CN110540983B - 基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于杜氏藻代谢途径的ζ‑胡萝卜素高产工程菌及其构建方法与应用。本发明公开一种15‑顺式‑ζ‑胡萝卜素异构酶Ziso及应用，且第一次实现全部利用来自杜氏藻(如杜氏巴氏藻或杜氏盐藻)的类胡萝卜素途径的基因来构建工程菌。当杜氏藻为杜氏巴氏藻时，所述ζ‑胡萝卜素高产工程菌的ζ‑胡萝卜素的产率为2.2mg/g(细胞干重)；当杜氏藻为杜氏盐藻时，所述ζ‑胡萝卜素高产工程菌的ζ‑胡萝卜素的产率为3.6mg/g(细胞干重)。本发明采用的载体的启动子都是T7启动子，包含lacZ调控元件，其在IPTG作用的大肠杆菌BL21(DE3)中能够高表达，这有利于ζ‑胡萝卜素的大量积累，可用于实际应用生产。

Description

基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌及其构建方法 与应用
技术领域
本发明涉及基因工程菌领域，涉及植物类胡萝卜素代谢途径载体的构建克隆***，特别涉及一种基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌及其构建方法与应用；具体涉及一种杜氏藻(如杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)、杜氏盐藻(Dunaliellasaline))中牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)、八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因的cDNA并构建出高产ζ-胡萝卜素的工程菌。
背景技术
类胡萝卜素分子是含8个异戊二烯单位的萜类化合物，其作为有机色素广泛存在于植物的叶绿体和有色体中，以及其它的一些光合组织中，比如藻类，部分细菌和真菌中。在特定条件下，杜氏藻细胞中类胡萝卜素含量可达到细胞干重的14％。其高含量可能跟酶的转化效率有很大的关系。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)。
本发明的另一目的在于提供所述的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)的应用。
本发明的另一目的在于提供一种基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌。
本发明的另一目的在于提供上述基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌的构建方法。
本发明的再一目的在于提供上述基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：12所示。
一种15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQID NO:11所示。
所述的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)在合成类胡萝卜素中的应用。
进一步的，牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)、八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)和15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)在合成类胡萝卜素中的应用。
其中，牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)的氨基酸序列如GenBank：APW83740.1或SEQ ID NO：10所示；其基因的核苷酸序列如GenBank：KX231795.1或SEQ IDNO：9所示。
八氢番茄红素合成酶(Psy)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或GenBank：AAB51287.1所示；其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或GenBank：U91900.1所示。
八氢番茄红素脱氢酶(Pds)的氨基酸序列如GenBank：ADD52599.1或GenBank：CAA75094.1所示；其基因的核苷酸序列如GenBank：GQ923693.1或GenBank：Y14807.1所示。
所述的类胡萝卜素为β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、番茄红素或链孢红素。
本发明提供一种基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌，基于杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)代谢途径时，所述ζ-胡萝卜素高产工程菌含有编码GenBank：APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因、编码SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因、编码GenBank：ADD52599.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因和编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因；
基于杜氏盐藻(Dunaliella saline)代谢途径时，所述ζ-胡萝卜素高产工程菌含有编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因、编码GenBank：AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因、编码GenBank：CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因和编码SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因。
优选的，基于杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)代谢途径时，编码GenBank：APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因的核苷酸序列为如GenBank：KX231795.1所示的核苷酸序列；其中，GenBank：APW83740.1与GenBank：KX231795.1中的来源Dunaliella salina记载有误，实际来源应该是Dunaliellabardawil；
编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
编码GenBank：ADD52599.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因的核苷酸序列为如GenBank：GQ923693.1所示的核苷酸序列；其中，GenBank：ADD52599.1与GenBank：GQ923693.1中的来源Dunaliella salina记载有误，实际来源应该是Dunaliellabardawil；
编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
优选的，基于杜氏盐藻(Dunaliella saline)代谢途径时，编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；
编码GenBank：AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因的核苷酸序列为如GenBank：U91900.1所示的核苷酸序列；其中，GenBank：U91900.1中的来源Dunaliella bardawil记载有误，实际来源应该是Dunaliella saline；
编码GenBank：CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因的核苷酸序列为如GenBank：Y14807.1所示的核苷酸序列；其中，GenBank：Y14807.1中的来源Dunaliella bardawil记载有误，实际来源应该是Dunaliella saline；
编码SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；
所述的基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)利用相关基因工程手段从杜氏藻中克隆到牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)、八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)；
(2)将Ggps和Psy构建在pACYduet-1载体上，氯霉素抗性，得到重组载体pACYduet-ggps-psy；将Pds构建在pCDFduet-1载体上，链霉素抗性，得到重组载体pCDFduet-pds；将Ziso构建在pETduet-1载体上，氨苄抗性，得到重组载体pETduet-ziso；
(3)然后将步骤(2)构建的三个重组载体共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌。
优选的，所述的杜氏藻为杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)或杜氏盐藻(Dunaliella saline)。
优选的，重组载体构建时，在4个目的基因的N端(5′端)均连接有rbs(核糖体结合位点)序列，或者，均连接有T7启动子(T7_promoter)序列和rbs(核糖体结合位点)序列。
所述的基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌在生产ζ-胡萝卜素中的应用。
当杜氏藻为杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)时，所述ζ-胡萝卜素高产工程菌的ζ-胡萝卜素的产率为2.2mg/g(细胞干重)。
当杜氏藻为杜氏盐藻(Dunaliella saline)时，所述ζ-胡萝卜素高产工程菌的ζ-胡萝卜素的产率为3.6mg/g(细胞干重)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明第一次实现全部利用来自杜氏藻(如杜氏巴氏藻或杜氏盐藻)的类胡萝卜素途径的基因来构建工程菌。而杜氏藻(如杜氏巴氏藻或杜氏盐藻)是已知的产ζ-胡萝卜素最高的植物之一。本发明采用的载体的启动子都是T7启动子，包含lacZ调控元件，其在IPTG作用的大肠杆菌BL21(DE3)中能够高表达，这有利于ζ-胡萝卜素的大量积累，可用于实际应用生产。
附图说明
图1是本发明pACYduet-Dbggps-Dbpsy(A)和pCDFduet-Dbpds-Dbzds-Dblycb(B)构建图。
图2是本发明pCDFduet-Dbpds(A)和pCDFduet-Dbpds-Dbzds(B)构建图。
图3是本发明pETduet-Dbziso(A)和pETduet-Dbcrtiso(B)构建图。
图4是本发明pETduet-Dbziso-Dbcrtiso构建图。
图5是本发明基于杜氏巴氏藻代谢途径的类胡萝卜素高产工程菌与普通大肠杆菌BL21(DE3)颜色比较，其中，A是β-胡萝卜素高产工程菌；B是ζ-胡萝卜素高产工程菌；C是番茄红素高产工程菌(1：BL21(DE3)菌株，2：番茄红素高产菌株)；D是链孢红素高产工程菌；E是组合⑤、⑥、⑦、⑧获得的目的菌株。
图6是β-胡萝卜素液相图；其中，A是实施例1；B是实施例2。
图7是ζ-胡萝卜素液相图；其中，A是实施例1；B是实施例2。
图8是番茄红素液相图；其中，A是实施例1；B是实施例2。
图9是链孢红素液相图；其中，A是实施例1；B是实施例2。
图10是本发明pACYduet1-Dsggps-Dspsy构建图。
图11是本发明pCDFduet1-Dspds构建图。
图12是本发明pCDFduet1-Dspds-Dszds构建图。
图13是本发明pCDFduet1-Dspds-Dszds-Dslycb构建图。
图14是本发明pETduet1-Dsziso构建图。
图15是本发明pETduet1-Dscrtiso构建图。
图16是本发明pETduet1-Dsziso-Dscrtiso构建图。
图17是本发明基于杜氏盐藻代谢途径的类胡萝卜素高产工程菌与普通大肠杆菌BL21(DE3)颜色比较，其中，A是β-胡萝卜素高产工程菌；B是ζ-胡萝卜素高产工程菌；C是番茄红素高产工程菌；D是链孢红素高产工程菌；E是组合⑤、⑥、⑦、⑧获得的目的菌株。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1.制备线性化载体
(1)用NcoI和HindIII(购自Thermo Fisher Scientific)双酶切质粒pACYduet-1，pCDFduet-1和pETduet-1(购自EMD Biosciences)。37℃水浴3h。酶切反应体系如下：
10×Buffer 5μL、两种酶各1μL、质粒10μL、Add dH2O To 50μL。
(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
(3)酶切之后，采用PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。
2.PCR扩增目的片段
(1)以杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)(购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，编号FACHB-847)反转录的cDNA为模板，使用Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(高保真酶，购自Takara)，进行PCR反应。
(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
(3)用OMEGA公司的胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收目的片段，纯化PCR产物。测序结果如GenBank：KX231795.1、SEQ ID NO：1、GenBank：GQ923693.1、SEQ ID NO：3、5、7、GenBank：KX218392.1所示，对应编码的氨基酸序列如GenBank：APW83740.1、SEQ ID NO：2、GenBank：ADD52599.1、SEQ ID NO：4、6、8、GenBank：ANY98896.1所示。其中，番茄红素β-环化酶(Lycb)的氨基酸序列如GenBank：ANY98896.1所示；其基因的核苷酸序列如GenBank：KX218392.1所示；GenBank：ANY98896.1与GenBank：KX218392.1中的来源Dunaliella salina记载有误，实际来源应该是Dunaliella bardawil。
3.In-Fusion克隆
用NcoI和HindIII双酶切质粒pACYduet-1并***用引物Pac_dbggps_F和Pac_dbggps_R扩增得到的Dbggps，得到pACYduet-Dbggps；再用NdeI和EcoRV双酶切pACYduet-Dbggps并***用引物Pac_dbpsy_F和Pac_dbpsy_R扩增得到的Dbpsy，得到pACYduet-Dbggps-Dbpsy。引物序列如表1所示。
用NcoI和HindIII双酶切质粒pCDFduet-1并***用引物Pcd_dbpds_F和Pcd_dbpds_R扩增得到的Dbpds，得到pCDFduet-Dbpds；再用NdeI和EcoRV双酶切pCDFduet-Dbpds并***用引物Pcd_dbzds_F和Pcd_dbzds_R扩增得到的Dbzds，得到pCDFduet-Dbpds-Dbzds；再用AatII和KpnI双酶切pCDFduet-Dbpds-Dbzds并***用引物Pcd_dblycb_F和Pcd_dblycb_R扩增得到的Dblycb，得到pCDFduet-Dbpds-Dbzds-Dblycb。引物序列如表1所示。
用NcoI和HindIII双酶切质粒pETduet-1并***用引物Pet_dbziso_F和Pet_dbziso_R扩增得到的Dbziso，得到pETduet-Dbziso；再用NdeI和EcoRV双酶切pETduet-Dbziso并***用引物Pet_dbcrtiso_F和Pet_dbcrtiso_R扩增得到的Dbcrtiso，得到pETduet-Dbziso-Dbcrtiso。引物序列如表1所示。
用NdeI和EcoRV双酶切质粒pETduet-1并***用引物Pet_dbcrtiso_F和Pet_dbcrtiso_R扩增得到的Dbcrtiso，得到pETduet-Dbcrtiso。引物序列如表1所示。
(1)建立In-Fusion(购自Takara)克隆反应体系：
5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL
线性化载体 1μL
纯化的PCR片段 2μL
dH<sub>2</sub>O 5μL
Total 10μL
(2)50℃孵育15min，然后置于冰上。
(3)连接产物分别转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氯霉素(CmR或CamR)、链霉素(Sm)或氨苄青霉素(Ap或Amp)的相应平板上。在37℃生化培养箱中分别倒置培养12～16h。注意培养时间不宜过长，否则抗性失效，生长出卫星菌落，给筛选阳性克隆造成困难。
表1构建重组质粒的引物
Figure BDA0002139870480000041
4.质粒的提取
参照OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒的说明书，提取重组质粒pACYduet-Dbggps-Dbpsy(图1A)、pCDFduet-Dbpds(图2A)、pCDFduet-Dbpds-Dbzds(图2B)、pCDFduet-Dbpds-Dbzds-Dblycb(图1B)、pETduet-Dbziso(图3A)、pETduet-Dbcrtiso(图3B)、pETduet-Dbziso-Dbcrtiso(图4)。
(1)10000g，1min离心，收集菌体。(2)加入250μL SolutionⅠ，涡旋十几秒，混匀。(3)加入250μL SolutionⅡ，上下颠倒4～6次，室温放置2min。(4)加入350μL SolutionⅢ，轻轻摇匀，10000g，10min离心。(5)转上清至Hibind柱，10000g，1min离心。(6)弃掉滤液，加入500μL Buffer HB，10000g，1min离心。(7)弃掉滤液，加入700μL DNA Wash Buffer，10000g，1min离心。(8)重复洗一次(步骤(7))。(9)10000g，空管离心2min。(10)弃掉收集管将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管，加入50～100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA，静置1～2min后，10000g，1min离心。
5.转化大肠杆菌BL21(DE3)
将提取的重组质粒设置如下组合：
①：pACYduet-Dbggps-Dbpsy、pCDFduet-Dbpds-Dbzds-Dblycb和pETduet-Dbziso-Dbcrtiso；
②：pACYduet-Dbggps-Dbpsy、pCDFduet-Dbpds和pETduet-Dbziso；
③：pACYduet-Dbggps-Dbpsy、pCDFduet-Dbpds-Dbzds和pETduet-Dbziso-Dbcrtiso；
④：pACYduet-Dbggps-Dbpsy、pCDFduet-Dbpds-Dbzds和pETduet-Dbziso；
⑤：pACYduet-Dbggps-Dbpsy、pCDFduet-Dbpds-Dbzds-Dblycb和pETduet-Dbcrtiso；
⑥：pACYduet-Dbggps-Dbpsy和pCDFduet-Dbpds；
⑦：pACYduet-Dbggps-Dbpsy、pCDFduet-Dbpds-Dbzds和pETduet-Dbcrtiso；
⑧：pACYduet-Dbggps-Dbpsy和pCDFduet-Dbpds-Dbzds；
分别共转化到大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有CmR和Sm，或，CmR、Sm和Ap抗生素的平板上，在37℃生化培养箱中分别倒置培养12～16h。经过筛选分别获得目的菌株，如图5所示，组合①、②、③、④获得的目的菌株分别对应图5A、5B、5C、5D，组合⑤、⑥、⑦、⑧获得的目的菌株分别对应图5E。结果表明可知，缺少15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)时，不能生成番茄红素的红色菌、链孢红素黄色菌和β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素的土黄色菌，说明Ziso在生成类胡萝卜素中起到必不可少的作用，在缺少其的情况下，均不能生成相应类胡萝卜素。
6.转化子的培养
将目的菌株接种于50mL已灭菌的LB液体培养基中(组合①、②、③、④、⑤、⑦：加入氯霉素、氨苄青霉素、链霉素抗性；组合⑥、⑧：加入氯霉素、氨苄青霉素抗性)，于200rpm，37℃下振荡培养6h。加入IPTG进行诱导，培养6小时。
7.提取转化子的类胡萝卜素
(1)将24mL菌液于4℃，8000rpm下离心2min，弃上清。(2)用去离子水重新悬浮大肠杆菌细胞，4℃，8000rpm离心2min，弃上清。(3)重复步骤(2)。(4)加6mL丙酮至大肠杆菌沉淀，涡旋振荡分散。(5)55℃水浴20min，每隔5min振荡一次。(6)将混合物于4℃，8000rpm下离心20min，收集上清。(7)用丙酮定容至6mL，-20℃保存。
8.HPLC定性分析转化子的类胡萝卜素成分
(1)将流动相用0.22μm孔径滤膜进行抽滤处理，接着超声处理60min去除液体中的气泡。
(2)将类胡萝卜素提取物以及β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、番茄红素或链孢红素标准品溶液，用0.2μm孔径的聚碳酸酯滤膜进行过滤处理。
(3)调节色谱柱(C30 YMC carotenoid column,5μm,250*4.6mm)温度在25℃，以1.0mL/min的流速用甲醇冲洗至平衡(约2h)。
(4)改为用流动相甲基叔丁基醚(A相)/甲醇(B相)(梯度洗脱:0min，90％A相和10％B相；10min，60％A相和40％B相；20min 50％A相和50％B相；25min，10％A相和90％B相；29.5min，90％A相和10％B相)，以1mL/min的流速进行洗柱，直至平衡。
(5)将浓度为100μg/mL的ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素和β-胡萝卜素标准品存储液分别稀释为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL等不同浓度的工作液，用HPLC仪测定473nm波长下工作液的峰面积，根据结果分别绘制标准曲线。
(6)上样20μL，在波长473nm下检测40min。
结果如图6A所示，表明在16.2min左右出现了β-胡萝卜素的特征峰，这与标准品的出峰时间是一致的，另外根据该峰面积，结合得到的标准曲线方程：y＝34.791x+59.973(x为峰面积，y为β-胡萝卜素的含量)，再根据细胞的干重，可以计算出β-胡萝卜素的产率为2.7mg/g(细胞干重)。
如图7A所示，表明在11min左右，出现ζ-胡萝卜素的特征峰，根据得到的标准曲线方程式：y＝110.41x+34.1(x为峰面积，y为ζ-胡萝卜素含量)，再根据细胞干重，得到ζ-胡萝卜素产率为2.2mg/g。
如图8A所示，表明在29.1min出现了番茄红素的特征峰，这与标准品的出峰时间是一致的，另外根据峰面积，结合得到的标准曲线方程：y＝59.5x+118.09(x为峰面积，y为番茄红素的含量)，再根据细胞的干重，可以计算出番茄红素的含量为2.0mg/g。
如图9A所示，表明在18.2min左右出现了链孢红素的特征峰，这与标准品的出峰时间是一致的，另外根据该峰面积，结合得到的标准曲线方程：y＝63.124x-0.4755(x为峰面积，y为链孢红素的含量)，再根据细胞的干重，可以计算出链孢红素的产率为2.4mg/g(细胞干重)。
实施例2
1.制备线性化载体
(1)用Asc I和Sal I(购自Thermo Fisher Scientific)双酶切质粒pACYduet-1，pCDFduet-1和pETduet-1(购自EMD Biosciences)。37℃水浴3h。酶切反应体系如下：
10×Buffer 5μL、两种酶各1μL、质粒10μL、Add dH2O To 50μL。
(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
(3)酶切之后，采用PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。
2.PCR扩增目的片段
(1)以杜氏盐藻(Dunaliella saline)(购自Culture Collection of Algae andProtozoa，英国；编号CCAP 19/18)反转录的cDNA为模板，使用Takara的PrimeSTAR HS DNAPolymerase(高保真酶，购自Takara)，进行PCR反应。
(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
(3)用OMEGA公司的胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收目的片段，纯化PCR产物。测序结果如SEQ ID NO：9、GenBank：U91900.1、GenBank：Y14807.1、SEQ IDNO：11、13、15、GenBank：HQ728089.1所示，对应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10、GenBank：AAB51287.1、GenBank：CAA75094.1、SEQ ID NO：12、14、16、GenBank：ADX41685.1所示。其中，番茄红素β-环化酶(Lycb)的氨基酸序列如GenBank：ADX41685.1所示；其基因的核苷酸序列如GenBank：HQ728089.1所示。
3.In-Fusion克隆
用Asc I和Sal I双酶切质粒pACYduet-1并***用引物Pac_dsggps_F和Pac_dsggps_R扩增得到的Dsggps，得到pACYduet1-Dsggps；再用NdeI和EcoRV双酶切pACYduet1-Dsggps并***用引物Pac_dspsy_F和Pac_dspsy_R扩增得到的Dspsy，得到pACYduet1-Dsggps-Dspsy。引物序列如表2所示。
用Asc I和Sal I双酶切质粒pCDFduet-1并***用引物Pcd_dspds_F和Pcd_dspds_R扩增得到的Dspds，得到pCDFduet-Dspds；再用NdeI和EcoRV双酶切pCDFduet-Dspds并***用引物Pcd_dszds_F和Pcd_dszds_R扩增得到的Dszds，得到pCDFduet-Dspds-Dszds；再用AatII和KpnI双酶切pCDFduet-Dspds-Dszds并***用引物Pcd_dslycb_F和Pcd_dslycb_R扩增得到的Dslycb，得到pCDFduet-Dspds-Dszds-Dslycb。引物序列如表2所示。
用Asc I和Sal I双酶切质粒pETduet-1并***用引物Pet_dsziso_F和Pet_dsziso_R扩增得到的Dsziso，得到pETduet1-Dsziso；再用NdeI和EcoRV双酶切pETduet1-Dsziso并***用引物Pet_dscrtiso_F和Pet_dscrtiso_R扩增得到的Dscrtiso，得到pETduet1-Dsziso-Dscrtiso。引物序列如表2所示。
用NdeI和EcoRV双酶切质粒pETduet-1并***用引物Pet_dscrtiso_F和Pet_dscrtiso_R扩增得到的Dscrtiso，得到pETduet1-Dscrtiso。引物序列如表2所示。
(1)建立In-Fusion(购自Takara)克隆反应体系：
5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL
线性化载体 1μL
纯化的PCR片段 2μL
dH<sub>2</sub>O 5μL
Total 10μL
(2)50℃孵育15min，然后置于冰上。
(3)连接产物分别转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有氯霉素(CmR或CamR)、链霉素(Sm)或氨苄青霉素(Ap或Amp)的相应的平板上。在37℃生化培养箱中分别倒置培养12～16h。注意培养时间不宜过长，否则抗性失效，生长出卫星菌落，给筛选阳性克隆造成困难。
表2构建重组质粒的引物
Figure BDA0002139870480000061
4.质粒的提取
参照OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒的说明书，提取重组质粒pACYduet1-Dsggps-Dspsy(图10)、pCDFduet1-Dspds(图11)、pCDFduet1-Dspds-Dszds(图12)、pCDFduet1-Dspds-Dszds-Dslycb(图13)、pETduet1-Dsziso(图14)、pETduet1-Dscrtiso(图15)、pETduet1-Dsziso-Dscrtiso(图16)。
(1)10000g，1min离心，收集菌体。(2)加入250μL SolutionⅠ，涡旋十几秒，混匀。(3)加入250μL SolutionⅡ，上下颠倒4～6次，室温放置2min。(4)加入350μL SolutionⅢ，轻轻摇匀，10000g，10min离心。(5)转上清至Hibind柱，10000g，1min离心。(6)弃掉滤液，加入500μL Buffer HB，10000g，1min离心。(7)弃掉滤液，加入700μL DNA Wash Buffer，10000g，1min离心。(8)重复洗一次(步骤(7))。(9)10000g，空管离心2min。(10)弃掉收集管将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管，加入50～100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA，静置1～2min后，10000g，1min离心。
5.转化大肠杆菌BL21(DE3)
将提取的重组质粒设置如下组合：
①：pACYduet1-Dsggps-Dspsy、pCDFduet1-Dspds-Dszds-Dslycb和pETduet1-Dsziso-Dscrtiso；
②：pACYduet1-Dsggps-Dspsy、pCDFduet1-Dspds和pETduet1-Dsziso；
③：pACYduet1-Dsggps-Dspsy、pCDFduet1-Dspds-Dszds和pETduet1-Dsziso-Dscrtiso；
④：pACYduet1-Dsggps-Dspsy、pCDFduet1-Dspds-Dszds和pETduet1-Dsziso；
⑤：pACYduet1-Dsggps-Dspsy、pCDFduet1-Dspds-Dszds-Dslycb和pETduet1-Dscrtiso；
⑥：pACYduet1-Dsggps-Dspsy和pCDFduet1-Dspds；
⑦：pACYduet1-Dsggps-Dspsy、pCDFduet1-Dspds-Dszds和pETduet1-Dscrtiso；
⑧：pACYduet1-Dsggps-Dspsy和pCDFduet1-Dspds-Dszds；
分别共转化到大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有CamR和Sm，或，CamR、Sm和Amp抗生素的平板上，在37℃生化培养箱中分别倒置培养12～16h。经过筛选分别获得目的菌株，如图17所示，组合①、②、③、④获得的目的菌株分别对应图17A、17B、17C、17D，组合⑤、⑥、⑦、⑧获得的目的菌株分别对应图17E。结果表明可知，缺少15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)时，不能生成番茄红素的红色菌、链孢红素黄色菌和β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素的土黄色菌，说明Ziso在生成类胡萝卜素中起到必不可少的作用，在缺少其的情况下，均不能生成相应类胡萝卜素。
6.转化子的培养
将目的菌株接种于50mL已灭菌的LB液体培养基中(组合①、②、③、④、⑤、⑦：加入氯霉素、氨苄青霉素、链霉素抗性；组合⑥、⑧：加入氯霉素、氨苄青霉素抗性)，于200rpm，37℃下振荡培养6h。加入IPTG进行诱导，培养6小时。
7.提取转化子的类胡萝卜素
(1)将24mL菌液于4℃，8000rpm下离心2min，弃上清。(2)用去离子水重新悬浮大肠杆菌细胞，4℃，8000rpm离心2min，弃上清。(3)重复步骤(2)。(4)加6mL丙酮至大肠杆菌沉淀，涡旋振荡分散。(5)55℃水浴20min，每隔5min振荡一次。(6)将混合物于4℃，8000rpm下离心20min，收集上清。(7)用丙酮定容至6mL，-20℃保存。
8.HPLC定性分析转化子的类胡萝卜素成分
(1)将流动相用0.22μm孔径滤膜进行抽滤处理，接着超声处理60min去除液体中的气泡。
(2)将类胡萝卜素提取物以及β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、番茄红素或链孢红素标准品溶液，用0.2μm孔径的聚碳酸酯滤膜进行过滤处理。
(3)调节色谱柱(C30 YMC carotenoid column,5μm,250*4.6mm)温度在25℃，以1.0mL/min的流速用甲醇冲洗至平衡(约2h)。
(4)改为用流动相甲基叔丁基醚(A相)/甲醇(B相)(梯度洗脱：0min，90％A相和10％B相；10min，60％A相和40％B相；20min 50％A相和50％B相；25min，10％A相和90％B相；29.5min，90％A相和10％B相)，以1mL/min的流速进行洗柱，直至平衡。
(5)ζ-胡萝卜素、链孢红素、番茄红素和β-胡萝卜素标的标准曲线参照实施例1步骤8(5)。
(6)上样20μL，在波长473nm下检测40min。
结果如图6B所示，表明在16.2min左右出现了β-胡萝卜素的特征峰，这与标准品的出峰时间是一致的，另外根据该峰面积，结合得到的标准曲线方程：y＝34.791x+59.973(x为峰面积，y为β-胡萝卜素的含量)，再根据细胞的干重，可以计算出β-胡萝卜素的产率为3.3mg/g(细胞干重)。
结果如图7B所示，表明在11min左右，出现ζ-胡萝卜素的特征峰，根据得到的标准曲线方程式：y＝110.41x+34.1(x为峰面积，y为ζ-胡萝卜素含量)，再根据细胞干重，得到ζ-胡萝卜素产率为3.6mg/g。
结果如图8B所示，表明在29.1min出现了番茄红素的特征峰，这与标准品的出峰时间是一致的，另外根据峰面积，结合得到的标准曲线方程：y＝59.5x+118.09(x为峰面积，y为番茄红素的含量)，再根据细胞的干重，可以计算出番茄红素的含量为3.8mg/g。
结果如图9B所示，表明在18.2min左右出现了链孢红素的特征峰，这与标准品的出峰时间是一致的，另外根据该峰面积，结合我们先前课题组得到的标准曲线方程：y＝63.124x-0.4755(x为峰面积，y为链孢红素的含量)，再根据细胞的干重，可以计算出链孢红素的产率为3.1mg/g(细胞干重)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌及其构建方法与应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 1305
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Psy
<400> 1
atgacgctgt caatgttgga cgcgcgaagg atggcacagc gaacagcaac ttcctcctcc 60
tcctctccta gcatcatata tgccccatcg cccataagca atcgcagcgg caggcgcgca 120
gcagcgaatc acggcatcag gaatggtagt cgcagagcag caggccggat gggactctgc 180
agcactgtgc aagtgaactg cacgctcgcg atgccccagc ccaaccacgg ccagaagatg 240
cgattgcagc agcagcagca gcaacaactg cagcagcagc agcaacagca actatcggga 300
aagcaggtgg aggagcaggc gatgctgcag tgcataaaga ccgctcagtc agtgcccccc 360
tccaccggac tcctcaatcc tcgcggcctg cgatggcagg gcagcagctt ggaagcagcg 420
tacgagcgat gtggggcggt gtgcagcgag tacgccaaga ccttctacct cggtactcag 480
ctcatgacac cagtgcaggc caggtgcatc tgggccatct atgtgtggtg ccgccgcaca 540
gatgagctgg tggatggccc caatgcatca aagatcacgc ctcaggccct agacagatgg 600
gaggagcgcc ttgaaagcat gttccaaggc aagccctatg atgtgctgga cgcggcgctc 660
acagacacca tctccaaatt ccctctggag gtgcaaccct tcagagacat gatcgagggc 720
atgcgaatgg acctcttcaa gtcgcggtat cacacctttg atgagctgta cgagtactgc 780
tatcgtgtgg cgggcacagt ggggctgatg accatgccag tgatggggat tgatcccaac 840
tacaagggtc caattgacaa ggtctacaag gccgcccttg cgctgggtac ggcaaaccag 900
ctcaccaaca ttctgcgaga tgtgggagag gacatcagag agcgtgaccg tatctacttg 960
cccctggatg agctcaagca gttcggcatc tccgaagagg aggtaaaagc aggtatccac 1020
aagccatcgc aaggcaaggt ggatgagcgg tggcgagcgt tcatgaagtt ccagatcaag 1080
cgtgcgcgag agtacttcca ggaagcagag gatggggtag actacttgga cgtgaaggcg 1140
cggtggccag tgtggtcagc gctgatcctt taccgccaaa tcttggatgt cattgagaag 1200
aatgactacg acaacttctc catgcgcgca tacgtgccta agtccaagaa gtttgcatcg 1260
ttgccgatgg ccttgttccg ggccttggtg cccaagaaca aataa 1305
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Psy
<400> 2
Met Thr Leu Ser Met Leu Asp Ala Arg Arg Met Ala Gln Arg Thr Ala
1 5 10 15
Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ile Ile Tyr Ala Pro Ser Pro Ile
20 25 30
Ser Asn Arg Ser Gly Arg Arg Ala Ala Ala Asn His Gly Ile Arg Asn
35 40 45
Gly Ser Arg Arg Ala Ala Gly Arg Met Gly Leu Cys Ser Thr Val Gln
50 55 60
Val Asn Cys Thr Leu Ala Met Pro Gln Pro Asn His Gly Gln Lys Met
65 70 75 80
Arg Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln
85 90 95
Gln Leu Ser Gly Lys Gln Val Glu Glu Gln Ala Met Leu Gln Cys Ile
100 105 110
Lys Thr Ala Gln Ser Val Pro Pro Ser Thr Gly Leu Leu Asn Pro Arg
115 120 125
Gly Leu Arg Trp Gln Gly Ser Ser Leu Glu Ala Ala Tyr Glu Arg Cys
130 135 140
Gly Ala Val Cys Ser Glu Tyr Ala Lys Thr Phe Tyr Leu Gly Thr Gln
145 150 155 160
Leu Met Thr Pro Val Gln Ala Arg Cys Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp
165 170 175
Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala Ser Lys Ile
180 185 190
Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Glu Arg Leu Glu Ser Met Phe
195 200 205
Gln Gly Lys Pro Tyr Asp Val Leu Asp Ala Ala Leu Thr Asp Thr Ile
210 215 220
Ser Lys Phe Pro Leu Glu Val Gln Pro Phe Arg Asp Met Ile Glu Gly
225 230 235 240
Met Arg Met Asp Leu Phe Lys Ser Arg Tyr His Thr Phe Asp Glu Leu
245 250 255
Tyr Glu Tyr Cys Tyr Arg Val Ala Gly Thr Val Gly Leu Met Thr Met
260 265 270
Pro Val Met Gly Ile Asp Pro Asn Tyr Lys Gly Pro Ile Asp Lys Val
275 280 285
Tyr Lys Ala Ala Leu Ala Leu Gly Thr Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile
290 295 300
Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ile Arg Glu Arg Asp Arg Ile Tyr Leu
305 310 315 320
Pro Leu Asp Glu Leu Lys Gln Phe Gly Ile Ser Glu Glu Glu Val Lys
325 330 335
Ala Gly Ile His Lys Pro Ser Gln Gly Lys Val Asp Glu Arg Trp Arg
340 345 350
Ala Phe Met Lys Phe Gln Ile Lys Arg Ala Arg Glu Tyr Phe Gln Glu
355 360 365
Ala Glu Asp Gly Val Asp Tyr Leu Asp Val Lys Ala Arg Trp Pro Val
370 375 380
Trp Ser Ala Leu Ile Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Val Ile Glu Lys
385 390 395 400
Asn Asp Tyr Asp Asn Phe Ser Met Arg Ala Tyr Val Pro Lys Ser Lys
405 410 415
Lys Phe Ala Ser Leu Pro Met Ala Leu Phe Arg Ala Leu Val Pro Lys
420 425 430
Asn Lys
<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Ziso
<400> 3
atggcgagct tgtgtagagc tgcccttggg caggccagtg cgaaggggct gagtggctta 60
caaacttcct ccaagcctct catctccaag agccctcttg tagcaagacc accatgcatc 120
agaattagcg aacgctgccc agtcttagaa aattccgtat ggagcagaag acgagcggag 180
gtgtgtgtgc gggctgctag cgacgaggag tcgccccgac ctgcggggct tgttggcgag 240
gatgcggcag ccttcgacgt ttcccagcag agtaccaagt cctgggcgct gtttactggg 300
cttctgactg gcgtgctggg cctcatttac ctggtatgga tccagccggg agcaggtctg 360
gcagatgact tcttggggtt ggtcgagggc ttcagcaaca acaacccgga ggcaacaatc 420
ctccttatcc tctttgtgtt tgctgttgta cacagtgggc tggcaggcct gcgccccaaa 480
ggggagcagc tgatcggcgc acgagcatac cgggtgattt ttgcccttgt cagcctgccc 540
ttggccatcg tggccatcgt gtacttcatc aaccatagat acgatggcat gcccttatgg 600
gatctcaggg gtgtgacggg agtgcatgag ctggtgtggc tcctcaactt tgtgtccttc 660
tacttccttt acccttccac ctttaacatc cttgaggtgg ctgcagtgga cgagcccaag 720
ctgcatatgt gggaaacggg aatcatgcga atcactcgtc acccacaaat ggtagggcag 780
ctaatatggt gcgcagcaca cacgttgtgg atcgggaaca gcttcatgct cgtgacctca 840
gcaggcctca tggctcatca tctctttggt tgctggcatg gtgaccggcg gttgtctgcc 900
aagtatggcg aggcctttga aatcgtcaag gcgcggacaa gtacctttcc attgcaagct 960
atttgggagg gccgccaggt cttgccagct gattactaca aggagttcct gcgggcgccc 1020
tacttcgctg tgactgcctt caccctgggc gcctacttcg cacaccccat catgcagtct 1080
gccagcttct atttgagatg gtag 1104
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Ziso
<400> 4
Met Ala Ser Leu Cys Arg Ala Ala Leu Gly Gln Ala Ser Ala Lys Gly
1 5 10 15
Leu Ser Gly Leu Gln Thr Ser Ser Lys Pro Leu Ile Ser Lys Ser Pro
20 25 30
Leu Val Ala Arg Pro Pro Cys Ile Arg Ile Ser Glu Arg Cys Pro Val
35 40 45
Leu Glu Asn Ser Val Trp Ser Arg Arg Arg Ala Glu Val Cys Val Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Asp Glu Glu Ser Pro Arg Pro Ala Gly Leu Val Gly Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Ala Phe Asp Val Ser Gln Gln Ser Thr Lys Ser Trp Ala
85 90 95
Leu Phe Thr Gly Leu Leu Thr Gly Val Leu Gly Leu Ile Tyr Leu Val
100 105 110
Trp Ile Gln Pro Gly Ala Gly Leu Ala Asp Asp Phe Leu Gly Leu Val
115 120 125
Glu Gly Phe Ser Asn Asn Asn Pro Glu Ala Thr Ile Leu Leu Ile Leu
130 135 140
Phe Val Phe Ala Val Val His Ser Gly Leu Ala Gly Leu Arg Pro Lys
145 150 155 160
Gly Glu Gln Leu Ile Gly Ala Arg Ala Tyr Arg Val Ile Phe Ala Leu
165 170 175
Val Ser Leu Pro Leu Ala Ile Val Ala Ile Val Tyr Phe Ile Asn His
180 185 190
Arg Tyr Asp Gly Met Pro Leu Trp Asp Leu Arg Gly Val Thr Gly Val
195 200 205
His Glu Leu Val Trp Leu Leu Asn Phe Val Ser Phe Tyr Phe Leu Tyr
210 215 220
Pro Ser Thr Phe Asn Ile Leu Glu Val Ala Ala Val Asp Glu Pro Lys
225 230 235 240
Leu His Met Trp Glu Thr Gly Ile Met Arg Ile Thr Arg His Pro Gln
245 250 255
Met Val Gly Gln Leu Ile Trp Cys Ala Ala His Thr Leu Trp Ile Gly
260 265 270
Asn Ser Phe Met Leu Val Thr Ser Ala Gly Leu Met Ala His His Leu
275 280 285
Phe Gly Cys Trp His Gly Asp Arg Arg Leu Ser Ala Lys Tyr Gly Glu
290 295 300
Ala Phe Glu Ile Val Lys Ala Arg Thr Ser Thr Phe Pro Leu Gln Ala
305 310 315 320
Ile Trp Glu Gly Arg Gln Val Leu Pro Ala Asp Tyr Tyr Lys Glu Phe
325 330 335
Leu Arg Ala Pro Tyr Phe Ala Val Thr Ala Phe Thr Leu Gly Ala Tyr
340 345 350
Phe Ala His Pro Ile Met Gln Ser Ala Ser Phe Tyr Leu Arg Trp
355 360 365
<211> 1749
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Zds
<400> 5
atgttggggc tgcagagcaa ggaatcgcaa ctgtgcacca caaatgtgcc agccaggcgt 60
ggctatgcgc agtgcaccag tacccgcacc cgcagacgga cgcgctgcac cacccaagcc 120
attgccaccc cccctgctcc tccaaagacc acacccaggg agtggaccac ccaggatgtg 180
agcaaggtgg ccttgaagga tgtgcctttg aagtccttgt acccggatga gcctgcccct 240
ccaaagccag gtgcccccaa gatgcgtgtg gccattgtgg gcagtggact ggctggcctg 300
tcgacagcag tggagctgct agaccaaggg catgaggtgg acatctatga ccagcgcagc 360
tgggttggag gcaaggtggc ctcatggcaa gacaaggatg gcaaccacat tgagatgggc 420
ttgcacgtct tcttcggctg ctaccacaac cttttccgtc tgatggccaa gtgtggagta 480
ctggagaact tgctggtgaa ggagcatact cacacctttt gcaacaatga tggggatgtc 540
agggagcttg acttccgttt tgaggtcgga ggacagaaaa tcggggctcc cttccatggc 600
ctgaaagcct tcttcacaac cccccagctt tctgtgggag acaaggcagc caatgcgctg 660
gcgctgggca ccagccctat tgtgcgctcc ttgatagacc cagagggggg catgagtgat 720
gtgcgaaacc tggacaacat cagcttctgg gactggttca agagccatgg cgggtctgag 780
caatccatga agcgcatgtg ggatcccatt gcgtatgctt tgggtttctt ggactgcaaa 840
gacatcagtg cgcgctgcat gctgaccatc ttccagttct ttgccaccaa gaccgacgcc 900
tccgtcctgc gcatgctgaa cggatctcca gctgagaggc tcctgaagcc catcaccgac 960
tacattgagg ccaagggagg ccgcatccac ttgcgtcagg gttgcaagga ggttctattt 1020
gaggatggcc ctgacggcaa gcctgtagtg accggcatgt gcatgggccg ggatggccaa 1080
gttgtgaagg ctgatgccta tgttgcagcc ctggacgtcc ctggggcgaa gcagctcttg 1140
ccgcaggcat ggagaaagta cccccagttt gacaaaatct acaagctcaa tggcgtgcct 1200
gtgatcactg tacagctgcg ctacaatggt tgggtgacgg agatgcagga cccagagaag 1260
gtcaagcagc tgacccagcc ccaaggcatc aacaacctgt tgtacagccc tgatgcgttc 1320
ttctcctgct tcgccgacct tgcccttgtg agccctgtgg agtacttcca tgagggcaag 1380
ggctccctca tgcaagtcgt gatcacgcct gctgccccgt acatgccatg gaccaacgag 1440
gccattgctg aggaggctga ccggcaggtc cgccagctct tccccagcgc ccgtaagctg 1500
gacatgatct ggcatagtgt tgtgaagatt ggccagtcct tgtaccagga ggccccaggc 1560
atggaccctt acaggcccga gcaggccacg cctgtgccca acttcttcct ggcaggcagc 1620
tacaccaagc aagactacat cgactcaatg gagggcgcca ccttgtcagg tcggcagtgt 1680
gctggtgaga ttatgaaggc tgtgcccttg atccaaagcc tgtcaaaggc gccacttccg 1740
agcatgtaa 1749
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Zds
<400> 6
Met Leu Gly Leu Gln Ser Lys Glu Ser Gln Leu Cys Thr Thr Asn Val
1 5 10 15
Pro Ala Arg Arg Gly Tyr Ala Gln Cys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Arg
20 25 30
Arg Thr Arg Cys Thr Thr Gln Ala Ile Ala Thr Pro Pro Ala Pro Pro
35 40 45
Lys Thr Thr Pro Arg Glu Trp Thr Thr Gln Asp Val Ser Lys Val Ala
50 55 60
Leu Lys Asp Val Pro Leu Lys Ser Leu Tyr Pro Asp Glu Pro Ala Pro
65 70 75 80
Pro Lys Pro Gly Ala Pro Lys Met Arg Val Ala Ile Val Gly Ser Gly
85 90 95
Leu Ala Gly Leu Ser Thr Ala Val Glu Leu Leu Asp Gln Gly His Glu
100 105 110
Val Asp Ile Tyr Asp Gln Arg Ser Trp Val Gly Gly Lys Val Ala Ser
115 120 125
Trp Gln Asp Lys Asp Gly Asn His Ile Glu Met Gly Leu His Val Phe
130 135 140
Phe Gly Cys Tyr His Asn Leu Phe Arg Leu Met Ala Lys Cys Gly Val
145 150 155 160
Leu Glu Asn Leu Leu Val Lys Glu His Thr His Thr Phe Cys Asn Asn
165 170 175
Asp Gly Asp Val Arg Glu Leu Asp Phe Arg Phe Glu Val Gly Gly Gln
180 185 190
Lys Ile Gly Ala Pro Phe His Gly Leu Lys Ala Phe Phe Thr Thr Pro
195 200 205
Gln Leu Ser Val Gly Asp Lys Ala Ala Asn Ala Leu Ala Leu Gly Thr
210 215 220
Ser Pro Ile Val Arg Ser Leu Ile Asp Pro Glu Gly Gly Met Ser Asp
225 230 235 240
Val Arg Asn Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Asp Trp Phe Lys Ser His
245 250 255
Gly Gly Ser Glu Gln Ser Met Lys Arg Met Trp Asp Pro Ile Ala Tyr
260 265 270
Ala Leu Gly Phe Leu Asp Cys Lys Asp Ile Ser Ala Arg Cys Met Leu
275 280 285
Thr Ile Phe Gln Phe Phe Ala Thr Lys Thr Asp Ala Ser Val Leu Arg
290 295 300
Met Leu Asn Gly Ser Pro Ala Glu Arg Leu Leu Lys Pro Ile Thr Asp
305 310 315 320
Tyr Ile Glu Ala Lys Gly Gly Arg Ile His Leu Arg Gln Gly Cys Lys
325 330 335
Glu Val Leu Phe Glu Asp Gly Pro Asp Gly Lys Pro Val Val Thr Gly
340 345 350
Met Cys Met Gly Arg Asp Gly Gln Val Val Lys Ala Asp Ala Tyr Val
355 360 365
Ala Ala Leu Asp Val Pro Gly Ala Lys Gln Leu Leu Pro Gln Ala Trp
370 375 380
Arg Lys Tyr Pro Gln Phe Asp Lys Ile Tyr Lys Leu Asn Gly Val Pro
385 390 395 400
Val Ile Thr Val Gln Leu Arg Tyr Asn Gly Trp Val Thr Glu Met Gln
405 410 415
Asp Pro Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Gln Pro Gln Gly Ile Asn Asn
420 425 430
Leu Leu Tyr Ser Pro Asp Ala Phe Phe Ser Cys Phe Ala Asp Leu Ala
435 440 445
Leu Val Ser Pro Val Glu Tyr Phe His Glu Gly Lys Gly Ser Leu Met
450 455 460
Gln Val Val Ile Thr Pro Ala Ala Pro Tyr Met Pro Trp Thr Asn Glu
465 470 475 480
Ala Ile Ala Glu Glu Ala Asp Arg Gln Val Arg Gln Leu Phe Pro Ser
485 490 495
Ala Arg Lys Leu Asp Met Ile Trp His Ser Val Val Lys Ile Gly Gln
500 505 510
Ser Leu Tyr Gln Glu Ala Pro Gly Met Asp Pro Tyr Arg Pro Glu Gln
515 520 525
Ala Thr Pro Val Pro Asn Phe Phe Leu Ala Gly Ser Tyr Thr Lys Gln
530 535 540
Asp Tyr Ile Asp Ser Met Glu Gly Ala Thr Leu Ser Gly Arg Gln Cys
545 550 555 560
Ala Gly Glu Ile Met Lys Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Leu Ser Lys
565 570 575
Ala Pro Leu Pro Ser Met
580
<211> 1905
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Crtiso
<400> 7
atgtttgcaa cgaatggttg tccaaggggg ctgcaagcag ggaaggccag tggctcgcag 60
gcaggaaaga gagttgtcgg actccgtgat tctggcctgg accatgtcat caggcatgtt 120
ccacacccta gcacctccat acccgctagc agcagcagga ccactcaggg caccagtaat 180
agcgcccgcc caggcatcaa cagcagccgc agacaacagc ggttgcagcg ctgcacagcc 240
gctgcgtccg caacggctta tcctcctgca gaggtggtga aggctctacc aacagatgcc 300
ccaacagatg tggagtacga tgccgttatt gtggggagtg gcatgggggg actggcaact 360
gcctcccagc tggcagcaaa gggagcccgt gtggttgtcc tggaaaagta cctcatccct 420
ggaggcagtg cagggcactt caagagagag ggctacacct ttgatgtcgg ctcctcgatg 480
atgtttggct ttggagacaa gggaaccacc aacctgctga cccgctgcct agccgccctg 540
gacaagaaaa ttgagactgt gcctgacccg acccaggtgt actaccattt gcctgcaacc 600
aaagctcacc ccaatgggct ggacgtccag gtctggagaa agtacgagga cttcgtgtca 660
gagctgtgcg ctcaattccc tcacgagagc aatggcatca aggcattcta tgacgagtgc 720
tggaagatct tcaatgctct caacaccttg gagctcaaga gcttggaaga gatccggtac 780
ctgctgcgag agtttgcaaa gcatcccatc gagtgcctga cgcttgcggc atatgccact 840
tccaacgtcg cggacatctc gcgcaaatac atcaaggacc ctgagctcct gcgcttcatt 900
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cgcattccgg aagtgctagc agaaggcttg acagagcgtg gcagtcatgt agtctacaag 1080
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gagcggtaca agaaagcacc ctcatttttc tccatgcaca tgggcgtgga agccagtgtg 1320
tttgagggtt caggagagac agtggactgc caccatgtga ttgtagacga ctggtcaaag 1380
ctggaagatg cctatggaac actttttgtg tccatgccct ccctgctaga cccatccctg 1440
gccccgcccg gcaagcacat tgtccatgca ttcactccag actggataga ctcctggcag 1500
ggcctgtctg tacaagatta cgaggctaag aaggaggaag tttctgcgca gctcattgac 1560
cgcctcgatg ctgtgtttcc tggactgaag caaggggtgg tcttcaagga ggtggggacg 1620
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aggccacccc tgggcatgtt gtccatgcct ttcaacagga ctgctgtgca agggctttat 1740
tgtgtgggag actcaacttt tccaggccaa ggagtgaatg cagtcgtctt ctccggcttt 1800
ggctgtgccc atcgagtggc ttgcgacatt gggcttgagc ccacctggcc tgccctggac 1860
aagcctttta acaagttcct cgagtatgtg cgggacagct cataa 1905
<211> 634
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏巴氏藻（Dunaliella bardawil）：Crtiso
<400> 8
Met Phe Ala Thr Asn Gly Cys Pro Arg Gly Leu Gln Ala Gly Lys Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ser Gln Ala Gly Lys Arg Val Val Gly Leu Arg Asp Ser Gly
20 25 30
Leu Asp His Val Ile Arg His Val Pro His Pro Ser Thr Ser Ile Pro
35 40 45
Ala Ser Ser Ser Arg Thr Thr Gln Gly Thr Ser Asn Ser Ala Arg Pro
50 55 60
Gly Ile Asn Ser Ser Arg Arg Gln Gln Arg Leu Gln Arg Cys Thr Ala
65 70 75 80
Ala Ala Ser Ala Thr Ala Tyr Pro Pro Ala Glu Val Val Lys Ala Leu
85 90 95
Pro Thr Asp Ala Pro Thr Asp Val Glu Tyr Asp Ala Val Ile Val Gly
100 105 110
Ser Gly Met Gly Gly Leu Ala Thr Ala Ser Gln Leu Ala Ala Lys Gly
115 120 125
Ala Arg Val Val Val Leu Glu Lys Tyr Leu Ile Pro Gly Gly Ser Ala
130 135 140
Gly His Phe Lys Arg Glu Gly Tyr Thr Phe Asp Val Gly Ser Ser Met
145 150 155 160
Met Phe Gly Phe Gly Asp Lys Gly Thr Thr Asn Leu Leu Thr Arg Cys
165 170 175
Leu Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ile Glu Thr Val Pro Asp Pro Thr Gln
180 185 190
Val Tyr Tyr His Leu Pro Ala Thr Lys Ala His Pro Asn Gly Leu Asp
195 200 205
Val Gln Val Trp Arg Lys Tyr Glu Asp Phe Val Ser Glu Leu Cys Ala
210 215 220
Gln Phe Pro His Glu Ser Asn Gly Ile Lys Ala Phe Tyr Asp Glu Cys
225 230 235 240
Trp Lys Ile Phe Asn Ala Leu Asn Thr Leu Glu Leu Lys Ser Leu Glu
245 250 255
Glu Ile Arg Tyr Leu Leu Arg Glu Phe Ala Lys His Pro Ile Glu Cys
260 265 270
Leu Thr Leu Ala Ala Tyr Ala Thr Ser Asn Val Ala Asp Ile Ser Arg
275 280 285
Lys Tyr Ile Lys Asp Pro Glu Leu Leu Arg Phe Ile Asp Leu Glu Cys
290 295 300
Tyr Ile Trp Ser Thr Val Pro Ala Glu Leu Thr Pro Met Met Asn Ala
305 310 315 320
Gly Met Val Phe Cys Asp Arg His Tyr Gly Gly Ile Asn Tyr Pro Ile
325 330 335
Gly Gly Val Gly Arg Ile Pro Glu Val Leu Ala Glu Gly Leu Thr Glu
340 345 350
Arg Gly Ser His Val Val Tyr Lys Ala Asn Val Lys Arg Ile Leu Thr
355 360 365
Glu Lys Gln Gly Glu Glu Met Lys Ala Val Gly Val Glu Leu Ala Asp
370 375 380
Gly Arg Val Phe Arg Gly Lys Ser Ile Ile Ser Asn Ala Thr Arg Trp
385 390 395 400
Asp Thr Phe Glu Ser Met Ile Gly Asp Asp Asn Leu Pro Pro Ser Glu
405 410 415
Lys Leu Phe Arg Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Pro Ser Phe Phe Ser Met
420 425 430
His Met Gly Val Glu Ala Ser Val Phe Glu Gly Ser Gly Glu Thr Val
435 440 445
Asp Cys His His Val Ile Val Asp Asp Trp Ser Lys Leu Glu Asp Ala
450 455 460
Tyr Gly Thr Leu Phe Val Ser Met Pro Ser Leu Leu Asp Pro Ser Leu
465 470 475 480
Ala Pro Pro Gly Lys His Ile Val His Ala Phe Thr Pro Asp Trp Ile
485 490 495
Asp Ser Trp Gln Gly Leu Ser Val Gln Asp Tyr Glu Ala Lys Lys Glu
500 505 510
Glu Val Ser Ala Gln Leu Ile Asp Arg Leu Asp Ala Val Phe Pro Gly
515 520 525
Leu Lys Gln Gly Val Val Phe Lys Glu Val Gly Thr Pro Arg Thr His
530 535 540
Arg Arg Phe Leu Asn Arg Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Pro Ile Pro Ser
545 550 555 560
Arg Pro Pro Leu Gly Met Leu Ser Met Pro Phe Asn Arg Thr Ala Val
565 570 575
Gln Gly Leu Tyr Cys Val Gly Asp Ser Thr Phe Pro Gly Gln Gly Val
580 585 590
Asn Ala Val Val Phe Ser Gly Phe Gly Cys Ala His Arg Val Ala Cys
595 600 605
Asp Ile Gly Leu Glu Pro Thr Trp Pro Ala Leu Asp Lys Pro Phe Asn
610 615 620
Lys Phe Leu Glu Tyr Val Arg Asp Ser Ser
625 630
<211> 1077
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Ggps
<400> 9
atggccgccc atcagatgca gctctttagt agccaacgga tgtgctcaac gtcctcaagg 60
agcatgaggc cagcagtctg cagccggccg caagtgccac gaattcgccc tgcaaacgtt 120
agacaaggtc gccatcaggc cttcaggaca atggccattg caactgcaga cgaggcccag 180
cagtccactt cttcctttga cttcaagagc tatatgaagg agcgtgcagt catggtgaat 240
gatgcgttgg acaaggccct gccgcagcgc tatccagagg tgctgctaga gtctatgagg 300
tactcactcc tagctggtgg caagcgcgtg cgcccatgcc tgaccttggc tgcctgcgaa 360
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accatgagcc tgatccacga cgacctaccc tccatggaca atgatgattt ccgcagaggg 480
tctcccacca accacaagaa atacggagag gacattgcca ttcttgccgg agacgccctg 540
ctttctttcg ccttcgagca cgtcgcgcgc gccaccactg gcacctcgcc tgagcgcgtg 600
ttgcgtgtga tcattgagct gggcaaggct gtgggtgcag atgggctaac aggaggacag 660
gttgtggaca tcaagagcga aaaccaggag gtgggcctgg aagttctgca gtacatccat 720
gagcacaaga cagcggccct gctagaggca gctgtggtgt gtggcgcgct ggtgggcggc 780
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gagaagcgcg ccccccttgt agctctggcc aagtacattg gctaccgtca aaactaa 1077
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Ggps
<400> 10
Met Ala Ala His Gln Met Gln Leu Phe Ser Ser Gln Arg Met Cys Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Arg Ser Met Arg Pro Ala Val Cys Ser Arg Pro Gln Val
20 25 30
Pro Arg Ile Arg Pro Ala Asn Val Arg Gln Gly Arg His Gln Ala Phe
35 40 45
Arg Thr Met Ala Ile Ala Thr Ala Asp Glu Ala Gln Gln Ser Thr Ser
50 55 60
Ser Phe Asp Phe Lys Ser Tyr Met Lys Glu Arg Ala Val Met Val Asn
65 70 75 80
Asp Ala Leu Asp Lys Ala Leu Pro Gln Arg Tyr Pro Glu Val Leu Leu
85 90 95
Glu Ser Met Arg Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gly Lys Arg Val Arg Pro
100 105 110
Cys Leu Thr Leu Ala Ala Cys Glu Cys Val Gly Gly Asp Ile Ala His
115 120 125
Ala Met Pro Thr Ala Cys Ala Met Glu Val Val His Thr Met Ser Leu
130 135 140
Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Phe Arg Arg Gly
145 150 155 160
Ser Pro Thr Asn His Lys Lys Tyr Gly Glu Asp Ile Ala Ile Leu Ala
165 170 175
Gly Asp Ala Leu Leu Ser Phe Ala Phe Glu His Val Ala Arg Ala Thr
180 185 190
Thr Gly Thr Ser Pro Glu Arg Val Leu Arg Val Ile Ile Glu Leu Gly
195 200 205
Lys Ala Val Gly Ala Asp Gly Leu Thr Gly Gly Gln Val Val Asp Ile
210 215 220
Lys Ser Glu Asn Gln Glu Val Gly Leu Glu Val Leu Gln Tyr Ile His
225 230 235 240
Glu His Lys Thr Ala Ala Leu Leu Glu Ala Ala Val Val Cys Gly Ala
245 250 255
Leu Val Gly Gly Ala Asp Asp Val Thr Val Glu Lys Met Arg Lys Phe
260 265 270
Ala Leu Asn Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Val Asp Asp Ile Leu Asp
275 280 285
Cys Thr Gln Thr Thr Glu Gln Leu Gly Lys Thr Ala Gly Lys Asp Met
290 295 300
Gly Val Asn Lys Thr Thr Tyr Pro Lys Leu Leu Gly Leu Glu Lys Ser
305 310 315 320
Lys Gln Thr Ala Glu Asp Leu Ile Thr Glu Ala Ile Gln Gln Leu Asp
325 330 335
Gly Phe Pro Pro Glu Lys Arg Ala Pro Leu Val Ala Leu Ala Lys Tyr
340 345 350
Ile Gly Tyr Arg Gln Asn
355
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Ziso
<400> 11
atggcaagct tgtgtgcagg tcgggccctt gggctggctg gtcaggggct gactggctca 60
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cagccgggag cagggctggc agatgacttc ctgagcactg tcgagagctt cagcaacaac 420
aaccccgagg caacaatcct cctcatcctg tttgtgtttg cggtcgcgca cagtgggcta 480
gcagccctgc gcccaaaagg cgagcagctg atcggtgctc gagcattccg cgtgattttt 540
gcccttgtca gcctgcccct ggccatcgtg gcggtggtgt atttcatcaa ccacagatat 600
gatggcatac ccttatggga tctcaggggt gtgacgggag tgcatgagct ggtgtggacc 660
ctcaacttca tttccttcta cttcctgtac ccgtccacct tcaacatcct tgaggtggct 720
gcagtggatg agcccaagct ccacatgtgg gaaaccggca tcatgcgaat cactcgtcac 780
ccacaaatgg tagggcaggc catctggtgt gcagcgcaca cgctgtggat cgggaacagc 840
ttcatgctgg tgacttcggc aggcctcatg gctcaccacc ttttcgggtg ctggcatggt 900
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actttcccga tgcaggctgt ttgggagggc cgccagaaat tgccagctga cttctacaag 1020
gagttcctgc gagcccccta ctttgctgtg actgcgttca ccctgggcgc ctattatgca 1080
caccccatca tgcagtctgc tagcttctac ctggggtggt ga 1122
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Ziso
<400> 12
Met Ala Ser Leu Cys Ala Gly Arg Ala Leu Gly Leu Ala Gly Gln Gly
1 5 10 15
Leu Thr Gly Ser His Ala Ser Ser Arg Gly Leu Pro Ala Lys Pro Leu
20 25 30
Val Ser Arg Ser Pro Ile Leu Ala Lys Thr Pro Pro Cys Ile Arg Asn
35 40 45
Arg Asp Leu Gln Gln Ala Leu Gly Ile Ser Val Pro His Arg Arg Arg
50 55 60
Ser Glu Val Cys Val Arg Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ser Ser Pro Pro
65 70 75 80
Ala Gly Leu Val Gly Glu Asp Ala Ala Ala Phe Asp Val Ser Gln Gln
85 90 95
Ser Thr Lys Ser Trp Ala Ile Phe Thr Gly Leu Leu Thr Gly Val Leu
100 105 110
Gly Leu Ile Tyr Leu Val Trp Ile Gln Pro Gly Ala Gly Leu Ala Asp
115 120 125
Asp Phe Leu Ser Thr Val Glu Ser Phe Ser Asn Asn Asn Pro Glu Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Leu Ile Leu Phe Val Phe Ala Val Ala His Ser Gly Leu
145 150 155 160
Ala Ala Leu Arg Pro Lys Gly Glu Gln Leu Ile Gly Ala Arg Ala Phe
165 170 175
Arg Val Ile Phe Ala Leu Val Ser Leu Pro Leu Ala Ile Val Ala Val
180 185 190
Val Tyr Phe Ile Asn His Arg Tyr Asp Gly Ile Pro Leu Trp Asp Leu
195 200 205
Arg Gly Val Thr Gly Val His Glu Leu Val Trp Thr Leu Asn Phe Ile
210 215 220
Ser Phe Tyr Phe Leu Tyr Pro Ser Thr Phe Asn Ile Leu Glu Val Ala
225 230 235 240
Ala Val Asp Glu Pro Lys Leu His Met Trp Glu Thr Gly Ile Met Arg
245 250 255
Ile Thr Arg His Pro Gln Met Val Gly Gln Ala Ile Trp Cys Ala Ala
260 265 270
His Thr Leu Trp Ile Gly Asn Ser Phe Met Leu Val Thr Ser Ala Gly
275 280 285
Leu Met Ala His His Leu Phe Gly Cys Trp His Gly Asp Lys Arg Leu
290 295 300
Ser Asn Lys Tyr Gly Glu Ala Phe Glu Ile Val Lys Thr Arg Thr Ser
305 310 315 320
Thr Phe Pro Met Gln Ala Val Trp Glu Gly Arg Gln Lys Leu Pro Ala
325 330 335
Asp Phe Tyr Lys Glu Phe Leu Arg Ala Pro Tyr Phe Ala Val Thr Ala
340 345 350
Phe Thr Leu Gly Ala Tyr Tyr Ala His Pro Ile Met Gln Ser Ala Ser
355 360 365
Phe Tyr Leu Gly Trp
370
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Zds
<400> 13
atgctgggac tgcacggtaa ggatgccctc caggctggcc gcaccaacca gggcccgcca 60
gtcaggacta gctttgtgca gtctacccgt accaggagaa ggacgcgctg caccacccat 120
gccatcgctg cgccccctgc acctccaaag accacaccca aggagtggac cacccaggat 180
cttagcaagg tggccctgaa agacaggcct ctgaagtccc tgtacccgga tgagcccgcc 240
ccaccaaagc caggtgatcc caagctacgc gtggccatcg tgggcagtgg actggctgga 300
ctgtccacag cagtggagct gctagaccag gggcatgagg tggacatcta tgaccagcga 360
ccctttctag gaggcaaagt ggcttcatgg gtagacaagg atggcaacca catagagatg 420
ggcttgcatg tcttcttcgg gtgctaccac aaccttttcc gactgatggc caagtgcggt 480
gtactggaaa acttgctggt caaggatcac acccacacct tttgcaacgc tgatggggac 540
gtcagggagc ttgacttccg ctttgaagct ggaggacaga agattggggc cccattccat 600
ggcctgaaag ccttctttac cacccctcag ctcactgtgg ccgacaaggc acaaaatgca 660
ttggcactgg gcacgagccc tatcgtgcgc gccttgatag atcctgaggg gggtatgcaa 720
gatgtgagga acctagacaa cattagcttc tgggactggt tcaagagcca tggcggatca 780
gagctctcca tgaagcgtat gtgggacccc attgcctacg ctttgggctt cttggactgc 840
aaggacatca gtgcgcgctg catgttgaca atcttccaat tttttgccac caagaccgac 900
gcttctgtcc tccgcatgct taacggatct cctggggaga ggctgttgaa gcccatcgtt 960
aactacattg agtccaaggg tggccgcatc cacctgcgcc agggttgcaa ggaagtactc 1020
tacgaggatg gccctgacgg cacacctgtg gtgactggca tgcgcatggg ccgggatggc 1080
caaattgtga aagctgatgc ctatgtggct gccttggatg ttcctggggc caagcagctc 1140
ttaccgcagg cgtggaggaa gtaccctcaa tttgacaaca tctacagcct gattggcgtg 1200
cctgtgatca ccgttcagct gcgatacaat ggatgggtga ccgagatgca ggacccagag 1260
aaggtcaagc agctgaccca gccccaaggc atcaacaact tgctatacag ccctgatgcg 1320
ttctactcct gctttgctga cctcgctctt gtgagccctg tggagtactt caaggagggc 1380
caggggtcgc tcatgcaagt cgtgattaca ccagcggccc cctacatgcc atgggaaaac 1440
aaggccattg ctgaggaggc tgaccgccag acccgccggc tgttccccag cgcgcgcaac 1500
ttggacatga tctggcacag tgttgtgaag atcggccagt ccctgtacca ggaggcccca 1560
ggcatggacc ctttcaggcc tgagcaggcc acgcctgtgc ccaacttctt cttggcaggc 1620
agttacacca agcaagacta catcgactcc atggagggtg ccaccctgtc aggccgacaa 1680
tgtgctggcg aggtcgtgaa agccgtgccc cggatccaga gcctatcggt ggcgccactg 1740
gcaagcattt ga 1752
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Zds
<400> 14
Met Leu Gly Leu His Gly Lys Asp Ala Leu Gln Ala Gly Arg Thr Asn
1 5 10 15
Gln Gly Pro Pro Val Arg Thr Ser Phe Val Gln Ser Thr Arg Thr Arg
20 25 30
Arg Arg Thr Arg Cys Thr Thr His Ala Ile Ala Ala Pro Pro Ala Pro
35 40 45
Pro Lys Thr Thr Pro Lys Glu Trp Thr Thr Gln Asp Leu Ser Lys Val
50 55 60
Ala Leu Lys Asp Arg Pro Leu Lys Ser Leu Tyr Pro Asp Glu Pro Ala
65 70 75 80
Pro Pro Lys Pro Gly Asp Pro Lys Leu Arg Val Ala Ile Val Gly Ser
85 90 95
Gly Leu Ala Gly Leu Ser Thr Ala Val Glu Leu Leu Asp Gln Gly His
100 105 110
Glu Val Asp Ile Tyr Asp Gln Arg Pro Phe Leu Gly Gly Lys Val Ala
115 120 125
Ser Trp Val Asp Lys Asp Gly Asn His Ile Glu Met Gly Leu His Val
130 135 140
Phe Phe Gly Cys Tyr His Asn Leu Phe Arg Leu Met Ala Lys Cys Gly
145 150 155 160
Val Leu Glu Asn Leu Leu Val Lys Asp His Thr His Thr Phe Cys Asn
165 170 175
Ala Asp Gly Asp Val Arg Glu Leu Asp Phe Arg Phe Glu Ala Gly Gly
180 185 190
Gln Lys Ile Gly Ala Pro Phe His Gly Leu Lys Ala Phe Phe Thr Thr
195 200 205
Pro Gln Leu Thr Val Ala Asp Lys Ala Gln Asn Ala Leu Ala Leu Gly
210 215 220
Thr Ser Pro Ile Val Arg Ala Leu Ile Asp Pro Glu Gly Gly Met Gln
225 230 235 240
Asp Val Arg Asn Leu Asp Asn Ile Ser Phe Trp Asp Trp Phe Lys Ser
245 250 255
His Gly Gly Ser Glu Leu Ser Met Lys Arg Met Trp Asp Pro Ile Ala
260 265 270
Tyr Ala Leu Gly Phe Leu Asp Cys Lys Asp Ile Ser Ala Arg Cys Met
275 280 285
Leu Thr Ile Phe Gln Phe Phe Ala Thr Lys Thr Asp Ala Ser Val Leu
290 295 300
Arg Met Leu Asn Gly Ser Pro Gly Glu Arg Leu Leu Lys Pro Ile Val
305 310 315 320
Asn Tyr Ile Glu Ser Lys Gly Gly Arg Ile His Leu Arg Gln Gly Cys
325 330 335
Lys Glu Val Leu Tyr Glu Asp Gly Pro Asp Gly Thr Pro Val Val Thr
340 345 350
Gly Met Arg Met Gly Arg Asp Gly Gln Ile Val Lys Ala Asp Ala Tyr
355 360 365
Val Ala Ala Leu Asp Val Pro Gly Ala Lys Gln Leu Leu Pro Gln Ala
370 375 380
Trp Arg Lys Tyr Pro Gln Phe Asp Asn Ile Tyr Ser Leu Ile Gly Val
385 390 395 400
Pro Val Ile Thr Val Gln Leu Arg Tyr Asn Gly Trp Val Thr Glu Met
405 410 415
Gln Asp Pro Glu Lys Val Lys Gln Leu Thr Gln Pro Gln Gly Ile Asn
420 425 430
Asn Leu Leu Tyr Ser Pro Asp Ala Phe Tyr Ser Cys Phe Ala Asp Leu
435 440 445
Ala Leu Val Ser Pro Val Glu Tyr Phe Lys Glu Gly Gln Gly Ser Leu
450 455 460
Met Gln Val Val Ile Thr Pro Ala Ala Pro Tyr Met Pro Trp Glu Asn
465 470 475 480
Lys Ala Ile Ala Glu Glu Ala Asp Arg Gln Thr Arg Arg Leu Phe Pro
485 490 495
Ser Ala Arg Asn Leu Asp Met Ile Trp His Ser Val Val Lys Ile Gly
500 505 510
Gln Ser Leu Tyr Gln Glu Ala Pro Gly Met Asp Pro Phe Arg Pro Glu
515 520 525
Gln Ala Thr Pro Val Pro Asn Phe Phe Leu Ala Gly Ser Tyr Thr Lys
530 535 540
Gln Asp Tyr Ile Asp Ser Met Glu Gly Ala Thr Leu Ser Gly Arg Gln
545 550 555 560
Cys Ala Gly Glu Val Val Lys Ala Val Pro Arg Ile Gln Ser Leu Ser
565 570 575
Val Ala Pro Leu Ala Ser Ile
580
<211> 1887
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Crtiso
<400> 15
atgtttgcaa tcactgggcc atcagggata acaagtggct ctcaggcagg aaggggggtc 60
gcaagtctcc gcgtgtccgg tctggaccaa gtcatcaggc atgttcctca cccttccacc 120
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gcaaaaggcg cccgcgtggt tgtcctggaa aagtatctca tccctggcgg cagcgcaggg 420
cactacaggc gtgagggcta cacctttgat gttggctcct ccatgatgtt tggctttgga 480
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ttcccgggcc aaggagtgaa tgcagttgtc ttctctggct ttggctgcgc ccatcgtgtg 1800
gcttgcgaca ttggactgga gcccacttgg cctgccttgg acaagccctt ccacaagttc 1860
ctcgactacg tgcgcgacaa ctcatag 1887
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏盐藻（Dunaliella saline）：Crtiso
<400> 16
Met Phe Ala Ile Thr Gly Pro Ser Gly Ile Thr Ser Gly Ser Gln Ala
1 5 10 15
Gly Arg Gly Val Ala Ser Leu Arg Val Ser Gly Leu Asp Gln Val Ile
20 25 30
Arg His Val Pro His Pro Ser Thr Ser Thr Pro Ala Ser Thr Ser Trp
35 40 45
Pro Ser Arg Thr Pro Asn Ser Asp Ala Arg Pro Ser Ala Phe Ser Ser
50 55 60
Lys Arg Gln Gln Arg Leu Gln Arg Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Met
65 70 75 80
Ala Tyr Pro Pro Ala Glu Val Val Lys Ala Leu Pro Thr Asp Ala Pro
85 90 95
Thr Asp Val Glu Tyr Asp Ala Val Ile Val Gly Ser Gly Met Gly Gly
100 105 110
Leu Ala Thr Ala Ser Gln Leu Ala Ala Lys Gly Ala Arg Val Val Val
115 120 125
Leu Glu Lys Tyr Leu Ile Pro Gly Gly Ser Ala Gly His Tyr Arg Arg
130 135 140
Glu Gly Tyr Thr Phe Asp Val Gly Ser Ser Met Met Phe Gly Phe Gly
145 150 155 160
Asp Lys Gly Thr Thr Asn Leu Leu Thr Arg Cys Leu Ala Ala Leu Gly
165 170 175
Lys Lys Ile Glu Thr Val Pro Asp Gln Thr Gln Val Phe Tyr His Leu
180 185 190
Pro Ala Ser Glu Ala His Pro Asn Gly Leu Asn Val Gln Val Trp Arg
195 200 205
Lys Tyr Glu Asp Phe Val Ala Glu Leu Cys Asp Arg Phe Pro His Glu
210 215 220
Ser Asn Gly Ile Lys Ala Phe Tyr Asp Glu Asn Trp Arg Ile Phe Asn
225 230 235 240
Ser Leu Asn Thr Leu Glu Leu Lys Ser Leu Glu Glu Ile Arg Tyr Leu
245 250 255
Leu Gly Glu Phe Val Lys His Pro Ile Ala Cys Leu Thr Leu Ala Ser
260 265 270
Tyr Ala Thr Thr Asn Val Ala Asp Ile Ser Arg Lys Tyr Ile Lys Asp
275 280 285
Pro Glu Leu Leu Arg Phe Ile Asp Leu Glu Cys Phe Ile Trp Ser Thr
290 295 300
Val Ser Ala Glu Leu Thr Pro Met Met Asn Ala Gly Met Val Phe Cys
305 310 315 320
Asp Arg His Tyr Gly Gly Ile Asn Tyr Pro Lys Gly Gly Val Gly Arg
325 330 335
Ile Pro Glu Leu Leu Ala Glu Gly Leu Thr Glu Arg Gly Ser His Val
340 345 350
Val Tyr Lys Ala Asn Val Lys Arg Ile Leu Thr Glu Lys Gln Gly Asn
355 360 365
Glu Thr Lys Ala Val Gly Val Glu Leu Ala Asp Gly Arg Val Tyr Arg
370 375 380
Gly Lys Ser Ile Val Ser Asn Ala Thr Arg Trp Asp Thr Phe Glu Ser
385 390 395 400
Met Ile Gly Glu Asp Gln Leu Pro Pro Ser Glu Gln Ala Phe Arg Glu
405 410 415
Arg Tyr Lys Lys Ala Pro Ser Phe Phe Thr Met His Leu Gly Val Glu
420 425 430
Ala Ser Val Phe Glu Gly Lys Gly Glu Val Asp Cys His His Val Ile
435 440 445
Val Asn Asp Trp Ser Lys Leu Glu Asp Ala Tyr Gly Thr Leu Phe Val
450 455 460
Ser Met Pro Ser Leu Leu Asp Pro Ser Leu Ala Pro Pro Gly Lys His
465 470 475 480
Ile Val His Ala Phe Thr Pro Asp Trp Ile Asp Asn Trp Gln Gly Leu
485 490 495
Ser Val Gln Asp Tyr Glu Ala Lys Lys Glu Glu Val Ser Ala Gln Phe
500 505 510
Ile Asp Arg Leu Asp Ala Val Phe Pro Gly Leu Lys Gln Gly Val Val
515 520 525
Phe Lys Glu Val Gly Thr Pro Arg Thr His Arg Arg Phe Leu Asn Arg
530 535 540
Asn Ala Gly Thr Tyr Gly Pro Ile Pro Ser Arg Arg Pro Leu Gly Met
545 550 555 560
Leu Ser Met Pro Leu Asn Arg Thr Ala Val Gln Gly Leu Tyr Cys Ala
565 570 575
Gly Asp Ser Thr Phe Pro Gly Gln Gly Val Asn Ala Val Val Phe Ser
580 585 590
Gly Phe Gly Cys Ala His Arg Val Ala Cys Asp Ile Gly Leu Glu Pro
595 600 605
Thr Trp Pro Ala Leu Asp Lys Pro Phe His Lys Phe Leu Asp Tyr Val
610 615 620
Arg Asp Asn Ser
625

Claims (11)

1.一种15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
2.编码权利要求1所述的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
3.氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso或权利要求1所述的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso的应用，其特征在于：
所述的应用包括如下应用之一：
所述的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso在合成类胡萝卜素中的应用；
或者，
牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps、八氢番茄红素合成酶Psy、八氢番茄红素脱氢酶Pds和所述的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso在合成类胡萝卜素中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps的氨基酸序列如GenBank：APW83740.1或SEQ ID NO：10所示；
所述的八氢番茄红素合成酶Psy的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或GenBank：AAB51287.1所示；所述的八氢番茄红素脱氢酶Pds的氨基酸序列如GenBank：ADD52599.1或GenBank：CAA75094.1所示。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
编码牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps的基因的核苷酸序列如GenBank：KX231795.1或SEQ ID NO：9所示；
编码八氢番茄红素合成酶Psy的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或GenBank：U91900.1所示；
编码八氢番茄红素脱氢酶Pds的基因的核苷酸序列如GenBank：GQ923693.1或GenBank：Y14807.1所示。
6.根据权利要求3或4或5所述的应用，其特征在于：
所述的类胡萝卜素为β-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、番茄红素或链孢红素。
7.一种基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌，其特征在于：
基于杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)代谢途径时，所述ζ-胡萝卜素高产工程菌含有编码GenBank：APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps基因、编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶Psy基因、编码GenBank：ADD52599.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶Pds基因和编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso基因；
基于杜氏盐藻(Dunaliella saline)代谢途径时，所述ζ-胡萝卜素高产工程菌含有编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps基因、编码GenBank：AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶Psy基因、编码GenBank：CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶Pds基因和编码SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso基因。
8.根据权利要求7所述的基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌，其特征在于：
基于杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)代谢途径时，编码GenBank：APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps基因的核苷酸序列为如GenBank：KX231795.1所示的核苷酸序列；
编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶Psy基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
编码GenBank：ADD52599.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的核苷酸序列为如GenBank：GQ923693.1所示的核苷酸序列；
编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
基于杜氏盐藻(Dunaliella saline)代谢途径时，编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；
编码GenBank：AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶Psy基因的核苷酸序列为如GenBank：U91900.1所示的核苷酸序列；
编码GenBank：CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的核苷酸序列为如GenBank：Y14807.1所示的核苷酸序列；
编码SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。
9.权利要求7或8所述的基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用相关基因工程手段从杜氏藻中克隆到牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps、八氢番茄红素合成酶Psy、八氢番茄红素脱氢酶Pds、15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso；
(2)将Ggps和Psy构建在pACYduet-1载体上，氯霉素抗性，得到重组载体pACYduet-ggps-psy；将Pds构建在pCDFduet-1载体上，链霉素抗性，得到重组载体pCDFduet-pds；将Ziso构建在pETduet-1载体上，氨苄抗性，得到重组载体pETduet-ziso；
(3)然后将步骤(2)构建的三个重组载体共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌；
所述的杜氏藻为杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)或杜氏盐藻(Dunaliellasaline)。
10.权利要求7或8所述的基于杜氏藻代谢途径的ζ-胡萝卜素高产工程菌在生产ζ-胡萝卜素中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：
当杜氏藻为杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)时，所述ζ-胡萝卜素高产工程菌的ζ-胡萝卜素的产率为2.2mg/g细胞干重；
当杜氏藻为杜氏盐藻(Dunaliella saline)时，所述ζ-胡萝卜素高产工程菌的ζ-胡萝卜素的产率为3.6mg/g细胞干重。
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"巴氏杜氏藻类胡萝卜素异构酶基因的分子克隆及外源表达***的构建";中国优秀硕士学位论文全文数据库（基础科学辑）;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（基础科学辑）》;20170515(第5期);正文第4、66页 *
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