CN110540991B - 使用截短的引导RNA(tru-gRNA)提高RNA引导的基因组编辑的特异性 - Google Patents

使用截短的引导RNA(tru-gRNA)提高RNA引导的基因组编辑的特异性 Download PDF

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Abstract

CRISPR‑Cas基因组编辑使用引导RNA将Cas9核酸酶导向靶DNA，所述引导RNA包括通过碱基配对结合靶DNA的互补区和Cas9结合区。还公开了通过使用截短的引导RNA(tru‑gRNA)，使用CRISPR/Cas9***提高RNA引导的基因组编辑的特异性的方法。

Description

使用截短的引导RNA(tru-gRNA)提高RNA引导的基因组编辑的 特异性
本发明是基于申请日为2014年3月14日，申请号为 “201480026133.4”(国际申请号为PCT/US2014/029068)，发明名称 为“使用截短的引导RNA(tru-gRNA)提高RNA引导的基因组编辑的 特异性”的专利申请的分案申请。
优先权申明
本申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请系列第 61/799,647号、2013年6月21日提交的美国专利申请系列第 61/838,178号、2013年6月21日提交的美国专利申请系列第 61/838,148号和2013年12月26日提交的美国专利申请系列第 61/921,007号的权益。前述专利申请系列号的完整内容在此通过引用 并入。
联邦资助的研究或开发
本发明是在由美国国家卫生研究院授予的基金第DP1 GM105378号下借助政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
用于提高RNA引导的基因组编辑(例如使用CRISPR/Cas9***， 使用截短的引导RNA(tru-gRNA)编辑)的特异性的方法。
背景
最近的工作已显示成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR- 相关(Cas)***(Wiedenheft等，Nature 482，331-338(2012)；Horvath 等，Science 327，167-170(2010)；Terns等，Curr Opin Microbiol 14， 321-327(2011))可用作在细菌、酵母和人细胞中以及在体内在完整生 物体诸如果果蝇、斑马鱼和小鼠中进行基因组编辑的基础(Wang等，Cell153，910-918(2013)；Shen等，Cell Res(2013)；Dicarlo等， Nucleic Acids Res(2013)；Jiang等，Nat Biotechnol 31，233-239(2013)； Jinek等，Elife 2，e00471(2013)；Hwang等，Nat Biotechnol 31，227-229 (2013)；Cong等，Science 339，819-823(2013)；Mali等，Science 339， 823-826(2013c)；Cho等，Nat Biotechnol 31，230-232(2013)；Gratz 等，Genetics 194(4)：1029-35(2013))。来自化脓性链球菌(S.pyogenes) 的Cas9核酸酶(在下文中简称为Cas9)可通过工程化引导RNA(gRNA) 的前20个核苷酸与紧接前间区序列邻近基序(PAM)例如匹配序列 NGG或NAG的PAM之后的目标靶基因组DNA序列的互补链之间 的碱基对互补序列来引导(Shen等，Cell Res(2013)；Dicarlo等， Nucleic Acids Res(2013)；Jiang等，Nat Biotechnol 31，233-239(2013)； Jinek等，Elife 2，e00471(2013)；Hwang等，Nat Biotechnol 31，227-229 (2013)；Cong等，Science 339，819-823(2013)；Mali等，Science 339， 823-826(2013c)；Cho等，Nat Biotechnol 31，230-232(2013)；Jinek 等，Science 337，816-821(2012))。在体外(Jinek等，Science 337， 816-821(2012))于细菌中(Jiang等，Nat Biotechnol 31，233-239(2013)) 和人细胞中(Cong等，Science 339，819-823(2013))进行的先前研究已 显示Cas9-介导的裂解在一些情况下可被gRNA/靶位点交界处上，特别地位于20nt gRNA互补区的3’末端中的最后10-12个核苷酸(nt)中 的单个错配消除。
概述
CRISPR-Cas基因组编辑使用引导RNA，其包括互补区(其通过 碱基配对结合靶DNA)和Cas9-结合区，以将Cas9核酸酶导向靶 DNA(参见图1)。所述核酸酶可耐受互补区中的许多错配(多达5个， 如本文中显示的)并且仍然裂解；难以预测任何给定的单个错配或错 配的组合对活性的影响。综上所述，这些核酸酶可显示显著的脱靶效 应，但预测这些位点可具有挑战性。本文中描述了用于使用CRISPR/Cas***，例如使用Cas9或基于Cas9的融合蛋白提高基因 组编辑的特异性的方法。具体地，提供包括缩短的靶互补区(即，少 于20nt，例如17-19或17-18nt的靶互补序列，例如17、18或19nt 的靶互补序列)的截短的引导RNA(tru-gRNA)，及其使用方法。如本文中所用，“17-18或17-19”包括17、18或19个核苷酸。
在一个方面，本发明提供具有17-18或17-19个核苷酸的靶互补 区的引导RNA分子(例如，单一引导RNA或crRNA)，例如，靶互补 区由17-18或17-19个核苷酸组成，例如，靶互补区由连续靶互补序列的17-18或17-19个核苷酸组成。在一些实施方案中，引导RNA 包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18或17-19个连续核苷酸 互补的由17-18或17-19个核苷酸组成的互补区。在一些实施方案中， 靶互补区由17-18个核苷酸(靶互补序列的)组成。在一些实施方案中， 互补区与选定的靶序列的互补链的17个连续核苷酸互补。在一些实 施方案中，互补区与选定的靶序列的互补链的18个连续核苷酸互补。
在另一个方面，本发明提供由以下序列组成的核糖核酸：
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO：2404)；
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO：2407)；或
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO：2408)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCG(XN)(SEQ IDNO：1)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQ ID NO：2)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQ ID NO：3)； (X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN) (SEQ ID NO：4)、
(X17-18或X17-19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SE Q ID NO：5)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGC(SEQ ID NO：6)；或
(X17-18或 X17-19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGC(SEQ ID NO：7)；
其中X17-18或X17-19是与选定的靶序列，优选地紧接前间区序列 邻近基序(PAM)例如NGG、NAG或NNGG的5’的靶序列的互补链互 补的序列(17-18或17-19个核苷酸的)(参见，例如，图1中的构型)， 并且XN是不干扰核糖核酸对Cas9的结合的任意序列，其中N(在RNA中)可以是0-200，例如0-100、0-50或0-20。X17-18或X17-19与天然存 在的与RNA其余部分相邻的序列绝不相同。在一些实施方案中，作 为用作终止RNA PolIII转录的终止信号的一个或多个T的任选的存 在的结果，所述RNA在分子的3’末端包括一个或多个U，例如1至 8个或更多个U(例如，U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、 UUUUUUU、UUUUUUUU)。在一些实施方案中，所述RNA在RNA 分子的5’末端包含一个或多个，例如多达3个，例如，1、2或3个 不与靶序列互补的另外的核苷酸。在一些实施方案中，所述靶互补区 由17-18核苷酸(靶互补序列的)组成。在一些实施方案中，所述互补 区与选定的靶序列的互补链的17个连续核苷酸互补。在一些实施方 案中，所述互补区与18个连续核苷酸互补。
在另一个方面，本发明提供编码本文中描述的核糖核酸的DNA 分子以及具有或表达核糖核酸或载体的宿主细胞。
在其它方面，本发明用于在细胞中提高RNA引导的基因组编辑 的特异性的方法，所述方法包括将细胞与引导RNA接触，所述引导RNA包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18或17-19个连续核 苷酸互补的由17-18或17-19个核苷酸组成的互补区，如本文中所描 述的。
在另一个方面，本发明提供用于诱导例如细胞中的基因组序列中 的双链DNA分子的靶区域中的单链或双链断裂的方法。所述方法包 括在细胞中表达如下物质或将所述物质引入细胞：Cas9核酸酶或切 口酶；和引导RNA，其包括与选定的靶序列，优选地紧接前间区序 列邻近基序(PAM)例如NGG、NAG或NNGG的5’的靶序列的互补链互补的由17或18或19个核苷酸组成的序列，例如如本文中描述的 核糖核酸。
本文中还提供用于修饰细胞中的双链DNA分子的靶区域的方 法。所述方法包括在细胞中表达如下物质或将所述物质引入细胞： dCas9-异源功能性结构域融合蛋白(dCas9-HFD)；和引导RNA，其包 括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18或17-19个连续核苷酸互 补的由17-18或17-19个核苷酸组成的互补区，如本文中描述的。
在一些实施方案中，所述引导RNA为(i)单一引导RNA，其包括 与选定的靶基因组序列的互补链的17-18或17-19个连续核苷酸互补 的由17-18或17-19个核苷酸组成的互补区，或(ii)crRNA，其包括与 选定的靶基因组序列的互补链的17-18或17-19个连续核苷酸互补的 由17-18或17-19个核苷酸组成的互补区，以及tracrRNA。
在一些实施方案中，所述靶互补区由17-18个核苷酸(靶互补序列 的)组成。在一些实施方案中，所述互补区与选定的靶序列的互补链 的17个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，所述互补区与18个连载核苷酸互补。
本文中描述的任何分子的X17-18或X17-19与天然存在的与RNA的 其余部分相邻的序列绝不相同。在一些实施方案中，作为用作终止 RNA PolIII转录的终止信号的一个或多个T的任选的存在的结果，所 述RNA在分子的3’末端包括一个或多个U，例如1至8个或更多个U(例如，U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、UUUUUUU、UUUUUUUU)。在一些实施方案中，所述RNA在RNA分子的5’末 端包括不与靶序列互补的一个或多个，例如多至3个，例如1、2或 3个另外的核苷酸。
在一些实施方案中，RNA的一个或多个核苷酸被修饰，例如被 锁定(2’-O-4’-C亚甲基桥)，为5′-甲基胞苷，为2′-O-甲基-假尿苷，或其中磷酸核糖主链已被聚酰胺链替代，例如靶互补区X17-18或X17-19内或外的一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA或crRNA 的一些或全部，例如在X17-18或X17-19靶互补区内或外，包含脱氧核 糖核苷酸(例如，全部或部分为DNA，例如DNA/RNA杂交体)。
在另外的方面，本发明提供用于修饰例如细胞中的基因组序列中 的双链DNA分子的靶区域的方法。所述方法包括在细胞中表达以下 物质或将所述物质引入细胞：
dCas9-异源功能性结构域融合蛋白(dCas9-HFD)；和
引导RNA，其包括与选定的靶序列，优选地紧接前间区序列邻 近基序(PAM)例如NGG、NAG或NNGG的5’的靶序列的互补链互补 的由17-18或17-19个核苷酸组成的序列，例如如本文中描述的核糖 核酸。X17-18或X17-19与天然存在的与RNA的其余部分相邻的序列绝 不相同。在一些实施方案中，所述RNA在RNA分子的5’末端包括 不与靶序列互补的一个或多个，例如多至3个，例如1、2或3个另 外的核苷酸。
在另一个方面，本发明提供用于修饰(例如，将序列特异性断裂 引入)例如细胞中的基因组序列中的双链DNA分子的靶区域的方法。所述方法包括在细胞中表达以下物质或将所述物质引入细胞：Cas9 核酸酶或切口酶，或dCas9异源功能性结构域融合蛋白(dCas9-HFD)；
tracrRNA，例如，包含如下序列或由所述序列组成： GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAG UCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：8)或其活性部分；
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ IDNO：2405)或其活性部分；
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQID NO：2407)或其活性部分；
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：2409)或其活性部分；
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUG(SEQ ID NO：2410)或其活性部分；
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(SEQ ID NO：2411)或其活性部分；或
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(SEQ ID NO：2412)或 其活性部分；和
crRNA，其包括与选定的靶序列，优选地紧接前间区序列邻近基 序(PAM)例如NGG、NAG或NNGG的5’的靶序列的互补链互补的由17-18或17-19个核苷酸组成的序列；在一些实施方案中，所述crRNA 具有序列：
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO：2404)；
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO：2407)；或
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO：2408)。
在一些实施方案中，所述crRNA为(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQID NO：2407)并且所 述tracrRNA为 GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：8)；所述cRNA为(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO：2404)并且所述tracrRNA为 UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：2405)；或所述cRNA为 (X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO：2408)并且所述tracrRNA为 AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：2406)。
X17-18或X17-19与天然存在的与RNA的其余部分相邻的序列绝不 不同。在一些实施方案中，作为用作终止RNA PolIII转录的终止信号 的一个或多个T的任选的存在的结果，所述RNA(例如，tracrRNA或 crRNA)在分子的3’末端包括一个或多个U，例如2至8个或更多个 U(例如，U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、UUUUUUU、UUUUUUUU)。在一些实施方案中，所述RNA(例如，tracrRNA或 crRNA)在RNA分子5’末端上包含不与靶序列互补的一个或多个，例如多至3个，例如1、2或3个另外的核苷酸。在一些实施方案中， crRNA或tracrRNA的一个或多个核苷酸被修饰，例如被锁定 (2’-O-4’-C亚甲基桥)，为5′-甲基胞苷，为2′-O-甲基-假尿苷，或其中 磷酸核糖主链已被聚酰胺链替代，例如序列X17-18或X17-19内或外的 一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，tracrRNA或crRNA的一些或全部，例如在X17-18或X17-19靶互补区内或外，包含脱氧核糖核苷 酸(例如，全部或部分为DNA，例如DNA/RNA杂交体)。
在一些实施方案中，所述dCas9-异源功能性结构域融合蛋白 (dCas9-HFD)包含修饰基因表达、组蛋白或DNA的HFD，例如转录 激活结构域、转录阻遏子(例如，沉默子诸如异染色质蛋白1(HP1)， 例如，HP1α或HP1β)、修饰DNA的甲基化状态的酶(例如，DNA甲 基转移酶(DNMT)或TET蛋白，例如TET1)或修饰组蛋白亚单位的酶 (例如，组蛋白乙酰转移酶(HAT)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)或组蛋白 脱甲基酶)。在优选实施方案中，所述异源功能性结构域是转录激活 结构域，例如，VP64或NF-κB p65转录激活结构域；催化DNA脱 甲基化的酶，例如，TET蛋白家族成员或来自这些家族成员之一的催 化结构域；或组蛋白修饰(例如，LSD1、组蛋白甲基转移酶、HDAC或HAT)或转录沉默结构域，例如，来自异染色质蛋白1(HP1)，例如， HP1α或HP1β；或生物系链，例如MS2、CRISPR/Cas亚型Ypest蛋 白4(Csy4)或λN蛋白。dCas9-HFD描述于2013年3月15日提交的 美国临时专利申请USSN 61/799,647、2013年6月21日提交的律师 签号00786-0882P02，USSN 61/838,148和PCT国际申请第 PCT/US14/27335号(所述临时专利申请、PCT国际申请全部通过引用 整体并入本文)中。
在一些实施方案中，本文中描述的方法导致选定的靶基因组序列 的***缺失突变或序列改变。
在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞， 例如人细胞。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有与 本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文 中描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域中已知的其它合 适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅为示例性的并非旨在限 制。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目 和其它参考资料通过引用整体并入。如发生矛盾，则以本专利说明书包括定义为准。
根据以下详细说明和附图以及权利要求，本发明特征和有利将是 显而易见的。
附图简述
图1：举例说明结合于其靶DNA位点的gRNA/Cas9核酸酶复合 物的示意图。剪刀表示Cas9核酸酶在基因组DNA靶位点上的大致裂 解点。注意，引导RNA上的核苷酸的编号以相反方式从5’至3’进行。
图2A：举例说明截短gRNA的5’互补区的基本原理的示意图。 粗的灰色线＝靶DNA位点，细的深灰色线结构＝gRNA，黑线显示 gRNA与靶DNA位点之间的碱基配对(或其不存在)。
图2B：EGFP破坏测定的示意性概述。通过错易NHEJ介导的修 复进行的单一整合的EGFP-PEST报告基因的靶向Cas9介导的双链断 裂的修复导致破坏编码序列并且与荧光在细胞中的丢失相关的移码 突变。
图2C-F：在EGFP报告基因序列中的3个不同靶位点上测定的 拥有具有(C)单个错配、(D)相邻的双错配、(E)可变间隔的双错配和(F) 递增数目的相邻错配的单一引导RNA(gRNA)的RNA引导的核酸酶 (RGN)的活性。显示了针对优选地匹配的单一gRNA的活性标准化的 平均复制活性。误差条指示平均值的标准误差。每一个单一gRNA中 的错配位置在下面的网格中以灰色突出显示。3个EGFP靶位点的序列如下：
EGFP位点1GGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGG(SEQ ID NO：9)
EGFP位点2GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGG(SEQ ID NO：10)
EGFP位点3GGTGGTGCAGATGAACTTCAGGG(SEQ ID NO：11)
图2G：gRNA的5′末端上的错配产生比更多3′错配更敏感的 CRISPR/Cas。除使用沃尔森-克里克颠换使其错配(即，通过将gRNA 在位置18及19上改变成其沃尔森-克里克伴侣来使EGFP位点#2 M18-19错配)的用“m”指示的位置外的RNA与DNA之间的gRNA沃 尔森-克里克碱基配对。虽然gRNA的5’附近的位置通常被极好地耐 受，但当其它残基被错配时这些位置中的匹配对于核酸酶活性是非常 重要的。当使所有四个位置错配时，核酸酶活性不再是可检测的。这进一步表明这些5′位置上的匹配可帮助补偿其它更多3′位置上的错 配。注意利用可显示相较于密码子最优化形式较低绝对水平的核酸酶 活性的Cas9的非密码子优化形式进行这些实验。
图2H：由具有范围在15至25nt内的可变长度互补区的gRNA 引导性Cas9核酸酶活性在基于人细胞的U2OS EGFP破坏测定的效率。gRNA从U6启动子的表达需要5’G的存在，从而只可能评价具 有某些长度的与靶DNA位点的互补性(15、17、19、20、21、23和 25nt)的gRNA。
图3A：EGFP报告基因中的4个靶位点的由Cas9和全长或缩短 的gRNA介导的人细胞中的EGFP破坏的效率。显示了互补区和对应靶DNA位点的长度。Ctrl＝缺乏互补区的对照gRNA。
图3B：通过匹配的标准RGN(Cas9和标准全长gRNA)和 tru-RGN(Cas9和在其5’互补区具有截短的gRNA)在7个不同的人内 源基因靶上引入的靶向***缺失突变的效率。显示了gRNA互补区和 对应靶DNA位点的长度。通过T7EI测定测量的***缺失频率。Ctrl＝ 缺乏互补区的对照gRNA。
图3C：通过使用被靶向EMX1位点的tru-gRNA或匹配的全长 gRNA的RGN诱导的***缺失突变的DNA序列。与gRNA互补区 相互作用的靶DNA位点的部分以灰色突出显示，PAM序列的第一碱 基以小写字母显示。缺失由以灰色突出显示的虚线指示，***由以灰 色突出显示的斜体字母指示。缺失或***的碱基的净数目和每一个序 列的次数被分离并且示于右边。
图3D：通过匹配的标准和tru-RGN在家个内源人基因上引入的 精确HDR/ssODN介导的改变的效率。使用BamHI限制酶切消化测 定(参见实施例2的实验方法)测量％HDR。对照gRNA＝空U6启动子 载体。
图3E：利用可变量的全长gRNA表达质粒(顶)或tru-gRNA表达 质粒(底)与固定量的Cas9表达质粒一起转染U2OS.EGFP细胞，随后 测定具有减少的EGFP表达的细胞的百分比。显示来自一式二份实验 的平均值和所述平均值的标准误差。注意，利用tru-gRNA获得的数 据与来自利用全长gRNA表达质粒而非tru-gRNA质粒针对这3个 EGFP靶位点进行的实验的数据密切匹配。
图3F：利用可变量的Cas9表达质粒与固定量的针对每一个靶的 全长gRNA表达质粒(顶)或tru-gRNA表达质粒(底)一起转染 U2OS.EGFP细胞(针对来自图3E的实验的每一个tru-gRNA测定的 量)。显示来自一式二份实验的平均值和所述平均值的标准误差。注 意，利用tru-gRNA获得的数据与来自利用全长gRNA表达质粒而非 tru-gRNA质粒针对这3个EGFP靶位点进行的实验的数据密切匹配。 这些滴定的结果确定用于在实施例1和2中进行的EGFP破坏测定的质粒的浓度。
图4A：举例说明成对双切口的被gRNA靶向的VEGFA位点1 和4的简图。全长gRNA的靶位点加以下划线，PAM序列中的第一 碱基以小写字母显示。显示了利用ssODN供体通过HDR***的BamHI限制性位点的位置。
图4B：可将tru-gRNA与成对切口酶策略一起用于高效地诱导插 入缺失突变。对于VEGFA位点1利用tru-gRNA对全长gRNA的取 代不减小针对成对全长gRNA对于VEGFA位点4和Cas9-D10A切口 酶观察到的***缺失突变的效率。使用的对照gRNA是缺乏互补区的 gRNA。
图4C：可将tru-gRNA与成对切口酶策略一起用于高效地诱导精 确的HDR/ssODN介导的序列改变。对于VEGFA位点1利用tru-gRNA 对全长gRNA的取代不减小针对成对全长gRNA对于VEGFA位点4 和Cas9-D10A切口酶观察到的的***缺失突变(利用ssODN供体模板)。使用的对照gRNA是缺乏互补区的gRNA。
图5A：使用在每一个位置(除在其上必须保留G以进行从U6启 动子的高效表达的最5’碱基外)上具有单一错配的全长(顶)或 tru-gRNA(底)的被靶向EGFP中的3个位点的RGN的活性。下面网 格中的灰色框代表沃尔森-克里克颠换错配的位置。使用的空gRNA 对照是缺乏互补区的gRNA。使用EGFP破坏测定测量RGN活性， 并且显示的值代表相对于使用完美匹配的gRNA的RGN观察到的 EGFP-阴性的百分比。以一式二份进行实验，并且显示了具有代表平均值的标准误差的平均值代表。
图5B：使用在每一个位置(除在其上必须保留G以进行从U6启 动子的高效表达的最5’碱基外)上具有相邻双错配的全长(顶)或 tru-gRNA(底)的被靶向EGFP中的3个位点的RGN的活性。数据如 5A中显示的。
图6A：通过深度测序测量的由被靶向3个不同内源人基因位点 的RGN诱导的中靶或脱靶***缺失突变的绝对频率。显示了来自其 中表达利用全长gRNA、tru-gRNA或缺乏互补区的对照gRNA的靶 向RGN的细胞的3个靶位点的***缺失频率。用于产生这些图表的***缺失突变的绝对量可见于表3B中。
图6B：3个tru-RGN的脱靶位点特异性的倍数提高。显示的值 代表使用来自(A)和表3B的数据计算的显示的脱靶位点的tru-RGN的 中靶/脱靶活性对标准RGN的中靶/脱靶活性的比率。对于星号(*)标 记的位点，对于tru-RGN未观察到***缺失，从而显示的值代表这些 脱靶位点的特异性的倍数提高的保守统计估算(参见结果和实验程 序)。
图6C，顶图：通过被靶向VEGFA位点1的tru-RGN的T7EI测 定鉴定的中靶与脱靶位点的比较(通过深度测序鉴定更多的中靶和脱 靶位点)。注意，全长gRNA在靶位点的5’末端与2个核苷酸错配， 并且这两个核苷酸是不存在于tru-gRNA靶位点中的两个核苷酸。脱 靶位点中相对于中靶的错配用加以粗体下划线的文本来突出显示。 gRNA与脱靶位点之间的错配以X显示。
图6C，底图：通过具有全长或截短的gRNA的RGN在脱靶位点 中诱导的***缺失突变频率。***缺失突变频率通过T7EI测定来测 定。注意，该图中的脱靶位点是我们先前就被靶向VEGFA位点1的 标准RGN诱导的***缺失突变已检查的并且在该早期研究中被称为位点OT1-30的位点(实施例1和Fu等，Nat Biotechnol. 31(9)：822-6(2013))。我们可能在我们的先前的实验中不鉴定该位点上 的脱靶突变，因为***缺失突变的频率似乎处于T7EI测定的可靠检 测限(2-5％)。
图7A-D：通过使用被靶向VEGFA位点1和3的tru-gRNA或匹 配的全长gRNA的RGN诱导的***缺失突变的DNA序列。序列描 绘于图3C中。
图7E。由具有错配的5’G核苷酸的tru-gRNA诱导的***缺失突 变的频率。显示了由通过具有针对VEGFA位点1和3以及EMX1位 点1的17、18或20nt的互补区的tru-gRNA引导的Cas9在人U2OS.EGFP细胞中诱导的***缺失突变频率。这些gRNA中的3个 含有错配的5’G(由以粗体文本标记的位置指示的)。条表示来自使用 全长gRNA(20nt)、tru-gRNA(17或18nt)和具有错配的5’G核苷酸的 tru-gRNA(17或18nt，在5’末端具有粗体T)的实验的结果。(注意， 针对EMX1位点1对于错配的tru-gRNA未检测到活性)
图8A-C：由RGN在人U2OS.EGFP细胞中诱导的脱靶***缺失 突变的序列。被RGN识别的野生型基因组脱靶位点(包括PAM序列) 以灰色突出显示并且如表1和表B中一样编号。注意，显示了一些位 点的互补链。缺失的碱基在灰色背景中以虚线显示。***的碱基以斜体字显示并且以灰色突出显示。
图9A-C：由RGN在人HEK293细胞中诱导的脱靶***缺失突变 的序列。被RGN识别的野生型基因组脱靶位点(包括PAM序列)以灰 色突出显示并且如表1和表B中一样编号。注意，显示了一些位点的 互补链。缺失的碱基在灰色背景中以虚线显示。***的碱基以斜体字 显示并且以灰色突出显示。*产生大量的单bp***缺失。
详述
CRISPR RNA引导的核酸酶(RGN)已快速形成为用于基因组编 辑的轻便高效的平台。虽然Marraffini及同事(Jiang等，Nat Biotechnol 31，233-239(2013))最近在细菌中进行了Cas9 RGN特异性的***性 研究，但RGN在人细胞中的特异性一直未被广泛地确定。如果这些 核酸酶将被广泛用于研究和治疗性应用，理解RGN介导的脱靶效应 在人和其它真核细胞中的范围将是非常必需的。本发明人已使用基于 人细胞的报告测定来表征基于Cas9的RGN的脱靶裂解。取决于它们 沿着引导RNA(gRNA)-DNA界面的位置，单和双错配被耐受至不同 程度。由被靶向人细胞中的内源基因座的6个RGN中的4个诱导的 脱靶改变可通过部分错配位点的检查来容易地检测。已鉴定的脱靶位点具有多至5个错配，并且许多以可与在期望的中靶位点上观察到的 频率相当(或更高)的频率被诱变。因此，即使在人细胞中具有不完全 匹配的RNA-DNA界面，RGN亦具有很高的活性，这是可能使它们 在研究和治疗性应用中的用途受挫的发现。
本文中描述的结果显示预测任何给定的RGN的特异性特征谱既 不简单也不直接。EGFP报告基因测定实验显示单和双错配可对人细 胞中的RGN活性具有可变的作用，所述作用不严格地取决于它们在靶位点中的位置。例如，与先前公开的报导一致，sgRNA/DNA界面的3’半部分的改变通常具有比5’半部分的改变更大的效应(Jiang等， Nat Biotechnol31，233-239(2013)；Cong等，Science 339，819-823 (2013)；Jinek等，Science 337，816-821(2012))；然而，3’末端中的 单和双突变有时也表现被良好地耐受，然而5’末端中的双突变可极大 地降低活性。此外，针对在任何给定的位置上的错配的这些效应的量 级似乎是位点依赖性的。通过所有可能的核苷酸取代(涵盖用于我们的EGFP报告基因实验的沃尔森-克里克颠换)的测试进行的大系列 RGN的全面图谱表征可帮助提供对潜在脱靶的范围的另外见解。在 这一点上，最近描述的Marraffini及同事的基于细菌细胞的方法(Jiang等，Nat Biotechnol 31，233-239(2013))或由Liu及同事先前用于ZFN 的在体外基于组合文库的裂解位点-选择法(Pattanayak等，Nat Methods 8，765-770(2011))可用于产生更大组的RGN特异性特征谱。
尽管这些在全面预测RGN特异性中提出了挑战，但有可能通过 检查一个亚组的与中靶位点相异在于1至5个错配的基因组位点来鉴 定RGN的真正脱靶。值得注意的是，这些实验的条件下，RGN在这 些脱靶位点的许多位点上诱导的突变的频率与在期望的中靶位点上观察到的所述频率相似(或更高)，这使得能够使用T7EI测定(所述测 定，如在我们实验室中进行的，具有～2％至5％的突变频率的可靠检 测限)检测这些位点上的突变。因于这些突变率非常高，因此有可能 避免使用先前需要用来检测低得多的频率的ZFN-和TALEN-诱导的脱靶改变的深度测序法(Pattanayak等，Nat Methods 8，765-770(2011)； Perez等，Nat Biotechnol 26，808-816(2008)；Gabriel等，Nat Biotechnol 29，816-823(2011)；Hockemeyer等，Nat Biotechnol 29，731-734 (2011))。人细胞中的RGN脱靶诱变的分析还确认了预测RGN特异 性的困难-并非所有单和双错配脱靶位点显示突变的证据，虽然具有多至5个错配的一些位点也可显示改变。此外，鉴定的真正的脱靶位点不显示任何明显的相对于期望的靶序列(表E；灰色突出显示的行) 的朝向转换或颠换的偏倚性。
虽然对于许多RGN看到脱靶位点，但这些位点的鉴定既非全面 的也非全基因组规模的。对于6个研究的RGN，仅检查极小亚组的 人基因组中的大多得的总数的潜在脱靶序列(与期望的靶位点相异3 至6个核苷酸的位点；比较表E与C)。虽然通过T7EI测定检查这样大数目的基因座的脱靶突变既然不现实也不是成本效益好的策略，但 在将来的研究中使用高通量测序可能使得能够质询更大数目的候选 脱靶位点并且提供用于检测真正的脱支突变的更加灵敏的方法。例 如，此类方法可能使得能够揭示我们对于其不能发现任何脱靶突变的 两个RGN的另外的脱靶位点。另外，RGN特异性和可影响RGN在 细胞中的活性的任何表观因子(例如，DNA甲基化和染色质状态)的更 加深刻的理解可能也减少需要被检查的潜在位点的数目，从而使得 RGN脱靶的全基因评估更可行和可承受得起。
如本文中所述，许多策略可用于使基因组脱靶突变的频率减小至 最小。例如，RGN靶位点的特异性选择可被优化；鉴于在多至5个 位置与期望的靶位点不同的脱靶位置可被RGN高效地突变，因此选 择具有最少脱靶位点数目的靶位点(如通过错配计数判断的)似乎不可 能是有效的；对于被靶向人基因组的序列的任何给定的RGN，通常 存在在20bp RNA：DNA互补区内相异在于4或5个位置的数千潜在 的脱靶位点(参见，例如，表C)。还可能的是，gRNA互补区的核苷 酸含量可能影响潜在脱靶效应的范围。例如，已显示高GC含量稳定RNA：DNA杂交体(Sugimoto等，Biochemistry 34，11211-11216(1995))， 从而还可能预期使gRNA/基因组DNA杂交更稳定并且对错配更加耐 受。需要利用更大数目的gRNA的另外的实验来评估这两个参数(基 因组中的错配位点的数目和RNA：DNA杂交体的稳定性)是否影响和 如何影响RGN的全基因组特异性。然而，重要地要指出，如果此类 预测参数可被确定，则执行此类指导方针的作用将进一步限制RGN 的靶向范围。
用于减弱RGN诱导的脱靶效应的一个可能的一般策略可能是降 低细胞中表达的gRNA和Cas9核酸酶的浓度。在U2OS.EGFP细胞 中使用RGN针对VEGFA靶位点2和3测试该想法；转染较少的表达sgRNA和Cas9的质粒减少中靶位点上的突变率但丝毫不改变相对脱 靶突变率(表2A和2B)。与此一致，在两个其它人细胞类型(HEK293 和K562细胞)中也观察到高水平的脱靶诱变率，既使绝对中靶诱变率 比在U2OS.EGFP细胞中低。因此，降低细胞中的gRNA和Cas9的 表达水平不可能提供减小脱靶效应的解决方法。此外，这些结果还表 明在人细胞中观察到的高脱靶诱变率非由gRNA和/或Cas9的过表达引起。
表2A
针对被靶向VEGFA靶位点2的RGN的由不同量的表达Cas9和单 一gRNA的质粒诱导的中靶和脱靶基因组位点上的***缺失突变频 率
在每一栏的顶部显示了用于这些测定的转染进U2OS.EGFP细胞 的表达gRNA和Cas9的质粒的量。(注意，关于250ng gRNA/750ng Cas9的数据与表1中显示的那些数据相同)。如方法中所述，使用T7EI 测定从重复样品测定平均***缺失频率。OT＝脱靶位点，如表1和表 B中一样编号。来自中靶位点(在gRNA与其杂交的20bp区域内)的 错配以粗体下划线文本突出显示。N.D.＝未检测到。
表2B
针对被靶向VEGFA靶位点3的RGN的由不同量的表达Cas9和单 一gRNA的质粒诱导的中靶和脱靶基因组位点上的***缺失突变频 率
在每一栏的顶部显示了用于这些测定的转染进U2OS.EGFP细胞 的表达gRNA和Cas9的质粒的量。(注意，关于250ng gRNA/750ng Cas9的数据与表1中显示的那些数据相同)。如方法中所述，使用T7EI 测定从重复样品测定平均***缺失频率。OT＝脱靶位点，如表1和表 B中一样编号。N.D.＝未检测到。
可在3个不同的人细胞类型中通过RGN诱导显著的脱靶诱变的 发现对该基因组编辑平台的更广泛用途具有重要影响。对于研究应 用，特别是对于牵涉及具有缓慢的世代时间的培养细胞或生物体的实 验，将需要考虑高频率脱靶突变的潜在混淆作用，对于所述细胞或生 物不期望的改变的异型杂交将具有挑战性。由于脱靶效应不是随机的 而是与靶位点相关的，因此控制此类效应的一个方式可能是使用被靶向不同DNA序列的多个RGN来诱导基因组改变。然而，对于治疗 性应用，这些发现明确地表明，如果这些核酸酶将在更长时期中被安 全地用于治疗人疾病，则需要仔细地确定和/或提高RGN的特异性。
用于提高特异性的方法
如本文中所示，基于化脓性链球菌Cas9蛋白的CRISPR-Cas RNA 引导的核酸酶可具有可与期望的中靶活性相当或比其更高的显著的 脱靶诱变效应(实施例1)。此类脱靶效应对于研究，特别是对于潜在 治疗性应用可以是有问题。因此，需要用于提高CRISPR-CasRNA引 导的核酸酶(RGN)的特异性的方法。
如实施例1中所述，Cas9 RGN可在人细胞中在脱靶位点诱导高 频率的***缺失突变(也参见Cradick等，2013；Fu等，2013；Hsu 等，2013；Pattanayak等，2013)。这些不期望的改变可在基因序列 中发生，其与期望的中靶位点相异在于多至5个错配(参见实施例1)。另外，尽管相较于3’末端的错配，gRNA互补区的5’末端上的错配通 常被更好地耐受，但这些关系不是绝对的，并且显示位点-对-位点依 赖性(参见实施例1和Fu等，2013；Hsu等，2013；Pattanayak等，2013)。因此，对于鉴定真正的脱靶位点，依赖于错配的数目和/或位置的计算方法目前具有有限的预测值。因此，如果RNA引导的核酸 酶将被用于研究和治疗性应用，则用于减少脱靶突变的频率的方法仍 然具有重要的优先性。
截短的引导RNA(tru-gRNA)实现更大的特异性
引导RNA一般而言出现在两个不同的***中：***1，其使用 一起引导Cas9进行裂解的单独的crRNA和tracrRNA，和***2，其 使用在单个***中组合两个单独的引导RNA的嵌合crRNA-tracrRNA 杂交体(被称为单一引导RNA或sgRNA，也参见Jinek等，Science2012；337：816-821)。tracrRNA可被可变地截短，并且已显示许多长度在所述单独的***(***1)和嵌合gRNA***(***2)中都具有功 能。例如，在一些实施方案中，可从其3’末端将tracrRNA截短至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40nt。在 一些实施方案中，可将tracrRNA分子从其5’末端截短至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40nt。或者，可以 从5’和3’末端截短tracrRNA分子，例如在5’末端截短至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15或20nt并且在3’末端鞭短至少1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40nt。参见，例如，Jinek等，Science 2012；337：816-821；Mali等，Science.2013年2月 15日；339(6121)：823-6；Cong等，Science.2013年2月15日；339 (6121)：819-23；以及Hwang和Fu等，Nat Biotechnol.2013年3月； 31(3)：227-9；Jinek等，Elife 2，e00471(2013))。对于***2，一般地 更长长度的嵌合gRNA已显示更大的中靶活性，但不同长度的gRNA 的相对特异性目有仍未确定，从而在某些情况下可能期望使用较短的 gRNA。在一些实施方案中，gRNA与在转录起始位点上游约100-800 bp内，例如在转录起始位点的上游约500bp内，包括转录起始位点， 或在转录起始位点下游约100-800bp，例如约500bp内的区域互补。 在一些实施方案中，使用编码不止一个gRNA的载体(例如，质粒)， 例如编码导向靶基因的相同区域内的不同位点的2、3、4、5或更多 个gRNA的质粒。
本申请描述了基于缩短而非延长gRNA互补区的表面上违反直 觉的想法的用于提高RGN特异性的策略。这些较短的gRNA可以以可与全长gRNA相当(或者，在一些情况下，更高)的效率在单一整合 的EGFP报告基因中的多个位点上和在内源人基因中诱导不同类型的Cas9介导的中靶基因组编辑事件。另外，使用这些缩短的gRNA 的RGN显示提高的对gRNA-靶DNA界面上的少数错配的敏感性。最重要地，缩短的gRNA的使用显著减小人细胞中的基因组脱靶效应 的比率，从而在这些位点产生高达5000倍或更高的特异性的提高。 因此，该缩短的gRNA策略提供用于减小脱靶效应而不削弱中靶活性 并且无需第二潜在诱变gRNA的表达的高度有效的方法。可单独执行 该方法或可将其与其它策略诸如成对切口酶法结合执行以减小人细胞中的RGN的脱靶效应。
因此，提高CRISPR/Cas核酸酶的特异性的一个方法缩短用于引 导核酸酶特异性的引导RNA(gRNA)种类的长度。可使用引导RNA，例如在其5’末端具有与基因组DNA靶位点的互补链互补的17或18 nt的单gRNA或crRNA(与tracrRNA配对的)将Cas9核酸酶导向具有 另外的近端前间区序列邻近基序(PAM)(例如序列NGG的)的特定 17-18nt的基因组靶(图1)。
虽然可能预期增加gRNA互补区的长度可提高特异性，但本发明 人(Hwang等，PLoSOne.2013年7月9日；8(7)：e68708)和其它研究 人员(Ran等，Cell.2013年9月12日；154(6)：1380-9)先前已观察到 在gRNA的5’末端延长靶位点互补区实现上使得其在中靶位点上不太有效地发挥功能。
相反地，实施例1中的实验显示在标准长度的5’互补靶向区内具 有多个错配的gRNA可以仍然诱导强劲的Cas9介导的它们的靶位点 的裂解。因此，缺乏这些5’末端核苷酸的截短的gRNA可能可显示 可与它们的全长对应物相当的活性(图2A)。进一步推测这些5’核苷 酸可能通常在沿着gRNA-靶DNA界面的其它位置上补偿错配，从而 预测较短的gRNA可能对错配更加敏感并从而诱导较低水平的脱靶 突变(图2A)。
减少被靶的DNA序列的长度可能也减小gRNA:DNA杂交体的 稳定性，使得其不太耐受错配，从而使靶向更加特异。即，截短gRNA 序列以识别更短的DNA靶可能实际上导致不太耐受甚至单核苷酸错 配，从而更加特异并具有更少的不期望的脱靶效应的RNA引导的核酸酶。
可潜在地将缩短gRNA互补区的该策略与除化脓性链球菌Cas9 外的RNA引导的蛋白(包括来自细菌或古细菌(archaea)的其它Cas蛋 白以及切割DNA的单链的Cas9或不具有核酸酶活性的Cas9，诸如 在一个或两个核酸酶结构域上具有无催化活性的突变的dCas9)一起 使用。该策略可用于利用单一gRNA的***以及使用双重gRNA(例如，在天然存在的***中发现的crRNA和tracrRNA)的那些***。
因此，本文中描述了包含与通常反式编码的tracrRNA融合的 crRNA的单一引导RNA，例如Mali等，Science 2013年2月15日； 339(6121)：823-6中描述的单一Cas9引导RNA，但其在5’末端具有与 紧接前间区序列邻近基序(PAM)例如NGG、NAG或NNGG的5’的靶 序列的互补链的少于20个核苷酸(nt)例如19、18或17nt，优选地17 或18nt互补的序列。在一些实施方案中，缩短的Cas9引导RNA由 下列序列组成：
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO：2404)；
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO：2407)；或
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO：2408)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCG(XN)(SEQ IDNO：1)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQ ID NO：2)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQ ID NO：3)；(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN) (SEQ IDNO：4)、
(X17-18或 X17-19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SE Q ID NO：5)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGC(SEQ ID NO：6)；或(X17-18或 X17-19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGC(SEQ ID NO：7)；其中X17-18或X17-19是分别与靶序列的 17-18或17-19个连续核苷酸互补的核苷酸序列。本文中还描述了先 前已在文献(Jinek等，Science.337(6096)：816-21(2012)和Jinek等，Elife.2：e00471(2013))中被描述的编码缩短的Cas9引导RNA的 DNA。
引导RNA可包括可以是不干扰核糖核酸对Cas9结合的任何序列 的XN，其中N(在RNA中)可以是0-200例如0-100、0-50或0-20。
在一些实施方案中，所述引导RNA在3’末端上包括一个或多个 腺嘌呤(A)或尿嘧啶(U)核苷酸。在一些实施方案中，作为用作终止 RNA PolIII转录的终止信号的一个或多个T的任选的存在的结果，所 述RNA在分子的3’末端包括一个或多个U，例如，1至8个或更多个U(例如，U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、UUUUUUU、 UUUUUUUU)。
经修饰的RNA寡核苷酸诸如锁核酸(LNA)已被证明通过以更有 利的(稳定的)构象锁定经修饰的寡核苷酸来提高RNA-DNA杂交的特 异性。例如，2’-O-甲基RNA是其中在2’氧与4’碳之间存在另外的共 价键联的经修饰的碱基，当被掺入寡核苷酸中时其可提高总体热稳定 性和选择性(式I)。
因此，在一些实施方案中，本文中公开的tru-gRNA可包含一个 或多个经修饰的RNA寡核苷酸。例如，本文中描述的截短的引导RNA 分子可具有已被修饰的与靶序列互补的引导RNA的5’区的17-18或 17-19nt的一个或一些或全部被修饰，例如锁定的(2’-O-4’-C亚甲基桥)、5′-甲基胞苷、2′-O-甲基-假尿苷，或其中磷酸核糖主链已被聚酰 胺链(肽核酸)例如合成核糖核酸替代。
在其它实施方案中，tru-gRNA序列的一个、一些或全部核苷酸 可被修饰，例如锁定的(2’-O-4’-C亚甲基桥)、5′-甲基胞苷、2′-O-甲基-假尿苷，或其中磷酸核糖主链已被聚酰胺链(肽核酸)例如合成核糖核 酸替代。
在细胞背景中，Cas9与这些合成gRNA的复合物可用于提高 CRISPR/Cas9核酸酶***的全基因特异性。
示例性经修饰或合成的tru-gRNA可包含下列序列或由下列序列 组成：
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUA(XN)(SEQ ID NO：2404)；
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(XN)(SEQ ID NO：2407)；
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(XN)(SEQ ID NO：2408)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCG(XN)(SEQ IDNO：1)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQ ID NO：2)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQ ID NO：3)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG C(XN)(SEQ ID NO：4)、
(X17-18或 X17-19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SE Q ID NO：5)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGC(SEQ ID NO：6)；或
(X17-18或 X17-19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGC(SEQ ID NO：7)；
其中X17-18或X17-19是分别与靶序列，优选地紧接前间区序列邻 近基序(PAM)例如NGG、NAG或NNGG的5’的靶序列的17-18或 17-19nt互补的序列，并且另外地其中核苷酸的一个或多个，例如， 序列X17-18或X17-19内的一个或多个核苷酸，序列XN内的一个或多个 核苷酸，或tru-gRNA的任何序列内的一个或多个核苷酸被锁定。XN是不干扰核糖核酸对Cas9的结合的任何序列，其中N(在RNA中)可 以是0-200，例如，0-100、0-50或0-20。在一些实施方案中，作为用 作终止RNA PolIII转录的终止信号的一个或多个T的任选的存在的结果，所述RNA在分子的3’末端包括一个或多个U，例如1至8个 或更多个U(例如，U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、UUUUUU、 UUUUUUU、UUUUUUUU)。
虽然本文中描述的一些实例利用单一gRNA，但还也将所述方法 与双重gRNA(例如在天然存在的***中发现的crRNA和tracrRNA) 一起使用。在该情况下，可将单一tracrRNA与多个不同的使用本***表达的crRNA结合使用，例如下列序列：(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO：2404)；
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO：2407)；或
(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO：2408)；和 tracrRNA序列。在该情况下，将crRNA在本文中描述的方法和分子 中用作引导RNA，并且从相同或不同DNA分子表达tracrRNA。在 一些实施方案中，所述方法包括将细胞与tracrRNA接触，所述 tracrRNA包含如下序列或由所述序列组成： GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAG UCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：8)或其活性部分(活性部分是保留与Cas9或dCas9形成复合物 的能力的部分)。在一些实施方案中，可从其3’末端将tracrRNA分子截短至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或 40nt。在另一个实施方案中，可从其5’末端将tracrRNA截短至少1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40nt。或者， 可从5’和3’末端将分子截短，例如，在5’末端截短至少1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15或20nt并且在3’末端截短至少1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40nt。除了SEQ ID NO：8以外，示例性tracrRNA序列还包括下列序列：
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ IDNO：2405)或其活性部分；
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQID NO：2407)或其活性部分；
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：2409)或其活性部分；
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUG(SEQ ID NO：2410)或其活性部分；
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(SEQ ID NO：2411)或其活性部分；或UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(SEQ ID NO：2412)或其活 性部分。
在一些实施方案中，其中(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO：2407)用作 crRNA，使用下列tracrRNA：
GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC( SEQ ID NO：8)或其活性部分。在一些实施方案中，其中(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO：2404)用作crRNA，使用下列 tracrRNA： UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：2405)或其活性部分。在 一些实施方案中，其中(X17-18或X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO：2408)用作crRNA，使用下列tracrRNA： AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO：2406)或其活性部 分。
另外，在使用单独的crRNA和tracrRNA的***中，其一种或两 种可以是合成的并且包含一个或多个经修饰的(例如，锁定的)核苷酸 或脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，所述单一引导RNA和/或crRNA和/或 tracrRNA可在3’末端上包括一个或多个腺嘌呤(A)或尿嘧啶(U)核苷 酸。
现有基于Cas9的RGN使用gRNA-DNA异源双链体形成来引导 靶向目标基因组位点。然而，RNA-DNA异源双链体可形成比它们的 DNA-DNA对应物更加混杂的范围的结构。实际上，DNA-DNA双链 体对错配更加敏感，从而表明DNA引导的核酸酶可能不能容易地结 合于脱靶序列，从而使得它们相较地比RNA引导的核酸酶更具特异 性。因此，本文中描述的截短的引导RNA可以是杂交体，即，其中 一个或多个脱氧核糖核苷酸例如短的DNA寡核苷酸替代gRNA的全 部或部分，例如gRNA的互补区的全部或部分。该基于DNA的分子 可替代单一gRNA***中的gRNA的全部或部分或可选地可替代双重crRNA/tracrRNA***中的crRNA的全部或部分。将DNA整合进 互补区的此类***应当因DNA-DNA双链体对错配的总体不耐受性 而相较于RNA-DNA双链体更容易靶向期望的基因组DNA序列。用于产生此类双链体的方法在本领域中是已知的，参见，例如，Barker 等，BMC Genomics.2005年4月22日；6：57；和Sugimoto等，Biochemistry.2000年9月19日；39(37)：11270-81。
示例性经修饰的或合成的tru-gRNA可包含下列序列或由下列序 列组成：
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCG(XN)(SEQ IDNO：1)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQ ID NO：2)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(XN)(SEQ ID NO：3)；(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(XN) (SEQ IDNO：4)、
(X17-18或 X17-19)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SE Q ID NO：5)；
(X17-18或 X17-19)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGC(SEQ ID NO：6)；或
(X17-18或 X17-19)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGA GUCGGUGC(SEQ ID NO：7)；
其中X17-18或X17-19是分别与靶序列，优选地紧接前间区序列邻 近基序(PAM)例如NGG、NAG或NNGG的5’的靶序列的17-18或17-19nt互补的序列，并且另外地其中核苷酸的一个或多个是脱氧核 糖核苷酸，例如序列X17-18或X17-19内的一个或多个核苷酸，序列XN内的一个或多个核苷酸，或tru-gRNA的任何序列内的一个或多个核 苷酸。XN是不干扰核糖核酸对Cas9的结合的任何序列，其中N(在 RNA中)可以是0-200，例如，0-100、0-50或0-20。在一些实施方案 中，作为用作终止RNA PolIII转录的终止信号的一个或多个T的任 选的存在的结果，所述RNA在分子的3’末端包含一个或多个U，例 如1至8个或更多个U(例如，U、UU、UUU、UUUU、UUUUU、 UUUUUU、UUUUUUU、UUUUUUUU)。
另外，在使用单独的crRNA和tracrRNA的***中，其一者或两 者可以是合成的并且包括一个或多个脱氧核糖核苷酸。
在一些实施方案中，单一引导RNA或crRNA或tracrRNA在3’ 末端上包括一个或多个腺嘌呤(A)或尿嘧啶(U)核苷酸。
在一些实施方案中，所述gRNA被靶向与基因组的其余部分中的 任何序列相异至少3或更多个错配的位点以使脱靶效应减小至最小。
所述方法可包括在细胞中表达，或将细胞与本文中所述的缩短的 Cas9 gRNA(tru-gRNA)(任选地经修饰的tru-gRNA或DNA/RNA杂交 tru-gRNA)加可被所述缩短的Cas9gRNA例如Cas9核酸酶(例如，如 在Mali等中描述的)、Cas9切口酶(如Jinek等，2012中描述的)；或 dCas9-异功能结构域融合物(dCas9-HFD)引导的核酸酶接触。
Cas9
许多细菌表达Cas9蛋白变体。来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9是目前最常使用的；一些另外的Cas9蛋白与化脓性 链球菌Cas9具有高水平的序列同一性，并且使用相同的引导RNA。 其它的更加多样，使用不同的gRNA，并且同样地识别不同的PAM 序列(与由RNA指定的序列相邻的由蛋白质指定的2-5个核苷酸的序 列)。Chylinski等将来自一大组细菌的Cas9蛋白分类(RNA Biology 10：5，1-12；2013)，并且许多Cas9蛋白列于补充图1和其补充表1 中，所述图表通过引用并入本文。另外的Cas9蛋白描述于Esvelt等， Nat Methods.2013年11月；10(11)：1116-21和Fonfara等，“Phylogeny of Cas9determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologoustype II CRISPR-Cas systems.”Nucleic Acids Res. 2013年11月22日中。[先于印刷的电子出版]doi：10.1093/nar/gkt1074。
许多物种的Cas9分子可用于本文中描述的方法和组合物。虽然 化脓性链球菌和嗜热链球菌Cas9分子是本文中的许多公开内容的主 题，但同样地可使用本文中所列的其它物种的Cas9分子、来源于或 基于所述物种的Cas9蛋白的Cas9分子。换句话说，虽然本文中的许 多描述使用化脓性链球菌和嗜热链球菌Cas9分子，但来自其它物种的Cas9分子可替代它们。此类物种包括下表中所示的那些物种，所 述表是基于Chylinski等，2013的补充图1产生的。
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本文中描述的构建体和方法包括任何那些Cas9蛋白以及它们对 应的引导RNA或相容的其它引导RNA的使用。也已显示来自嗜热 链球菌LMD-9 CRISPR1***的Cas9在Cong等(Science 339，819 (2013))中的人细胞中起作用。来自奈瑟氏脑膜炎球菌的Cas9直系同源物描述于Hou等，Proc Natl Acad Sci USA.2013年9月24日； 110(39)：15644-9和Esvelt等，Nat Methods.2013年11月； 10(11)：1116-21中。另外，Jinek等人在体外显示来自嗜热链球菌和英 诺克李斯特菌(L.innocua)(但非来自奈瑟氏脑膜炎球菌或空肠弯曲菌(C.jejuni)的Cas9直系同源物(其可使用不同的引导RNA)可被双重化 脓性链球菌gRNA导向裂解靶质粒DNA，虽然效率略有降低。
在一些实施方案中，本***利用来自化脓性链球菌的Cas9蛋白 (如在细菌中编码的或针对在哺乳动物细胞中的表达进行密码子最优 化的)，其在D10、E762、H983或D986和H840或N863上含有突变， 例如D10A/D10N和H840A/H840N/H840Y，以使得蛋白的核酸酶部分催化失活；这些位置上的取代可以是丙氨酸(如它们在Nishimasu 等，Cell 156,935–949(2014)中一样)或它们可以是其它残基，例如谷 氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、丝氨酸或天冬氨酸，例如，E762Q、H983N、 H983Y、D986N、N863D、N863S或N863H。可用于本文中描述的方 法和组合物的自由化来活的化脓性链球菌Cas9的序列如下；D10A 和H840A的示例性突变以粗体表示并加以下划线。
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在一些实施方案中，本文中使用的Cas9核酸酶与化脓性链球菌 Cas9的序列具有至少约50％的同一性，即与SEQ ID NO：33具有至少 50％的同一性。在一些实施方案中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：33 具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、 99％或100％的同一性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：33的任何 差异存在于非保守区，如通过Chylinski等，RNA Biology 10：5，1-12； 2013(例如，在补充图1及其补充表1中)；Esvelt等，Nat Methods.2013 年11月；10(11)：1116-21和Fonfara等，Nucl.Acids Res.(2014)42(4)： 2577-2590中所示的序列的序列比对鉴定的。[2013年11月22日先于印刷的电子版]doi：10.1093/nar/gkt1074。
为了测定两个序列的百分比同一性，为了最佳比较目的，将所述 序列比对(可根据需要在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个 序列中引入缺口以进行最佳比对，并且为了比较目的可忽略非同源序 列)。为了比较目的比对的参照序列的长度为至少50％(在一些实施方 案中，约50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、95％或 100％的参照序列的长度被比对)。随后比较对应位置上的核苷酸或残 基。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的核苷酸或 残基占据时，则所述分子在该位置上是相同的。两个序列之间的百分 比同一性是由序列序列共享的相同位置的数目的函数，该函数考虑了为一两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数目和每一个缺口的长 度。
序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的测定可使用数学 算法来实现。为了本申请的目的，两个氨基酸序列之间的百分比同一 性使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法，使 用Blossum 62评分矩阵，利用为12的缺口罚分、为4的缺口延伸罚 分和为5的移码缺口罚分来测定，该算法已被整合进GCG软件包中 的GAP程序。
Cas9-HFD
Cas9-HFD描述于2013年3月15日提交的美国临时专利申请 USSN 61/799,647、2013年6月21日提交的USSN 61/838,148和PCT 国际申请第PCT/US 14/27335号(所述临时专利申请和PCT国际申请 全部通过引用整体并入本文)中。
Cas9-HFD通过将异源功能性结构域(例如，例如来自VP64或 NF-κB p65的转录激活结构域)与无催化活性的Cas9蛋白(dCas9)的N 末端或C末端融合来生成。在本情况下，如上所指出的，dCas9可来 自任何物种，但优选来自化脓性链球菌，在一些实施方案中，Cas9在D10和H840残基中含有突变例如D10N/D10A和 H840A/H840N/H840Y以使得蛋白质的核酸酶部分无催化活性，例如 如上文中的SEQ ID NO：33中显示的。
可在Cas9的N或C末端上融合转录激活结构域。另外地，尽管 本说明书举例说明转录激活结构域，但还可使用如在本领域中是已知 的其它异源功能性结构域(例如，转录阻遏物(例如，KRAB、ERD、 SID和其它，例如ets2阻遏因子(ERF)阻遏结构域(ERD)的氨基酸473-530、KOX1的KRAB的结构域的氨基酸1-97或Mad mSIN3相 互作用结构域(SID)的氨基酸1-36；参见Beerli等，PNAS USA 95：14628-14633(1998))或沉默子诸如异染色质蛋白1(HP1，也称为 swi6)，例如HP1α或HP1β；可招募与固定的RNA结合序列诸如被 MS2衣壳蛋白、内切核糖核酸酶Csy4或λN蛋白结合的那些序列融 合的长的非编码RNA(lncRNA)的蛋白质或肽；修饰DNA的甲基化状 态的酶(例如，DNA甲基转移酶(DNMT)或TET蛋白)；或修饰组蛋白亚单位的酶(例如，组蛋白乙酰转移(HAT)、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、 组蛋白甲基转移酶(例如，用于赖氨酸或精氨酸残基的甲基化)或组蛋 白脱甲基酶(例如，用于赖氨酸或精氨酸残基的脱甲基化))。此类结构 域的许多序列在本领域中是已知的，例如，催化DNA中的甲基化半 胱氨酸的羟化的结构域。示例性蛋白包括10-11-易位(TET)1-3家族， 将DNA中的5-甲基胞嘧啶(5-mC)转化成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的 酶。
人TET1-3的序列在本领域中是已知的并且示于下表中：
*变体(1)代表较长的转录物并且编码较长的同种型(a)。变体(2) 与变体1在5′UTR和3′UTR中以及在编码序列中不同。所得的同种 型(b)是较短的并且相较于同种型a具有不同的C末端。
在一些实施方案中，可包括催化结构域的全长序列的全部或部 分，例如包含富含半胱氨酸的延伸和由7个高度保守的外显子编码的 2OGFeDO结构域，例如包含氨基酸1580-2052的Tet1催化结构域、 包含氨基酸1290-1905的Tet2和包含氨基酸966-1678的Tet3的催化 模块。关于举例说明所有3个Tet蛋白中的至关重要的催化残基的比 对，参见，例如，Iyer等，Cell Cycle.2009年6月1日；8(11)：1698-710. Epub 2009年6月27日的图1，并且关于全长序列(参见，例如，seq 2c)，参见其补充材料(可在ftp站点 ftp.ncbi.nih.gov/pub/aravind/DONS/supplementary_material_DONS.html 获得)；在一些实施方案中，所述序列包括Tet1的氨基酸1418-2136 或Tet2/3中的对应区域。
其它催化分子可来自由Iyer等，2009鉴定的蛋白质。
在一些实施方案中，异源性功能结构域是生物系链，并且包含 MS2衣壳蛋白、内切核糖核酸酶Csy4或λN蛋白的全部或部分(例如 来自其的DNA结合结构域)。这些蛋白可用于将含有特定茎环结构的 RNA分子招募至由dCas9 gRNA靶向序列指定的场所。例如，与MS2衣壳蛋白、内切核糖核酸酶Csy4或λN融合的dCas9可用于招募长 的非编码RNA(lncRNA)诸如XIST或HOTAIR；参见，例如，Keryer-Bibens等，Biol.Cell 100：125-138(2008)，其连接于Csy4、MS2 或λN结合序列。或者，可将Csy4、MS2或λN蛋白结合序列连接于另一种蛋白质，如Keryer-Bibens等(同上)中描述的，并且可使用本文 中描述的方法和组合物将所述蛋白质靶向dCas9结合位点。在一些实 施方案中，Csy4是无催化活性的。
在一些实施方案中，融合蛋白包括dCas9与异源功能性结构域之 间的接头。可用于这些融合蛋白中(或串联结构中的融合蛋白之间)的接头可包括不干扰融合蛋白的功能的任何序列。在优选实施方案中， 所述接头是短的，例如2-20个氨基酸，并且通常是柔性的(即，包含 具有高度自由的氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。在一些实施 方案中，所述接头包含一个或多个由GGGS(SEQ ID NO：34)或 GGGGS(SEQ ID NO：35)组成的单位，例如，2、3、4或更多个 GGGS(SEQ ID NO：34)或GGGGS(SEQ ID NO：35)单位的重复。还可使 用其它接头序列。
表达***
为了使用描述的引导RNA，可能期望从编码它们的核酸表达它 们。这可以以多种方式来进行。例如，可将编码引导RNA的核酸克 隆入用于转化进用于复制和/或表达的原核或真核细胞的中间载体。 中间载体通常是原核载体，例如，质粒或穿梭载体或昆虫载体，其用 于贮存或操纵编码引导RNA的核酸以用于引导RNA的产生。还可 将编码引导RNA的核酸克隆入表达载体，例如用于向植物细胞、动 物细胞，优选地哺乳动物细胞或人细胞、真菌细胞、细菌细胞或原生 动物细胞施用。
为了获得表达，通常将编码引导RNA的序列亚克隆入含有指导 转录的启动子的表达载体。合适的细菌和真核启动子在本领域中是公 在的，并且描述于例如Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2001年第3版)；Kriegler，Gene Transfer andExpression：A Laboratory Manual(1990)和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，编辑，2010)中。用于表达工程化蛋白质的细菌 表达***可在例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门 菌属(Salmonella)(Palva等，1983，Gene22：229-235)中获得。此类表达 ***的试剂盒是商购可得的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的 真核表达***在本领域中是公知的并且也是商购可得的。
用于指导核酸表达的启动子取决于具体应用。例如，强组成型启 动子通常用于融合蛋白的表达和纯化。相反地，当将体内施用引导 RNA以进行基因调控时，可使用组成型或诱导型启动子，这取决于 引导RNA的具体用途。另外，用于施用引导RNA的优选启动子可 以是弱启动子，诸如HSV TK或具有类似活性的启动子。启动子还可 包括响应反式激活的元件，例如，缺氧应答元件、Gal4应答元件、lac 阻遏应答元件和小分子控制***诸如四环素调节的***和RU-486系 统(参见，例如，Gossen&Bujard，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547；Oligino等，1998，Gene Ther.，5：491-496；Wang等，1997， Gene Ther.，4：432-441；Neering等，1996，Blood，88：1147-55和Rendahl 等，1998，Nat.Biotechnol.，16：757-761)。
除了启动子以外，表达载体通常还含有包含核酸在宿主细胞(原 核或真核的)中表达所需的所有另外的元件的转录单位或表达盒。常 见表达盒从而含有可操作地连接于例如编码gRNA的核酸序列的启 动子和例如进行转录物的高效多腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位 点或翻译终止的所需的任何信号。表达盒的另外元件可包括例如增强 子和异源剪接内含子信号。
根据gRNA的期望用途(例如，在植物、动物、细菌、真菌、原 生动物等中表达)选择用于将遗传信息转运至细胞的特定表达载体。 标准细菌表达载体包括质粒诸如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D 和商购可得的靶-融合表达***诸如GST和LacZ。
含有来自真核病毒的调控元件的表达载体通常用于真核表达载 体，例如，SV40载体、***状瘤病毒载体和来源于爱泼斯坦-巴尔病 毒的载体。其它示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、 pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和允许在如下启动子指导下表达蛋白质的任何其它载体：SV40早期启动子、SV40晚期启动 子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒动子、劳斯肉瘤病毒启动子、 多角体蛋白启动子或经显示对于在真核细胞中的表达是有效的其它启动子。
用于表达引导RNA的载体可包括驱动引导RNA表达的RNA Pol III启动子，例如H1、U6或7SK启动子。这些人启动子允许在质粒 转染后在哺乳动物细胞中表达gRNA。或者，T7启动子可用于例如体外转录，并且所述RNA可被体外转录和纯化。可使用适合用于短 的RNA例如siRNA、shRNA或其它小的RNA表达的载体。
一些表达***具有用于选择稳定地转染的细胞系的标志物诸如 胸苷激酶、潮霉素B磷酸物转移酶和二氢叶酸还原酶。高产表达*** 也是合适的，诸如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，利用在多角体蛋 白启动子或其它强杆状病毒启动子的指导下的gRNA编码序列。
通常被包括在表达载体中的元件还包括在大肠杆菌中起作用的 复制子、编码抗生素抗性以允许选择具有重组质粒的细菌的基因和允 许重组序列***的质粒的非必需区中的独特限制性位点。
标准转染法可用于产生表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母 或昆虫细胞系，随后使用标准技术(参见，例如，Colley等，1989，J.Biol. Chem.，264：17619-22；Guide toProtein Purification，于Methods in Enzymology，第182卷(Deutscher，编辑，1990)中)纯化所述蛋白质。 真核和原核细胞的转化按照标准技术(参见，例如，Morrison，1977，J.Bacteriol.132：349-351；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology 101：347-362(Wu等，编辑，1983)来进行。
可使用用于将外来核苷酸序列引入宿主细胞的任何已知方法。这 些方法包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、核转 染、脂质体、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体(游离型和融合型)和用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传物质引入宿主细胞的任何其它公知的方法(参见，例如，Sambrook 等，同上)。唯一必需的是，使用的特定遗传工程方法能够成功地将 至少一个基因引入能够表达gRNA的宿主细胞。
本发明包括所述载体和包含所述载体的细胞。
实施例
在下列实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求 中描述的本发明的范围。
实施例1.评估RNA引导的内切核酸酶的特异性
CRISPR RNA引导的核酸酶(RGN)已迅速形成为用于基因组编 辑的轻便高效的平台。本实施例描述基于人细胞的报告测定用于表征 基于Cas9的RGN的脱靶裂解的用途。
材料和方法
下列材料和方法用于实施例1中。
引导RNA的构建
将具有用于Cas9靶向的可变20nt序列的DNA寡核苷酸(表A) 退火以产生具有与至BsmBI-消化的质粒pMLM3636中的连接相容4 bp悬突的短的双链DNA片段。这些退火的寡核苷酸的克隆产生编码 在U6启动子的表达下的具有20个可变5’核苷酸的嵌合+103单链引导RNA的质粒(Hwang等，Nat Biotechnol 31，227-229(2013)；Mali 等，Science 339，823-826(2013))。用于本研究的pMLM3636和表达 质粒pJDS246(编码Cas9的密码子最优化的形式)都可通过非营利质粒 的分销服务Addgene(addgene.org/crispr-cas)获得。
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用于产生编码被靶向EGFP报告基因中的位点的单一gRNA/变 体单一gRNA和被靶向6个内源人基因靶的单一gRNA的表达质粒 的寡核苷酸的序列。#，SEQ ID NO：。
EGFP活性测定
如先前所述(Reyon等，Nat Biotech 30，460-465(2012))培养具有 单个整合的拷贝的EGFP-PEST融合基因的U2OS.EGFP细胞。为了进行转染，按照制造商的方案，使用SE细胞系4D-NucleofectorTM X 试剂盒(Lonza)，利用指定量的sgRNA表达质粒和pJDS246与30ng的Td-Tomato-编码质粒一起对200,000个细胞进行核转染。使用BD LSRII流式细胞仪在转染后2天分析细胞。以一式三份进行最优化 gRNA/Cas9质粒浓度的转染，并且以一式二份进行所有其它转染。
内源人基因组位点的PCR扩增和序列验证
使Phusion Hot Start II高保真DNA聚合酶(NEB)，利用表B中所 列的PCR引物和条件进行PCR反应。采用降落PCR(98℃，10秒； 72-62℃；-1℃/循环，15秒；72℃，30秒]10个循环，[98℃，10秒； 62℃，15秒；72℃，30秒]25个循环)成功地扩增大多数基因座。必 要时，在68℃或72℃的恒定退火温度下和3％DMSO或1M甜菜碱 中进行用于其余靶的PCR，进行35个循环。在QIAXCEL毛细管电 泳***上分析PCR产物以验证大小和纯度。利用 ExoSap-IT(Affymetrix)处理验证的产物，并通过Sanger法(MGH DNA Sequencing Core)对所述产物进行测序以验证每一个靶位点。
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人细胞中的RGN诱导的中靶和脱靶突变频率的测定
对于U2OS.EGFP和K562细胞，按照制造商的方案(Lonza)，使 用4D Nucleofector***，用250ng的gRNA表达质粒或空U6启动 子质粒(用于阴性对照)、750ng Cas9表达质粒和30ng的td-Tomato 表达质粒转染2x105个细胞。对于HEK293细胞，按照制造商的方案(Life Technologies)，使用Lipofectamine LTX试剂，利用125ng的 gRNA表达质粒或空U6启动子质粒(用于阴性对照)、375ng的Cas9 表达质粒和30ng的td-Tomato表达质粒转染1.65x105个细胞。按照 制造商的说明书，使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(QIAGEN)从转染的U2OS.EGFP、HEK293或K562细胞细胞收获基因组DNA。 为了产生足够的基因组DNA以扩增脱靶候选位点，将来自3个核转 染(对于U2OS.EGFP细胞)、2个核转染(对于K562细胞)或2个脂质 体LTX转染的DNA混合在一起，随后进行T7EI。对于每一个测试 的条件，该过程进行2次，从而产生一式两份代表总共4或6个单独的转染的基因组DNA的混合物。随后如上所述使用这些基因组DNA 作为模板进行PCR，随后按照制造商的说明书使用Ampure XP珠(Agencourt)进行纯化。如先前所述(Reyon等，2012，同上)进行T7EI 测定。
NHEJ介导的***缺失突变的DNA测序
将用于T7EI测定的纯化的PCR产物克隆入Zero Blunt TOPO载 体(LifeTechnologies)，利用MGH DNA Automation Core，使用碱裂解 小量制备法分离质粒DNA。随后利用Sanger法(MGH DNA Sequencing Core)，使用M13正向引物(5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’(SEQ ID NO：1059)对质粒进行测序。
实施例1a.单核苷酸错配
为了开始确定人细胞中的RGN的特异性决定簇，进行大规模测 试来评估多个gRNA/靶DNA界面内的***性错配的不同位置的效应。为了进行该测定，使用先前描述的(参见上述方法和Reyon等， 2012，同上)基于人细胞的定量提高绿色荧光蛋白(EGFP)破坏测定， 该测定使得能够快速定量靶向核酸酶活性(图2B)。在该测定中，被靶 向单一整合的EGFP报告基因的核酸酶的活性可通过评估通过灭活移码***/缺失(***缺失)突变(通过核酸酶诱导的双链断裂(DSB)的 易错非同源末端连接(NHEJ)修复引起的)引起的人U2OS.EGFP细胞 中的荧光信号的损失来定量(图2B)。为了进行此处描述的研究，使用如下被靶向EGFP内的不同序列的三个～100nt的单一gRNA：
EGFP位点1GGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGG(SEQ ID NO：9)
EGFP位点2GATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGG(SEQ ID NO：10)
EGFP位点3GGTGGTGCAGATGAACTTCAGGG(SEQ ID NO：11)
这些gRNA中的每一个可高效地引导Cas9介导的EGFP表达的 破坏(参见实施例1e和2a，以及图3E(顶)和3F(顶))。
在最初的实验中，测试3个EGFP-靶向gRNA的互补靶向区中 的20个核苷酸中的19个核苷酸上的单核苷酸错配的效应。为进行该 测定，产生针对3个在位置1至19(以3’至5’方向编号1至20；参见 图1)上具有沃尔森-克里克颠换错配的靶位点的每一个的变体gRNA，并且测试这些不同的gRNA在测试的人细胞中引导Cas9介导的 EGFP破坏的能力(未产生在位置20上具有取代的变体gRNA，因为 该核苷酸为U6启动子序列的部分，从而必须保留鸟嘌呤来避免影响 表达)。
对EGFP靶位点#2，gRNA的位置1-10中的单个错配对相关Cas9 活性具有显著作用(图2C，中图)，与表明相较于3’末端上的错配， gRNA的5’末端上的错配被更好地被耐受的先前研究一致(Jiang等， Nat Biotechnol 31，233-239(2013)；Cong等，Science 339，819-823 (2013)；Jinek等，Science 337，816-821(2012))。然而，对于EGFP靶 位点#1和#3，gRNA中除少数位置外所有位置上的单个错配似乎被良 好地耐受，即使在序列的3’末端内亦如此。此外，对错配敏感的特定 位置对于两个靶是不同的(图2C，比较顶图与底图)-例如，靶位点#1 对位置2上的错配特别敏感，而靶位点#3对于位置1和8上的错配是最敏感的。
实施例1b.多个错配
为了测试gRNA/DNA界面上的不止一个错配的效应，在相邻和 分开的位置中产生一系列具有双沃尔森-克里克颠换错配的变体 gRNA，并使用EGFP破坏测定在人细胞中测试这些gRNA引导Cas9 核酸酶活性的能力。所有三个靶位点通常显示更大的对双改变的敏感性，在所述双改变中一个或两个错配存于gRNA靶向区域的3’半部 分内。然而，这些效应的量级显示位点特异性变化，靶位点#2显示 最大的对这些双错配的敏感性，并且靶位点#1通常显示最小的敏感 性。为了测试可被耐受的相邻错配的数目，构建在gRNA靶向区的5’ 末端中具有在位置19至15的范围内的递增数目的错配位置的变体 gRNA(其中单和双错配似乎被更好地耐受)。
这些递增错配的gRNA的测试显示对于所有3个靶位点，3个或 更多个相邻错配的引入导致RGN活性的显著丧失。当从5’末端的位 置19开始，朝向3’末端添加更多错配时，对于3个不同的EGFP靶 向gRNA，发生活性的突然下降。具体地，在位置19和19+18上含 有错配的gRNA显示基本上完全的活性，然而在位置19+18+17、 19+18+17+16和19+18+17+16+15上具有错配的那些显示相对于阴性 对照基本上无差异(图2F)。(注意，我们在这些变体gRNA中在位置 20上不错配，因为该位置需要保留来作为G，因为其为驱动gRNA 的表达的U6启动子的部分)。
在下列实验中获得缩短gRNA互补性可导致具有更大特异性的 RGN的另一个证据：对于4个不同的EGFP靶向gRNA(图2H)，在 位置18和19上引入双错配不显著影响活性。然而，在位置10和11 上引入另一个双错配然后进入这些gRNA导致活性几乎完全丧失。有 趣地，仅10/11双错配的引入通常对活性没有同样巨大的影响。
综上所述，人细胞中的这些结果确认了RGN的活性可对gRNA 靶向序列的3’半部分中的错配更敏感。然而，所述数据还明确地显示 RGN的特异性是复杂的并且是靶位点依赖性的，单和双错配通常被 良好地耐受，即使当一个或多个错配存在于gRNA靶向区域的3’半部分中时。此外，这些数据还表明并非gRNA/DNA界面的5’半部分 中的所有错配都一定被良好耐受。
另外，这些结果强有力表明具有较短的互补性区域(具体地～17nt) 的gRNA在它们的活性上具有更大的特异性。我们指出，与由PAM 序列赋予的2nt的特异性组合的17nt的特异性导致19bp序列(在大 的复杂基因组诸如在人细胞中发现的那些基因组中是唯一的足够长 度之一)的特异性。
实施例1c.脱靶突变
为了确定针对被靶向内源人基因的RGN的脱靶突变是否可被鉴 定，使用靶向VEGFA基因中的3个不同位点、EMX1基因中的一个 位点、RNF2基因中的一个位点和FANCF基因中的一个位点的6个 单一gRNA(表1和表A)。这6个gRNA在人U2OS.EGFP细胞中在 它们各自的内源基因座上高效地引导Cas9介导的***缺失，如通过 T7内切核酸酶I(T7EI)测定(上述方法和表1)检测的。对这6个RGN 的每一个，我们随后在U2OS.EGFP细胞中针对核酸酶诱导的NHEJ 介导的***缺失突变检查成打的潜在脱靶位点(数目在46至多至64 的范围内)。被评估的基因座包括相异在于1或2个核苷酸的所有基 因组位点，以及成亚组的差异在于3至6个核苷酸并且具有朝向在 gRNA靶向序列的5’半部分中具有这些错配中的一个或多个的那些 位点的偏向性的基因组位点(表B)。通过使用T7EI测定，容易地鉴定 了针对VEGFA位点1的4个脱靶位点(所检查的53个候选位点中的)、针对VEGFA位点2的12个脱靶位点(所检查的46个中的)、针对 VEGFA位点3的7个脱靶位点(所检查的64个中的)和针对EMX1位 点的1个脱靶位点(所检查的46个中的)(表1和表B)。在分别针对 RNF2或FANCF基因检查的43个和50个潜在位点中未检测到脱靶 突变(表B)。经验证的脱靶位点上的突变率非常高，在期望的靶位点 上观察到在5.6％至125％(40％的平均值)的范围内的突变率(表1)。这 些真正的脱靶包括在靶位点的3’末端具有错配并且具有多至总共5 个错配的序列，大多数脱靶位点存在于蛋白质编码基因内(表1)。一 个亚组的脱靶位点的DNA测序提供***缺失突变存在于预期的RGN 裂解位点上的另外的分子构象(图8A-C)。
表1由被针对内源人基因设计的RGN诱导的中靶和脱靶突变
“OT”表示脱靶位点(位点编号如表E中一样)。来自中靶的错配(在 与gRNA杂交的20bp区域内)以粗体加下划线的文本突出显示。如 方法中所述测定U2OS.EGFP、HEK293和K562细胞中的平均***缺 失突变频率。显示了位点(如果有的话)所位于的基因。所列的所有位 点在Cas9表达质粒和不表达功能性gRNA的对照U6启动子质粒转 染的细胞中都未显示任何修饰的证据。N.D.＝未检测到；---＝未测试的。
实施例1d.其它细胞类型中的脱靶突变
在已确定RGN可在U2OS.EGFP细胞中以高频率诱导脱靶突变 后，我们随后设法确定这些核酸酶是否在其它类型的人细胞中也具有 这些效应。我们已选择U2OS.EGFP细胞用于我们的初始实验，因为 我们先前使用这些细胞来评价TALEN15的活性，但人HEK293和K562细胞已被更广泛地用于测试靶向核酸酶的活性。因此，我们还 在HEK293和K562细胞中评估被靶向VEGFA位点1、2和3以及 EMX1位点的4个RGN的活性。我们发现，在这两个另外的人细胞 系中，这4个RGN中的每一个在它们期望的中靶位点上高效地诱导 NHEJ介导的***缺失突变(如通过T7EI测定法测定的)(表1)，虽然 具有比在U2OS.EGFP细胞中观察到的突变频率稍微更低的突变频 率。最初在U2OS.EGFP细胞中鉴定的这4个RGN的24个脱靶位点的评估显示许多位点在HEK293和K562细胞中再次以与在对应的中 靶位点上的频率相似的频率被突变(表1)。如所预期的，一个亚组的 来自HEK293细胞的这些脱靶位点的DNA测序提供改变在预期的基 因组基因座上发生的另外的分子证据(图9A-C)。我们出于某种因不 知道为什么在HEK293细胞中有4个在U2OS.EGFP细胞中鉴定的脱 靶位点以及在K562细胞中有11个所述脱靶序列未显示可检测的突 变。然而，我们要指出，这些脱靶位点中的许多位点在U2OS.EGFP 细胞中也显示相对较低的突变频率。因此，我们推测这些位点在HEK293和K562细胞中的突变率可落在我们的T7EI测定的可靠检测 限(～2-5％)下方，因为在我们的实验中，RGN通常似乎在HEK293和 K562细胞中相较于U2OS.EGFP细胞具有较低的活性。综上所述， 我们在HEK293和K562细胞中的结果提供了我们对于RGN观察到 的高频脱靶突变将为在多个人细胞类型中看到的一般现象的证据。
实施例1e.用于EGFP破坏测定的表达gRNA和Cas9的质粒的 量的滴定
产生针对位于EGFP核苷酸502上游(在其上通过非同源末端连 接引入移码突变可强烈地破坏EGFP的表达的位置)的3个不同序列 (上文中显示的EGFP位点1-3)的单一gRNA(Maeder，M.L.等，Mol Cell 31，294-301(2008)；Reyon，D.等，Nat Biotech 30，460-465(2012))。
对于所述3个靶位点的每一个，最初将一系列表达gRNA的质粒 的量(12.5至250ng)与750ng表达Cas9核酸酶的密码子最优化形式 的质粒一起转染进我们的U2OS.EGFP报告细胞，所述细胞具有单拷 贝的组成型表达的EGFP-PEST报告基因。所有3个RGN在编码gRNA的质粒的最高浓度(250ng)上高效地破坏EGFP表达(图 3E(顶))。然而，当转染较少量的表达gRNA的质粒时，针对靶位点 #1和#3的RGN显示等同水平的破坏，而当降低转染的表达gRNA 的质粒的量时，RGN在靶位点#2上的活性立即下降(图3E(顶))。
滴定在转染进我们的U2OS.EGFP报告细胞的编码Cas9的质粒 的量(在50ng至750ng的范围内)，并测定EGFP破坏。如图3F(顶) 中显示的，靶位点#1耐受转染的表达Cas9的质粒的量的3倍降低而 无EGFP破坏活性的显著丧失。然而，RGN靶向靶位点#2和#3的活性随着转染的Cas9质粒的量的3倍降低而立即降低(图3F(顶))。基 于这些结果，分别将25ng/250ng、250ng/750ng和200ng/750ng的表 达gRNA的质粒/表达Cas9的质粒用于EGFP靶位点#1、#2和#3， 以进行实施例1a-1d中描述的实验。
一些gRNA/Cas9组合在破坏EGFP表达中表现比其它组合好的 原因还不清楚，这些组合中的一些组合对用于转染的质粒的量更敏感 或不太敏感的原因也不清楚。虽然对于这3个gRNA，存在于基因组 中的脱靶位点的范围有可能影响它们的每一个的活性，但对于这些特 定的靶位点的每一个，在相异在于1至6bp的基因组位点的数目上 未看到差异(表C)，所述差异可解释3个gRNA的差异行为。
表C
针对被靶向内源人基因的6个RGN和被靶向EGFP报告基因的3 个RGN的人基因组中的脱靶位点的数目
在人基因组序列构建GRCh37中鉴定了被靶向VEGFA、RNF2、 FANCF和EMX1基因的6个RGN和被靶向EGFP靶位点#1、#2和 #3的3个RGN的每一个的脱靶位点。仅允许在与gRNA退火的20nt 区域中但不允许在PAM序列中存在错配。
实施例2：缩短gRNA互补长度以提高RGN裂解特异性
假设RGN的脱靶效应可只通过缩短gRNA-DNA界面的长度(起 初可能似乎违反直觉的方法)减小至最小而不削弱中靶活性。较长的 gRNA实际上在中靶位点上的功能可不太有效(参见下文和Hwang 等，2013a；Ran等，2013)。相反地，如在上文实施例1中显示的， 在它们的5’末端具有多个错配的gRNA仍然可诱导它们的靶位点的 强劲裂解(图2A和2C-2F)，这表明这些核苷酸可能不是完全中靶活 性所需的。因此，假设缺乏这些5’核苷酸的截短的gRNA可能显示 可与全长gRNA相当的活性(图2A)。据推测，如果全长gRNA的5’ 核苷酸不是中靶活性所需的，则它们的存在可能也补偿沿着gRNA- 靶DNA界面的其它位置上的错配。如果这是真的，假设gRNA可能 具有更大的对错配的敏感性，从而可能也诱导显著较低水平的Cas9 介导的脱靶突变(图2A)。
实验程序
将下列实验程序用于实施例2。
质粒构建
通过设计、合成具有互补区的寡核苷酸(IDT)，使其退火并将成 对的所述寡核苷酸克隆入上述(实施例1)质粒pMLM3636(可从Addgene获得)中来装配所有gRNA表达质粒。所得的gRNA表达载体编码其表达由人U6启动子驱动的～100nt gRNA。用于构建gRNA 表达载体的所有寡核苷酸的序列示于表D中。通过使用QuikChange 试剂盒(AgilentTechnologies)利用下列引物突变质粒pJDS246来产生 在RuvC内切核酸酶结构域中具有突变的Cas9 D10A切口酶表达质粒 (pJDS271)：Cas9 D10A有义引物 5’-tggataaaaagtattctattggtttagccatcggcactaattccg-3’(SEQ ID NO：1089)； Cas9 D10A反义引物 5’-cggaattagtgccgatggctaaaccaatagaatactttttatcca-3’(SEQ ID NO：1090)。 用于本研究的所有靶向gRNA质粒和Cas9切口酶质粒可通过非营利 质粒的分销服务Addgene(addgene.org/crispr-cas)获得。
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基于人细胞的EGFP破坏测定
先前(Reyon等，2012)已描述了具有单拷贝整合的EGFP-PEST 报告基因的U2OS.EGFP细胞。将这些细胞维持在补充有10％FBS、 2mM GlutaMax(Life Technologies)、青霉素/链霉素和400μg/ml G418 的高级DMEM(Life Technologies)中。为了测定EGFP表达的破坏，按照制造商的说明书，使用LONZA 4D-NucleofectorTM，利用SE溶 液和DN100程序，用gRNA表达质粒或空U6启动子质粒(作为阴性 对照)、Cas9表达质粒(pJDS246)(实施例1和Fu等，2013)和10ng的 td-Tomato表达质粒(以控制转染效率)以一式两份转染2x105个U2OS.EGFP细胞。我们将25ng/250ng、250ng/750ng、200ng/750ng 和250ng/750ng的gRNA表达质粒/Cas9表达质粒分别用于利用 EGFP位点#1、#2、#3和#4的实验。转染后2天，用胰蛋白酶处理 细胞，随后将细胞重悬浮于补充有10％(体积/体积)胎牛血清(FBS)的 Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen)中，并在BD LSRII 流式细胞仪上分析所述细胞。对于每一个样品，以一式二份进行转染和流式细胞术测量。
人细胞的转染和基因组DNA的分离
为了评估由被靶向内源人基因的RGN诱导的中靶和脱靶***缺 失突变，使用下列条件将质粒转染进U2OS.EGFP或HEK293细胞：使用与针对上述EGFP破坏测定的条件相同的条件转染U2OS.EGFP 细胞。通过在37℃下于CO2培养箱中，在补充有10％FBS和2mMGlutaMax(Life Technologies)的高级DMEM(Life Technologies)中将它们以1.65×105个细胞/孔的密度接种在24孔板中来转染HEK293细 胞。在22-24小时的孵育后，按照制造商的说明书(Life Technologies)使用脂质体LTX试剂，用125ng gRNA表达质粒或空U6启动子质粒(作为阴性对照)、375ng Cas9表达质粒(pJDS246)(实施例1和Fu 等，2013)和10ng td-Tomato表达质粒转染细胞。转染后16小时更换 培养基。对于两种类型的细胞，按照制造商的说明书，使用Agencourt DNAdvance基因组DNA分离试剂盒(Beckman)在转染后2天收获基因组DNA。对于待测定的每一个RGN样品，进行12个单独的4D 转染重复，对于这12个转染的每一个分离基因组在DNA，随后将这 些样品组合以产生两个“一式二份”混合物，每一个混合物由6个混合的基因组DNA样品组成。随后通过T7EI测定、Sanger测序和/或如 下所述的深度测序评估来自这些一式二份样品的中靶和脱靶位点上 的***缺失突变。
为了评估利用ssODN供体模板通过HDR引入的精确改变的频 率，用250ng gRNA表达质粒或空U6启动子质粒(作为阴性对照)、 750ng Cas9表达质粒(pJDS246)、50pmolssODN供体(或对于对照， 无ssODN)和10ng td-Tomato表达质粒(作为转染对照)转染2x105个 U2OS.EGFP细胞。转染后3天使用Agencourt DNAdvance纯化基因 组DNA，随后测定其在如下所述的目标基因座上的BamHI位点的引入。以一式二份进行所有这些转染。
对于牵涉Cas9切口酶的实验，用125ng的每一种gRNA表达质 粒(如果使用成对的gRNA)或250ng的gRNA表达质粒(如果使用单 一gRNA)、750ng Cas9-D10A切口酶表达质粒(pJDS271)、10ng td-Tomato质粒和(如果进行HDR)50pmol的ssODN供体模板(编码 BamHI位点)转染2x105个U2OS.EGFP细胞。以一式二份进行所有转 染。在转染后2天(如果测定***缺失突变)或转染后3天(如果测定 HDR/ssODN介导的改变)使用Agencourt DNAdvance基因组DNA分 离试剂盒(Beckman)收获基因组DNA。
用于定量***缺失突变的频率的T7EI测定
如先前所述(实施例1和Fu等，2013)进行T7EI测定。简言之， 使用两个下列程序之一，利用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)进行扩增特异性中靶或脱靶位点的PCR反应：(1)降 落PCR程序[(98℃，10秒；72-62℃；-1℃/循环，15秒；72℃，30 秒)x10个循环，(98℃，10秒；62℃，15秒；72℃，30秒)x25个循 环)]或(2)恒定Tm PCR程序[(98℃，10秒；68℃或72℃，15秒；72℃， 30秒)x35个循环]，必要时利用3％DMSO或1M甜菜碱。用于这些 扩增的所有引物列于表E中。所得PCR产物的大小在300至800bp 的范围内，并且按照制造商的说明书通过Ampure XP珠(Agencourt) 纯化。将200ng纯化的PCR产物在19μl的总体积中于1xNEB缓冲 液2中杂交，随后使用下列条件变性以以形成异源双链：95℃，5分 钟；95至85℃，-2℃/秒；85至25℃，-0.1℃/秒；在4℃保持。将1μl 的T7内切核酸酶I(New EnglandBiolabs，10个单位/μ1)添加至杂交的 PCR产物，随后于37℃孵育15分钟。通过添加2μl的0.25M EDTA 溶液终止T7EI反应，随后使用AMPure XP珠(Agencourt)，通过在20 μl 0.1xEB缓冲液(QIAgen)中洗脱来纯化珠。随后在QIAXCEL毛细管 电泳***上分析反应产物，使用与先前所述(Reyon等，2012)相同的 公式计算***缺失突变的频率。
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用于定量***缺失突变的频率的Sanger测序
将用于T7EI测定的纯化的PCR产物连接进Zero Blunt TOPO载 体(LifeTechnologies)，并将其化学地转染进感受态Top 10细菌细胞。 分离质粒DNA，并使用M13正向引物 (5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’)(SEQ ID NO：1059)通过马萨诸塞州 总医院(MGH)DNAAutomation Core对其进行测序。
用于定量利用ssODN通过HDR诱导的特异性改变的限制酶切 消化测定
使用Phusion高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)进行特异 性中靶位点的PCR反应。使用降落PCR程序((98℃，10秒；72-62℃， -1℃/循环，15秒；72℃，30秒)x10个循环，(98℃，10秒；62℃， 15秒；72℃，30秒)x25个循环)，利用3％DMSO扩增VEGF和EMX1 基因座。用于这些PCR反应的引物列于表E中。按照制造商的说明 书，利用Ampure XP珠(Agencourt)纯化PCR产物。对于由ssODN供 体模板编码的BamHI限制性位点的检测，利用BamHI在37℃消化 200ng的纯化的PCR产物，进行45分钟。通过Ampure XP珠 (Agencourt)纯化消化产物，将其在20ul 0.1xEB缓冲液中进行洗脱，使用QIAXCEL毛细管电泳***对其进行分析和定量。
TruSeq文库生成和测序数据分析
基因座特异性引物被设计来侧翼连接中靶位点以及潜在的和经 验证的脱靶位点以产生长度为～300bp至400bp的PCR产物。将来自 上述混合的一式二份的样品的基因组DNA用作PCR的模板。按照制造商的说明书，利用Ampure XP珠(Agencourt)纯化所有PCR产物。 在QIAXCEL毛细管电泳***上定量纯化的PCR产物。从每一个混 合的一式二份样品(上述的)扩增每一个基因座的PCR产物，纯化、定 量所述PCR产物，随后将其以相等量混合在一起以用于深度测序。 用如先前所述(Fisher等，2011)的双指数Illumina TruSeq 衔接头连接 混合的扩增子。纯化所述文库，随后将其在QIAXCEL毛细管电泳系 统上运行以验证衔接头连接后大小的变化。通过qPCR定量衔接头连 接的文库，随后使用由Dana-Farber CancerInstitute Molecular Biology Core Facilities进行的Illumina MiSeq 250bp成对-末端读数对其进行 测序。我们对每一个样品分析75,000至1,270,000个(平均～422,000 个)读灵敏。如先前所述(Sander等，2013)就***缺失诱变率分析 TruSeq读数。将特异性比计算为观察到的中靶基因座上的诱变对特定脱靶基因座的诱变的比率，如通过深度测序测定的。将针对tru-RGN 的单独的靶位点的特异性的倍数提高计算为对于tru-gRNA观察到的特异性比对比针对匹配的全长gRNA的该相同靶的特异性比。如原文 中提及的，对于一些脱靶位点，对于tru-gRNA未检测到***缺失突 变。在这些情况下，我们使用泊松计算器以95％的置信度测定突变序 列的实际数目的上限在数目上为3。我们随后使用该上限来估计针对这些脱靶位点的的特异性的最小倍数提高。
实施例2a.截短的gRNA可在人细胞中高效地引导Cas9介导的 基因组编辑
为了测试在它们的5’末端上截短的gRNA可与它们的全长对应 物一样高效地起作用的假说，如上文中针对EGFP报告基因中的单个 靶位点所描述的，最初利用下列序列构建一系列逐渐缩短的gRNA： 5’-GGCGAGGGCGATGCCACCTAcGG-3’(SEQ ID NO：2241)。选择该 特定的EGFP位点，因为这可能使gRNA与其具有15、17、19和20 nt的各自在它们的5’末端具有G(从用于这些实验的U6启动子高效表 达所需的)的互补性。通过使用其中RGN诱导的***缺失的频率可通 过评估单个整合的并且组成型表达的提高绿色荧光蛋白(EGFP)基因 的破坏来定量的基于人细胞的报告测定(实施例1和Fu等，2013； Reyon等，2012)(图2B)，测量这些可变长度的gRNA引导Cas9诱导 的***缺失的能力。
如上所指出的，具有较长互补长度(21、23和25nt)的gRNA显 示相对于含有20nt的互补序列的标准全长gRNA降低的活性(图2H)， 一个与由其它研究人员最近报导的结果(Ran等，Cell 2013)匹配的结 果。然而，具有17或19nt的靶互补性的gRNA显示可与全长gRNA 相当或高于其的活性，然而，仅具有15nt的互补性的较短的gRNA 未显示显著的活性(图2H)。
为了测试这些初步发现的一般性，测定与4个另外的EGFP报告 基因位点(EGFP位点#1、#2、#3和#4；图3A)具有18、17和/或16nt 的互补性的全长gRNA和匹配的gRNA。在所有4个靶位点上，具有 17和/或18nt的互补性的gRNA与它们的全长gRNA一样高效地(或， 在一个情况下，比其更高效地)诱导Cas9介导的EGFP表达的破坏(图 3A)。然而，仅具有16nt的互补性的gRNA对可针对其产生它们的 两个位点显示显著降低的或不可检测的活性(图3A)。对于每一个测试 的不同位点，我们转染相同量的全长或缩短的gRNA表达质粒和Cas9 表达质粒。其中我们改变用于针对EGFP位点#1、#2和#3转染的Cas9 和截短的gRNA表达质粒的量的对照实验表明，缩短的gRNA与它 们的全长对应物功能等同(图3E(底)和3F(底))，从而当在任何给定的 靶位点进行比较时，我们可使用相同量的质粒。综上所述，这些结果 提供了具有17或18nt的互补性的缩短的gRNA通常可与全长gRNA 一样高效地起作用的证据，并且在下文中具有这些互补长度的截短的 gRNA称为“tru-gRNA”以及使用这些tru-gRNA的RGN被称为 “tru-RGN”。
随后测试tru-RGN是否可高效地在染色质化的内源基因靶上诱 导***缺失。针对3个内源人基因(VEGFA、EMX1和CLTA)中的7 个位点(包括先前已被在3个内源人基因中的标准全长gRNA靶向的 4个位点：VEGFA位点1、VEGFA位点3、EMX1和CTLA(实施例1 和Fu等，2013；Hsu等，2013；Pattanayak等，2013))构建Tru-gRNA(图 3B)。(不可能针对来自实施例1的VEGFA位点2测试tru-gRNA，因 为该靶序列在互补区的位置17或18上不具有gRNA从U6启动子表达所需的G)。通过使用如上所述的良好建立的T7内切核酸酶I(T7EI) 基因分型测定(Reyon等，2012)，在人U2OS.EGFP细胞中定量由这 些不同的gRNA的每一个在它们各自的靶位点上诱导的Cas9介导的 ***缺失突变频率。对于七四个位点中的所有5个位点，tru-RGN以 与匹配的标准RGN介导的效率相当的效率强劲的诱导***缺失突变 (图3B)。对于tru-RGN对于其显示比它们的全长对应物低的活性的两 个位点，我们注意到，绝对诱变率在水平上仍然很高(13.3％和16.6％的平均值)，所述诱变率可用于大多数应用。这些靶位点的3个位点 (VEGFA位点1和3以及EMX1)的Sanger测序确认由tru-RGN诱导 的***缺失源于预期的裂解位点，并且这些突变与利用标准RGN诱 导的那些突变基本上没有差别(图3C和图7A-D)。
我们还发现具有错配的5’G和18nt互补区的tru-gRNA可高效 地引导Cas9诱导的***缺失，然而具有错配的5’G和17nt互补区 的那些显示相较于匹配的全长gRNA更低的或不可检测的活性(图7E)，与最小17nt的互补性是高效RGN活性所需的我们的发现一致。
为了进一步评估tru-RGN的基因组编辑能力，测试它们通过HDR 利用ssODN供体模板诱导精确的序列改变的能力。先前的研究已显 示Cas9诱导的断裂可在人细胞中刺激来自同源ssODN供体的序列至 内源基因座的引入(Cong等，2013；Mali等，2013c；Ran等，2013；Yang等，2013)。因此，比较被靶向VEGFA位点1和EMX1位点的 匹配的全长与tru-gRNA将在同源ssODN上编码的BamHI限制性位 点引入这些内源基因的能力。在两个位点上，tru-RGN都以与对于具有它们的全长gRNA对应物的标准RGN看到的效率相当的效率介导 BamHI位点的引入(图3D)。综上所述，该数据表明tru-RGN可与标 准RGN一样高效地用于在人细胞中引导***缺失和精确的HDR介 导的基因组编辑事件。
实施例2b.tru-RGN显示提高的对gRNA/DNA界面错配的敏感 性
在已确定tru-RGN可高效地用于诱导中靶基因组编辑改变后，测 试这些核酸酶是否可显示更大的对gRNA/DNA界面上的错配的敏感 性。为了评估该敏感性，构建先前已针对EGFP位点#1、#2和#3进 行了测试的tru-gRNA的一系列***的变体(上述图3A)。所述变体gRNA在互补区的每一个位置(除从U6启动子表达所需的5’G外)上 具有单沃尔森-克里克取代(图5A)。将基于人细胞的EGFP破坏测定用于评估这些变体tru-gRNA和一个类似组的如实施例1中所述的针 对相同的3个位点产生的匹配的变体全长gRNA引导Cas9介导的插 入缺失的相对能力。结果显示对于所有3个EGFP靶位点，tru-RGN 通常显示比具有匹配的全长gRNA的标准RGN更大的对单个错配的 敏感性(比较图5A的底图与顶图)。敏感性的量级根据位点而变化，对于其tru-gRNA具有17nt的互补性的位点#2和#3观察到最大的差 异。
受提高的tru-RGN对单核苷酸错配的敏感性激励，我们随后设法 检查gRNA-DNA界面上的***性错配的两个相邻位置的效应。我们 因此产生被靶向EGFP靶位点#1、#2和#3的tru-gRNA的变体，每一 个变体在两个相邻核苷酸位置上具有沃尔森-克里克颠换取代(图5B)。如通过EGFP破坏测定判断的，相较于对于实施例1中产生的 被靶向所有这3个EGFP靶位点的匹配的全长gRNA的类似变体，对于tru-gRNA，相邻双错配对RGN活性的影响再次地显著更大(比较 图5B中的底图与顶图)。这些影响似乎是位点依赖性的，对于EGFP 位点#2和#3几乎所有双错配的tru-gRNA未能显示相对于不存在互补 区的对照gRNA的EGFP破坏活性的提高，并且对于EGFP位点#1 只有3个错配的tru-gRNA变体显示任何残留活性(图5B)。另外，尽 管对于全长gRNA双突变通常显示更大的对5’末端的影响，但对于 tru-gRNA未观察到该影响。综上所述，我们的数据表明tru-gRNA显 示比全长gRNA更大的对gRNA-DNA界面上的单和双沃尔森-克里克 颠换错配的敏感性。
实施例2c.被靶向内源基因的tru-RGN在人细胞中显示提高的 特异性
进行接下来的实验以确定tru-RGN是否可在人细胞中显示相对 于具有全长gRNA对应物的标准RGN的减小的基因组脱靶效应。我们检查被靶向VEGFA位点1、VEGFA位点3和EMX1位点1的匹 配的全长和tru-gRNA(上文图3B中描述的)，因为先前的研究(参见实 施例1和Fu等，2013；Hsu等，2013)已确定被靶向这些位点的全 长gRNA的13个真正的脱靶位点。(我们不能针对来自我们的原始研究6的VEGFA位点2测试tru-gRNA，因为该靶序列在互补区的位置 17或18上不具有从U6启动子进行高效gRNA表达所需的G)。令人 惊讶地，我们发现tru-RGN在人U2OS.EGFP细胞中在所有13个这 些真正的脱靶位点上显示相对于匹配的标准RGN显著降低的诱变活 性，如通过T7EI测定判断的(表3A)；对于13个脱靶位点中的11个 脱靶位点，对于tru-RGN的突变频率降至低于T7EI测定的可靠检测 限(2-5％)(表3A)。当在另一个人细胞系(FT-HEK293细胞)中在相同的 13个脱靶位点上测试这些匹配的成对标准和tru-RGN时，我们观察 到相似的结果(表3A)。
为了定量对于tru-RGN观察到的特异性提高的量级，我们使用高 通量测序测量脱靶突变频率，所述高通量测序提供比T7EI测定更灵 敏的用于检测和定量低频突变的方法。我们评估一个亚组的13个真 正的脱靶位点中的12个位点，对于所述位点，我们已通过T7EI测定 针对tru-gRNA看到减小的突变率(由于技术原因，我们不能扩增所述 位点之一的所需的较短的扩增子)，并且还检查了已被另一个组7鉴 定的EMX1位点1的另外的脱靶位点(图6A)。对于我们测试的13个脱靶位点，tru-RGN显示相对于匹配的标准RGN显著降低的绝对诱 变频率(图6A和表3B)并且产生相对于它们的标准RGN对应物多至 ～5000倍或更多的特异性的提高(图6B)。对于两个脱靶位点(OT1-4和OT1-11)，难以定量针对tru-RGN的中靶对脱靶比率，因为由 tru-RGN诱导的***缺失突变的绝对数和频率降至本底水平或接近本底水平。因此，中靶对脱靶的比率可在这些情况下计算为无穷的。为了解决该问题，我们相反地以95％的置信水平鉴定针对这些位点的 可能地最大的***缺失频率，随后使用该保守估计来计算tru-RGN相 对于标准RGN对于这些脱靶的特异性提高的可能地最低量级。这些 计算表明tru-RGN在这些位点上产生～10,000倍或更多倍的提高(图 6B)。
为了进一步探测tru-RGN的特异性，我们检查它们在人基因组中 的另外的密切相关的位点上诱导脱靶突变的能力。对于针对VEGFA 位点1和EMX1的tru-gRNA(其各自具有18nt的靶位点互补性)，我 们通过计算鉴定人基因组中在互补区内的一个或两个位置上错配的 所有另外的位点(上述表3A中未检查的)和一个亚组的在3个位置上错配的所有位点，在所述错配中我们偏爱如实施例1中描述的位点的5’末端中的错配。对于针对VEGFA位点3的tru-gRNA(其具有17nt 的靶位点互补性)，我们鉴定所有在一个位置上错配的位点，和一个 亚组的在两个位置上错配的所有位点，在所述错配中5’末端中的错配 获得偏爱(再次地在表3A中未被检查的)。该计算分析对于被靶向 VEGFA位点1、VEFGA位点3和EMX1位点的tru-RGN分别产生总 共30、30和34个另外的潜在脱靶位点，我们随后使用T7EI测定在 其中已表达RGN的人U2OS.EGFP和HEK293细胞中评估所述脱靶 位点。
令人惊讶地，针对VEGFA位点1、VEFGA位点3和EMX1的3 个tru-RGN在人U2OS.EGFP细胞中检查的94个潜在脱靶位点中的 93个位点上，或在人HEK293细胞中的94个潜在脱靶位点中的任何 脱靶位点上不诱导可检测的Cas9介导的***缺失突变(表3C)。对于 在其上看到脱靶突变的一个位点，检查具有被靶向VEGFA位点1的 全长gRNA的标准RGN是否还可诱变该相同的脱靶位点；其诱导可 检测的突变，虽然以略低频率诱导(图6C)。对于gRNA的缩短在该 脱靶位点上观察到的提高的不存在可通过比较全长与tru-gRNA的20 和18nt序列来理解，所述比较显示全长20nt的靶中的两个另外的碱 基都是错配的(图6C)。总之，基于该94个另外的潜在脱靶位点的观 察，gRNA的缩短似乎不诱导新的高频脱靶突变。
一个亚组的来自该组94个位点(即-具有一个或多个错配的那些 位点)的30个最密切匹配的潜在脱靶位点的深度测序显示不可检测的 ***缺失突变率，或可与我们在其它先前鉴定的脱靶位点(表3B)上所 观察到的***缺失突变率相当的极低***缺失突变率(表3D)。我们得 出tru-RGN通常似乎在与中靶位点相异在于一个或两个错配的位点 上诱导极低水平或不可检测的水平的突变。这与标准RGN相反，对 于标准RGN，在相异在于多至5个错配的位点上相对容易地发现高 频脱靶突变(参见实施例1)。
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频率＝***缺失突变的频率＝***缺失序列的数目/野生型序列的 数目。对照gRNA＝缺乏互补区的gRNA
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S#：SEQ ID NO：
实施例2d.可将tru-gRNA与双重Cas9切口酶一起用于在人细 胞中高效地诱导基因组编辑
利用最近描述的诱导***缺失突变的双重Cas9切口酶法测试 tru-gRNA。为了进行该测试，将Cas9-D10A切口酶与被靶向人VEGFA 基因中的位点(VEGFA位点1和我们称为VEGFA位点4的另外的序列) 的两个全长gRNA一起在U2OS.EGFP细胞中共表达(图4A)。如先前 所描述的(Ran等，2013)，该对切口酶协同地在VEGFA靶基因座上诱 导高比率的***缺失突变(图4B)。有趣地，与单独的被靶向VEGFA 位点4的gRNA共表达的Cas9-D10A切口酶也以高频率诱导***缺失突变，虽然以比对于成对全长gRNA观察到的频率稍低的频率诱导(图4B)。重要的是，使用针对VEGFA位点1的tru-gRNA替代全长 gRNA不影响双重切口酶法诱导***缺失突变的效率(图4B)。
双重切口酶策略也已被用于刺激使用ssODN进行的特定序列改 变的引入(Mali等，2013a；Ran等，2013)，因此也测试tru-gRNA是否可用于该类型的改变。如所预期的，针对VEGFA位点1和4的 成对的全长gRNA与Cas9-D10A切口酶一起协同地提高来自ssODN 供体的短的***(图3A)至人U2OS.EGFP细胞中的VEGFA基因座中 的高效引入(图3C)。再次地，对于使用tru-gRNA替代被靶向VEGFA 位点1的全长gRNA，通过双重切割进行的ssODN介导的序列改变 的效率仍然同样高(图3C)。综上所述，这些结果表明tru-gRNA可用 作双重Cas9切口酶策略的部分来诱导***缺失突变和ssODN介导的 序列改变，而不削弱通过该方法进行的基因组编辑的效率。
在确定tru-gRNA的使用不减小成对切口酶的中靶基因组编辑活 性后，我们随后使用深度测序来检查先前鉴定的VEGFA位点1gRNA 的4个真正的脱靶位点上的突变频率。该分析显示当使用具有 tru-gRNA的成对切口酶时，突变率在所有这4个脱靶位点上降至基本上不可检测的水平(表4)。相反地，tru-RGN(表3B)和具有全长gRNA 的成对切口酶(表4)都不能完全消除这4个脱靶位置(OT1-3)之一上的 脱靶突变。这些结果表明tru-gRNA的使用还可减小成对Cas9切口酶 的脱靶效应(并且反之亦然)而不削弱中靶基因组编辑的效率。
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其它实施方案
应理解，虽然已结合其详细描述说明了本发明，但前述说明指在 举例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所述权利要求的 范围来界定。其它方面、有利方面和修改在下列权利要求的范围内。

Claims (29)

1.一种在细胞中修饰双链DNA分子的靶区域的方法，所述方法包括在细胞中表达如下物质或将所述物质引入细胞：
dCas9-异源功能性结构域融合蛋白(dCas9-HFD)；和
引导RNA，其包含由17-18个核苷酸组成的互补性区域，所述互补性区域与包含靶基因组序列的双链DNA分子的互补链的17-18个连续核苷酸互补，其中所述靶基因组序列紧邻前间区序列邻近基序(PAM)的5’，并且其中所述引导RNA互补区将Cas9核酸酶或Cas9切口酶结合并导向至双链DNA分子的靶区域，
并且其中所述引导RNA选自由以下组成的组：
(X17-18)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:2404)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:2407)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:2408)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCG(SEQ ID NO:1)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(SEQ ID NO:2)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAG CAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(SEQ ID NO:3)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG C(SEQ ID NO:4)；
(X17-18)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG C(SEQ ID NO:5)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGU UUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCAC CGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6)；和
(X17-18)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGU UUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCAC CGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:7)；
其中X17-18是与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的互补区；
由此在细胞中修饰双链DNA分子的靶区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述互补区与双链DNA分子的选定靶区域的互补链的17个连续核苷酸互补。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述互补区与双链DNA分子的选定靶区域的互补链的18个连续核苷酸互补。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述引导RNA为crRNA，其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区，并且所述tracrRNA由如下序列组成：
GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:8)；
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2405)；
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ IDNO:2406)；
CAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2409)；
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA AAAAGUG(SEQ ID NO:2410)；
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA(SEQ ID NO:2411)；或
UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(SEQ ID NO:2412)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述引导RNA为crRNA，其包括与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的由17-18个核苷酸组成的互补区，并且所述crRNA为(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:2407)并且所述tracrRNA为GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAG UCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ IDNO:8)；所述crRNA为(X17-18)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:2404)并且所述tracrRNA为UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAA AGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2405)；或所述crRNA为(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:2408)并且所述tracrRNA为AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:2406)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在所述选定的靶基因组序列中导致序列改变。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
9.权利要求1所述的方法，其中所述的互补区与选定的靶基因组序列的互补链的17个连续核苷酸互补。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的互补区与选定的靶基因组序列的互补链的18个连续核苷酸互补。
11.根据权利要求6所述的方法，其中所述序列改变是***缺失突变。
12.权利要求1的方法，其中所述dCas9-异源功能性结构域融合蛋白(dCas9-HFD)包含修饰基因表达、组蛋白或DNA的HFD。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述异源功能性结构域为转录激活结构域、催化DNA脱甲基化的酶、催化组蛋白修饰的酶或转录沉默结构域。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述转录激活结构域来自于VP64或NF-κBp65。
15.权利要求12的方法，其中催化组蛋白修饰的酶是LSD1，组蛋白甲基转移酶(HNMT)，组蛋白乙酰转移酶(HAT)，组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)或组蛋白脱甲基酶。
16.权利要求12的方法，其中所述转录沉默结构域来自于异染色质蛋白1(HP1)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述HP1蛋白是HP1α或HP1β。
18.一种gRNA分子，其在gRNA的5'端包括互补区域(acomplementarity region)，该互补区域由与靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的17-18个核苷酸组成，其中所述靶基因组序列紧邻前间区序列邻近基序的5'，其中所述gRNA是单个gRNA或CRISPR RNA(crRNA)，其中在存在Cas9核酸酶的情况下，gRNA互补区结合Cas9核酸酶并将其引导至靶基因组序列，并且所述Cas9核酸酶编辑靶基因组序列，并且其中所述gRNA选自下述组成的组：
(X17-18)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:2404)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:2407)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:2408)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCG(SEQ ID NO:1)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGAAAAGCAUAGCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(SEQ ID NO:2)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUGGAAACAAAACAG CAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUC(SEQ ID NO:3)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG C(SEQ ID NO:4)；
(X17-18)GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG C(SEQ ID NO:5)；
(X17-18)GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGU UUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCAC CGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6)；和
(X17-18)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGU UUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCAC CGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:7)；
其中X17-18是与选定的靶基因组序列的互补链的17-18个连续核苷酸互补的互补区。
19.权利要求18所述的gRNA，其中所述gRNA的互补区由17个核苷酸组成。
20.权利要求18所述的gRNA，包含在所述分子的3'端含一个或多个尿嘧啶(U)的核糖核酸。
21.权利要求18所述的gRNA，其中所述互补区与靶基因组序列的互补链的17个连续核苷酸互补。
22.权利要求18所述的gRNA，其中所述互补区与靶基因组序列的互补链的18个连续核苷酸互补。
23.一种DNA分子，其编码权利要求18的gRNA。
24.一种载体，其包含权利要求23的DNA分子。
25.非动植物品种的宿主细胞，其表达权利要求24的载体。
26.权利要求25的表达宿主细胞，其中所述细胞为真核细胞。
27.权利要求26的表达宿主细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
28.权利要求18所述的gRNA，其中所述gRNA的互补区由18个核苷酸组成。
29.权利要求18所述的gRNA，其中所述gRNA保留与Cas9核酸酶或催化失活的Cas9(dCas9)核酸酶形成复合物的能力。
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