CN113880960B - 一种抗缺氧活性铁皮石斛多糖及其蒸汽***制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗缺氧活性铁皮石斛多糖及其蒸汽***制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明将铁皮石斛原料经过特定参数蒸汽***处理后，经过水提醇沉提取，去除蛋白以及小分子杂质后，用DEAE‑Cellulose阴离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析进一步纯化，收集的小分子量(6.2～8.4kDa)多糖。上述方法使铁皮石斛中大分子多糖在蒸汽***作用下降解为小分子多糖，并改变了多糖的化学基团及单糖化学组成，提高抗缺氧活性的多糖组分中糖醛酸含量，从而使制备的多糖具有显著提高机体的急性缺氧耐受力的活性，可用于制备抗急性缺氧损伤的药品或功能性食品。

Description

一种抗缺氧活性铁皮石斛多糖及其蒸汽***制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗缺氧活性铁皮石斛多糖及其蒸汽***制备方法和应用。

背景技术

急性高原病(acute mountain sickness，AMS)是指从平原进入高原或由高原进入更高海拔地区时，在数小时至数天内发生的各种临床综合征，包括急性轻型高原病、高原肺水肿和高原脑水肿，高原急性低氧是造成AMS的主要原因。

我国是世界上高原面积最大，高原居住人口最多的国家。这些地区不仅具有丰富的能源、矿藏、药材、畜牧业资源，也是重要的国防前哨和少数民族聚居地。随着西部大开发战略的实施和青藏铁路的开通，高原旅游业日益兴旺，据西藏自治区***公布的数据，2019年全区接待国内外旅游者突破4000万人次，比上年同期增长19.1％，进藏游客普遍面临高原代偿问题。同时，在急进高原过程中，AMS高发也是造成部队大量非战斗性减员、严重影响战斗力的主要因素。此外，在近些年的高原自然灾害如玉树地震、舟曲特大泥石流等的救援行动中，由于缺乏对AMS防治知识的认识，加上劳累、感冒、寒冷等因素，使救援人员中出现大量AMS患者，成为救灾初期面临的最大困难之一。AMS已经成为我国高原地区日趋严峻的公共卫生问题，对高原地区经济、医疗、健康及各项事业的发展带来重大负担。所以，积极采取措施预防和治疗机体急性缺氧造成的损伤对保证人体健康具有重要意义。

目前，抗急性缺氧药物主要分为化学药和中成药，化学药如乙酰唑胺、***、氨磷汀、尼尔雌醇等，虽具有较好的抗缺氧作用，但由于其副作用明显而受到限制；抗缺氧的中成药包括人参、红景天、冬虫夏草等，虽可有效提高机体的低氧耐受力，但因资源有限且价格昂贵，也难以大范围推广使用。所以，亟待开发功效确凿、高效经济的抗急性缺氧损伤的药品或功能性食品。

铁皮石斛是兰科植物的新鲜或干燥茎，居“中华九大仙草”之首，已被《中国药典》列为“可用于保健食品开发”的新资源，也被国家卫健委列入药食同源物质管理试点名单。铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热、抗疲劳、祛痰镇咳等功效。多糖作为铁皮石斛的主要活性成分，随着铁皮石斛功效研究的广泛开展，铁皮石斛多糖药理学活性及作用机制研究成果迅速增加，然而，目前尚未见关于铁皮石斛多糖抗缺氧方面的报道，也未有关于如何提取其抗缺氧多糖方面的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗缺氧活性铁皮石斛多糖及其蒸汽***制备方法和应用。

本发明提供了一种蒸汽***制备抗缺氧活性铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：

1)将铁皮石斛经过蒸汽***处理，得到预处理的铁皮石斛；

蒸汽***处理的条件如下：

***腔装料系数为0.7～0.9，***蒸汽压力0.8～1.5MPa，维压时间60～180s；

2)将步骤1)中所述预处理的铁皮石斛细化后，用水回流提取，所得浸提液用乙醇溶液沉淀，收集沉淀物得到粗多糖；

3)将步骤2)中粗多糖溶于水后去除蛋白，用分子截流量2000Da的透析袋透析，浓缩透析袋内多糖溶液；

4)将步骤3)中浓缩后的多糖溶液复溶后上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用0～2mol/L的NaCl溶液连续线性洗脱，检测每管洗脱液中多糖含量，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线上出峰情况合并流份，收集重均分子量为6.2～8.4kDa的多糖为抗缺氧活性铁皮石斛多糖。

优选的，所述蒸汽***处理的条件如下：

***腔装料系数为0.78，***蒸汽压力1.0～1.3MPa，维压时间80～160s。

优选的，步骤2)中回流提取的温度为70～100℃，回流提取的时间为2～3h，回流提取的次数为2～3次；

乙醇溶液的质量百分含量为70％～100％。

优选的，步骤3)中去除蛋白的方法是用Sevage试剂与所得粗多糖溶液涡旋混合，去除蛋白沉淀；

所述Sevage试剂是将氯仿和正丁醇按照(3.5～4.5)：1的体积比混合制备得到；

所得粗多糖溶液和Sevage试剂的体积比为1:(0.5～2)，涡旋混合的时间为5～10min。

优选的，步骤4)中洗脱的流速为0.5～0.8mL/min。

优选的，步骤4)中所述合并流份后，还包括对合并的各流份纯化；

所述纯化的方法各流份分别采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析，用去离子水洗脱，得到精制多糖。

本发明提供了所述方法制备的抗缺氧活性铁皮石斛多糖，包含甘露糖、葡萄糖、***糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，且总糖醛酸的含量>3wt％；多糖纯度为90wt％～95wt％，

所述甘露糖、葡萄糖、***糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为(5.5～5.7):(2.1～2.15):(1.8～1.9):(0.26～0.28):(0.08～0.1)。

本发明提供了所述抗缺氧活性铁皮石斛多糖在制备抗急性缺氧损伤的药物中的应用。

优选的，所述急性缺氧损伤的疾病包括急性高原病；

所述急性高原病包括以下一种或几种：急性轻型高原病、高原肺水肿、高原脑水肿。

本发明提供了所述抗缺氧活性铁皮石斛多糖在缓解急性缺氧损伤的功能性食品中的应用。

本发明提供了一种蒸汽***制备抗缺氧活性铁皮石斛多糖的方法，将铁皮石斛原料经过特定参数蒸汽***处理后，经过水提醇沉提取，去除蛋白以及小分子杂质后，用DEAE-Cellulose阴离子交换柱进一步分离多糖，收集的小分子量(6.2～8.4kDa)多糖为抗缺氧活性铁皮石斛多糖。实验证明，与不经蒸汽***处理或***处理程度过高或过低的处理方案相比，经过特定参数蒸汽***处理有利于显著提高多糖的抗急性缺氧活性。同时结构分析进一步表明，与未蒸汽***处理的铁皮石斛中多糖相比，蒸汽***处理铁皮石斛会显著改变其多糖显微结构，获得了一个新构象的低分子量多糖，重均分子量为6.2～8.4kDa，由甘露糖、葡萄糖、***糖及少量半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，总糖醛酸含量>3％(g/g)，经实验验证其为最主要的抗缺氧活性多糖。其中发挥抗缺氧活性的多糖组分中糖醛酸含量明显增多。提取的铁皮石斛多糖具有显著的抗急性缺氧活性，包括显著提高小鼠常压耐缺氧实验和亚硝酸钠中毒实验中的存活时间，降低急性缺氧导致的dPC12细胞损伤，且无明显的毒副作用，可用于制备抗急性缺氧损伤的药品或功能性食品。

同时，本发明利用蒸汽***技术处理铁皮石斛原料后，能够快速、高效提取铁皮石斛多糖，且多糖得率显著提高了60％以上。

附图说明

图1为各组小鼠在常压耐缺氧(A)和亚硝酸钠中毒(B)实验中的存活时间(*表示与空白对照组比较，具有显著性差异，p＜0.05)；

图2为铁皮石斛蒸汽爆前后其多糖(①S-DOP1、①S-DOP2、②S-DOP1、②S-DOP2以及⑤DOP)的电镜扫描图，其中图2A：①S-DOP1多糖；图2B：①S-DOP2多糖；图2C：②S-DOP1多糖；图2D：②S-DOP2多糖；图2E：⑤DOP多糖；

图3为铁皮石斛蒸汽***前后其多糖(①S-DOP1、①S-DOP2、②S-DOP1、②S-DOP2以及⑤DOP)的红外光谱图；

图4为抗缺氧活性多糖①S-DOP1(A)和②S-DOP1(B)的HPLC-GPC色谱图；

图5为抗缺氧活性多糖①S-DOP1的单糖组成HPLC分析，其中图5A：标准品；图5B：①S-DOP1多糖。

具体实施方式

本发明提供了一种蒸汽***制备抗缺氧活性铁皮石斛多糖的方法，包括以下步骤：

1)将铁皮石斛经过蒸汽***处理，得到预处理的铁皮石斛；

蒸汽***处理的条件如下：

***腔装料系数为0.7～0.9，***蒸汽压力0.8～1.5MPa，维压时间60～180s；

2)将步骤1)中所述预处理的铁皮石斛细化后，用水回流提取，所得浸提液用乙醇溶液沉淀，收集沉淀物得到粗多糖；

3)将步骤2)中粗多糖溶于水后去除蛋白，用分子截流量2000Da的透析袋透析，浓缩透析袋内多糖溶液；

4)将步骤3)中浓缩后的多糖溶液复溶后上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用0～2mol/L的NaCl溶液连续线性洗脱，检测每管洗脱液中多糖含量，绘制洗脱曲线，合并流份，收集重均分子量为6.2～8.4kDa的多糖为抗缺氧活性铁皮石斛多糖。

本发明将铁皮石斛经过蒸汽***处理，得到预处理的铁皮石斛。

在本发明中，在蒸汽***处理前，优选将铁皮石斛进行烘干。所述蒸汽***处理的条件优选如下：***腔装料系数为0.78，***蒸汽压力1.0～1.3MPa，维压时间80～160s。所述蒸汽***处理有利于造成原料细胞壁破裂而形成多孔，极大地提高酶和化学提取剂在物料中的可及性，增加目标物质从胞内溶出率，实现了多糖的高效提取。同时蒸汽***处理过程的高温高压还会使物料内发生类似酸水解、热降解、类机械断裂、氢键破坏和结构重排等协同作用，引起铁皮石斛化学成分的降解或重构。大分子多糖在蒸汽***作用下降解为小分子多糖，并改变了多糖的化学基团及单糖化学组成。与未蒸汽***处理的铁皮石斛中多糖相比，蒸汽***处理铁皮石斛会显著改变其多糖显微结构，其中发挥抗缺氧活性的多糖组分中糖醛酸含量明显增多。

得到预处理的铁皮石斛后，本发明将所述预处理的铁皮石斛细化后，用纯水回流提取，所得浸提液用乙醇溶液沉淀，收集沉淀物得到粗多糖。

在本发明中，所述细化的方法优选为粉碎。所述粉碎后铁皮石斛的粒径优选为不高于60目，更优选为70～100目。所述粉碎有利于提高多糖提取效率。

在本发明中，回流提取时，所得铁皮石斛粉末和水的质量比优选为1:10～40，更优选为1:20～30，最优选为1:25。回流提取的温度优选为70～100℃，更优选为80～100℃。回流提取的时间优选为2～3h，更优选为2.5h。回流提取的次数优选为2次。回流提取后，减压浓缩至1/2～1/5，离心除沉淀，得到浸提液。所述的离心除沉淀的转速优选为6000～8000rpm，更优选为7000rpm。离心时间优选为5～15min，更优选为10min。

在本发明中，乙醇溶液的质量百分含量优选为70％～100％。所述乙醇溶液中溶剂优选为水。所述乙醇溶液沉淀多糖时间优选为12～24h，更优选为15～20h，最优选为18h。所述乙醇溶液的添加量优选为浸提液的3～5倍体积。所述乙醇溶液优选为预冷后的乙醇溶液。

得到粗多糖后，本发明将所述粗多糖溶于水后去除蛋白，用分子截流量2000Da的透析袋透析，浓缩透析袋内多糖溶液。

在本发明中，去除蛋白的方法优选是用Sevage试剂与所得粗多糖溶液涡旋混合，去除蛋白沉淀。所述Sevage试剂优选是将氯仿和正丁醇按照(3.5～4.5)：1的体积比混合制备得到，氯仿和正丁醇的体积比更优选为4:1。所得粗多糖溶液和Sevage试剂的体积比优选为1:(0.5～2)，更优选为1:1～1.5。涡旋混合的时间优选为5～10min，更优选为8min。

在本发明中，去除蛋白后的粗多糖用分子截流量2000Da的透析袋透析，以便去除小分子杂质。所述透析优选在2～6℃下进行。所述透析的时间优选为24～48h，更优选为36h。

在本发明中，透析后，将透析袋内粗多糖经减压浓缩后冷冻干燥得纯度大于60wt％(苯酚-硫酸法测定)的多糖。

浓缩后，本发明将浓缩后的多糖溶液复溶后上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用0～2mol/L的NaCl溶液连续线性洗脱，检测每管洗脱液中多糖含量，绘制洗脱曲线，合并流份，收集重均分子量为6.2～8.4kDa的多糖为抗缺氧活性铁皮石斛多糖。

在本发明中，浓缩后的多糖溶液优选用10mmol/L的Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液复溶。洗脱的流速优选为0.5～0.8mL/min。NaCl溶液连续线性洗脱的程序是：以0.2mol/L递增梯度从0升至2mol/L，每个浓度洗脱5个柱体积。检测洗脱液中多糖含量的方法优选采用苯酚-硫酸法进行。所述洗脱曲线的横轴为不同时间收集的多糖，纵轴为多糖含量。合并流份的方法为根据洗脱曲线峰走势将同属于一个峰的多糖合并为一管，用于测定重均分子量。

在本发明中，为了使制备的多糖在制备药物时具有更加良好的治疗效果，本发明对所述合并流份后，优选还包括对合并的各流份纯化。所述纯化的方法各流份优选分别采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析，用去离子水洗脱，得到精制多糖。所述洗脱的速度优选为0.5mL/min。

在本发明中，上述制备方法利用蒸汽***技术处理铁皮石斛原料后，能够快速、高效提取铁皮石斛多糖，且多糖得率显著提高了60％以上。利用蒸汽***技术处理铁皮石斛原料后，获得了一个新构象的低分子量多糖，重均分子量为6.2～8.4kDa，由甘露糖、葡萄糖、***糖及少量半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成，总糖醛酸含量>3％(g/g)，经实验验证其为最主要的抗缺氧活性多糖。与未经蒸汽***技术或不采用本发明限定蒸汽***方法相比，本发明保护的制备方法制备的多糖具有显著提高抗急性缺氧活性，包括显著提高小鼠常压耐缺氧实验和亚硝酸钠中毒实验中的存活时间，降低急性缺氧导致的dPC12细胞损伤，可用于制备抗急性缺氧损伤的药品或功能性食品。

本发明提供了所述方法制备的抗缺氧活性铁皮石斛多糖，包含甘露糖、葡萄糖、***糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，且总糖醛酸的含量>3wt％；多糖纯度为90wt％～95wt％；所述甘露糖、葡萄糖、***糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为(5.5～5.7):(2.1～2.15):(1.8～1.9):(0.26～0.28):(0.08～0.1)。

本发明提供了所述抗缺氧活性铁皮石斛多糖在制备抗急性缺氧损伤的药物中的应用。所述急性缺氧损伤的疾病优选包括急性高原病。所述急性高原病包括以下一种或几种：急性轻型高原病、高原肺水肿、高原脑水肿。

本发明提供了所述抗缺氧活性铁皮石斛多糖在缓解急性缺氧损伤的功能性食品中的应用。

本发明应用蒸汽***技术首次开发了铁皮石斛多糖抗急性缺氧的新功效，扩展了铁皮石斛多糖的新用途。

下面结合实施例对本发明提供的一种抗缺氧活性铁皮石斛多糖及其蒸汽***制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种铁皮石斛多糖的制备方法

(1)取产自浙江温州雁荡山的兰科植物铁皮石斛的新鲜茎，65℃烘干后，采用QBS-80B蒸汽***试验台(河南鹤壁正道生物能源有限公司)处理铁皮石斛。分别采用以下四组不同参数的蒸汽***处理铁皮石斛：

①处理：压力1.2MPa，处理时间120秒；

②处理：压力1.5MPa，处理时间180秒；

③处理：压力0.8MPa，处理时间60秒；

④处理：压力0.6MPa，处理时间240秒；

⑤处理：未蒸汽***处理的铁皮石斛。

各组处理完成后均65℃烘干，备用。

(2)将上述得到的蒸汽***处理和未处理的铁皮石斛样本分别切段后粉碎，过60目筛，收集筛下物。取①～⑤处理的干粉各20g，用25倍量(质量倍数)的蒸馏水于100℃下回流提取2次，每次2小时，得到浸提液，合并两次浸提液，浓缩至浸提液体积的1/4，在7000rpm下离心10min除去不溶物，即得到①～⑤处理的浓缩提取液；

(3)持续搅拌下向①～⑤处理的浓缩提取液中各加入4倍体积量的质量分数为95％的预冷乙醇溶液，于4℃下放置18h，将浓缩提取液中的多糖沉淀出，离心收集沉淀物，将沉淀物冷冻干燥后，分别得到①～⑤处理的粗多糖；

(4)步骤(3)中获得的各粗多糖重新用去离子水溶解后，采用Sevage(氯仿：正丁醇＝4:1，v/v)试剂进行多糖的除蛋白操作，反复进行6次直至蛋白质完全去除(无乳白色沉淀析出)，减压浓缩去除Sevage试剂，加适量去离子水加热至70℃，趁热滤出不溶物，滤液冷却后装于分子截流量2000Da的透析袋中4℃下用去离子水透析去除小分子杂质，干燥后得到总多糖。采用苯酚-硫酸法测定各多糖纯度，并计算各样本中的多糖得率，结果见表1。

表1各铁皮石斛样本提取的多糖纯度及得率

由表1可知，蒸汽***预处理有利于提高铁皮石斛的多糖得率。

(5)将步骤(4)获得的各铁皮石斛多糖溶于10mmol/L的Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液，上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用0～2mol/L的NaCl溶液线性洗脱，洗脱流速为0.5mL/min，苯酚-硫酸法跟踪监测每管洗脱液中多糖含量，制备多糖在层析柱中的洗脱曲线，按曲线规律，将同属于一个波峰的多糖溶液合并流份。其中样本①～③提取的多糖均获得大小不同分子量的两段流份，分别记为①S-DOP1(较低分子量)和①S-DOP2(较高分子量)、②S-DOP1(较低分子量)和②S-DOP2(较高分子量)以及③S-DOP1(较低分子量)和③S-DOP2(较高分子量)。而样本④和⑤提取的多糖仅有一段流份。

(6)将步骤(5)中的各流份分别采用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析进一步纯化，用去离子水洗脱，冷冻干燥后得精制多糖。采用苯酚-硫酸法测定各精制多糖纯度，结果见表2。

表2各铁皮石斛样本中所获精制多糖的纯度

实施例2

抗急性缺氧药效学实验

(1)动物实验评价

取健康的雄性ICR小鼠180只，体重20±2g，由浙江中医药大学动物中心提供(伦理批准编号：IACUC-20210412-07，浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会)，按体重随机分为9组，每组20只(具体分组情况见表3)，适应性培养5天后进行实验。抗急性缺氧评价包括常压耐缺氧实验测试和亚硝酸钠中毒实验测试。

将实施例1中制得的各精制多糖分别用蒸馏水充分分散溶解，同时以蒸馏水为空白对照组，灌胃给药15天后，每组随机选10只小鼠进行常压耐缺氧实验，另外10只进行亚硝酸钠中毒实验测试。饲喂、给药期间，自由饮水、进食，并称量小鼠体重。

表3实验小鼠分组给药情况

①常压耐缺氧实验测试：参考文献[Xie Y,et al.Composition analysis andanti-hypoxia activity of polysaccharide from Brassica rapa L.[J].International Journal ofBiological Macromolecules,2010,47(4):528-533.]中抗缺氧评价方法。实验小鼠最后一次灌胃给药后，禁食禁水，在正常环境下活动1小时后，分别放入装有5g钠石灰的250mL的具塞磨口广口瓶中(每瓶1只)，瓶盖周围涂抹凡士林密封，加盖后立即计时。以小鼠呼吸停止为终点，停止计时，记录小鼠因缺氧而死亡的时间，并按照式I计算小鼠存活时间延长率。同时，小鼠死亡后立即解剖取脏器，并测定肺组织含水量。

存活时间延长率(％)＝[(给药组存活时间-模型组存活时间)/模型组存活时间]×100％ 式I。

②亚硝酸钠中毒实验测试：参考文献[Zhang C,et al.Anti-hypoxia activityof a polysaccharide extracted from the Sipunculus nudus L[J].InternationalJournal ofBiological Macromolecules,2011,49:523-526.]中抗缺氧评价方法。实验小鼠最后一次灌胃给药后，禁食禁水，待小鼠在正常环境下活动1小时后，由腹腔注射浓度为200mg/kg.bw(注射量为0.1g/10g)的亚硝酸钠溶液，立即开始计时，记录小鼠的存活时间，并按照式I计算小鼠存活时间延长率。

表4各组小鼠常压耐缺氧实验存活时间(mean±SD)

注：*表示与空白对照组相比具有显著性差异，p＜0.05。

表5各组小鼠急性缺氧死亡后的肺脏含水量(mean±SD)

注：*表示与空白对照组相比具有显著性差异，p＜0.05。

表6各组小鼠亚硝酸钠中毒实验存活时间(mean±SD)

注：*表示与空白对照组相比具有显著性差异，p＜0.05。

结果显示，连续15天灌胃不同蒸汽***处理铁皮石斛中的精制多糖对小鼠耐缺氧能力影响具有较大差异。其中，经参数①(压力1.2MPa+120秒)、参数②(压力1.5MPa+180秒)和参数③(压力0.8MPa+60秒)的蒸汽***处理的铁皮石斛，所提取制备的精制多糖(编号①S-DOP1、②S-DOP1和③S-DOP1)能显著延长小鼠在常压耐缺氧和亚硝酸钠中毒实验中的存活时间(p<0.05)，同时显著降低小鼠急性缺氧死亡后肺组织的含水量(p<0.05)。而经实施例1中参数④(压力0.6MPa+240秒)蒸汽***处理或未蒸汽***处理的铁皮石斛中精制多糖则并无此效果(图1、表4～表6)。这表明蒸汽***处理铁皮石斛，能有效提高其精制多糖的抗缺氧活性并减轻急性缺氧性肺水肿，但与蒸汽爆参数密切相关，而蒸汽爆参数则决定了铁皮石斛中多糖的重构特性。此外，在整个灌胃给药过程中，小鼠健康状况良好，无一例死亡，各组间小鼠的体重及脏器指数也均无显著差异(p>0.05)(数据未列出)。

(2)细胞实验评价

以类神经细胞dPC12细胞株为对象，评价实施例1中制得的各精制多糖对细胞急性缺氧损伤的保护作用。具体实验方法如下：

1)dPC12细胞用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养，毎两天更换培养基，直至细胞进入对数生长期。

2)于96孔板中每孔接种100μL dPC12细胞液(约5×10³个)，继续在正常条件下培养24h使细胞贴壁及正常生长。

3)小心地除去培养基，加入含不同精制多糖的培养基，各多糖分别设置低剂量组(10.0μg/mL)和高剂量组(50.0μg/mL)，同时设置缺氧模型组和正常对照组，每组6个复孔。于37℃、5％CO₂条件的正常培养箱中孵育3h后，除正常对照组外，将其余组的培养板转入37℃、0.5％O₂+5％CO₂+94.5％N₂条件的三气培养箱中培养36h。

4)在避光下于超净工作台中小心地向每孔中加入10μL的CCK-8溶液，混匀。在37℃培养箱中孵育3h后采用酶标仪测定450nm波长下的吸光度。

表7各组铁皮石斛精制多糖对急性缺氧下dPC12细胞损伤的防护作用(mean±SD)

注：*表示与缺氧模型组相比具有显著性差异，p＜0.05；**p＜0.01。^##表示缺氧模型组与正常组相比具有显著性差异，p＜0.01。

结果显示，急性缺氧下培养dPC12细胞36h使其细胞活力显著下降(p＜0.01)，仅为正常培养组的49.6％。而采用浓度为10.0μg/mL和50.0μg/mL的①S-DOP1、②S-DOP1以及③S-DOP1精制多糖共孵育培养可使dPC12细胞活力显著提升(p＜0.05)，显示出其良好的急性缺氧细胞损伤防护作用；但其余组别的精制多糖未表现出抗急性缺氧损伤的效果(表7)。与实施例2的“(1)动物实验评价”结果一致。

实施例3

实施例1制得的各精制多糖中糖醛酸含量的测定

测定实施例1制得的各精制多糖中糖醛酸含量。采用硫酸-咔唑法测定，参考文献[黄赵刚,等.不同产地黄精中糖醛酸含量的比较[J].中国药师,2004,7(6):433-434]，以半乳糖醛酸为标准品，测定波长为530nm，每个样品测定三次。

结果由表8可知，从处理参数①～③的蒸汽***处理后的铁皮石斛中提取、分离、纯化获得的①S-DOP1多糖、②S-DOP1多糖和③S-DOP1多糖的糖醛酸含量显著高于未蒸汽***处理的⑤DOP多糖(p＜0.05)，其中①S-DOP1多糖的糖醛酸含量(3.66％)较⑤DOP多糖(1.68％)提高了118.3％。而由参数④(压力0.6MPa，处理时间240秒)处理组则未出现糖醛酸含量的明显提升。

表8铁皮石斛经不同参数蒸汽***处理后其精制多糖的糖醛酸含量(mean±SD)

注：*表示与⑤DOP精制多糖(未汽爆处理)组相比具有显著性差异，p＜0.05；**p＜0.01。

实施例4

抗缺氧活性多糖的结构解析

(1)扫描电镜表征多糖显微结构

根据实施例2的功能评价结果，以实施例1中制得的精制多糖①S-DOP1、①S-DOP2、②S-DOP1、②S-DOP2和⑤DOP为对象，采用扫描电镜表征其显微结构，结果见图2。显示未蒸汽***处理的铁皮石斛中多糖(⑤DOP)(图2E)与经参数①(压力1.2MPa，处理时间120秒)和参数②(压力1.5MPa，处理时间180秒)的蒸汽***处理后所制多糖具有显著差异(图2A～图2D)，蒸汽爆会使铁皮石斛中多糖的碎片化和无序化加剧，多糖裸露的残基也随之增多，提示这可能是汽爆处理铁皮石斛提升其多糖抗缺氧活性的作用机制之一。同时，不同参数的蒸汽***处理铁皮石斛后，其精制多糖的显微结构也具有一定差异。

(2)采用红外光谱仪对比分析多糖的结构

将实施例1中制得的精制多糖①S-DOP1、①S-DOP2、②S-DOP1、②S-DOP2和⑤DOP用溴化钾压片后于4000～400cm^-1波长范围内进行红外光谱扫描，结果见图3。多糖中一些基本基团在光谱区均具有其特征吸收峰。3425cm^-1处的强吸收代表多糖的羟基伸缩振动吸收峰，2924cm^-1处信号代表多糖的C-H伸缩与弯曲振动；而1736cm^-1归属于多糖中乙酰基或羧基上的C＝O非对称伸缩振动，提示铁皮石斛多糖中含糖醛酸，且①S-DOP1和②S-DOP1多糖中的糖醛酸丰度明显高于①S-DOP2、②S-DOP2和⑤DOP，与实施例3所测定的醛酸含量结果对应；1640cm^-1为结晶水或水化物的吸收峰，可能因多糖易吸水造成此处峰值较大；1378cm^-1处吸收峰为O-H的弯曲振动；1250cm^-1、1150cm^-1、1060cm^-1和1030cm^-1四个吸收峰来自于吡喃糖环的C-O-H伸缩振动和C-O-C糖苷键的非对称伸缩振动；811cm^-1附近是甘露糖的特征吸收。蒸汽爆前后铁皮石斛多糖的红外光谱吸收有较大差异，尤其是1736cm^-1、1378cm^-1、1250cm^-1、1060cm^-1、1030cm^-1和811cm^-1处的吸收峰。提示蒸汽***处理铁皮石斛对其多糖的化学基团及结构具有较大影响。

(3)①S-DOP1和②S-DOP1精制多糖的重均分子量分析

将实施例1中制得的抗缺氧活性多糖①S-DOP1和②S-DOP1采用凝胶渗透色谱法(GPC)进行重均分子量测定，方法参考[唐伟敏.芜菁多糖与玛咖多糖的化学结构及其抗疲劳作用比较研究[D].浙江大学博士论文，2017，浙江：杭州]。以不同分子量的葡聚糖标准品结合GPC色谱仪软件制备标准曲线为Log10(Mw)＝-0.8251x+10.788，①S-DOP1和②S-DOP1的保留时间分别为8.411min和8.476min，换算得①S-DOP1和②S-DOP1多糖的重均分子量分别为7.048kDa和6.229kDa(图4)。

(4)①S-DOP1多糖的单糖组成分析

将实施例1中制得的抗缺氧活性多糖①S-DOP1，称取10mg(精确到0.1mg)，加入2mL浓度为2mol/L的三氟乙酸溶液，充氮后于100℃下水解12小时。然后采用PMP法进行单糖衍生。采用HPLC进行单糖组成分析，结果见图5。表明①S-DOP1多糖主要由甘露糖、葡萄糖和***糖为主，同时含有少量的半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，各单糖甘露糖、葡萄糖、***糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为5.63:2.12:1.87:0.27:0.09。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种蒸汽***制备抗缺氧活性铁皮石斛多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将铁皮石斛经过蒸汽***处理，得到预处理的铁皮石斛；蒸汽***处理的条件如下：***腔装料系数为0.7～0.9，***蒸汽压力0.8～1.5MPa，维压时间60～180s；

2)将步骤1)中所述预处理的铁皮石斛细化后用水回流提取，所得浸提液用乙醇溶液沉淀，收集沉淀物得到粗多糖；

3)将步骤2)中粗多糖溶于水后去除蛋白，用分子截流量2000Da的透析袋透析，浓缩透析袋内多糖溶液；

4)将步骤3)中浓缩后的多糖溶液复溶后上样于DEAE-Cellulose阴离子交换柱，用0～2mol/L的NaCl溶液连续线性洗脱，检测每管洗脱液中多糖含量，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线中出峰情况合并流份，收集重均分子量为6.2～8.4kDa的多糖为抗缺氧活性铁皮石斛多糖；

步骤4)中所述合并流份后，还包括对合并的各流份纯化；所述纯化的方法各流份分别采用SephadexG-100葡聚糖凝胶柱层析，用去离子水洗脱，得到精制多糖。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述蒸汽***处理的条件如下：***腔装料系数为0.78，***蒸汽压力1.0～1.3MPa，维压时间80～160s。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中回流提取的温度为70～100°C，回流提取的时间为2～3h，回流提取的次数为2～3次；乙醇溶液的质量百分含量为70％～100％。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)中去除蛋白的方法是用Sevage试剂与所得粗多糖溶液涡旋混合，去除蛋白沉淀；所述Sevage试剂是将氯仿和正丁醇按照(3.5～4.5)：1的体积比混合制备得到；所得粗多糖溶液和Sevage试剂的体积比为1:(0.5～2)，涡旋混合的时间为5～10min。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4)中洗脱的流速为0.5～0.8mL/min。

6.权利要求1～5任意一项所述方法制备的抗缺氧活性铁皮石斛多糖，其特征在于，包含甘露糖、葡萄糖、***糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，且总糖醛酸的含量>3wt％；多糖纯度为90wt％～95wt％，所述甘露糖、葡萄糖、***糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩尔比为(5 .5～5 .7):(2.1～2.15):(1.8～1.9):(0.26～0.28):(0.08～0.1)。

7.权利要求6所述抗缺氧活性铁皮石斛多糖在制备抗急性缺氧损伤的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述急性缺氧损伤的疾病包括急性高原病；所述急性高原病包括以下一种或几种：急性轻型高原病、高原肺水肿和高原脑水肿。

9.权利要求6所述抗缺氧活性铁皮石斛多糖在制备缓解急性缺氧损伤的功能性食品中的应用。

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