CN107722131B - 一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖及其制备方法和应用，属于药用真菌提取分离和医药食品应用开发领域。所述精制多糖主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖按摩尔比1：40～50：4～5.5：1.5～2.0组成的杂多糖，其纯度大于80％，重均分子量160～200KD。所述制备方法包括：热水动态提取、沉降联合粗滤去渣、精滤澄清、超滤膜浓缩去杂、喷雾干燥或醇沉风干。所述制备方法绿色、智能、节能，可解决产业化难题，具有显著规模化优势，制成品符合食品药品质管体系中关于安全性、有效性、可控性、稳定性的要求。所述精制多糖在辅助抗肿瘤方面具有显著功能活性，可用于肿瘤预防及治疗药品的开发，可进行相关领域食品和保健品的开发。

Description

一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖及其 制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖及其制备方法和应用，属于药用真菌提取分离技术和医药食品应用开发领域。

背景技术

灵芝(学名：Ganoderma Lucidum Karst)，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科真菌灵芝的子实体；具有补气安神、止咳平喘、延年益寿的功效；用于眩晕不眠、心悸气短、神经衰弱、虚劳咳喘。

灵芝的生长过程包括：孢子→菌丝体→子实体→释放孢子。灵芝孢子、菌丝体和子实体是其生长的不同阶段，从眼睛可见的灵芝朵(即子实体)开始讲起，当灵芝成熟后，菌伞会向外翻，把孢子向外弹射。随风飘散的灵芝孢子一旦掉落到环境适宜的树木上就会开始萌发，慢慢长出一节一节短短的菌丝。经过一段时间的营养富集，愈长愈密的菌丝在适宜的温度、湿度、光照等条件配合下，逐渐扭结分化形成一颗颗、硬硬扁扁、肉眼可见的生长点，称为灵芝的“原基”，再经过不断生长壮大成熟，最终形成子实体。也就是说，灵芝孢子粉是类似于灵芝子实体的“种子”，灵芝菌丝体通过组织集群化“变身”灵芝子实体。

根据世界卫生组织发表的《全球癌症报告2014》的研究称，2012年全球癌症患者和死亡病例都在不断增长，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分来自中国，中国新增癌症病例高居第一位。预测全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达2400万人。2012年全世界共新增1400万癌症病例，并有820万人死亡，其中，中国新增307万癌症患者，并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。

由此可见，癌症发病率逐年攀升，死亡率高，急需有效的预防和治疗恶性肿瘤的产品。目前主流的治疗癌症手段包括细胞毒类药物和放射治疗，但是这些手段同时也会导致患者身体不断衰竭，并加速了相当比例的死亡案例。为了减轻患者的痛苦和负担，国内外的抗肿瘤新药研究已经由原来的细胞毒类抗肿瘤药物逐渐转向为靶向的非细胞毒类抗肿瘤药物研究。

寻找更加高效低毒的非细胞毒类药物，或协助疗效显著但毒副作用强的治疗手段从而发挥增效减毒的辅助抗肿瘤作用药物，都是今后抗肿瘤药物发展的重要方向。非细胞毒类药物联合细胞毒类药物或放射治疗，将成为癌症治疗的最佳方案。近年来，随着对肿瘤逃避免疫凋亡机制的深入研究，肿瘤的免疫辅助治疗研究也不断取得突破性进展。

灵芝类药材作为天然药物资源，其药理功能表现为可以显著增强免疫***的机能，预防和***，降低血压，预防心血管疾病的产生，刺激胰岛素的分泌，降低血糖浓度，加速血液微循环，提高血液供氧能力，消除体内自由基，抗放射，对抗肝损伤，延长寿命等。灵芝已于2010年成为首批进入美国国家药典的中药之一，已逐渐成为国内外医药工作者心中开发抗肿瘤药物和免疫调节剂的潜在新宠。明确灵芝类药材抗肿瘤作用的药效物质基础，并将其开发成医药产品投向市场，具有广阔的应用前景、显著的社会效益和良好的经济价值。

发明内容

针对现有领域的开发需求和现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖及其规模产业化制备方法和应用。

本发明通过以下方案达到上述目的：

在本发明的第一方面，提供一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖，所述多糖主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖4种单糖按摩尔比1：40～50：4～5.5：1.5～2.0组成的杂多糖；每100g全灵芝孢子粉精制多糖分别含1.4～1.8g甘露醇、60～70g葡萄糖、7～8.5g半乳糖、2～3g岩藻糖；以上述4种主要组成单糖的绝对含量来计算全灵芝孢子粉精制多糖的纯度，达80％以上；重均相对分子量(Mw)为160～200KD，大于10KD分子量的累计切片重量面积占90％以上；全灵芝孢子粉精制多糖主要由4个级分组成，级分1、级分2、级分3、级分4的峰面积占比分别为20～25％、20～25％、30～40％、15～25％，4个级分的重均相对分子量(Mw)分别为620～700KD、90～110KD、14～18KD、4～6KD；紫外-可见分光光度法测定全灵芝孢子粉精制多糖中的蛋白质含量(BCA法)小于8％，多糖(蒽酮-硫酸法)含量大于85％。

在一个优选的实施例中，所述全灵芝孢子粉精制多糖主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖4种单糖按摩尔比1：45.05：4.76：1.74组成的杂多糖；每100g全灵芝孢子粉精制多糖分别含1.63g甘露醇、68.73g葡萄糖、7.79g半乳糖、2.59g岩藻糖；以上述4种主要组成单糖的绝对含量来计算全灵芝孢子粉精制多糖的纯度为80.74％；重均相对分子量(Mw)为179.689KD，大于10KD分子量的累计切片重量面积占99.11％；全灵芝孢子粉精制多糖主要由4个级分组成，级分1、级分2、级分3、级分4的峰面积占比分别为22.21％、23.04％、34.40％、20.35％，4个级分的重均相对分子量(Mw)分别为677.261KD、98.706KD、15.713KD、5KD；紫外-可见分光光度法测定全灵芝孢子粉精制多糖中的蛋白质含量(BCA法)为6.28％，多糖(蒽酮-硫酸法)含量为87.12％。

目前，学术界分离得到的灵芝类单峰多糖已超过100种，这些单峰多糖均来源于一种灵芝类药材，尚不能发挥多种活性多糖的协同增效作用。本发明的全灵芝孢子粉精制多糖，囊括了灵芝整个生长阶段可形成的活性多糖，具有显著辅助抗肿瘤活性和协同增效作用。

进一步地，目前的多种单峰活性多糖，绝大部分仅停留在实验室阶段，它们共同的特点是得率极低、单次处理量极小、成本奇高，所采用的工艺技术从产量设计和市场竞争力上来讲，几无规模产业化的可能。

基于此，在本发明的第二方面，提供一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖的制备方法，包括：

(1)热水提取：取已完成全灵芝孢子油提取的全灵芝孢子粉余渣适量，在多能提取罐中加入余渣重量10～30倍的纯化水，通蒸汽煮沸后，搅拌或启动料液泵逆流强制循环下缓慢加入上述余渣，继续搅拌或间歇启动料液泵强制逆流循环，直到维持微沸时间达到1～2小时后关闭蒸汽；

(2)粗滤分离：提取完成后，静置沉降并冷却，抽出上清液，用过滤精度0.2～2.5μm的板框过滤器或袋式过滤器进行粗滤，可选地，残渣按步骤(1)方法重复提取一次并再次粗滤，合并粗滤液；

(3)精滤澄清并去除超大分子杂质：粗滤液用200～800nm的管式陶瓷微滤膜或过滤精度0.1～0.22μm的微孔折叠式滤芯进行精滤澄清；

(4)膜超滤浓缩并去除小分子水溶性杂质：澄清液用超滤膜(截留分子量为3500～8000D)进行浓缩。

(5)干燥：浓缩液采用醇沉后热风干燥或直接喷雾干燥即得。

进一步优选的，一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖的制备方法，包括：

(1)热水动态提取多糖：取已完成全灵芝孢子油提取的全灵芝孢子粉余渣适量，在多能提取罐中加入余渣重量10～30倍的纯化水，通蒸汽煮沸后，以30～60r/min速度搅拌或启动料液泵逆流强制循环下缓慢加入上述余渣，继续搅拌或每间隔10～20min启动料液泵强制循环5～10min，直到维持微沸时间达到1～2小时后关闭蒸汽；

(2)自然沉降联合粗滤工艺实现渣液分离：提取完成后，静置沉降并冷却至50℃以下，抽出上清液，用过滤精度0.2～2.5μm的板框过滤器或袋式过滤器进行粗滤，可选地，残渣按步骤(1)方法重复提取一次并再次粗滤，合并粗滤液；

(3)精滤工艺实现药液澄清并去除热溶冷析的超大分子杂质：上述粗滤液用200～800nm的管式陶瓷微滤膜或过滤精度0.1～0.22μm的微孔折叠式滤芯进行精滤澄清，管式陶瓷微滤膜的操作工艺参数为温度30～70℃，操作压力0.20～0.80Mpa，膜面流速3～5m/s，透过液通量150～400LMH，残液剩余约20L时，加纯化水约20L稀释，继续澄清操作至残液剩余约20L，可选地，再重复一次稀释澄清操作，以尽可能保证目标多糖全部通过，降低工艺损耗；

(4)膜超滤工艺实现目标多糖的浓缩并去除小分子水溶性杂质：上述澄清液用超滤膜进行浓缩，超滤膜截留分子量为3500～8000D，操作工艺参数为温度30～50℃，操作压力0.15～0.6Mpa，膜面流速2～4.5m/s，透过液通量6～25LMH，浓缩至约40L时，加纯化水约40L稀释，继续浓缩至约40L，可选地，再重复一次稀释浓缩步骤，以最大限度的除尽小分子水溶性杂质，最后用约20L纯化水冲洗超滤膜置换出全部浓缩液，以尽可能的降低工艺损耗；

(5)干燥工艺：浓缩液低速搅拌下缓慢加入原体积3～7倍量的食用酒精进行醇沉，静置过夜，抽去上清液，取出沉淀，少量乙醇洗涤，热风干燥或真空干燥，最后可选地粉碎过筛即得；或者，浓缩液还可以采用喷雾干燥法一步完成干燥得到。

本发明提供的上述制备方法，采用的原料来源于发明专利CN 100593410C中已完成全灵芝孢子油超临界二氧化碳提取的全灵芝孢子粉余渣，该全灵芝孢子粉是由灵芝子实体和灵芝孢子粉按一定比例混合灭菌后作为培养基，接种“活性多糖富集型”专属灵芝菌种作为“种源”，并提供有利于菌丝体生长的营养条件和环境因素，让其形成茂密的、富含活性多糖的灵芝菌丝体。该全灵芝孢子粉集灵芝菌丝体、灵芝子实体、灵芝孢子粉于一体，囊括了灵芝整个生长阶段可形成的活性多糖，以其作为原料经提取、分离、纯化制得的混合活性多糖能克服单一品种多糖的应用局限性，有利于发挥出中国传统药物多组分、多靶点、多层次、多途径的综合药理作用特点，体现了中医诊疗的整体观特色。

发明人在对制备方法进行研究过程发现，本发明的制备方法的提取原料中存在的灵芝孢子粉，颗粒极细，约5～7μm，采用现有技术的提取方法时，在提取过程中极容易自然沉降形成团块，影响得率；因此，本发明技术方案采用动态提取，能有效克服上述生产难题。此外，极细的孢子粉还对过滤介质和过滤技术的选择应用，要求极高；发明人研究发现，当选择常规的过滤介质或者应用单一的澄清技术时，孢子粉非常容易穿透过滤介质而进入终产品中，影响成品品质；同时如果采用末端过滤技术，孢子粉极容易堵塞过滤介质，导致无法正常生产。针对这一难题，发明人在制备方法中采用自然沉降、粗滤、精滤的三步依次澄清工艺，能从大到小基本脱尽原料所有的碎片(200倍显微镜下检视，澄清液中几无细胞碎片存在)；并且粗滤和精滤工艺都尽可能采用了错流过滤方式，能克服孢子粉堵塞过滤介质造成无法正常生产的这一产业化难题。

进一步地，本发明的制备方法的提取原料的来源，是由一定比例的灵芝孢子粉和子实体的混合物经灭菌得到培养基，并接种上灵芝菌种，提供适宜的环境让其产生茂密的灵芝菌丝体；所以，提物原料中含有大量的正处于生长旺盛期的菌丝体，而这些处于旺盛期的菌丝体中存在较多的蛋白质、DNA、RNA、果胶、纤维素、水不溶性半纤维素等大分子非活性物质，它们的共同特点是能溶于热水，但温度降低后即析出，以胶体形态悬浮在提取液中，造成提取液浑浊，久置沉淀，成品复溶性较差，并且很难通过常规工艺去除。针对这一问题，本发明制备方法中特意选用了高精度的过滤介质，并通过调整相关参数至较佳的范围，能达到除尽这些非活性或者低活性大分子杂质的目的，获得很好的澄清效果(浊度仪检测，读数低于0.5号标准浊度液)。

此外，本发明制备方法的原料全灵芝在培养过程中，引入了有利于菌丝体生长的营养素和矿物质，属于非活性物质，本发明制备方法通过采用膜透析的办法，边除杂边浓缩，显著简化了工艺流程，提高了生产效率，并且所获终产品的重金属指标、灰分指标、杂质指标都有显著的改善。

本发明的制备方法，采用陶瓷微滤膜或精密微孔折叠滤芯、有机超滤膜、酒精沉淀三步除杂工艺，既能去除热溶冷析的大分子杂质，又能去除小分子的水溶性杂质，同时也能通过醇沉工艺去除醇水两溶的色素、多肽、遗传物质等杂质；并且澄清与除杂、浓缩与除杂、醇沉分离与除杂同步进行；既能制得80％以上绝对纯度的全灵芝孢子粉精制多糖，又能节约生产时间，提高生产效率。

同时，本发明的制备方法，采用的澄清、去杂、浓缩工艺均采用膜技术方案，属于低温生产技术，能确保活性多糖的三维立体结构不会破坏，进而最大限度的保留其药理活性，同时也显著降低了能耗。

在本发明的第三方面，本发明提供一种全灵芝孢子粉精制多糖在辅助抗肿瘤方面的用途。

在本发明的第四方面，本发明提供一种全灵芝孢子粉精制多糖在制备辅助抗肿瘤药品、食品、保健食品方面的用途。

所述全灵芝孢子粉精制多糖在辅助抗肿瘤方面，例如辅助紫杉醇的抗肿瘤活性方面，具有显著的效果；并且，还表现出特异性逆转肿瘤生长及对于化疗导致的免疫***和血液***主要生化指标值的异常方面的治疗和/或调整作用。例如，对于化疗导致的免疫***和血液***主要生化指标值异常包括但不限于脾脏应激变大、白细胞明显增加、外周血淋巴细胞亚群分布改变、外周血血红细胞数量下降、外周血血红蛋白浓度降低、外周血血小板减少等。

上述的全灵芝孢子粉精制多糖在辅助抗肿瘤方面及其他方面的效果在包括恶性乳腺癌细胞(4T-1)的BALB/c雌性小鼠等试验中得到证实，以正常小鼠灌胃纯化水作为正常组，以荷瘤小鼠灌胃纯化水作为模型组，以荷瘤小鼠单独紫杉醇给药作为单独紫杉醇化疗组，以经本发明技术方案制得的全灵芝孢子粉精制多糖联合紫杉醇给药作为联合治疗组，进行辅助抗肿瘤功能活性评价。最终结果显示，全灵芝孢子粉精制多糖联合紫杉醇治疗组在整个试验周期内均展现出显著的抑制恶性乳腺癌肿瘤生长的功能，联合治疗组的疗效显著强于单独紫杉醇化疗组，且能特异性逆转肿瘤生长及紫杉醇单独化疗导致的免疫***和血液***主要生化检查指标值的异常，如脾脏应激变大、白细胞明显增加、外周血淋巴细胞亚群分布改变、外周血血红细胞数量下降、外周血血红蛋白浓度降低、外周血血小板减少等。

因此，在有效剂量下的本发明的全灵芝孢子粉精制多糖单独使用，或与其他活性组分和/或与其药学上可接受的辅料、载体形成的复合物结合使用，均可应用于肿瘤预防及治疗药品的开发，也可应用于相关领域食品和保健品的开发等领域。

本发明中所述的有效剂量包括但不限于500mg/Kg靶标生物以上，靶标生物包括但不限于哺乳动物例如人。

和现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的制备方法全程只使用酒精和水，不会带入新的杂质和有毒有害物质，无有机试剂残留风险，保证了产品的天然品质，产品绿色，且对环境友好。

(2)本发明的制备方法是从大生产实际需要出发进行设计，经多次中试规模以上实际生产验证，全程均能实现管道化、自动化、智能化操作，具有工艺简单可行、适合规模产业化、整体运行成本低的优点，产品得率达1.8％以上。

(3)本发明方法制备得到的多糖，既采用全面而严格的多糖类物质质量控制标准来监控成品质量，还通过荷瘤动物模型进行辅助抗肿瘤功能活性评价证明其效果，得到的精制多糖具有安全性、有效性、可控性、稳定性的特点。

综上所述，本发明所述的制备方法，既符合国家产业政策关于绿色、智能、节能的要求，同时又解决了目前生产实际存在的产业化难题，具有显著的规模产业化优势，且所制得的成品符合食品药品质量管理体系中关于安全性、有效性、可控性、稳定性的要求。

附图说明

图1为实施例4中GPC分子量普适校正曲线。

图2为实施例4中全灵芝孢子粉精制多糖的RID图谱。

图3为实施例4中全灵芝孢子粉精制多糖分子量分布图。

图4为实施例4中全灵芝孢子粉精制多糖分子量累积重量分布曲线。

图5为实施例5中十二种混合单糖对照品的衍生化物紫外色谱图。

图6为实施例5中全灵芝孢子粉精制多糖的衍生化物紫外色谱图。

图7为实施例6的辅助抗肿瘤功能活性评价技术路线图。

图8为实施例6中的各组肿瘤对比照片。

图9为实施例6中实验动物荷瘤体积变化曲线。

图10为实施例6中各组的肿瘤重量图。

图11为实施例6中各组的肿瘤指数图。

图12为实施例6中各组的肿瘤体积图。

图13为实施例6中各组的脾脏指数图。

图14为实施例6中各组的CD19％图。

图15为实施例6中各组的CD3％图。

图16为实施例6中各组的CD4％图。

图17为实施例6中各组的CD8％图。

图18为实施例6中各组的CD4/CD8图。

图19为实施例6中各组的WBC(白细胞)水平图。

图20为实施例6中各组的RBC(红细胞)水平图。

图21为实施例6中各组的HGB(血红蛋白)水平图。

图22为实施例6中各组的PLT(血小板)水平图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

在本发明中，所述数据的误差在10％以内是可以接受的。

如无特别说明，本发明采用“BCA法蛋白浓度测定试剂盒(增强型)”测定蛋白质的含量。

如无特别说明，本发明采用蒽酮-硫酸法，按“《中国药典》2015年版一部灵芝项下【含量测定】多糖”中的步骤检测其粗多糖含量；以梯度分子量的9种右旋糖酐窄标标品作为对照，采用双凝胶柱串联的HPGPC法(示差折光检测器)检测其平均分子量和分子量分布；以12种单糖作为对照品，采用PMP-HPLC衍生化法测定其单糖组成及绝对纯度。

实施例1：

采用发明专利CN 100593410C中实施例2中已完成全灵芝孢子油提取的全灵芝孢子粉余渣40kg备用，多能提取罐中加入600L纯化水，通蒸汽煮沸后，60r/min搅拌下缓慢加入上述余渣，继续搅拌并维持微沸1h，静置沉降并冷却至50℃以下，抽出上清液，板框过滤，残渣按上法重复提取一次，合并粗滤液。粗滤液用江苏凯米膜科技股份有限公司的500nm管式陶瓷微滤膜(CX-30-1016-4-19型，4支并联，膜面积0.952m²)进行澄清，操作温度50℃，操作压力0.35Mpa，膜面流速4.5m/s，透过液通量360LMH，残液剩余20L时，加纯化水20L稀释，继续澄清操作至残液剩余20L，再重复一次。澄清液用美国GE公司生产的PT4040C2016型有机超滤膜浓缩(截留分子量为5KD、膜面积8.3m²)，操作温度40℃，操作压力0.5Mpa，膜面流速3.5m/s，透过液通量15LMH，浓缩至40L，加纯化水40L稀释，继续浓缩至40L，再重复一次，最后用20L纯化水冲洗超滤膜置换出全部浓缩液。浓缩液，喷雾干燥，粉碎，过筛，即得。

所获全灵芝孢子粉精制多糖为灰色粉末，收率1.99％。

实施例2：

采用发明专利CN 100593410C中实施例2中已完成全灵芝孢子油提取的全灵芝孢子粉余渣30kg备用，多功能提取罐中加入700L纯化水，通蒸汽煮沸后，启动料液泵逆流强制循环下缓慢加入上述余渣，每间隔10min启动料液泵强制循环5min，维持微沸1h后，静置沉降并冷却至50℃以下，抽出上清液，用过滤精度0.5μm的袋式过滤器粗滤，残渣按上法重复提取一次，合并粗滤液。粗滤液用过滤精度0.1μm的pp微孔折叠式滤芯精滤。精滤液用美国GE公司生产的PT4040C2016型有机超滤膜浓缩(截留分子量为5KD、膜面积8.3m²)，操作温度45℃，操作压力0.45Mpa，膜面流速4.0m/s，透过液通量17LMH，浓缩至40L，加纯化水40L稀释，继续浓缩至40L，再重复一次，最后用20L纯化水冲洗超滤膜置换出全部浓缩液。浓缩液搅拌下缓慢加入原体积5倍量的食用酒精，密闭，静置过夜，分离沉淀，热风干燥，粉碎，过筛，即得。

所获全灵芝孢子粉精制多糖为灰白色粉末，收率1.83％。

实施例3：

紫外-可见分光光度法测定全灵芝孢子粉精制多糖的蛋白质及多糖含量

蛋白质含量测定：采用BCA法测定，BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(EnhancedBCA Protein Assay Kit)购置于上海碧云天生物技术有限公司，按详细说明书步骤检测即可。

多糖含量测定：采用蒽酮-硫酸法测定，按“《中国药典》2015年版一部灵芝项下【含量测定】多糖”中的步骤检测即可。

将实施例1制备得到的全灵芝孢子粉精制多糖中的蛋白质含量和多糖含量分别按照上述方法进行测定，得到全灵芝孢子粉精制多糖的蛋白质含量为6.28％，多糖含量为87.12％。

实施例4：

全灵芝孢子粉精制多糖的分子量及分子量分布测定

对照品溶液的制备：取干燥至恒重的sigma系列右旋糖酐及无水葡萄糖对照品约50mg，精密称定，分别加0.71％Na₂SO₄水溶液溶解并定容至5mL量瓶中，密塞，摇匀，即得。

供试品溶液的制备：取实施例制备得到的全灵芝孢子粉精制多糖约100mg，精密称定，用少量50℃～60℃的0.71％Na₂SO₄水溶液溶解并转移至10mL量瓶中，放至室温(25℃)，0.71％Na₂SO₄水溶液定容至刻度，密塞摇匀，取上述溶液约5mL，25℃下4000r/min离心10min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，收集续滤液约3mL备用。

色谱条件：安捷伦1200高效液相***，示差折光检测器参数设置为控制模拟输出、光学部件温度35℃、零点补偿5％、衰减500*10³、分析前自动归0、正极性；两根TSK-GEL(7.8*300mm,10μ)色谱柱串联，串联顺序为G5000PWXL→G4000PWXL，柱温35℃；以0.71％Na₂SO₄水溶液(预先超声脱气)作流动相等度洗脱，流速0.5mL/min；进样量20μL，分析时间为1h。

数据处理：将各对照品溶液和全灵芝孢子粉精制多糖溶液的原始数据以AIA格式导入到上海千谱GPC凝胶专用处理软件中，进行分析即可。

得到的结果如表1至表2，图1至图4所示。

表1 右旋糖酐对照品的分子量与色谱中的峰顶时间

表2 全灵芝孢子粉精制多糖的分子量及分布情况

从表1至表2，和图1至图4的结果可以看出，实施例1制备得到的全灵芝孢子粉精制多糖的重均相对分子量(Mw)为179.689KD，大于10KD分子量的累计切片重量面积占99.11％；全灵芝孢子粉精制多糖主要由4个级分组成，级分1、级分2、级分3、级分4的峰面积占比分别为22.21％、23.04％、34.40％、20.35％，重均相对分子量(Mw)分别为677.261KD、98.706KD、15.713KD、5KD。

实施例5：

PMP-HPLC衍生化法测定全灵芝孢子粉精制多糖的纯度及单糖组成

对照品储备溶液的制备：取甘露糖、氨基葡萄糖盐酸盐、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、葡萄糖、半乳糖、木糖、***糖、岩藻糖等单糖对照品约25mg，精密称定，用去离子水溶解并定容至25mL量瓶中，密塞，摇匀，制得混合对照品储备溶液，备用。

供试品储备溶液的制备：取实施例1制备得到的全灵芝孢子粉精制多糖约100mg，精密称定，用少量50℃～60℃的去离子水溶解并转移至10mL量瓶中，放至室温(25℃)，去离子水定容至刻度，密塞，摇匀，取上述溶液约5mL，25℃下4000r/min离心10min，取上清液过0.45μm微孔滤膜，收集续滤液约3mL，制得10.005mg/mL的供试品储备溶液，备用。

衍生化反应试剂的配置：新鲜配置0.5mol/L PMP试剂的甲醇溶液若干，摇匀，密塞遮光低温保存；分别配置4mol/L的三氟乙酸水溶液，0.6mol/L的氢氧化钠水溶液，0.6mol/L的盐酸水溶液，密塞，摇匀，备用。

对照品衍生化溶液的制备：精密吸取混合单糖对照品溶液2.000mL入15mL离心管中，加2.000mL 0.6mol/L的氢氧化钠水溶液，再加4.000mL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液，闭盖，封口膜外封加固，涡旋充分混匀，入70℃水浴保温30min，迅速取出，冰浴30s终止反应，开盖，加入2.000mL 0.6mol/L的盐酸水溶液，混匀后转移到10mL量瓶中，用去离子水定容至刻度，密盖，充分混匀，精密吸取7.000mL入15mL离心管中，移液管吸取7mL氯仿冲入衍生液中，移出上层水液至另一15mL离心管中，继续用氯仿同样方式冲洗2次，吸取上层水液，室温下12000r/min离心10min，取上清液适量，按母液浓度的3/4，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64进行稀释，制成8个梯度的衍生化对照品溶液，即得。

供试品衍生化溶液的制备：精密移取供试品储备溶液0.200mL至5mL安培瓶中，加入0.200mL 4mol/L的三氟乙酸溶液，安培瓶充满氮气，迅速用酒精喷灯封管，置110℃烘箱中水解4h，取出，放至室温，正立状态下敲去安瓿瓶瓶颈；加入0.5mL甲醇，60℃以下真空减压干燥或干式氮吹仪吹干，反复处理三次，至水解液干燥完全；残渣分别精密加入0.200mL去离子水，0.200mL0.6mol/L的氢氧化钠水溶液，加0.400mL0.5mol/L的PMP甲醇溶液，低频率低强度超声30s并用移液枪吹打瓶壁残渣数次，使其溶解完全并充分混匀，精密吸取0.700mL至5mL离心管中，闭盖，封口膜外封加固，入70℃水浴保温30min，迅速取出，冰浴30s终止反应，开盖，加入0.200mL0.6mol/L的盐酸水溶液，再加去离子水定容至2mL，充分混匀后，用移液枪吸取氯仿每次2毫升，冲入衍生液中，移出上层水液至另一5mL离心管中，继续用氯仿同样方式冲洗2次，吸取上层水液，室温下12000r/min离心10min，取上清液，即得。

色谱条件：安捷伦1200高效液相色谱***，WatersSymmetryShieldRP18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，柱温30℃，以18％乙腈-82％0.1mol/L的醋酸铵水溶液作为流动相等度洗脱，流速1mL/min，检测波长250nm，检测时间50min，进样量20μL。

数据处理：分别绘制单糖的标准曲线，计算实施例1的全灵芝孢子粉精制多糖中12种单糖的总含量；针对精制多糖中占比较大的单糖，分别求出其物质的量浓度，将目标单糖中物质的量浓度最小的单糖作为基准参数1，其他单糖的物质的量浓度与其进行折算，求得倍数即得。

实验结果如表3至表6，图5至图6所示。

表3 十二种混合单糖对照品溶液的配置浓度与衍生化物色谱出峰时间

表4 十二种混合单糖对照品的配置浓度与对应峰面积

表5 十二种混合单糖对照品的标准曲线

表6 全灵芝孢子粉精制多糖的纯度和单糖组成

注：仅计算含量不低于0.3％的单糖

根据上述实验结果，可以得知，按照本发明申请实施例1的方法所制备的全灵芝孢子粉精制多糖是主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖4种单糖组成的杂多糖，其摩尔比为1.00:45.05:4.76:1.74，每100g全灵芝孢子粉精制多糖分别含1.63g甘露醇、68.73g葡萄糖、7.79g半乳糖、2.59g岩藻糖，以主要单糖的绝对含量来计算全灵芝孢子粉精制多糖的纯度为80.74％。

实施例6：

全灵芝孢子粉精制多糖辅助抗肿瘤功能活性评价

1 实验操作

1.1 试剂：阳性药物为海南全星制药有限公司生产的紫杉醇，规格为100mg/16.7mL；全灵芝孢子粉精制多糖按本发明实施例1制备；怡宝纯化水。

1.2 肿瘤细胞及实验动物：小鼠恶性乳腺癌细胞(4T-1)，来源：中国科学院细胞库。SPF级BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，体重14-16g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002，动物合格证明编号：No.44007200042242。

1.3 乳腺癌皮下移植模型的制备方法：4T1细胞用含10％胎牛血清、1％青链霉素的RPMI1640培养基，于5％CO₂培养箱中37℃培养，以0.25％的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化细胞、传代，取对数生长期的细胞用于实验。收集细胞后，用1640培养液洗洛2次，台盼蓝实验证实细胞活力>95％，用1640培养液调整活细胞浓度为2*l0⁵/mL，备用。荷瘤组动物接种部位消毒备皮，用1mL注射器吸取4T1细胞悬液0.1mL(含有2*10⁴个细胞)接种于小鼠腋下皮下，当肿瘤大小2mm*2mm时，判断为模型建立成功。空白对照组腋下皮下注射0.1mL完全培养基。

1.4 动物分组：检疫期结束后，按体重随机分为正常组(8只)和荷瘤组(24只)；荷瘤组接种4T1乳腺癌细胞，建立小鼠乳腺癌模型；建模24h后，荷瘤组动物按体重随机区组法分为：模型组对照组、紫杉醇组、全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组，每组8只。

1.5 给药方案：造模24h后，荷瘤组分组开始给药，连续20天。全灵芝孢子粉精制多糖、纯化水均灌胃给药，给药体积为0.2mL/10g，每天1次；紫杉醇腹腔注射给药，给药体积为0.1mL/10g，每周1次。给药方案详见表7、表8。

表7 各组别剂量编号一览表

表8 给药方案一览表

2 观察指标

2.1 荷瘤体积测量：从给药当日开始关注瘤块的生长，分别给药第8、10、12、14、16、18、20天使用游标卡尺测量肿瘤块体积。长＝a，为瘤体最长方向的长度，宽＝b，最长方向的垂直面最短长度；计算肿瘤体积(tumor volume,TV)＝1/2×a×b²，绘制荷瘤体积变化曲线。

2.2 血液：停药24h后，动物取材测定指标。首先采集血样：(1)眼眶取血(约6滴)，肝素钠抗凝，流式细胞仪检测外周血淋巴细胞群。(2)眼眶取血(约6滴)，4％EDTA抗凝，样品送检，测血常规。

2.3 瘤块与脾脏：(1)眼眶取血后，处死小鼠后剥离瘤体，仔细去除瘤体表面的增生血管、被膜等***后称重。(2)继续取脾脏，除去表面附着组织后称重。(3)拍照：所有动物瘤块取下后，按组别顺序排好，附上相应标签，背景放置一把直尺，拍照，作为原始记录保存。

3 数据处理

所有资料以均数加减标准差

表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，组间均数两两比较，方差齐时采用LSD法；方差不齐时采用Dunnett’sT3法。由SPSS软件完成，α＝0.05。

整个辅助抗肿瘤功能活性评价实验的技术路线，详见图7。

4 实验结果

4.1 动物实验结束后，解剖荷瘤小鼠，剥离肿瘤组织，其各分组肿瘤组织照片见图8所示，全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组能显著抑制肿瘤的生长，其疗效强于单用紫杉醇组。

4.2 实验动物荷瘤体积变化如表9、图9所示，模型组动物肿瘤体积快速增长，而单用紫杉醇组和全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组动物肿瘤体积增长趋势较模型组缓慢；与模型组比较，给药第14天、第16天直至第20天，全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组的肿瘤体积均显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与单用紫杉醇组比较，给药第14天、第16天直至第20天，全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组的肿瘤体积均明显降低，其中第14天的差异具有统计学意义(P＜0.01)。

表9 实验动物荷瘤体积变化(n＝8)

注：与模型组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与紫杉醇组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。

4.3 实验动物荷瘤重量及相关脏器指数如表10、图10～13所示，与模型组比较，全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组的肿瘤重量、肿瘤指数、肿瘤体积、批脾脏指数均显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与单用紫杉醇组比较，全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组的肿瘤重量、肿瘤指数、肿瘤体积、脾脏指数均明显下降，其中脾脏指数的差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表10 实验动物荷瘤重量及相关脏器指数

注：与空白组比较，△p＜0.05，△△p＜0.01；与模型组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与紫杉醇组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。

4.4 外周血淋巴细胞亚群流式分析结果如表11、图14～18所示，全灵芝孢子粉多糖联用紫杉醇组能显著逆转单用紫杉醇组造成的外周血淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8比例降低的趋势，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

表11 实验动物外周血淋巴细胞亚群分布情况(亚群在CD中的占

注：与空白组比较，△p＜0.05，△△p＜0.01；与模型组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与紫杉醇组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。

4.5 血常规检测结果如表12、图19～22所示，与模型组和单用紫杉醇组比较，全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组能明显降低外周血白细胞水平，使其接近正常值，其中与模型组的差异具有统计学意义(P＜0.01)；同时与模型组和单用紫杉醇组比较，全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组能明显升高血小板水平，其中与模型组的差异具有统计学意义(P＜0.01)；另外与模型组和单用紫杉醇组比较，全灵芝孢子粉精制多糖联用紫杉醇组还能轻微提升外周血的血红细胞水平和血红蛋白水平。

表12 实验动物血常规检测结果

注：与空白组比较，△p＜0.05，△△p＜0.01；与模型组比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与紫杉醇组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。

5 结论

全灵芝孢子粉精制多糖联合紫杉醇治疗组在整个试验周期内均展现出显著的抑制恶性乳腺癌肿瘤生长的功能，联合治疗组的疗效显著强于单独紫杉醇化疗组，且能特异性逆转肿瘤生长及紫杉醇单独化疗导致的免疫***和血液***主要生化检查指标值的异常，此活性多糖可应用于肿瘤预防及治疗药品的开发，也可应用于相关领域食品和保健品的开发。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种具有抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖组合物，其特征在于，所述组合物由质量比为500:10的全灵芝孢子粉精制多糖和紫杉醇组成，所述全灵芝孢子粉精制多糖主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖4种单糖按摩尔比1：40～50：4～5 .5：1 .5～2 .0组成的杂多糖；以上述4种主要组成单糖的绝对含量来计算全灵芝孢子粉精制多糖的纯度，达80％以上；重均相对分子量为160～200KD，大于10KD分子量的累计切片重量面积占90％以上；全灵芝孢子粉精制多糖主要由4个级分组成，级分1、级分2、级分3、级分4的峰面积占比分别为20～25％、20～25％、30～40％、15～25％，4个级分的重均相对分子量分别为620～700KD、90～110KD、14～18KD、4～6KD；BCA法测定全灵芝孢子粉精制多糖中的蛋白质含量小于8％，蒽酮-硫酸法测定的多糖含量大于85％；

所述全灵芝孢子粉精制多糖的提取方法包括以下步骤：

(1)热水提取：取已完成全灵芝孢子油提取的全灵芝孢子粉余渣适量，在多功能提取罐中加入余渣重量10～30倍的纯化水，通蒸汽煮沸后，搅拌或启动料液泵逆流强制循环下缓慢加入上述余渣，继续搅拌或间歇启动料液泵强制逆流循环，直到维持微沸时间达到1～2小时后关闭蒸汽；

(2)粗滤分离：提取完成后，静置沉降并冷却，抽出上清液，用过滤精度0 .2～2 .5μm的板框过滤器或袋式过滤器进行粗滤，残渣按步骤(1)方法重复提取一次并再次粗滤，合并粗滤液；

(3)精滤澄清并去除超大分子杂质：粗滤液用200～800nm的管式陶瓷微滤膜或过滤精度0 .1～0 .22μm的微孔折叠式滤芯进行精滤澄清；

(4)膜超滤浓缩并去除小分子水溶性杂质：澄清液用截留分子量为3500～8000D的超滤膜进行浓缩；

(5)干燥：浓缩液采用醇沉后热风干燥或直接喷雾干燥，即得全灵芝孢子粉精制多糖。

2.根据权利要求1所述的全灵芝孢子粉精制多糖组合物，其特征在于，所述全灵芝孢子粉精制多糖主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖4种单糖按摩尔比1：42 .05：4 .76：1.74组成的杂多糖；以上述4种主要组成单糖的绝对含量来计算全灵芝孢子粉精制多糖的纯度为80 .74％；重均相对分子量为179 .689KD，大于10KD分子量的累计切片重量面积占99.11％；全灵芝孢子粉精制多糖主要由4个级分组成，级分1、级分2、级分3、级分4的峰面积占比分别为22 .21％、23 .04％、34 .40％、20 .35％，4个级分的重均相对分子量分别为677.261KD、98 .706KD、15 .713KD、5KD；BCA法测定全灵芝孢子粉精制多糖中的蛋白质含量为6.28％，蒽酮-硫酸法测定的多糖含量为87 .12％。

3.一种具有抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖组合物的制备方法，其特征在于，所述组合物由质量比为500:10的全灵芝孢子粉精制多糖和紫杉醇组成，所述全灵芝孢子粉精制多糖的制备方法包括以下步骤：

(1)热水动态提取多糖：取已完成全灵芝孢子油提取的全灵芝孢子粉余渣适量，在多功能提取罐中加入余渣重量10～30倍的纯化水，通蒸汽煮沸后，以30～60r/min速度搅拌或启动料液泵逆流强制循环下缓慢加入上述余渣，继续搅拌或每间隔10～20min启动料液泵强制循环5～10min，直到维持微沸时间达到1～2小时后关闭蒸汽；

(2)自然沉降联合粗滤工艺实现渣液分离：提取完成后，静置沉降并冷却至50℃以下，抽出上清液，用过滤精度0 .2～2 .5μm的板框过滤器或袋式过滤器进行粗滤，残渣按步骤(1)方法重复提取一次并再次粗滤，合并粗滤液；

(3)精滤工艺实现药液澄清并去除热溶冷析的超大分子杂质：上述粗滤液用200～800nm的管式陶瓷微滤膜或过滤精度0 .1～0 .22μm的微孔折叠式滤芯进行精滤澄清，管式陶瓷微滤膜的操作工艺参数为温度30～70℃，操作压力0 .20～0 .80MPa，膜面流速3～5m/s，透过液通量150～400LMH，残液剩余20L时，加纯化水20L稀释，继续澄清操作至残液剩余20L，再重复一次稀释澄清操作，以尽可能保证目标多糖全部通过，降低工艺损耗；

(4)膜超滤工艺实现目标多糖的浓缩并去除小分子水溶性杂质：上述澄清液用超滤膜进行浓缩，超滤膜截留分子量为3500～8000D，操作工艺参数为温度30～50℃，操作压力0.15～0 .6MPa，膜面流速2～4 .5m/s，透过液通量6～25LMH，浓缩至40L时，加纯化水40L稀释，继续浓缩至40L，再重复一次稀释浓缩步骤，以最大限度的除尽小分子水溶性杂质，最后用20L纯化水冲洗超滤膜置换出全部浓缩液，以尽可能的降低工艺损耗；

(5)干燥工艺：浓缩液低速搅拌下缓慢加入原体积3～7倍量的食用酒精进行醇沉，静置过夜，抽去上清液，取出沉淀，少量乙醇洗涤，热风干燥或真空干燥，最后粉碎过筛即得全灵芝孢子粉精制多糖；或者，浓缩液采用喷雾干燥法一步完成干燥得到全灵芝孢子粉精制多糖。

4.根据权利要求3所述方法制备得到的全灵芝孢子粉精制多糖组合物。

5.根据权利要求1至2或4中任一所述的全灵芝孢子粉精制多糖组合物在制备用于肿瘤预防及治疗的抗肿瘤药品、食品方面的用途。

6.根据权利要求5所述的全灵芝孢子粉精制多糖组合物在制备用于肿瘤预防及治疗的抗肿瘤药品、食品方面的用途，其特征在于，还包含药学上可接受的辅料或载体。

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