CN110790839A

CN110790839A - 抗pd-1抗体、其抗原结合片段及医药用途

Info

Publication number: CN110790839A
Application number: CN201910710377.9A
Authority: CN
Inventors: 顾晓玲; 叶鑫; 葛虎; 胡齐悦; 陶维康
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-08-03
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2039-08-02
Also published as: CN110790839B

Abstract

本公开涉及抗PD‑1抗体、其抗原结合片段及医药用途。具体地，本公开涉及包特定CDR区的人源化的抗PD‑1抗体及其抗原结合片段，以及包含抗PD‑1抗体及其抗原结合片段的药物组合物，及其作为药物的用途。特别地，本公开涉及一种人源化的抗PD‑1抗体在制备用于***的药物中的用途。

Description

抗PD-1抗体、其抗原结合片段及医药用途

技术领域

本公开属于生物技术领域，更具体地，本公开涉及抗PD-1抗体及其应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。

肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域一个长时期的热点，其中T细胞的肿瘤免疫治疗又处于其核心位置。肿瘤免疫治疗是充分利用、调动肿瘤患者体内的杀伤性T细胞，对肿瘤进行杀伤作用，它可能是最有效的也是最安全的***的途径。与此同时，肿瘤细胞逃逸是肿瘤免疫治疗面临的一个巨大障碍，肿瘤细胞利用其自身对免疫***的抑制作用促进了肿瘤的快速生长。

肿瘤的免疫逃逸机制与机体对肿瘤的免疫应答之间存在着极为复杂的关系。肿瘤免疫治疗早期肿瘤特异性的杀伤性T细胞是有其生物活性的，但随着肿瘤生长后期失去了杀伤的功能。所以肿瘤免疫治疗是为了最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫反应，它不但要在体内激活原有的免疫***反应，更要维持免疫***反应的持续时间和反应强度，才是免疫***的关键。

人体内T细胞的活化采取了两条信号通路***，除了需要通过抗原呈递细胞递呈MHC-抗原肽给T细胞提供第一信号外，还需要一系列协同刺激分子提供第二信号，进而才能使T细胞产生正常的免疫应答。这个双信号通路***对体内免疫***的平衡起着至关重要的作用，它严格调控机体对自身和非自身抗原产生不同的免疫应答。如果缺少协同刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无应答或持续特异性免疫应答，从而产生耐受。因此，第二信号通路在机体免疫应答的整个过程中起着非常关键的调节作用。

程序性死亡分子1(programmed death-l,PD-l)是1992年发现的表达在T细胞表面的一个蛋白受体，参与到细胞的凋亡过程之中。PD-l属于CD28家族，与细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T Iymphocyte antigen4,CTLA-4)具有23％的氨基酸同源性，但其表达却与CTLA不同，主要表达在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上。PD-1有两个配体，分别为PD-L1和PD-L2。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell,DC)上，在活化后细胞上的表达能够进行上调。而PD-L2的表达相对较局限，主要表达在抗原呈递细胞上，如活化的巨噬细胞和树突状细胞。

PD-L1通过和PD-1及B7-1的结合抑制免疫***，很多肿瘤细胞及肿瘤组织微环境的免疫细胞表达PD-L1。新的研究发现乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等人类肿瘤组织中检测到高PD-L1蛋白的表达，且PD-L1的表达水平和患者的临床及预后紧密相关。由于PD-L1起到第二信号通路抑制T细胞增殖的作用，所以阻断PD-L1/PD-1之间结合成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的新兴靶点。

目前有多家跨国制药公司在研发针对PD-L1/PD-1的单克隆抗体，它通过阻断PD-L1/PD-1之间结合，最大限度的提高患者自身对肿瘤的免疫***反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。FDA已经批准上市的5个PD-1/PD-L1抗体药物，包括抗PD1的抗体(Pembrolizumab,Novilumab)和抗PD-L1的抗体(Atezolizumab,Avelumab,Durvalumab)，已经被批准用于黑色素瘤，霍奇金淋巴瘤患者，非小细胞肺癌，肾癌，膀胱癌，头颈部鳞癌，胃癌，肝癌，默克尔皮肤癌，以及所有微卫星不稳定的实体瘤等肿瘤类型。更多的抗PD-L1/PD-1抗体专利见：WO0139722、WO2013173223、WO2014195852、WO2013181634、WO2015048520、WO2015036511、US2014335093、WO2014100079、WO2014055897、US6803192B1、WO2014022758、US8617546B2、WO2010089411A2、WO2015085847等。尽管一些抗PD-1抗体在血液肿瘤中的应答率(ORR)较好，但在晚期非小细胞肺癌应答率仅30％左右，在中晚期食管癌和胃癌中，单独给药的总应答率仅14％。本公开申请人曾通过筛选获得了一种抗PD-1抗体H005-1(WO2015085847中公开)，该抗体也已进入多项临床试验研究，并取得良好的临床效果。在2018年ASCO大会上公布的最新研究结果显示，在晚期非鳞非小细胞癌中，抗PD-1抗体联合阿帕替尼的治疗的有效率为41.2％，疾病控制率为94.1％。在胃癌和肝癌的临床研究中，抗PD-1抗体联合阿帕替尼治疗的有效率为30.6％，疾病控制率为83.3％。目前仍有必要继续开发出更有效的抗PD-1抗体。

发明内容

本公开提供与PD-1的胞外区的氨基酸序列或三维结构结合的抗PD-1抗体或抗原结合片段。具体的，本公开在H005-1的基础上得到一系列具有更高亲和力、更长体内半衰期、更高生物活性的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。

在一些可选的实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：

(i)如SEQ ID NO：6所示的重链HCDR1区，如SEQ ID NO：7所示的重链HCDR2区，和如SEQ ID NO：8或9所示的重链HCDR3区；和/或

(ii)分别如SEQ ID NO：10、11、12所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

其中所述的SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12分别具有如下所示的通式序列：

其中：X₁选自D或N，X₂选自L、R或Q，X₃选自T、S、G、N或D，X₄选自G、A或Y，X₅选自T、Y、N、S或D，X₆选自T、N或A，X₇选自T、G或L，X₈选自T、S或H，X₉选自R或L，X₁₀选自A、E或Q，X₁₁选自D、Y或S，X₁₂选自V或A，X₁₃选自S或T，X₁₄选自V、T或I。

在一些实施方式中，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：

如SEQ ID NO：6所示的重链HCDR1，如SEQ ID NO：16或17所示的重链HCDR2，如SEQID NO：8或9所示的重链HCDR3区；和/或

如SEQ ID NO：18-24任一氨基酸序列所示的轻链LCDR1，如SEQ ID NO：25-30任一氨基酸序列所示的轻链LCDR2区和SEQ ID NO：31-34任一氨基酸序列所示的轻链LCDR3区。

在一些实施方式中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：

(a)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(b)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(c)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(d)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(e)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(f)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(g)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：32所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(h)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(i)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

(j)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；或

(k)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区。优选地，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：

重链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

重链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些实施方式中，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包括FR区。

在一些实施方式中，所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的重链可变区和如SEQ ID NO：15所示的轻链可变区，其中所述的SEQ ID NO:13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15分别具有如下所示的通式序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFAX₁SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTQIGFTNWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：13

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFAX₁SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：14

DIQMTQSPSSLSASVGDX₁₅VTITCX₂ASQX₃IX₄X₅WLX₆WYQQKPGX₁₆X₁₇PKLLIX₁₈X₇ATX₈X₉X₁₀X₁ ₁GVPSRFSGSGSGTDFTLTIX₁₉SLQPEDFAX₂₀YYCQQX₁₂YX₁₃X₁₄PWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：15

其中X₁选自D或N，X₂选自L、R或Q，X₃选自T、S、G、N或D，X₄选自G、A或Y，X₅选自T、Y、N、S或D，X₆选自T、N或A，X₇选自T、G或L，X₈选自T、S或H，X₉选自R或L，X₁₀选自A、E或Q，X₁₁选自D、Y或S，X₁₂选自V或A，X₁₃选自S或T，X₁₄选自V、T或I，X₁₅选自R或I，X₁₆选自K或Q，X₁₇选自A或P，X₁₈选自Y或H，X₁₉选自S或G，X₂₀选自A或T。

在一些实施方式中，所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包含选自：如SEQ ID NO：35、36或37所示的重链可变区和如SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46或47任一所示的轻链可变区；

优选地，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：

如SEQ ID NO：36所示的重链可变区和如SEQ ID NO：40所示的轻链可变区；

如SEQ ID NO：37所示的重链可变区和如SEQ ID NO：40所示的轻链可变区；

如SEQ ID NO：36所示的重链可变区和如SEQ ID NO：41所示的轻链可变区；或

如SEQ ID NO：35所示的重链可变区和如SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46或47任一所示的轻链可变区；

更优选地，所述的抗PD-1抗体获其抗原结合片段优选包含：

如SEQ ID NO：35所示的重链可变区和SEQ ID NO：38所示的轻链可变区；或

如SEQ ID NO：35所示的重链可变区和SEQ ID NO：40所示的轻链可变区。

在一些实施方式中，所述抗体为全长抗体，其中所述抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，其它重链恒定区的非限制性实施包括在人IgG1、IgG2、IgG4的恒定区为改善功能所做的优化设计，如D265A、N297A、L234A/L235A或L234F/L235A等可以降低ADCC，P331S或附近的突变可降低CDC，还有S228P，F234A和L235A突变等；优选包含人源IgG1或IgG4重链恒定区，更优选包含引入F234A和L235A突变的IgG1或IgG4重链恒定区；所述抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区。

在另一些实施方式中，所述抗体为全长抗体，所述的PD-1抗体的重链恒定区选自IgG4野生型的恒定区，或在IgG4、IgG1的恒定区引入其他降低ADCC或CDC活性的突变，恒定区的不同，基本不会影响本公开中的抗体的功能。

在一些实施方式中，所述抗体为全长抗体，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的重链恒定区序列如SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示或与其具有至少85％序列同一性，轻链恒定区如SEQ ID NO：50所示或与其具有至少85％序列同一性。在一些实施方式中，所述具有至少85％序列同一性是具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一些实施方式中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段优选包含如SEQ ID NO：51所示的重链和如SEQ ID NO：52所示的轻链；或具有如SEQ ID NO：53所示的重链和如SEQ IDNO：54所示的轻链。

在一些实施方式中，所述抗原结合片段是选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段

一方面，本公开还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体与前述任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段竞争性结合人PD-1，或与前述任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段结合相同的人PD-1抗原表位。

另一方面，本公开提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据前述任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方式中，所述治疗有效量的抗体或其抗原结合片段为单位剂量0.1-3000mg/kg的如前所述抗体或其抗原结合片段。

在一些方面，本公开提供一种核酸分子，其编码前述任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。

在一些方面，本公开提供一种载体，其包含如前所述的核酸分子。

在一些方面，本公开提供一种用根据如前所述的载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。

在一些方面，本公开提供用于生产如前所述任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将前述的宿主细胞在培养物中进行培养以形成并积累前述任一项的抗体或其抗原结合片段，以及从培养物回收所述抗体或其抗原结合片段。

在一些方面，本公开提供用于免疫检测或测定人PD-L1的方法，所述方法包括使用如前所述任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。

在一些方面，本公开提供如前所述任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备肿瘤诊断剂中的应用。

在一些方面，本公开提供肿瘤的治疗方法，所述方法包括向受试者施用药物有效量的如前任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，或包含如前任一项所述的药物组合物，或如前任一项所述的核酸分子。在一些实施方案中，其中所述肿瘤选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经***癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、膀胱癌、***癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。更优选的，所述肿瘤为黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、膀胱癌。在一些实施方案中，其中所述肿瘤为PD-L1阳性肿瘤。

在一些方面，本公开提供如前任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，或包含如前所述的药物组合物，或如前所述的核酸分子在制备肿瘤药物中的用途。在一些实施方案中，其中所述肿瘤选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经***癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、膀胱癌、***癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病。在一些实施方案中，其中所述肿瘤为黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、膀胱癌。在一些实施方案中，其中所述肿瘤为PD-L1阳性肿瘤。

在一些方面，本公开提供用作抗肿瘤药物的如前任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。

本公开中的抗PD-1抗体或其抗原结合片段在生化测试或体外药效实验中，均表现出良好的效果。其中，在一项亲和力检测试验中，本公开的抗PD-1抗体均能有效阻断PD-1与其配体PD-L1的结合，其中抗PD-1抗体Ab05、Ab01的阻断活性均高于亲本抗体H005-1。

在亲和力检测试验发现，本公开的抗PD-1抗体均能够特异性的结合PD-1，其亲和力均显著亲本抗体H005-1。

在一项体外活性检测试验中发现，本公开中的抗PD-1抗体均能有效激活PBMC细胞分泌细胞因子IFNγ，并具有剂量依赖效应，其中，抗体Ab01，Ab05，Ab09在高浓度条件下激活PBMC细胞分泌IFNγ的作用明显高于亲本抗体H005-1。同时，本公开也检测了不同恒定区对抗PD-1抗体体外活性的影响，结果发现，IgG1型的抗体对PBMC细胞依然保持较高的激活作用，其中抗体Ab01-IgG1、Ab07-IgG1、Ab08-IgG1、Ab09-IgG1激活PBMC细胞分泌IFNγ的作用均明显高于亲本抗体。恒定区的不同，基本不会影响本公开中的抗体的功能。

在一项体内药代动力学测试中发现，本公开中的示例性抗体Ab05在食蟹猴体内具有良好的药物代谢表现，平均药物半衰期t1/2约6.2天，提示该抗体在食蟹猴体内稳定性良好。而在相同剂量(1mpk)下发现，其亲本抗体H005-1的半衰期t1/2约3.7天。

在转基因PD-1小鼠结肠癌模型MC38中试验中，本公开的抗体能显著抑制小鼠结肠癌MC38移植瘤的生长，其中Ab05 30mpk组第20天测量时抑瘤率达76.4％。

附图说明

图1：抗PD-1抗体对PD-1与PD-L1的结合阻断活性。

图2A-2C：PD-1抗体对PBMC细胞分泌IFNγ的促进作用。其中，图2A、2B显示的是IgG4型抗体对PBMC细胞分泌IFNγ的影响，图2C显示的是IgG1型抗体对PBMC细胞分泌IFNγ的影响。

图3：抗PD-1抗体在转基因PD-1小鼠结肠癌模型MC38中的作用。

具体实施方式

一.术语

为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

术语“程序性死亡1”、“细胞程序性死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”可互换使用，且包括人PD1的变体、同种型、物种同源物、以及与PD1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以GenBank登录号U64863找到。

术语“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种为PD-L2)，它在与PD-1结合时下调T细胞活化和细胞因子分泌。如本文中使用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1)，hPD-L1的变体、同种型、和种间同源物，以及5种与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hPD-L1序列可以用GenBank登录号Q9NZQ7查到。

术语“细胞因子”是由一个细胞群体释放的、作为细胞间介质作用于其它细胞的蛋白质的一般术语。这样的细胞因子的例子包括淋巴因子、单核因子、趋化因子和传统的多肽激素。示例性的细胞因子包括：人IL-2、IFN-γ、IL-6、TNFα、IL-17和IL-5。

本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

在本公开中，本公开所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本公开中，本公开所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

“亲和力成熟的抗体”指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，相比不具有所述改变的亲本抗体，所述改变导致抗体对抗原的亲和力或性能有所改善。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR或VL)和重链可变区(HCVR或VH)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，优选人源化抗体。

术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的针对人PD-1的单克隆抗体。制备时用PD-1抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源PD-1抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后***表达载体中，最后在真核***或原核***中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述的PD-1嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的PD-1嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如L234A和/或L235A突变，和/或S228P突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由酵母菌展示对CDR进行亲和力成熟后获得的人源化抗体。

CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的PD-1抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人PD-1抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。

“人抗体”(HuMAb)、“人源抗体”、“全人抗体”、“完全人抗体”可以互换使用，可以是源于人的抗体或者是从一种转基因生物体中获得的抗体，该转基因生物体经“改造”以响应于抗原刺激而产生特异性人抗体并且可以通过本领域已知的任何方法产生。在某些技术中，将人重链和轻链基因座的元素元件引入到源于胚胎干细胞系的生物体的细胞株中，这些细胞系中的内源性重链和轻链基因座被靶向破坏这些细胞系中包含靶向的内源性重链和轻链基因座破坏。转基因生物可以合成对人抗原特异的人抗体，并且该生物可以用于产生人抗体-分泌杂交瘤。人抗体还可以是一种抗体，其中重链和轻链是由源于一个或更多个人DNA来源的核苷酸序列编码的。全人抗体还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，或者由体外活化的B细胞构建，所有的这些都是本领域已知的。

术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，PD-1)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。在一些实施方案中，本公开的抗原结合片段为Fab、F(ab')2、Fab'、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)或包含CDR的肽等。

Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。在一些实施方案中，本公开的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理本公开的特异性识别人PD-1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过将编码所述抗体的Fab的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产所述Fab。

F(ab')2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。在一些实施方案中，本公开的F(ab')2可以通过用胃蛋白酶处理本公开的特异性识别人PD-1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab'来生产所述F(ab')2。

Fab'是通过切割上述F(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。在一些实施方案中，本公开的Fab'可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本公开的特异性识别PD-1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab')2来生产。

此外，可以通过将编码抗体的Fab'片段的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产所述Fab'。

术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

本公开的scFv可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人PD-1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。

双抗体是其中scFv或Fab被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。双特异性抗体和多特异性抗体是指能同时结合两个或多个抗原或抗原决定簇的抗体，其中包含scFv或Fab片段。

本公开的双抗体可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人PD-1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。

dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering,7,697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。

本公开的dsFv可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人PD-1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。

包含CDR的肽是通过包含VH或VL的CDR中的一个或多个区域而构成的。包含多个CDR的肽可以被直接相连或经由适合的肽接头相连。

本公开的包含CDR的肽可以通过以下步骤来生产：构建本公开的特异性识别人PD-1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将所述DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述肽。也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产所述包含CDR的肽。

术语“CDR”、“互补决定区”、“高变区”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)，“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。。

本文中使用的术语抗体“框架区”、“骨架区”或“FR”、“FR区”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，PD-L1分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-8M，例如大约小于10^-9M、10^- ¹⁰M、10^-11M或更小的亲和力(KD)结合。

术语“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约10^-8M或10^-9M的解离平衡常数(KD)结合PD-1，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。

当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如PD-1抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。

本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

氨基酸序列“同一性”指在比对氨基酸序列及必要时引入间隙，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。

术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。

现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人PD-1或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http://imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达***会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人PD-1特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

“施用”、“给予”或“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”或“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”或“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。示例性保守取代于下表“示例性氨基酸保守取代”中陈述。

示例性氨基酸保守取代

“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量，有效量还意指足以允许或促进诊断的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或更多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的本公开靶抗原相关病症的进展。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。

“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。例如，可以通过BLAST算法执行比较，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS):Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7:649-656。其他如NCBI BLAST提供的常规BLAST算法也为本领域技术人员所熟知。

本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。

本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51:263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。

“分离的”指纯化状态，并且在这种情况下意味着在指定的分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”并不意图指完全不存在这些材料或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以显著干扰如本文所述的化合物的实验或治疗用途的量存在。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

术语“药学上可接受的载体”指适合用于制剂中用于递送抗体或抗原结合片段的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲的盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。

此外，本公开包括用于治疗与PD-1阳性细胞相关的疾病的药剂，所述药剂包含本公开的抗PD-1抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

对与PD-1相关的疾病没有限制，只要它是与PD-1相关的疾病即可，例如利用本公开的分子诱导的治疗反应可通过结合人类PD-1，然后阻遏PD-1与其配体PD-L1、PD-L2的结合，或杀伤过表达PD-1的肿瘤细胞。因此，当处于适于治疗应用的制备物和制剂中时，本公开的分子对这样一些人是非常有用的，他们患有肿瘤或癌症，优选黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、非小细胞肺癌、膀胱癌等。

此外，本公开涉及用于免疫检测或测定PD-1的方法、用于免疫检测或测定PD-1的试剂、用于免疫检测或测定表达PD-1的细胞的方法和用于诊断与PD-1阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本公开的特异性识别人PD-1并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。

在本公开中，用于检测或测定PD-1的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。

免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。

上述与PD-1阳性细胞相关的疾病可以通过用本公开的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达PD-1的细胞来诊断。

为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS***(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。

在本公开中，对用于检测或测定PD-1的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达PD-1的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。

根据所需的诊断方法，含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。

二.实施例与测试例

以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1.抗原的制备

设计并合成人PD-1-IgG1Fc融合蛋白，N端为人PD-1胞外区150个氨基酸，C端为人IgG1的Fc段。经Protein A的亲和柱纯化，可获得高纯度的重组PD-1-Fc蛋白，用于检测抗PD-1抗体与抗原的结合。

人PD-1-IgG1Fc：(SEQ ID NO：1)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

注释：下划线部分为信号肽，正体部分为胞外区，斜体部分为hIgG1Fc(信号肽+胞外区+hIgG1Fc)。

实施例2.PD-1抗体的亲和力成熟酵母文库的构建以及文库的验证为获得药效更佳的抗人PD-1抗体，通过酵母展示平台技术对H005-1抗体进行亲和力成熟，在H005-1抗体的基础上设计并制备针对H005-1-scFv抗体的6个CDR的亲和力成熟酵母文库，并从中筛选新的人PD-1抗体。H005-1抗体的CDR和轻/重链可变区序列均来自WO2015085847A1，具体序列如下：

H005-1抗体重链序列：(SEQ ID NO：2)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

H005-1抗体轻链序列：(SEQ ID NO：3)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

注：下划线部分为抗体的可变区部分，加粗斜体部分为CDR区(CDR的氨基酸残基由Kabat编号***确定并注释)，其他无下划线正体部分为抗体恒定区部分。

H005-1-scFv氨基酸序列：(SEQ ID NO：4)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

H005-1-scFv基因序列：(SEQ ID NO：5)

GAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACATGATGAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCACAATCTCTGGCGGAGGCGCCAACACCTACTACCCCGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCTCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCCGGCAGCTGTACTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAG CGGCGGTGGCGGGTCGGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCTGGCCTCCCAGACCATCGGCACCTGGCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACACCGCCACCAGTCTGGCCGATGGCGTGCCCTCTAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGGTGTACTCCATCCCCTGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAG

注：下划线部分为linker序列。

酵母文库的构建：设计简并引物，通过PCR的方法将设计的突变氨基酸引入到H005-1-scFv抗体的文库中，每个文库的大小在10⁹左右，构建好的酵母菌文库通过二代测序的方法验证文库的多样性。

实施例3.抗体的筛选

在第一轮筛选中，将来自H005-1抗体文库的约5×10¹⁰个细胞与10μg/ml生物素化的人PD-1-IgG1Fc蛋白在50m1含0.1％牛血清白蛋白(BSA)-磷酸盐缓冲液(称为PBSA)中于室温下孵育1小时。然后，混合物用0.1％PBSA洗涤三次，以去除未结合的抗体片段。然后往结合生物素化人PD-1-IgG1Fc蛋白的PD-1的抗体文库中加入100μl链菌素微珠(Mi1enviBiotec,Auburn,CA)，并使其负载于AutoMACS***上用于分选。收集具有对PD-1的高亲和力的抗体文库的细胞，然后在SDCAA培养基(20g右旋糖，6.7g Difco酵母菌氮源-无氨基酸，5gBacto酪蛋白氨基酸，5.4gNa2HP04和8.56g NaH₂PO₄·H₂O，溶解于1L蒸榴水中)中于250rpm和30℃下扩增24小时。然后，将培养物在SGCAA培养基(20g半乳糖，6.7g Difco酵母菌氮源-无氨基酸，5g Bacto酪蛋白氨基酸，5.4g Na2HP04和8.56g NaH₂PO₄·H₂O，溶解于1L蒸榴水中)中，于250rpm和20℃下诱导18个小时。将所得到的富集文库进行针对与生物素化的重组人PD-1-IgG1Fc的结合的第二轮筛选。为了确保用于第二和/或第三轮筛选的抗体文库的充分多样性，将来自前一轮的文库大小的100倍用作输入的细胞数量。

对于第三轮和第四轮的筛选，将来自前一轮的文库细胞与1μg/ml生物素化的人PD-1-IgG1Fc蛋白和10μg/ml Mouse Anti-cMyc(9E10,sigma)抗体在0.1％PBSA中于室温下孵育1小时，混合物用0.1％PBSA洗涤三次，以去除未结合的抗体片段。加入Goat anti-mouse-Alexa488(A-11001,life technologies)和Strepavidin-PE(S-866,Lifetechnologies)于4℃下孵育1小时，混合物用0.1％PBSA洗涤三次，以去除未结合的抗体片段。最后，通过FACS筛选(BD FACSAriaTM FUSION)出亲和力高的抗体。

H005-1文库利用生物素化的人PD-1-IgG1Fc抗原，经过两轮MACS筛选(链霉素磁珠，Invitrogen)和两轮FACS筛选(BD FACSAriaTM FUSION，再挑选400个左右的酵母单克隆培养和诱导表达，使用FACS(BD FACSCanto II)检测酵母单克隆对人PD-1-IgG1Fc抗原的结合，挑选出比野生型H005-1抗体亲和力高的酵母单克隆进行测序验证，对测序克隆进行比对分析，去除冗余序列之后，将非冗余序列转换成全长IgG(γ1，κ)后进行哺乳动物细胞表达。亲和纯化之后的全长抗体采用BIAcoreTM X-100(GE Life Sciences)进行亲合力测定。

1、筛选确认选择抗体的CDR区序列。

基于H005-1抗体序列的突变文库所挑选的克隆与H005-1抗体在HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3上均有差异。相关的CDR(CDR的氨基酸残基由Kabat编号***确定并注释)序列或通式，及其相应轻/重链可变区如下所描述：

获得相关的重链可变区序列通式如下：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFAX₁SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTQIGFTNWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：13)

或

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFAX₁SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：14)。

获得相关的轻链可变区序列通式如下：

DIQMTQSPSSLSASVGDX₁₅VTITCX₂ASQX₃IX₄X₅WLX₆ WYQQKPGX₁₆X₁₇PKLLIX₁₈ X₇ATX₈X₉X₁₀X₁ ₁ GVPSRFSGSGSGTDFTLTIX₁₉SLQPEDFAX₂₀YYCQQX₁₂YX₁₃X₁₄PWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：15)。

上述CDR和重、轻链可变区中X₁选自D或N，X₂选自L、R或Q，X₃选自T、S、G、N或D，X₄选自G、A或Y，X₅选自T、Y、N、S或D，X₆选自T、N或A，X₇选自T、G或L，X₈选自T、S或H，X₉选自R或L，X₁₀选自A、E或Q，X₁₁选自D、Y或S，X₁₂选自V或A，X₁₃选自S或T，X₁₄选自V、T或I，X₁₅选自R或I，X₁₆选自K或Q，X₁₇选自A或P，X₁₈选自Y或H，X₁₉选自S或G，X₂₀选自A或T。

获得的具体相关序列包括但不限于表1和表2所述：

表1.亲和力筛选获得的抗体重链可变区

表2.亲和力筛选获得的抗体轻链可变区序列

获得抗体轻、重链可变区具体序列如下：

VH1重链可变区(SEQ ID NO：35)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTQIGFTNWGQGTTVTVSS

VH2重链可变区(SEQ ID NO：36)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFANSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTQIGFTNWGQGTTVTVSS

VH3重链可变区(SEQ ID NO：37)：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSS

VL1轻链可变区(SEQ ID NO：38)：

DIQMTQSPSSLSASVGDIVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

VL2轻链可变区(SEQ ID NO：39)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGYWLNWYQQKPGKAPKLLIYGATSLAYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYTTPWTFGGGTKVEIK

VL3轻链可变区(SEQ ID NO：40)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSIPWTFGGGTKVEIK

VL4轻链可变区(SEQ ID NO：41)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGNWLAWYQQKPGKPPKLLIYLATSRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

VL5轻链可变区(SEQ ID NO：42)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIHTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAAYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

VL6轻链可变区(SEQ ID NO：43)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGIGYWLNWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYTTPWTFGGGTKVEIK

VL7轻链可变区(SEQ ID NO：44)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIASWLAWYQQKPGKAPKLLIYLATTREYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSVPWTFGGGTKVEIK

VL8轻链可变区(SEQ ID NO：45)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTIGSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

VL9轻链可变区(SEQ ID NO：46)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIYDWLAWYQQKPGQAPKLLIYLATSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

VL10轻链可变区(SEQ ID NO：47)：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQDIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLATHRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

注：上述轻/重链可变区序列中，划线部分为CDR区(CDR的氨基酸残基由Kabat编号***确定并注释)。

2、全长抗体序列的构建：

本公开中的抗体重链可变区可与选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、或其变体的重链恒定区连接形成抗体全长重链；抗体轻链可变区可与选自人κ链或λ链、或其变体的轻链恒定区连接形成抗体全长轻链。本领域公知，IgG1的Fc突变比如D265A、N297A、L234A/L235A或L234F/L235A等可以降低ADCC，P331S或附近的突变可降低CDC；IgG2的突变以及IgG2/4的Fc杂交抗体也可以降低ADCC和CDC；IgG4的恒定区ADDC活性较低；另外，在IgG4或IgG1的恒定区引入F234A和L235A突变(mAbs 4:3,310-318；May/June 2012)，可改变CH2结构域，降低与Fc受体的相互作用，从而降低ADCC活性。这些公知的IgG1、IgG4、或其突变体均可作为本公开的抗PD-1抗体的恒定区。示例性的，本公开抗体可选自如下所示轻/重链恒定区：

IgG4重链恒定区(SEQ ID NO：48)：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：49)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：50)：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

示例性地，将前述筛选获得的衍生自H005-1突变抗体文库的抗体的重链可变区与如SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的重链恒定区连接形成抗体重链，轻链可变区与和如SEQ ID NO：50所示的轻链kappa恒定区连接形成抗体轻链，然后轻链和重链组合进而形成完整抗体，所得的部分抗体的序列如下表3所示：

表3.由H005-1突变衍生的抗体的序列

备注：例如“Ab01”表示编号为Ab01的抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO：35所示，重链恒定区序列如SEQ ID NO：48所示，且其轻链可变区序列如SEQ ID NO：38所示，轻链恒定区序列如SEQ ID NO：50所示。

示例性的，Ab01抗体的重链(SEQ ID NO：51)如下：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFADSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTQIGFTNWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

Ab01抗体的轻链(SEQ ID NO：52)如下：

DIQMTQSPSSLSASVGDIVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Ab05抗体的重链(SEQ ID NO：53)如下：

Ab05抗体的轻链(SEQ ID NO：54)如下：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

注：划线部分为可变区，加粗部分为CDR区。

本公开以Merck的PD-1抗体Keytruda为阳性对照，Keytruda(Merck，Pembrolizumab，参见WHO Drug Information，第27卷，第2期，第161-162页(2013))的轻重链氨基酸序列如下：

>Keytruda重链:(SEQ ID NO：55)

QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVT LTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

>Keytruda轻链:(SEQ ID NO：56)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGS GSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

备注：划线部分为可变区。

PD-1抗体经常规方法纯化获得。

实施例4.抗体和配体阻断试验

深入研究了本品对PD-1与PD-L1结合的阻断作用，同时与在临床试验中的同类产品进行了比较。Promega公司构建了过表达PD-1和NFAT驱动的荧光素酶报告基因的Jurkat细胞(CS187102,Promega)以及过表达PD-L1的CHO-K1细胞(CS187108,Promega)。该体系通过检测luminescence来反应抗体阻断PD-1与PD-L1结合的能力。实验过程简单描述如下：消化CHOK1/PD-L1细胞(CS187108,Promega)，按照100μL/孔加入到96孔板中，放置于37℃，5％CO₂培养箱培养24小时。使用PBS稀释对照品(C25-IgG为阴性对照(实验室制备))和样品至所需浓度。计数Jurkat/PD1细胞(CS187102,Promega)，按一定比例接种于已种有CHOK1/PD-L1细胞的细胞培养板中(90μL/孔)，10μL/孔加入稀释后的抗体，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养5小时。取出细胞培养板，置于室温放置5分钟，然后每孔加入50μl Bio-GloTMReagent(G7940,Promega)，室温孵育5分钟，使用酶标仪(PerkinElmerVictor3，型号：1420-012)读板，读板通道是luminescence。数据详见表4和图1。

表4.抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体的结合测试

结果显示，本公开中示例性的抗PD-1抗体Ab05和Ab01能够有效阻断PD-1与PD-L1的结合。

实施例5.实例性抗体的BIAcore抗体亲和力实验

用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556,GE)亲和捕获IgG，人PD-1抗原(Cat.#10377H08H，Sino Biological)流过芯片表面，Biacore T200仪器实时检测抗PD-1抗体和抗原PD-1反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用10mM Glycine-HClpH1.5的缓冲液将生物传感芯片洗净再生。实验缓冲体系为1×HBS-EP缓冲溶液(Cat#BR-1001-88，GE)。实验结束后用GE Biacore T200 Evaluation version3.0软件以(1:1)Langmuir模型拟合数据，得出亲和力数值，同一批次的实验结果见表5。

表5.不同抗体与人PD-L1的亲和力

同一批次的实验结果显示，筛选得到的抗PD-1抗体，都能够与人PD-1结合，并且亲和力都高于Keytruda和H005-1。其中Ab05，Ab01与人PD-1结合的亲和力为2.8nM，2.56nM，而Keytruda，H005-1的亲和力分别为5.81nM，14.6nM。

实施例6.实例性抗体在PBMC-T淋巴细胞激活实验中对细胞IFNγ的分泌作用

为了研究抗PD-1抗体对人原代T淋巴细胞功能的影响，收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，采用结核菌素(TB)体外刺激5天后，检测细胞因子IFNγ分泌水平。实验过程简单描述如下：

新鲜血液利用Ficoll-Hypaque(17-5442-02，GE)，密度梯度离心(Stem CellTechnologies)得到PBMC，于RPMI 1640(SH30809.01，GE)培养基中培养，该培养基中添加10％(v/v)FBS(10099-141，Gibco)，37℃，5％CO₂条件下培养。

新鲜分离纯化的PBMC以RPMI 1640培养基调整密度为2×10⁶个/ml，20mL细胞悬液中加入40μl结核菌素(97-8800，Synbiotics)，37℃，5％CO₂培养箱培养5天。第5天，收集上述培养的细胞离心，重悬至新鲜的RPMI 1640培养基中，调整密度为1.1×10⁶个/ml，接种至96孔细胞培养板，每孔90μl。同时加入梯度稀释的抗体样品，用PBS(B320,上海源培生物科技股份有限公司)稀释，每孔10μl。细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱孵育3天。取出细胞培养板，离心(4000rpm，10min)收集细胞培养上清，采用ELISA的方法(人IFN-γ检测试剂盒(EHC102g.96，欣博盛)，检测IFN-γ的水平。具体操作参考试剂说明书。

结果(见图2A-2C)显示，在所测试的抗PD-1抗体分子中，所有抗体都可以激活IFN-γ的分泌，其中Ab01，Ab05，Ab09在高浓度条件下激活IFN-γ分泌的能力明显优于H005-1。

测试例7.实例性抗体的药代动力学测试

动物在给药剂量1mpk的抗PD-1抗体样品后于不同时间点采取血清，使用直接ELISA的实验方法作不同样品的标准曲线，100μL0.5μg/mL PD-1-His(Cat.#10377H08H，Sino Biological)铺板，4℃孵育过夜，200μL3％milk封闭，加入100μL样品，稀释50倍上板，37℃孵育2h，加入吸附二抗goat Anti-Human IgG Fc-HRP(1:5000)100μL，37℃孵育1h，TMB显色，1M H₂SO₄终止，读板。所得数据由Phoenix WinNonlin软件分析计算药代动力学相关参数。

实验用食蟹猴，普通级，雄性，3-7岁，4-8公斤，由美迪西普亚医药科技(上海)有限公司饲养，来源于广西雄森灵长类实验动物养殖开发有限公司。动物在纳入实验前按SOP要求进行检疫及适应饲养。饲养环境：通过自动计时控制器控制，每天提供大约12小时的光照。黑暗时间可以因研究相关活动的需求而间歇性中断。动物房环境温度和相对湿度分别控制在19-26℃和40-70％范围内，并每天监测记录。对食蟹猴进行分组，每组3只，分别编号mon1，mon2，mon3。实验当天，每只食蟹猴分别静脉注射受试药物，单次给药，给药剂量为1mg/kg，静脉输注(30min内)完成；给药体积(2ml/kg)。

分别于给药前，静脉输注开始后5min，15min，0.5h，8h，Day2(24h)，Day3(48h)，Day5(96h)，Day8(168h)，Day11(240h)，Day15(336h)，Day29(672h)，Day43(1008h)，Day57(1344h)，Day71(1680h)和Day85(2016h)经头静脉或隐静脉穿刺采血大约2.0mL，置于采血管(无抗凝剂)用于分离血清。采集后4℃放置30分钟1000g离心15min，取上清(血清)置于EP管中，分成2管于-80℃保存(血清采集后2h内完成)。

在食蟹猴中测定了Ab05和亲本抗体H005-1在1mpk剂量下的药物代谢参数，结果显示Ab05具有良好的食蟹猴体内药物代谢表现，平均药物半衰期t1/2约6.2天，见下表6，提示该抗体在食蟹猴体内稳定性良好。而在相同剂量(1mpk)下发现，H005-1的半衰期t1/2约3.7天。实验结果见表6。

表6.抗PD-1抗体的药代动力学参数

注：RSD(relative standard deviation)表示相对标准偏差。

测试例8.抗PD-1抗体在转基因PD-1小鼠结肠癌模型MC38中的作用

转基因PD-1小鼠来源于购买的转基因PD-1小鼠(ISIS INNOVATION LIMITED，University Offices，Wellington Square，Oxford OX1 2JD，England)在CephrimBiosciences，Inc.培育的第五代小鼠。将MC38细胞以5×10⁵个/100μl/只接种到hPD-1转基因小鼠(雌雄各半)右肋后部皮下，待小鼠平均肿瘤体积达到80-100mm³之间时，去除体重、肿瘤过大和过小的动物，按照肿瘤体积大小将荷瘤小鼠随机分为5组(每组8只)：阴性对照hIgG control-30mpk、H005-1-10mpk、Keytruda-30mpk、Ab05-10mpk、Ab05-30mpk。分组给药日设定为Day0。分组后腹腔给予各药物，给药周期22天，每两天给药一次，共11次。每周测2次瘤体积，称体重，记录数据。各组动物体重、肿瘤体积均用平均值±标准差(Mean±SEM)表示，并用Graphpad Prism5和Excel软件作图，使用student t test统计分析。

肿瘤体积(TV)＝0.5236×L_长×L_短 ²

肿瘤增殖率T/C％＝(T-T0)/(C-C0)×100％

抑瘤率％TGI＝1-T/C％

(其中，T、T0分别表示抗体给药组试验结束和试验开始时的肿瘤体积，C、C0分别表示空白对照组试验结束和试验开始时的肿瘤体积)

试验结果见下表7和附图3所示，试验结果表明，与对照组相比，本公开的抗体能显著抑制小鼠结肠癌MC38移植瘤的生长，其中抑瘤率最高的是Ab0530mpk组，第20天测量时抑瘤率达76.4％，即使低剂量组(10mpk)，Ab05-10mpk组的药效也好于阳性对照H005-1-10mpk。

表7.抗PD-1抗体对小鼠结肠癌MC38的抑瘤率影响

备注：表中“IP”表示腹腔注射；“Q2Dx11”表示每两天给药一次，共11次

虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本公开的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

上海恒瑞医药有限公司

<120> 抗PD-1抗体、其抗原结合片段及医药用途

<150> 201810875621.2

<151> 2018-08-03

<160> 56

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> 人PD-1-IgG1Fc

<400> 1

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn

20 25 30

Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn

35 40 45

Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu

50 55 60

Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala

65 70 75 80

Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val

85 90 95

Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala

100 105 110

Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala

115 120 125

Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr

130 135 140

Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg

145 150 155 160

Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

165 170 175

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

180 185 190

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

195 200 205

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

210 215 220

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

225 230 235 240

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

245 250 255

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

260 265 270

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

275 280 285

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

290 295 300

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

305 310 315 320

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

325 330 335

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

340 345 350

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

355 360 365

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

370 375 380

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

385 390 395 400

Lys

<210> 2

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> H005-1抗体重链序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> H005-1抗体轻链序列

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<223> H005-1-scFv氨基酸序列

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile

145 150 155 160

Gly Thr Trp Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

165 170 175

Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser

210 215 220

Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 5

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<223> H005-1-scFv基因序列

<400> 5

gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60

tcttgtgccg cctccggctt caccttctcc agctacatga tgagctgggt gcgacaggcc 120

cctggcaagg gactggaatg ggtggccaca atctctggcg gaggcgccaa cacctactac 180

cccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tctcgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc ccggcagctg 300

tactacttcg actactgggg ccagggcacc accgtgaccg tgtcctctgg tggaggcggt 360

tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg tcggacatcc agatgaccca gtccccctcc 420

agcctgtctg cctctgtggg cgacagagtg accatcacct gtctggcctc ccagaccatc 480

ggcacctggc tgacctggta tcagcagaag cctggcaagg cccccaagct gctgatctac 540

accgccacca gtctggccga tggcgtgccc tctagattct ccggctctgg ctctggcacc 600

gactttaccc tgaccatcag ctccctgcag cccgaggact tcgccaccta ctactgccag 660

caggtgtact ccatcccctg gacctttggc ggaggcacca aggtggaaat caag 714

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR1序列

<400> 6

Ser Tyr Met Met Ser

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR2序列通式

<220>

<221> DOMAIN

<222> (13)..(13)

<223> Xaa选自Asp或Asn.

<400> 7

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Xaa Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR3

<400> 8

Thr Gln Ile Gly Phe Thr Asn

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR3序列

<400> 9

Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1序列通式

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(1)

<223> Xaa选自Leu, Arg或Gln.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (5)..(5)

<223> Xaa选自Thr,Ser,Gly,Asn或Asp.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (7)..(7)

<223> Xaa选自Gly,Ala 或 Tyr.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (8)..(8)

<223> Xaa选自Thr,Tyr,Asn,Ser 或 Asp.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (11)..(11)

<223> Xaa选自Thr, Asn 或 Ala.

<400> 10

Xaa Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Trp Leu Xaa

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2序列通式

<220>

<221> DOMAIN

<222> (1)..(1)

<223> Xaa选自Thr,Gly 或 Leu.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (4)..(4)

<223> Xaa选自Thr,Ser 或 His.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (5)..(5)

<223> Xaa选自Arg 或 Leu.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (6)..(6)

<223> Xaa选自Ala,Glu 或 Gln.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (7)..(7)

<223> Xaa选自Asp,Tyr 或 Ser.

<400> 11

Xaa Ala Thr Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR3通式序列

<220>

<221> DOMAIN

<222> (3)..(3)

<223> Xaa选自Val或Ala.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (5)..(5)

<223> Xaa选自Ser或Thr.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (6)..(6)

<223> Xaa选自Val或Ile.

<400> 12

Gln Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Trp Thr

1 5

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> 重链可变区序列通式

<220>

<221> DOMAIN

<222> (62)..(62)

<223> Xaa选自Asp或Asn.

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Xaa Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gln Ile Gly Phe Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> 重链可变区序列通式

<220>

<221> DOMAIN

<222> (62)..(62)

<223> Xaa选自Asp或Asn.

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Xaa Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> 轻链可变区序列通式

<220>

<221> DOMAIN

<222> (18)..(18)

<223> Xaa选自Arg或Ile.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (24)..(24)

<223> Xaa选自Leu, Arg或Gln.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (28)..(28)

<223> Xaa选自Thr,Ser,Gly,Asn 或 Asp.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (30)..(30)

<223> Xaa选自Gly,Ala或Tyr.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (31)..(31)

<223> Xaa选自Thr,Tyr,Asn,Ser 或 Asp.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (34)..(34)

<223> Xaa选自Thr,Asn 或 Ala.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (42)..(42)

<223> Xaa选自Lys或Gln.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (43)..(43)

<223> Xaa选自Ala或Pro.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (49)..(49)

<223> Xaa选自Tyr或His.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (50)..(50)

<223> Xaa选自Thr,Gly或Leu.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (53)..(53)

<223> Xaa选自Thr,Ser或His.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (54)..(54)

<223> Xaa选自Arg或Leu.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (55)..(55)

<223> Xaa选自Ala,Glu或Gln.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (56)..(56)

<223> Xaa选自Asp,Tyr或Ser.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (76)..(76)

<223> Xaa选自Ser或Gly.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (85)..(85)

<223> Xaa选自Ala或Thr.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (91)..(91)

<223> Xaa选自Val或Ala.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (93)..(93)

<223> Xaa选自Ser或Thr.

<220>

<221> DOMAIN

<222> (94)..(94)

<223> Xaa选自Val或Ile.

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Xaa Val Thr Ile Thr Cys Xaa Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Trp

20 25 30

Leu Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Xaa Xaa Ala Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Xaa Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR2

<400> 16

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> HCDR2

<400> 17

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 18

Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Thr

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 19

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Tyr Trp Leu Asn

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 20

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 21

Gln Ala Ser Gln Gly Ile Gly Tyr Trp Leu Asn

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 22

Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ala Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 23

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR1

<400> 24

Leu Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2

<400> 25

Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp

1 5

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2

<400> 26

Gly Ala Thr Ser Leu Ala Tyr

1 5

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2

<400> 27

Leu Ala Thr Ser Arg Glu Ser

1 5

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2

<400> 28

Leu Ala Thr Thr Arg Glu Tyr

1 5

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2

<400> 29

Leu Ala Thr Ser Arg Gln Ser

1 5

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR2

<400> 30

Leu Ala Thr His Arg Gln Ser

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR3

<400> 31

Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR3

<400> 32

Gln Gln Ala Tyr Thr Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR3

<400> 33

Gln Gln Ala Tyr Ser Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> LCDR3

<400> 34

Gln Gln Val Tyr Ser Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 35

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VH1 重链可变区

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gln Ile Gly Phe Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VH2 重链可变区

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gln Ile Gly Phe Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VH3 重链可变区

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL1轻链可变区

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Ile Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL2轻链可变区

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Tyr Trp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Thr Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL3轻链可变区

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL4轻链可变区

<400> 41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Thr Ser Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL5轻链可变区

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 43

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL6轻链可变区

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Ile Gly Tyr Trp

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Thr Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 44

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL7轻链可变区

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ala Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Thr Thr Arg Glu Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL8轻链可变区

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL9轻链可变区

<400> 46

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Thr Ser Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> VL10轻链可变区

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Thr His Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> IgG4重链恒定区

<400> 48

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 49

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> IgG1重链恒定区

<400> 49

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> DOMAIN

<223> kappa轻链恒定区

<400> 50

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 51

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Ab01抗体的重链

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gln Ile Gly Phe Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 52

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Ab01抗体的轻链

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Ile Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 53

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Ab05抗体的重链

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Gln Ile Gly Phe Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 54

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Ab05抗体的轻链

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 55

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Keytruda重链

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 56

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<223> Keytruda轻链

<400> 56

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.一种抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：

(i)如SEQ ID NO：6所示的重链HCDR1区，如SEQ ID NO：7所示的重链HCDR2区，和如SEQID NO：8或9所示的重链HCDR3区；和/或

(ii)分别如SEQ ID NO：10、11、12所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区；

HCDR2TISGGGANTYFAX₁SVKG SEQ ID NO：7

LCDR1X₂ASQX₃IX₄X₅WLX₆ SEQ ID NO：10

LCDR2X₇ATX₈X₉X₁₀X₁₁ SEQ ID NO：11

LCDR3QQX₁₂YX₁₃X₁₄PWT SEQ ID NO：12

2.根据权利要求1所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：

如SEQ ID NO：6所示的重链HCDR1，如SEQ ID NO：16或17所示的重链HCDR2，如SEQ IDNO：8或9所示的重链HCDR3区；和/或

如SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23或24任一氨基酸序列所示的轻链LCDR1，如SEQ IDNO：25、26、27、28、29或30任一氨基酸序列所示的轻链LCDR2区和SEQ ID NO：31、32、33或34任一氨基酸序列所示的轻链LCDR3区。

3.根据权利要求2所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：

(k)分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：8所示的重链HCDR1、HCDR2、HCDR3区，和分别如SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示的轻链LCDR1、LCDR2、LCDR3区。

4.根据权利要求1-3任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包括FR区。

5.根据权利要求4所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的重链可变区和如SEQ ID NO：15所示的轻链可变区，其中所述的SEQ ID NO:13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15分别为具有如下所示的通式序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFAX₁SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR TQIGFTNWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：13

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYFAX₁SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR QLYYFDYWGQGTTVTVSS SEQIDNO：14DIQMTQSPSSLSASVGDX₁₅VTITCX₂ASQX₃IX₄X₅WLX₆ WYQQKPGX₁₆X₁₇PKLLIX₁₈ X₇ATX₈X₉X₁₀X₁₁ GVPSRFSGSGSGTDFTLTIX₁₉SLQPEDFAX₂₀YYCQ QX₁₂YX₁₃X₁₄PWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO：15其中X₁选自D或N，X₂选自L、R或Q，X₃选自T、S、G、N或D，X₄选自G、A或Y，X₅选自T、Y、N、S或D，X₆选自T、N或A，X₇选自T、G或L，X₈选自T、S或H，X₉选自R或L，X₁₀选自A、E或Q，X₁₁选自D、Y或S，X₁₂选自V或A，X₁₃选自S或T，X₁₄选自V、T或I，X₁₅选自R或I，X₁₆选自K或Q，X₁₇选自A或P，X₁₈选自Y或H，X₁₉选自S或G，X₂₀选自A或T。

6.根据权利要求5所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO：35、36或37所示的重链可变区和如SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46或47任一所示的轻链可变区；

优选地，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含：

如SEQ ID NO：35所示的重链可变区和如SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46或47任一所示的轻链可变区。

7.根据权利要求1至6任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1或IgG4重链恒定区，更优选包含引入F234A和L235A突变的IgG1或IgG4重链恒定区；所述抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区。

8.根据权利要求7所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的重链恒定区序列如SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示或与其具有至少85％序列同一性，轻链恒定区如SEQ ID NO：50所示或与其具有至少85％序列同一性。

9.根据权利要求1-8任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO：51所示的重链和如SEQ ID NO：52所示的轻链；或包含如SEQ ID NO：53所示的重链和如SEQ ID NO：54所示的轻链。

10.根据权利要求1至7任一项所述的的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自Fab、Fab'、F(ab')₂、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。

11.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段与权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争性结合人PD-1，或与权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段结合相同的人PD-1抗原表位。

12.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至11任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

13.一种核酸分子，其编码权利要求1至11任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。

14.一种载体，其包含如权利要求13所述的核酸分子。

15.一种用根据权利要求14所述的载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。

16.一种制备如权利要求1至11任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将如权利要求15所述的宿主细胞在培养物中进行培养以形成并积累如权利要求1至11任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，以及从培养物中回收所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的步骤。

17.一种用于免疫检测或测定PD-1的方法，所述方法包括使用权利要求1至11任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。

18.根据权利要求1至11任一项所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备肿瘤的诊断剂中的用途。

19.根据权利要求1-11任一项的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求12所述的药物组合物，或权利要求13所述的核酸分子在制备***的药物中的用途；优选的，所述肿瘤选自：头和颈鳞状细胞癌、头和颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经***癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝细胞瘤、肝细胞癌、肝胆癌、胰腺癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子***、膀胱癌、***癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、库肯勃氏瘤、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌；更优选的，所述淋巴瘤选自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞性淋巴瘤，所述肺癌选自：非小细胞肺癌和小细胞肺癌，所述白血病选自：慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、淋巴细胞白血病、成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和髓样细胞白血病；最优选的，所述肿瘤为黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、非小细胞肺癌或膀胱癌。