，以尽量提高产品最终收率。本发明以产品最终收率为指标，以20％～25％为浓缩浓度，对比乙醇浓度对产品最终收率的影响，通过试验确定乙醇浓度为80％～90％时可以确保黄芪多糖沉淀完全。结果见下表。

表27

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

取黄芪饮片420kg，加水煎煮三次(10倍量、8倍量、6倍量)，每次提取3小时，煎液滤过，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.18％(25℃)，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为70％，边加边搅拌，室温放置；

除去上清液，沉淀用乙醇反复处理至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水搅拌溶解；

溶液加乙醇使含醇量约为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量约为70％，放置，除去上清液。沉淀加水溶解、过滤，溶液加水超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留体积为原体积的25％～30％。

保留液经过微孔滤膜滤过，滤液经超滤***分级超滤，加水超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留体积为原体积的10％～15％。

保留液冻融、离心、浓缩，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为90％，边加边搅拌，离心，除去上清液，沉淀用乙醇反复处理，低温干燥、粉碎、混合即得黄芪多糖粉末520g。

实施例2

第二批样品的制备

取黄芪饮片210kg，加水煎煮二次(10倍量、8倍量)，每次提取3小时，煎液滤过，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.18％(25℃)，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为70％，边加边搅拌，室温放置；

除去上清液，沉淀用乙醇反复处理至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水搅拌溶解；

溶液加乙醇使含醇量约为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量约为70％，放置，除去上清液。沉淀加水溶解、过滤，溶液加水超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留体积为原体积的25％～30％。

保留液分别通过阳离子、阴离子交换层析柱，以醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱。洗脱液经过微孔滤膜滤过，滤液经超滤***分级超滤，加水超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留体积为原体积的10％～15％。

保留液冻融、离心、浓缩，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为90％，边加边搅拌，离心，除去上清液，沉淀用乙醇反复处理，低温干燥、粉碎、混合即得黄芪多糖粉末560g。

实施例3

第三批样品的制备

取黄芪饮片210kg，加水煎煮三次(10倍量、8倍量、6倍量)，每次提取1.5小时，煎液滤过，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.18％(25℃)，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为80％，边加边搅拌，室温放置；

除去上清液，沉淀用乙醇反复处理至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水搅拌溶解；

溶液加乙醇使含醇量约为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量约为70％，放置，除去上清液。沉淀加水溶解、过滤，溶液加水超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留体积为原体积的25％～30％。

保留液分别通过阳离子、阴离子交换层析柱，以醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱。洗脱液经过微孔滤膜滤过，滤液经超滤***分级超滤，加水超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留体积为原体积的10％～15％。

保留液冻融、离心、浓缩，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为90％，边加边搅拌，离心，除去上清液，沉淀用乙醇反复处理，低温干燥、粉碎、混合即得黄芪多糖粉末600g。

实施例4

第四批样品的制备

取黄芪饮片420kg，加水煎煮三次(10倍量、8倍量、6倍量)，每次提取3小时，煎液滤过，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.18％(25℃)，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为70％，边加边搅拌，室温放置；

除去上清液，沉淀用乙醇反复处理至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水搅拌溶解；

溶液加乙醇使含醇量约为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量约为70％，放置，除去上清液。沉淀加水溶解、过滤，溶液加水超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留体积为原体积的25％～30％。

保留液冻融、离心、浓缩，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为90％，边加边搅拌，离心，除去上清液，沉淀用乙醇反复处理，低温干燥、粉碎、混合即得黄芪多糖粉末600g。

实施例5

第五批样品的制备

取黄芪饮片420kg，加水煎煮三次(10倍量、8倍量、6倍量)，每次提取3小时，煎液滤过，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.18％(25℃)，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为70％，边加边搅拌，室温放置；

除去上清液，沉淀用乙醇反复处理至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水搅拌溶解；

溶液加乙醇使含醇量约为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量约为70％，放置，除去上清液。沉淀加水溶解、过滤，溶液加水超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留体积为原体积的25％～30％。

保留液分别通过阳离子、阴离子交换层析柱，以醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱。洗脱液经过微孔滤膜滤过，滤液经超滤***分级超滤，加水超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留体积为原体积的10％～15％。

保留液冻融、离心、浓缩，浓缩液低温干燥、粉碎、混合即得黄芪多糖粉末720g。

实施例6

取黄芪饮片420kg，加水煎煮三次(10倍量、8倍量、6倍量)，每次提取3小时，煎液滤过，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.18％(25℃)，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量约为70％，边加边搅拌，室温放置；

除去上清液，沉淀用乙醇反复处理至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水搅拌溶解；

溶液加乙醇使含醇量约为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量约为70％，放置，除去上清液。沉淀加水溶解、过滤，溶液加水超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留体积为原体积的25％～30％。

保留液分别通过阳离子、阴离子交换层析柱，以醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱。洗脱液经过微孔滤膜滤过，滤液经超滤***分级超滤，加水超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留体积为原体积的10％～15％。

保留液冻融、离心、浓缩，浓缩液放置至室温，加无水乙醇使含醇量大于99％，边加边搅拌，离心，除去上清液，沉淀用乙醇反复处理，低温干燥、粉碎、混合即得黄芪多糖粉末700g。

实施例1样品的检测：采用高效液相色谱法，按干燥品计算，含总糖量以葡萄糖计，应为85.0％-115％。

检测方法：

取无水葡萄糖对照品约100mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，制成对照品溶液。精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml，分别置25ml量瓶中，加水至2.0ml，再加苯酚溶液(取苯酚300g，铝片0.3g，碳酸氢钠0.15g混合蒸馏，收集182℃馏分，配制成5％水溶液)1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5分钟，置水浴中加热15分钟，取出，迅速冷却至室温，另取水2.0ml同上平行操作作为空白对照，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版第四部通则0401)，在490nm的波长处测定吸收度，以吸收收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程。取本品约50mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液。精密量取供试品溶液0.5ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法自“加水至2.0ml起”，依法测定吸收度，按回归方程计算，即得。

实施例1样品的检测，测定分子量分布：

步骤1取黄芪多糖精密称定，加流动相制成每1ml约含10mg的溶液，作为供试品溶液。

步骤2将供试品溶液μl注入色谱仪，所述色谱仪的色谱条件为：以ShodexAschipak GS-620HQ，串联保护柱：GS-2G 7B，以0.70％硫酸钠溶液为流动相，柱温40℃，流速为每分钟0.6m1，采用示差折光检测器检测。

步骤3计算，根据步骤2所得色谱图，用GPC软件计算回归方程并算出供试品的重均分子量与分子量分布。其中，算出供试品的重均分子量与分子量分布需要用到标准曲线，所述标准曲线制备如下：

取5～6个已知分子量的右旋糖酐对照品，加流动相制成每1ml中各含10mg的溶液作为对照品溶液，其中5～6个已知分子量的右旋糖酐对照品，选用由中国食品药品检定研究院提供的已知分子量的右旋糖酐分子量标准品系列(Dextran，Mp 2 700～300 600)作为分子量测定对照品，注入所述色谱仪，得到色谱图，根据色谱图绘制标准曲线。

步骤3所述用GPC软件计算回归方程并算出供试品的重均分子量与分子量分布，计算公式如下：

分散系数D＝Mw/Mn

式中：Hi：峰高

Mi：分子量

QF：Q因子(使用分子量时为1)

取不同批号的注射用黄芪多糖样品制备供试品溶液，分别进样，记录洗脱峰的保留时间，根据GPC软件绘制的标准曲线及供试品的保留时间，采用GPC专用软件计算各供试品的重均分子量及其分子量分布。重均分子量(Mw)应为48000～140000之间，分布系数D(Mw/Mn)应不得大于23.0。

Claims (4)

1.一种黄芪多糖的制备方法，所述方法，步骤如下：

1)取黄芪饮片加水煎煮，煎液滤过浓缩，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量为60-80％，室温放置；

2)过滤除去上清液，沉淀加乙醇至乙醇含量＞94％，过滤除去上清液，沉淀加水，溶解；

3)溶液加乙醇使含醇量为30-40％，取上清液加乙醇使含醇量为60-80％，放置，过滤除去上清液，沉淀加水溶解、过滤，滤液加水超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留体积为原体积的25％～30％；

4)滤液分别通过阳离子交换层析柱和阴离子交换层析柱，以醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱液经过滤膜滤过，再经过超滤***分级超滤，超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留体积为洗脱液体积的10％～15％；

5)滤液经-30至-70℃冷冻1-10天后室温复融，离心，上清液浓缩至药液糖度为20％～26％，浓缩液加乙醇使含醇量为85-95％，滤去上清液，沉淀用乙醇溶解、滤去上清液，干燥、粉碎、按照比例将不同极性及分子量的中间品进行混合，可得黄芪多糖粉末。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取黄芪饮片420kg，加水煎煮三次，第一次10倍量、第二次8倍量、第三次6倍量，煎液合并后滤过，滤液浓缩至25℃相对密度为1.14～1.18％，浓缩液放置至室温，加乙醇使含醇量为70％，边加边搅拌，室温放置；

2)除去上清液，沉淀加乙醇至上清液乙醇含量＞94％，除去上清液，按沉淀溶解后18％的浓度计算加水量，加水溶解沉淀；

3)溶液加乙醇使含醇量约为35％，搅拌均匀，离心，除去沉淀；上清液再加乙醇使含醇量约为70％，放置，除去上清液，沉淀加水溶解、过滤，滤液加水定容到糖度20～26％，超滤至透过液电导率≤350μs/cm，继续超滤至保留液体积为超滤前溶液加水定容体积的25％～30％。

4)保留液分别通过阳离子和阴离子交换层析柱，以20mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱，洗脱液经过三级串联微孔滤膜滤过，滤液经分级超滤***分两级超滤，分别收集不同极性及分子量的超滤保留液I和超滤保留液II，滤液加水超滤至透过液电导率≤150μs/cm，继续超滤至至保留液体积为洗脱液体积的10％～15％。

5)分级超滤所得的保留液I和II分别经-30至-70℃冷冻1-10天后室温复融，使用高速离心机离心，上清液在温度35-45℃、真空度小于1000mbar条件下用真空簿膜浓缩机浓缩浓缩至药液糖度为20％～26％，浓缩液加乙醇使含醇量为90％，离心，除去上清液，沉淀用乙醇搅拌至完全溶解、离心、除去上清液，反复2-3次，沉淀低温干燥、粉碎，得到两种不同极性及分子量的黄芪多糖粉末中间品I和黄芪多糖粉末II，将两者混合后，得到分子量分布范围在48000～140000、分布系数不大于23.0的黄芪多糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤4)保留液分别通过Pharmacia公司生产的Serharose SP Big Beads和Sepharose Q Big Beads规格为GE-G300×500×500的阳离子、阴离子交换层析柱，滤液经Millipore公司生产的型号为PZB008A系列超滤***分级超滤。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤5)在温度35-45℃、真空度小于1000mbar条件下，上清液用真空簿膜浓缩机浓缩至药液糖度为20％～26％。