CN114989323A - 具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖、提取分离方法和在制备抗肿瘤药物的补充剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于功能性食品领域，提供一种具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖的制备及结构表征方法。本发明通过水提醇沉法制备杜仲叶多糖，采用凝胶色谱柱进行分离纯化，得到均一性的杜仲叶多糖(EFP)。采用高效液相色谱、离子色谱、红外光谱和NMR对其进行表征。在小鼠体内研究了EFP这一组分的免疫调节和抗肿瘤作用，证明EFP的抗肿瘤活性较高，有望作为一种潜在的抗肿瘤药物进行开发。

Description

具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖、提取分离方法和在制备抗肿 瘤药物的补充剂中的应用
技术领域
本发明属于功能性食品技术领域，尤其是一种具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖、提取分离方法和在制备抗肿瘤药物的补充剂中的应用。
背景技术
杜仲具有巨大的经济价值和综合开发潜力。然而在过去的很长一段时间，只有杜仲的树皮被作为药物进行使用。随着药用需求日益增长，而杜仲皮的生长周期又比较长，使得这种资源更为稀缺。根据近年来的研究结果，因为一些重要的活性化合物如环烯醚萜类、黄酮类、酚类、木脂素类和多糖类在杜仲叶(EucommiaFolium)中与杜仲皮中的活性成分基本相同，所以杜仲叶可以在一定程度上作为药用以替代杜仲皮。同时，杜仲叶的降压、降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎、保肝、保肾、免疫调节等作用已被许多研究所证实。在过去的20年里，杜仲叶已经成为一种备受关注的功能性健康食品和植物药品。
通过糖苷键的连接，相同或不同的单糖和糖醛酸共同组成多糖，这种生物大分子在自然界中广泛存在，是所有生物体的必需成分。多糖广泛存在于植物、微生物、细菌、真菌和海藻中，与生命的许多生理行为密切相关。此外，杂多糖具有支持多种功能的潜力，例如抗氧化、抗病毒、免疫调节、抗糖尿病、抗肿瘤和抗疲劳功能。由于无毒副作用和强大的治疗特性，对来自植物资源的生物多糖和相关生物活性的研究在过去几十年中引起了越来越多的研究，应用范围广泛。这些丰富的多糖和生物活性成分是食品和生物医学行业潜在利用的理想候选者。研究发现杜仲叶中分离出的多糖具有多种重要的生物活性，有助于未来相关药物的开发。
作为威胁人类健康的一大问题，肝癌的发病率高达70％-90％，其致死率仅次于胃癌和食管癌。大部分肝癌由肝炎或过度饮酒引起，再加上代谢异常和肥胖等问题都会导致患肝癌的风险增加。
肝细胞癌(Hepatocellular carcino-ma，HCC)是最常见的肝癌病例，因为其早期症状难以确定，很多患者在确诊时已经进入了病程的晚期，不同程度的肝硬化在许多患者的病症中都十分常见。患者不可手术的比例较高，且手术后复发比例高。由于化疗和放疗所具有的毒性，患者的预期寿命和生活质量受到明显影响。虽然一线药物如索拉非尼、顺铂和5-氟尿嘧啶(5-Fu)显示出一定的治疗效果，但它们已被临床研究发现具有耐药性、细胞毒性和免疫抑制性。
在目前的研究中，针对杜仲叶多糖的研究鲜有报道，关于杜仲叶多糖在抗肿瘤方面的应用更是少之又少。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中杜仲叶多糖提纯的不足之处，提供一种具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖、提取分离方法和在制备抗肿瘤药物的补充剂中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖，所述杜仲叶多糖的相对分子量为9.98×105Da，由鼠李糖、***糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸按摩尔比为：0.226:1.739:2.183:1:0.155:0.321:0.358:0.047组成。
进一步地，所述杜仲叶多糖是一种同时含有α-型糖苷键和β-型糖苷键的酸性多糖，其主链由α-L-Araf-(1→、→3,5)-α-Araf-(1→、→3)-β-Galp-(1→、→3,6)-β-Glcp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→、→4)-α-GalpA-(1→和→2,4)-α-Rhap-(1→组成；
或者，所述杜仲叶多糖是一种同时含有α-型糖苷键和β-型糖苷键的酸性多糖，红外光谱中1617.03cm-1处出现的吸收峰和13C NMR中173.30ppm处的低场信号都证明了糖醛酸的存在。
进一步地，所述杜仲叶多糖在建立的H22荷瘤小鼠模型中能够诱导肿瘤细胞的凋亡，将其DNA复制周期阻滞在S期，同时降低肿瘤细胞线粒体膜电位，以此来抑制肿瘤的生长。
如权上所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，步骤如下：
(1)干燥的杜仲叶粉末作为原料，蒸馏水作为提取剂，采用水提醇沉法对杜仲叶粗多糖进行提取；
(2)采用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-200对杜仲叶多糖进行分离纯化，得到均一杜仲叶多糖EFP。
进一步地，提取的具体方法为提取温度100℃，料液比为1:20，提取时间为3小时，提取次数3次，醇沉浓度为60％。
进一步地，分离纯化的具体方法为采用Sephadex G-200凝胶柱进行洗脱，洗脱速度为0.1mL/min，每一管的收集时间设定为25min。
进一步地，干燥是指在50℃的烘箱中干燥3小时，再过60目筛；
或者，步骤(1)中采用5g杜仲叶粉末采用250mL石油醚，在水浴70℃的条件下进行脱脂处理，冷凝回流6小时后进行烘干处理，得到脱脂的杜仲叶粉末；
或者，步骤(1)中杜仲叶粉末和水的比例为1:20，提取时间为3小时，提取次数为3次，醇沉浓度为60％；
或者，步骤(1)中提取液被浓缩至三分之一体积，得到浓缩液；
或者，步骤(1)中浓缩液中加入乙醇过夜后，通过在4000rpm下离心10min获得粗多糖。
进一步地，步骤(2)包括向杜仲叶粗多糖溶液中加入1/5倍体积的Sevage试剂，Sevage试剂由正丁醇和三氯甲烷以4:1的比例配置得到，充分震荡20min后静置，等待溶液分层，弃去蛋白层，多糖溶液和Sevage试剂进行回收，再补充少量的Sevage试剂。重复5-7次直到多糖溶液中不再看到蛋白层出现，剩余的有机试剂通过旋转蒸发仪除去；
或者，步骤(2)包括除去蛋白后的粗多糖溶液用蒸馏水在4℃透析(100kDa)3天，期间每隔8小时换一次水，冷冻干燥并收集得到粗杜仲叶多糖(cEFP)；
或者，步骤(2)中精准称量20mg样品cEFP溶于1mL蒸馏水中，通过0.45μm滤膜。采用Sephadex G-200凝胶柱进行洗脱，准确控制0.1mL/min为洗脱速度，每一管的收集时间设定为25min；
或者，步骤(2)包括利用苯酚-硫酸法测定每一管洗脱液中的组分，得到洗脱曲线。将同一组分的洗脱液进行合并、冻干，得到的多糖命名为EFP。
如上所述的杜仲叶多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述抗肿瘤药物为预防和/或治疗肝癌疾病的药物。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明得到的杜仲叶多糖EFP主链主要由α-L-Araf-(1→、→3,5)-α-Araf-(1→、→3)-β-Galp-(1→、→3,6)-β-Glcp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→、→4)-α-GalpA-(1→和→2,4)-α-Rhap-(1→组成，与其他方式所得杜仲叶多糖的主链组成均不相同。
2、本发明首次得到具有抗肝癌活性的杜仲叶多糖EFP，可以有效抑制肿瘤的生长，具有较好的抗肿瘤活性。
3、本发明针对杜仲叶多糖的提取、分离纯化，采用易于工业化的水提醇沉法，初步得到杜仲叶粗多糖，再通过葡聚糖凝胶柱Sephadex G-200进行纯化，最终得到总糖含量为89.12％左右的杜仲叶多糖，为杜仲叶多糖的开发和应用奠定了基础。
4、本发明进行了体内抗肿瘤试验，结果证明，所述的杜仲叶多糖EFP能够有效抑制小鼠实体瘤的生长，保护小鼠的免疫器官和肝脏组织，并可以诱导肿瘤细胞凋亡，将肿瘤细胞阻滞在S期，阻止其进一步的增殖，同时破坏细胞线粒体膜电位，通过线粒体通路来诱导肿瘤细胞凋亡，并呈现一定的剂量依赖性。
5、本发明所述的杜仲叶多糖可用于制备抗肿瘤药物的补充剂。
6、本发明首次仅采用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-200对杜仲叶多糖进行分离纯化，操作简单，条件温和且不会对其活性造成损失；
7、本发明旨在通过水提醇沉法，分离纯化后得到均一性组分杜仲叶多糖(命名为EFP)，并通过高效液相色谱、离子色谱、红外光谱和NMR对其结构表征，之后建立H22荷瘤小鼠模型对其体内抗肿瘤活性进行探究，为杜仲叶多糖作为一种潜在的抗癌药物奠定一定的理论基础。
8、本发明通过水提醇沉法制备杜仲叶多糖，采用凝胶色谱柱进行分离纯化，得到均一性的杜仲叶多糖(EFP)。采用高效液相色谱、离子色谱、红外光谱和NMR对其进行表征。在小鼠体内研究了EFP这一组分的免疫调节和抗肿瘤作用，证明EFP的抗肿瘤活性较高，有望作为一种潜在的抗肿瘤药物进行开发。
附图说明
图1为本发明中杜仲叶多糖EFP的Sephadex G-200凝胶柱洗脱曲线；
图2本发明中杜仲叶多糖EFP的高效液相色谱图；
图3本发明中杜仲叶多糖EFP的离子色谱图，显示了其单糖组成；
图4本发明中杜仲叶多糖EFP的红外光谱图；
图5(a)本发明中杜仲叶多糖EFP的1H NMR谱图；
图5(b)本发明中杜仲叶多糖EFP的13C NMR谱图；
图6(a)本发明中杜仲叶多糖EFP的COSY谱图；
图6(b)本发明中杜仲叶多糖EFP的HSQC谱图；
图7本发明中杜仲叶多糖EFP对不同处理组小鼠肿瘤重量和体积的影响，其中*表示与模型组相比P<0.05(差异显著)；
图8本发明中杜仲叶多糖对不同处理组小鼠免疫指数的影响，其中#表示与空白组相比P<0.05，*表示与模型组相比P<0.05；
图9(a)本发明中荷瘤小鼠实体瘤石蜡切片的H&E染色结果(×20)；
图9(b)本发明中荷瘤小鼠肝脏石蜡切片的H&E染色结果(×20)；
图10(a)本发明中流式细胞仪检测杜仲叶多糖EFP对实体瘤细胞凋亡的影响结果；
图10(b)本发明中杜仲叶多糖EFP对不同治疗组肿瘤细胞凋亡和坏死比例的影响结果；
图11(a)本发明中流式细胞仪检测杜仲叶多糖EFP对实体瘤细胞的细胞周期分布影响结果；
图11(b)本发明中杜仲叶多糖EFP对小鼠实体肿瘤细胞周期不同时期细胞比例的直方图，其中*表示与模型组相比P<0.05；
图12(a)本发明中流式细胞仪检测肿瘤细胞JC-1染色结果；
图12(b)本发明中杜仲叶多糖EFP对小鼠肿瘤细胞不同处理组线粒体膜电位变化的直方图，其中*表示与模型组相比P<0.05。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1杜仲叶粗多糖的提取
本发明所用原料为纯天然晾晒干燥的杜仲叶，购买于安徽省六安市霍山县，烘干、粉碎、过筛后备用。利用沸水进行提取，料液比为1:20，提取时间为3小时，提取次数3次，醇沉浓度为60％，此条件下得率为4.79±0.26％。
实施例2杜仲叶多糖的分离纯化：
将获得的粗多糖溶于蒸馏水中，通过离心(8000rpm，10min)除去不溶性杂质。Sevage试剂由正丁醇和三氯甲烷以4:1的比例配置得到，然后将所得上清液与Sevage试剂按照5:1的比例进行混合，充分震荡20min后静置，等待溶液分层，弃去蛋白层，多糖溶液和Sevage试剂进行回收，再补充少量的Sevage试剂。以上操作需要重复5-7次直到多糖溶液中不再看到蛋白层出现，剩余的有机试剂通过旋转蒸发仪除去，经过真空冷冻干燥得到杜仲叶多糖cEFP。
得到的杜仲叶多糖cEFP溶液用蒸馏水在4℃透析(100kDa)3天，期间每隔8小时换一次水。多糖溶液经过透析处理后冷冻干燥并收集，置于干燥器中方便后续试验使用。
精准称量20mg上述样品溶于1mL蒸馏水中，通过0.45μm滤膜。采用Sephadex G-200凝胶柱进行洗脱，准确控制0.1mL/min为洗脱速度，每一管的收集时间设定为25min。利用苯酚-硫酸法测定每一管洗脱液中的组分，得到洗脱曲线。图1中展示了杜仲叶多糖纯化的洗脱曲线。将同一组分的洗脱液进行合并、冻干，得到的多糖命名为EFP。通过苯酚-硫酸法对其总糖含量进行测定，考马斯亮蓝法对其蛋白质含量进行测定，硫酸-咔唑法对其糖醛酸含量进行测定。
表1 EFP基本化学成分测定结果表
Figure BDA0003702567260000061
实施例3杜仲叶多糖的结构表征
1、分子量的测定
利用高效液相色谱对杜仲叶多糖EFP的平均分子量进行测定，将已知分子量的葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-110、T-500、T-2000作为标准品，建立标准曲线，根据保留时间-分子量标准曲线计算EFP的相对分子质量。
结果如图2所示，EFP显示为单一尖峰，表明EFP是一种均质多糖，其平均分子量经标准回归方程(y＝-0.3173x+8.9584,R2＝0.9923)计算得9.98×105Da(Rt＝9.327min)。
2.单糖组成的测定
准确称量5mg EFP，将其充分溶解在1mL 2mol/L的三氟乙酸(TFA)中，在110℃的条件下油浴3小时，自然冷却至室温。利用氮吹仪将溶液中的三氟乙酸吹干。再加入1mL甲醇用N2吹干，重复上述操作三次以确保三氟乙酸完全除去。
将酸水解产物完全溶于1mL超纯水中并稀释至150ppm，过0.22μm滤膜和RP-10小柱等待上机检测。同时配制浓度为50ppm的Rha、Ala、Fuc、Gal、Glc、Xyl、Man、GlcA、GalA等单糖混合液，过0.22μm滤膜和RP-10小柱，以备用于离子色谱检测。采用Dionex ISC5000色谱***进行分析，使用高效阴离子交换柱Dionex Carbopac PA10柱(150mm×3mm)和Dionex脉冲电流检测器，柱温为30℃，NaOH溶液(10mM)和醋酸钠溶液(200mM)用作流动相，梯度洗脱，流速为0.5mL/min。
结果如图3所示，根据出峰时间的前后可以对单糖混标按照进行区分，依次为Fuc、Rha、Ara、Gal、Glc、Xyl、Man、GalA、GlcA。将EFP与单糖混标的离子色谱图对比可以得出，EFP由Rha、Ara、Gal、Glc、Xyl、Man六种单糖和GalA、GlcA两种糖醛酸组成，其中半乳糖、***糖和葡萄糖以及半乳糖醛酸含量较多，剩余单糖和葡萄糖糖醛酸的含量较低。由单糖组成的测定结果可以计算出EFP中Rha:Ara:Gal:Glc:Xyl:Man:GalA:GlcA的摩尔比为0.226：1.739：2.183：1：0.155：0.321：0.358：0.047。
3.红外光谱分析
精准称量1mg EFP和150mg KBr，混合后在研钵中研磨成粉末，利用压片机将所得粉末制成均匀透光的薄片，设定波长范围为4000-400cm-1，分辨率为4cm-1，利用傅里叶变换红外分光光度计共扫描16次，检测得到EFP的红外光谱。
结果如图4所示，EFP在3423.67cm-1处出现明显的吸收峰是由于-OH拉伸振动导致的，2919.71cm-1和1420.49cm-1处的吸收峰与C-H的伸缩振动以及C-H的变角振动有关，表明EFP具有典型的多糖结构特征。1735.32cm-1处的吸收峰表明杜仲叶多糖中含有酯羰基(COOR)，1617.03cm-1处出现的吸收峰是由于样品中羧酸根离子(-COO-)的存在，表明EFP中含有糖醛酸。1077.24cm-1和1023.41cm-1处的吸收峰分别对应吡喃糖环上C-O-H和C＝O，证明吡喃环结构存在于EFP的糖链中。894.29cm-1和828.19cm-1处的特征吸收峰表明，多糖中既含有β-型糖苷键也含有α-型糖苷键。
4.核磁共振分析
称量60mg EFP充分溶解于1mLD2O中，通过BrukerAdvance DPX-500MHz光谱仪获得1H、13C NMR、COSY和HSQC图谱。
如图5(a)所示，EFP的化学位移在1H NMR中的3.39-5.42ppm之间，是多糖的典型信号，并证实EFP同时具有α型和β型糖苷键。3.39-4.39ppm归因于H2-H6的质子信号。1.26、1.30ppm处的信号来源于鼠李糖的H-6，甲基归于鼠李糖C-6，由HSQC图谱中的交叉峰1.23/17.42ppm可以得到证实。根据COSY图谱中H-5/H-6的交叉峰可以得到鼠李糖中H-5的化学位移信息。但是由于鼠李糖含量较低，其他质子的化学位移需要做进一步分析与研究，无法完全从COSY谱中得到。2.10-2.20ppm处的信号指定给O-乙酰基上的质子，13C信号上20.49ppm指定给O-乙酰基上的甲基碳信号，173.30ppm处的低场信号被标记为O-乙酰基上的羰基即糖醛酸的C-6，表明EFP中存在糖醛酸。69.39ppm处的信号峰是由甲氧基的存在引起的，这也被1H光谱中3.39-3.57ppm处的吸收峰所证实。13C图谱中多处异头碳区域峰堆叠较为严重，这可能是因为EFP分子量较大，在重水中溶解度降低，导致峰的分散性不佳。将5.17/109.94ppm的信号分配给α-L-Ara，4.55/105.65ppm处的信号归属于β-D-Gal，4.39/102.91ppm处的信号表明存在β-D-Glc，其他质子和碳信号需要通过同核相关谱(COSY)和异核多键相关谱(HSQC)进行归属。
表2 EFP糖残基的NMR归属
Figure BDA0003702567260000081
实例4杜仲叶多糖的体内抗肿瘤活性
在北京斯贝福生物技术有限公司购买50只昆明SPF级雌性小鼠，年龄约为6-8周，体重均在20g左右。饲养过程中保持室内相对湿度为45％-55％，温度为22±2℃。实验期间小鼠可以自由饮水、自由进食，12小时光照明暗循环。
适应环境一周后，将上述的50只小鼠随机分为：空白组、模型组、5-Fu组、低剂量给药组和高剂量给药组，每组内均为10只小鼠。除空白组外，其他小鼠均在右前肢腋下注射0.2mL细胞密度为1×106cells/mL的H22细胞悬液，H22肝癌细胞由中国科学院上海生命科学研究所提供。
空白组和模型组的小鼠进行0.2mL生理盐水的灌胃处理；
5-Fu组的小鼠需要每天进行0.2mL 5-氟尿嘧啶(20mg/kg)的注射处理；
低、高剂量组的小鼠每天分别进行0.2mL(100mg/kg、300mg/kg)的杜仲叶多糖灌胃处理。
持续治疗三周后结束实验。每天对小鼠的饮食、活动及毛发情况进行观察。
1.小鼠体重、免疫器官指数及瘤重、瘤体积的测定
每周对小鼠的体重进行称量。实验结束时，对小鼠的实体瘤进行精准称量重量。肿瘤的长(L，cm)、宽(W，cm)通过游标卡尺进行测量，用式
Figure BDA0003702567260000091
计算肿瘤的体积。肿瘤抑制率用：
Figure BDA0003702567260000092
计算。
由表3可知，在本实验初期，各组小鼠的体重均维持在20g左右，没有呈现明显的差异。所有小鼠的行为都比较活跃，饮食、饮水状况也并没有呈现明显的差别。而在实验即将结束时，与空白组相比，模型组体重的增加量小于空白组，且在实验过程中，模型组小鼠出现明显的行动变缓、精神倦怠、食欲不振等现象。与此同时，经5-Fu处理的小鼠厌食情况明显，身体时常处于蜷缩状态，行动迟缓，毛发失去光泽并出现毛发脱落现象。在实验后期5-Fu组的小鼠体型异常消瘦，小鼠无精打采，已经有部分小鼠出现死亡。
表3杜仲叶多糖对不同处理组小鼠体重的影响
Figure BDA0003702567260000093
注：#表示与空白组相比P<0.05，*表示与模型组相比P<0.05。
各组的瘤重和瘤体积如图7所示，可以看出在实验过程中模型组小鼠肿瘤出现明显的增长，明显高于各治疗组。经杜仲叶多糖灌胃处理的小鼠与模型组相比，肿瘤体积和重量均显著降低，抑瘤率达到21.43％。高剂量组抑瘤率达到46.54％，说明杜仲叶多糖可以抑制H22肿瘤的增值，且呈现出一定的剂量依赖性。
2.杜仲叶多糖对免疫器官的影响
实验结束时对小鼠的胸腺和脾脏精准称量重量。免疫器官指数用式：
Figure BDA0003702567260000094
计算，来评价杜仲叶多糖和5-氟尿嘧啶对小鼠免疫器官的影响。
各组免疫器官指数如图8所示。与正常的小鼠相比，模型组的胸腺指数明显降低，脾脏指数明显升高，且伴随胸腺有萎缩的现象，脾脏也出现肿大，说明肿瘤会对小鼠的免疫器官造成损伤。5-Fu组胸腺和脾脏指数均处于较低水平，可能是由于其具有较高的细胞毒性，对免疫***造成了损伤。而经杜仲叶多糖灌胃处理后，小鼠的免疫器官指数得到改善，尤其是高剂量组的胸腺指数明显高于模型组，脾脏指数也明显降低，说明杜仲叶多糖可以在基本不影响小鼠自身免疫***的同时达到较好的抑制肿瘤作用。
3.小鼠肿瘤、肝脏组织病理切片分析
从肿瘤和肝脏组织中剪取黄豆大小的组织块，用4％的多聚甲醛固定24小时后，用流水冲洗24小时以除去组织中的甲醛。然后将组织块脱水处理，再对脱水后的组织进行透明化处理，最后进行包埋。所有组织切片均按照标准方法用苏木精-伊红(H&E)试剂盒进行脱蜡染色处理，利用显微镜进行观察。
从图9(a)中可以看出，模型组肿瘤细胞数量排列规则，具有完整的细胞形态，呈现明显的梭性，细胞核完整且被染成均一的蓝色。经高剂量的杜仲叶多糖处理后，肿瘤细胞分布较乱，排列稀疏，细胞核形态不规则且出现核固缩和细胞核碎片等现象，与5-Fu组的结果相似，说明杜仲叶多糖可呈剂量依赖性地对肿瘤细胞造成损伤。
由图9(b)可以看出正常小鼠肝脏组织内细胞小叶形态清晰，排列紧密，细胞核结构清晰。而模型组由于接种了H22肝癌细胞，肝细胞的完整形态被破坏，细胞核出现偏移，细胞质间隙扩大。与模型组相比，杜仲叶多糖治疗组的坏死细胞呈现不同程度的减少，高剂量组的肝细胞基本恢复规则、致密地排列，说明给予高浓度的杜仲叶多糖没有明显毒性。
4.小鼠实体肿瘤细胞凋亡分析
剪取1g左右的肿瘤组织，利用200目的细胞筛对组织进行研磨处理，用生理盐水反复进行冲洗，收集研磨液，然后在1000rpm 4℃的条件下离心5min，用适量生理盐水重悬细胞沉淀并调节最终浓度为1×106cells/mL。用AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测肿瘤细胞的调亡程度。
如图10所示，模型组正常细胞有84％，表明肿瘤组织处于良好状态。用100mg/kg杜仲叶多糖处理后，凋亡率从12.37％增加至30.3％；300mg/kg杜仲叶多糖处理后，凋亡率增加至42％，且经过杜仲叶多糖处理的肿瘤细胞坏死程度也呈现剂量依赖式增加。5-Fu处理组也出现明显的调亡和坏死现象。实验结果说明杜仲叶多糖可以诱导H22细胞凋亡。
5.杜仲叶多糖对肿瘤细胞周期分布的影响
采用上述方法获得肿瘤细胞悬液，再次离心后可残留50μL生理盐水。参考细胞周期检测试剂盒进行操作
实验结果如图11所示，模型组G0/G1期、S期、G2/M期的比例分别为71％、16％、13％。经杜仲叶多糖治疗后，与模型组相比处理组的S期比例增加到29.67％(100mg/kg)和40.8％(300mg/kg)。同时，G0/G1期细胞比例也显著降低，低剂量组降低至57.45％，高剂量组降低至47.31％，G2/M期的比例也分别降至12.88％和11.89％。这表明杜仲叶多糖通过治疗可以将细胞周期阻滞在S期，以此来诱导破坏肿瘤细胞DNA复制增殖，进而引发细胞凋亡。
6.杜仲叶多糖对小鼠肿瘤细胞线粒体膜电位的影响
利用JC-1线粒体膜电位试剂盒对肿瘤细胞的线粒体膜电位变化进行检测。随后使用流式细胞仪检测线粒体膜电位。
如图12所示，经杜仲叶多糖处理后，信号峰出现左移。与模型组相比，低剂量组(100mg/kg)强荧光细胞比例从87.3％下降到73.9％，而高剂量组(300mg/kg)强荧光细胞比例下降到59.2％，说明杜仲叶多糖可以以剂量依赖性导致线粒体膜电位降低。上述实验结果表明肿瘤细胞线粒体受到了损伤，且这一损伤在细胞凋亡中并不可逆。这也表明杜仲叶多糖可以诱导肿瘤细胞出现调亡。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一种具有抗肿瘤活性的杜仲叶多糖，其特征在于：所述杜仲叶多糖的相对分子量为9.98×105Da，由鼠李糖、***糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸按摩尔比为：0.226:1.739:2.183:1:0.155:0.321:0.358:0.047组成。
2.根据权利要求1所述的杜仲叶多糖，其特征在于：所述杜仲叶多糖是一种同时含有α-型糖苷键和β-型糖苷键的酸性多糖，其主链由α-L-Araf-(1→、→3,5)-α-Araf-(1→、→3)-β-Galp-(1→、→3,6)-β-Glcp-(1→、→2)-α-D-Manp-(1→、→4)-α-GalpA-(1→和→2,4)-α-Rhap-(1→组成；
或者，所述杜仲叶多糖是一种同时含有α-型糖苷键和β-型糖苷键的酸性多糖，红外光谱中1617.03cm-1处出现的吸收峰和13C NMR中173.30ppm处的低场信号都证明了糖醛酸的存在。
3.根据权利要求1或2所述的杜仲叶多糖，其特征在于：所述杜仲叶多糖在建立的H22荷瘤小鼠模型中能够诱导肿瘤细胞的凋亡，将其DNA复制周期阻滞在S期，同时降低肿瘤细胞线粒体膜电位，以此来抑制肿瘤的生长。
4.如权利要求1至3任一项所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤如下：
(1)干燥的杜仲叶粉末作为原料，蒸馏水作为提取剂，采用水提醇沉法对杜仲叶粗多糖进行提取；
(2)采用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-200对杜仲叶多糖进行分离纯化，得到均一杜仲叶多糖EFP。
5.根据权利要求4所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：提取的具体方法为提取温度100℃，料液比为1:20，提取时间为3小时，提取次数3次，醇沉浓度为60％。
6.根据权利要求4所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：分离纯化的具体方法为采用Sephadex G-200凝胶柱进行洗脱，洗脱速度为0.1mL/min，每一管的收集时间设定为25min。
7.根据权利要求4所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：干燥是指在50℃的烘箱中干燥3小时，再过60目筛；
或者，步骤(1)中采用5g杜仲叶粉末采用250mL石油醚，在水浴70℃的条件下进行脱脂处理，冷凝回流6小时后进行烘干处理，得到脱脂的杜仲叶粉末；
或者，步骤(1)中杜仲叶粉末和水的比例为1:20，提取时间为3小时，提取次数为3次，醇沉浓度为60％；
或者，步骤(1)中提取液被浓缩至三分之一体积，得到浓缩液；
或者，步骤(1)中浓缩液中加入乙醇过夜后，通过在4000rpm下离心10min获得粗多糖。
8.根据权利要求4所述的杜仲叶多糖的提取分离方法，其特征在于：步骤(2)包括向杜仲叶粗多糖溶液中加入1/5倍体积的Sevage试剂，Sevage试剂由正丁醇和三氯甲烷以4:1的比例配置得到，充分震荡20min后静置，等待溶液分层，弃去蛋白层，多糖溶液和Sevage试剂进行回收，再补充少量的Sevage试剂。重复5-7次直到多糖溶液中不再看到蛋白层出现，剩余的有机试剂通过旋转蒸发仪除去；
或者，步骤(2)包括除去蛋白后的粗多糖溶液用蒸馏水在4℃透析(100kDa)3天，期间每隔8小时换一次水，冷冻干燥并收集得到粗杜仲叶多糖(cEFP)；
或者，步骤(2)中精准称量20mg样品cEFP溶于1mL蒸馏水中，通过0.45μm滤膜。采用Sephadex G-200凝胶柱进行洗脱，准确控制0.1mL/min为洗脱速度，每一管的收集时间设定为25min；
或者，步骤(2)包括利用苯酚-硫酸法测定每一管洗脱液中的组分，得到洗脱曲线。将同一组分的洗脱液进行合并、冻干，得到的多糖命名为EFP。
9.如权利要求1至3任一项所述的杜仲叶多糖在制备抗肿瘤药物的补充剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤药物为预防和/或治疗肝癌疾病的药物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116284486A (zh) * 2023-04-06 2023-06-23 金创克(珠海)生物技术有限公司 杜仲提取物及其制备方法和其在制备促进皮肤创伤愈合的产品中的应用

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