CN112029782B

CN112029782B - 一种β-胡萝卜素羟化酶及其基因与应用

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Publication number: CN112029782B
Application number: CN202010953385.9A
Authority: CN
Inventors: 王潮岗; 黄丹琼; 胡章立
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: CN112029782A

Abstract

本发明公开一种β‑胡萝卜素羟化酶及其基因与应用，其中，所述β‑胡萝卜素羟化酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明提供的β‑胡萝卜素羟化酶能更高效的转化β‑胡萝卜素，得到纯度更高的玉米黄质产物。经测定，玉米黄质含量在含有本发明β‑胡萝卜素羟化酶基因(HpCrtR‑b2基因)的大肠杆菌转化株中高达59.1mg/g干重。另外，含有本发明HpCrtR‑b2基因的大肠杆菌转化株中玉米黄质占总检测化合物的84.6％，显著优于另一个已报道的雨生红球藻β‑胡萝卜素羟化酶(73.1％)；本发明提供的β‑胡萝卜素羟化酶能在β‑胡萝卜素氧化酶/酮化酶基因BKT1的协同作用下，将β‑胡萝卜素转化为虾青素。

Description

一种β-胡萝卜素羟化酶及其基因与应用

技术领域

本发明涉及微藻基因工程技术技术领域，尤其涉及一种β-胡萝卜素羟化酶及其基因与应用。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种主要生长在淡水环境中的单细胞绿藻，属绿藻门(Chlorophata)、绿藻纲(Chloro-phyceae)、团藻目(Volvocales)、红球藻科(Haematococcaceae)、红球藻属(Haematococcus)。在刺激条件下，该藻能大量累积虾青素而呈现红色。虾青素作为类胡萝卜素合成代谢的最终产物，其中间代谢产物，如八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质等在雨生红球藻中均有一定程度的积累。除虾青素作为一种最高效的纯天然抗氧化剂及天然着色剂被广泛应用于食品、医药、化妆品及农业领域外，其他类胡萝卜素中间产物也具有抗氧化性，能够被用于医药等领域，具有较高的商业价值。因此，雨生红球藻作为自然界中类胡萝卜素天然的来源，是一种具有重要经济价值的藻类。

探明雨生红球藻中虾青素等类胡萝卜素的生物合成路径对虾青素的生产和高效生物合成具有重要的指导作用。目前已知雨生红球藻虾青素的生物合成涉及到的一系列合成酶基因中，β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶(β-carotenoid ketolase，BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(β-carotenoid hydroxylase，CrtR-b)为双功能酶，能将β-胡萝卜素转化为虾青素，被认为是虾青素合成中最重要的两个酶。但是，目前发现的BKT和CrtR-b对底物的特异性较低，能够催化相似的一类化学反应，得到多种复杂的中间产物，从而降低了目标产物虾青素的合成效率。缺乏高效的β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶也导致利用基因工程合成虾青素等类胡萝卜素进展不大，更高效的酶基因有待发掘。

因此，现有技术还有待于改进和发展以获得产率和纯度更高的类胡萝卜素产品。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种β-胡萝卜素羟化酶及其基因与应用，旨在解决现有β-胡萝卜素羟化酶的催化合成效率较低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种β-胡萝卜素羟化酶基因，其中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因为SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

所述的β-胡萝卜素羟化酶基因，其中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因从雨生红球藻中分离得到。

一种重组表达载体，其包括本发明所述的β-胡萝卜素羟化酶基因。

一种宿主细胞，其包括本发明所述的重组表达载体。

一种β-胡萝卜素羟化酶，其中，所述β-胡萝卜素羟化酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

一种β-胡萝卜素羟化酶的应用，其中，将本发明所述的β-胡萝卜素羟化酶用于将β-胡萝卜素转化为玉米黄质。

一种β-胡萝卜素羟化酶的应用，其中，将本发明所述的β-胡萝卜素羟化酶以及β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶，用于将β-胡萝卜素转化为虾青素。

有益效果：与现有β-胡萝卜素羟化酶相比，本发明提供的β-胡萝卜素羟化酶能更高效的转化β-胡萝卜素，得到纯度更高的玉米黄质产物并提高其产量。经测定，玉米黄质含量在含有本发明β-胡萝卜素羟化酶基因(HpCrtR-b2基因)的大肠杆菌转化株中高达59.1mg/g干重，显著优于另一个已报道的雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶和普遍使用的细菌来源的β-胡萝卜素羟化酶(分别是50.1mg/g干重和39.3mg/g干重)。另外，含有本发明HpCrtR-b2基因的大肠杆菌转化株中玉米黄质占总检测化合物的84.6％，显著优于另一个已报道的雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶(73.1％)；本发明提供的β-胡萝卜素羟化酶能在β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶基因BKT1的协同作用下，将β-胡萝卜素转化为虾青素。由此可见，本发明提供的β-胡萝卜素羟化酶基因在类胡萝卜素类化合物生产中具有更广泛的应用前景，尤其是可应用于高纯度玉米黄质的制备。

附图说明

图1是本发明实施例用于构建雨生红球藻HpCrtR-b2基因大肠杆菌表达***的pET-32a载体质粒图谱和多克隆位点信息。

图2是本发明实施例用于构建大肠杆菌本底表达β-胡萝卜素菌株的pACCAR16Δcrtx质粒图谱。

图3是本发明实施例3中HPLC检测含有HpCrtR-b2基因的大肠杆菌与含有HpCrtR-b1基因的大肠杆菌转化株中主要类胡萝卜素类化合物的液相色谱对比图。

图4为本发明实施例4中HPLC检测含有pET-HpCrtR-b2-BKT1的大肠杆菌转化株中主要类胡萝卜素类化合物的液相色谱图。

具体实施方式

本发明提供一种β-胡萝卜素羟化酶及其基因与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

雨生红球藻作为自然界虾青素产量最高的生物，必定存在高效的β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶。为了筛选出高效的β-胡萝卜素羟化酶，本发明从雨生红球藻基因组及三代转录组测序数据发掘出一个新的β-胡萝卜素羟化酶，它具有催化效率高、产物得率高等特点，在类胡萝卜素类化合物生物合成中，具有广阔的应用前景。

具体的，本发明提供的β-胡萝卜素羟化酶基因从雨生红球藻中分离得到，其中，所述β-胡萝卜素羟化酶基因为SEQ ID NO：1的核苷酸序列，所述核苷酸序列长度为1177个碱基。进一步地，本发明还提供了由所述β-胡萝卜素羟化酶基因表达后的β-胡萝卜素羟化酶，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的多肽。

本发明通过对所述雨生红球藻HpCrtR-b2基因的功能验证，发现其能更高效的转化β-胡萝卜素，得到纯度更高的玉米黄质产物，且经测定，玉米黄质含量在含有本发明β-胡萝卜素羟化酶基因(HpCrtR-b2基因)的大肠杆菌转化株中高达59.1mg/g干重；进一步地，所述HpCrtR-b2基因能在β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶基因BKT1的协同作用下，将β-胡萝卜素转化为虾青素。显然，本发明提供的β-胡萝卜素羟化酶基因在类胡萝卜素类化合物生产和合成中具有更广泛的应用前景，尤其是可应用于高纯度玉米黄质的制备。

在一些实施方式中，本发明还提供了一种重组表达载体，其是将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列直接与质粒、病毒或运载体连接所构建的重组载体。

在一些实施方式中，本发明还提供一种宿主细胞，其包括本发明所述的含有该HpCrtR-b2基因的重组表达载体。作为举例，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在一些实施方式中，还提供一种β-胡萝卜素羟化酶的应用，其将本发明所述的β-胡萝卜素羟化酶用于将β-胡萝卜素转化为玉米黄质。

在本实施例中，所述HpCrtR-b2基因的制备方法包括以下步骤：将雨生红球藻进行高光高盐处理，收集不同处理时间段的藻细胞，提取总RNA；采用TaKaRa的PrimeScript RTreagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒。根据试剂盒说明书，使用Oligo(dT18)作为锚定引物，将所述RNA进行反转录获得第一链cDNA；cDNA第一链为模板，利用设计的特异性引物，使用Invitrogen Platinum SuperFi DNA Ploymerase高保真酶进行HpCrtR-b2基因的扩增。采用T-A克隆的方法，对目的片段进行克隆，并测序验证。

本实施例中，所述HpCrtR-b2基因在将β-胡萝卜素转化为玉米黄质的应用包括以下步骤：利用酶切连接技术，将经密码子优化过的人工合成的HpCrtR-b2连接到pET-32a表达载体中，获得pET-HpCrtR-b2质粒；将构建好的pET-HpCrtR-b2质粒转化入含有pACCAR16Δcrtx质粒的大肠杆菌中，获得产玉米黄质的大肠杆菌转化株；利用HPLC检测技术，对大肠杆菌转化株中的玉米黄质、β-胡萝卜素等类胡萝卜素类化合物进行检测和含量测定。

在一些实施方式中，还提供一种β-胡萝卜素羟化酶的应用，其将本发明所述的β-胡萝卜素羟化酶以及β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶，用于将β-胡萝卜素转化为虾青素。

在本实施例中，所述HpCrtR-b2基因在类胡萝卜素类化合物合成中的另一种应用包括以下步骤：利用酶切连接技术，将HpCrtR-b2和雨生红球藻来源的β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶基因BKT1(该基因具有序列表中SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列)共同连接到pET-32a表达载体中，获得pET-HpCrtR-b2-BKT1质粒；将构建好的pET-HpCrtR-b2-BKT1质粒转化入含有pACCAR16Δcrtx质粒的大肠杆菌中，获得产虾青素的大肠杆菌转化株；利用HPLC检测技术，对大肠杆菌转化株中的玉米黄质、β-胡萝卜素等类胡萝卜素类化合物进行检测和含量测定。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中所用方法如无特殊说明均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明均采用常规试剂或为按常规方法配置的试剂。

实施例1

以雨生红球藻为材料分离、克隆并获得HpCrtR-b2基因

本实施例所采用的材料是雨生红球藻藻株192.80藻细胞(购买自The CultureCollection of the University of

Germany)。经培养后，收集高光高盐处理0h、1.5h、3h、6h、9h、12h、24h、48h的藻细胞，速冻于液氮中，超低温冰箱(-80℃)保存。将采集好的藻细胞进行混样后用于后续实施。

1)雨生红球藻总RNA的提取

按照RNAfast200总RNA急速提取试剂盒(购自上海飞捷生物技术有限公司)的说明书进行，具体操作为：将藻细胞置于1.5mL离心管中，加入RA2液500μL，立即震荡混匀数秒；将裂解物全部吸入内套管，12000rpm离心20秒；取出内套管，弃外套管中液体后将内套管放回，加入500μL洗液，12000rpm离心20秒；重复一次洗液过程；取出内套管，弃外套管中液体后将内套管放回，12000rpm离心1min；将内套管移入新的无RNA酶的1.5mL离心管中，加入50μL Elution Buffer，静置1min；4℃环境下12000rpm离心1min，获得总RNA；取2μL总RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；使用核酸蛋白分析仪测定总RNA浓度和纯度；完整性较好、纯度较高的总RNA样品可用于反转录。

2)第一链cDNA的合成

以所得到的总RNA为模板，使用TaKaRa的PrimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser(Perfect Real Time)(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)试剂盒，使用Oligo(dT18)作为锚定引物，参照试剂盒说明书，进行反转录获得第一链cDNA。具体操作如下：

于冰上在0.2mL离心管中配置反应液：2.0μL 5×gDNA Eraser Buffer,1.0μLgDNA Eraser,1μg总RNA，加无RNA酶的双蒸水补足10μL体系；42℃保温2min后，冰上迅速冷却；将该离心管离心，使离心管中的混合物均沉于管底；在反应液中继续加入PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0μL,Oligo(dT18)(10μM)5.0μL,5×PrimeScript Buffer 4.0μL；轻轻混匀后在PCR仪上于37℃保温15min，85℃保温5s使酶失活后冰上放置，得到cDNA溶液。

3)目的基因引物的设计及扩增

根据现有的雨生红球藻转录组测序数据，利用DNAstar PrimerSelect软件设计相应的引物，引物序列(委托北京擎科生物技术有限公司广州分公司合成)为：

上游引物CrtR-F139为5'-ATCTCCGGCCGCACTCATCAC-3'(SEQ ID NO.3)下游引物CrtR-R140为5'-CTAAACAGCGGCCCACACCTC-3'(SEQ ID NO.4)

以cDNA第一链为模板，利用Invitrogen Platinum SuperFi DNA Ploymerase高保真酶(购自ThermoFisher Scientific Co.,Ltd.,USA)进行HpCrtR-b2基因的扩增。PCR扩增体系(20μL)为：4μL 5×SuperFi Buffer，4μL 5×SuperFi GC Enhancer，0.4μL dNTP mix(10mM),1.0μL上游引物(10μM)，1.0μL下游引物(10μM)，1.0μL模板cDNA，0.2μL PlatinumSuperFi DNA Ploymerase,8.4μL灭菌的双蒸水。PCR程序为：98℃预变性30秒；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸5min，12℃保温。

4)目的片段回收与载体连接

PCR反应完成后，取全部PCR产物，加入4.0μL 6×DNA loading buffer，混匀后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，获得约1177bp的特异性扩增片段。用干净刀片切下目的片段后，采用EZNA Gel Extraction Kit凝胶回收试剂盒(购自Omega Bio-tek Inc.,USA)，根据试剂盒说明书对目的片段进行回收。

采用T-A克隆法对目的片段进行克隆测序。首先，使用TaKaRa DNA A-Tailing Kit试剂盒(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)对回收后的目的片段加“A”尾。具体操作为：于冰上在0.2mL离心管中配置反应液2.0μL 10×A-Tailing Buffer,1.6μL dNTP mix(10mM),0.2μL A-Tailing Enzyme，16.2μL回收的目的片段。72℃保温20min后，冰上迅速冷却并静置2min。采用Promega的pGEM-T Easy Vector System I(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)将加“A”尾的目的片段连接到pGEM-T载体上，连接反应体系为：5.0μL 2×Rapid Ligation buffer，3.0μL目的片段，1.0μL pGEM-T Vector，1.0μLT4 DNA ligase，轻轻吸打混匀后离心，室温放置1小时。

5)连接产物的转化

从超低温冰箱中取出感受态细胞大肠杆菌Top10菌株(购自上海维地生物技术有限公司)，置于冰上融化。吸取5μL的连接产物加入到100μL感受态细胞中；将离心管置于冰上冰浴25min；42℃水浴锅中水浴，热激45秒后立即置于冰上冰浴2min；在超净台中向离心管中加入700μL无抗生素的LB液体培养基，37℃、200rpm复苏1小时；5000rpm离心1min，吸去700μL上清；将沉淀的菌体重悬，涂于含氨苄青霉素(浓度100mg/L)，X-Gal(浓度为20mg/L)和IPTG(浓度为0.1mM)的LB平板，37℃培养过夜。

6)重组质粒的筛选与测序验证

挑取白色的单菌落，委托北京擎科生物技术有限公司广州分公司测序，测序引物为通用引物M13F/R。测序结果在NCBI上进行比对分析。根据对测序结果的分析，最终确定克隆得到1个雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶基因，命名为HpCrtR-b2基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，HpCrtR-b2基因长度为1177bp，含有ATG起始密码子和TGA终止密码子，其中ORF全长为894bp，编码含有297个氨基酸的蛋白质，分子量为32.7KDa，该蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

HpCrtR-b2的同源性分析

通过与已报道的雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶基因(HpCrtR-b1，GeneBank登录号：AF162276)进行比对，发现核苷酸序列相似度只有79.83％，其中编码区的相似度为79.88％。利用在线分析软件SMART(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL＝1)对HpCrtR-b2基因推测的氨基酸序列进行蛋白结构域分析，发现该蛋白含有一个23个氨基酸的跨膜区域和一个136个氨基酸的脂肪酸/胡萝卜素羟化酶结构域(FA_hydroxylase结构域)，符合β-胡萝卜素羟化酶基因的特性。

实施例3

利用HpCrtR-b2基因高效合成玉米黄质

本实施例所用的大肠杆菌菌株为BL21(DE3)，用于表达产β-胡萝卜素的pACCAR16Δcrtx质粒和本实施例构建的pET-HpCrtR-b2质粒。所用大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自深圳康体生命科技有限公司；所用质粒pACCAR16Δcrtx由上海交通大学生命科学技术学院食品与环境微生物技术实验室提供(Misawa,N.,S.Kajiwara,K.Kondo,A.Yokoyama,Y.Satomi,T.Saito,W.Miki,and T.Ohtani.1995.Canthaxanthin biosynthesis by the conversionof methylene to keto groups in a hydrocarbon b-carotene by a single gene.Biochem.Biophy.Res.Commun.209:867–876)；所用质粒pET-32a购自淼灵质粒平台(武汉淼灵生物科技有限公司)。所用玉米黄质标准品来源于含有pACCAR25Δcrtx质粒的大肠杆菌表达产物；所用质粒pACCAR25Δcrtx由上海交通大学生命科学技术学院食品与环境微生物技术实验室提供(Misawa N,Nakagawa M,Kobayashi K,et al.Elucidation of the Erwiniauredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of geneproducts expressed in Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology,1991,172(12):6704-6712.)。

1)pET-HpCrtR-b2质粒的构建

将实施例1获得的HpCrtR-b2基因ORF区域序列根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化，然后委托通用生物***(安徽)有限公司进行人工基因合成，并连接入pET-32a如图1所示的EcoRI和HindIII位点，构建pET-HpCrtR-b2质粒。

2)本底表达β-胡萝卜素的大肠杆菌感受态细胞的制备

实施例3使用的本底表达β-胡萝卜素的质粒pACCAR16Δcrtx含有4个β-胡萝卜素合成的必需基因，如图2所示。其感受态细胞制备具体步骤如下：将质粒pACCAR16Δcrtx转化入本实施例所用的大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，方法同实施例1中TOP10感受态细胞的转化；挑取生长于含抗生素(氯霉素，浓度34mg/L)LB平板上的单克隆，于LB液体培养基(含氯霉素，浓度34mg/L)中，37℃、200rpm震荡培养过夜；吸取1mL菌液，接种到含有50mL液体LB培养基(含氯霉素，浓度34mg/L)的三角瓶中，37℃、200rpm摇菌至OD600值为0.7左右；将菌液置于冰上冰浴30min，4℃、4000rpm离心5min，弃上清；加入25mL预冷的0.1mo1/L CaCl₂溶液，充分悬浮沉淀的菌体后冰浴20min；4℃，4000rpm离心5min，弃去上清；加入2mL预冷的0.1mo1/L CaCl₂、15％甘油的混合溶液充分悬浮菌体，即得到所要制备的感受态细胞。用离心管将其分装成100μL/管，-80℃放置保存。

3)产玉米黄质的大肠杆菌的制备及产物检测

将构建好的pET-HpCrtR-b2质粒转化入本底表达β-胡萝卜素的大肠杆菌中，培养后收集菌体，用适量丙酮进行类胡萝卜素的萃取，HPLC分析其合成玉米黄质的产量及占总检测色素的含量。具体操作步骤如下：将质粒pET-HpCrtR-b2转化入本底表达β-胡萝卜素的大肠杆菌感受态细胞，方法同实施例1中TOP10感受态细胞的转化。挑取生长于含抗生素(氯霉素和氨苄青霉素，浓度分别为34mg/L和100mg/L)LB平板上的单克隆，于LB液体培养基(含氯霉素和氨苄青霉素，浓度分别为34mg/L和100mg/L)中，37℃、200rpm震荡培养过夜；吸取1mL菌液，接种到含有100mL液体LB培养基(含氯霉素和氨苄青霉素，浓度分别为34mg/L和100mg/L)的三角瓶中，28℃、200rpm摇菌至OD600值为0.7左右；加入IPTG至终浓度0.1mmo1/L，继续28℃、200rpm培养5h；于4℃，4000rpm离心5min收集菌体，使用蒸馏水清洗菌体两次后，至于冷冻干燥机中冷冻干燥过夜。称取适量干燥的菌粉置于2.0mL离心管中，加入500μL丙酮，55℃水浴15min；4℃，12000rpm离心5min收集上清液；重复丙酮萃取步骤一次，最终获得含有类胡萝卜素类化合物的上清液；于真空抽干机中进行干燥后，溶于300μL流动相A(甲醇/异丙醇为8：2体积比)中；过0.2μm滤膜，使用安捷伦1260液相色谱仪对类胡萝卜素类化合物进行检测。HPLC检测条件为：色谱柱为Phenomenex Gemini-NX C18 column(5μ,150×3.0mm)；流动相A甲醇/异丙醇(8:2体积比)，流动相B纯水；0-10min流动相A由85％线性升至100％，10-12min保持100％流动相A，12-12.1min流动相A降至85％，12.1-18min保持85％流动相A；流速为0.6mL/min；进样量5μL；检测波长475nm；柱温35℃。

HPLC检测图谱如图3所示。经分析，大肠杆菌中玉米黄质的产量及占可检测化合物的比例如表1所示。结果表明，含有雨生红球藻来源的HpCrtR-b2基因的大肠杆菌中玉米黄质的含量百分比显著高于已报道的HpCrtR-b1基因，可达84.6％；产量显著高于细菌来源的CrtZ基因(pACCAR25Δcrtx质粒含有CrtZ基因，可以合成玉米黄质，产量仅为39.3±1.5mg/g干重)，高达59.1mg/g干重。

表1.大肠杆菌中玉米黄质含量的测定

基因	玉米黄质含量(mg/g干重)	玉米黄质百分含量(％)
			HpCrtR-b1	50.1±1.5	73.1±1.8
HpCrtR-b2	59.1±5.4	84.6±2.0

实施例4

利用HpCrtR-b2基因合成虾青素

本实施例所用的大肠杆菌菌株为BL21(DE3)，用于表达产β-胡萝卜素的pACCAR16Δcrtx质粒和本实施例构建的pET-HpCrtR-b2-BKT1质粒。所用大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自深圳康体生命科技有限公司；所用质粒pACCAR16Δcrtx由上海交通大学生命科学技术学院食品与环境微生物技术实验室提供；所用质粒pET-32a购自淼灵质粒平台(武汉淼灵生物科技有限公司)；所用虾青素标准品购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1)pET-HpCrtR-b2-BKT1质粒的构建

将实施例1获得的HpCrtR-b2基因和雨生红球藻BKT1基因(SEQ ID NO.5)，分别连接入pET-32a如图1所示的BamHI/EcoRI和EcoRI/NotI位点，构建pET-HpCrtR-b2-BKT1质粒。

2)本底表达β-胡萝卜素的大肠杆菌感受态细胞的制备

本实施例中使用到的本底表达β-胡萝卜素的大肠杆菌感受态的制备方法同实施例3。

3)产虾青素的大肠杆菌的制备及产物检测

将构建好的pET-HpCrtR-b2-BKT1质粒转化入本底表达β-胡萝卜素的大肠杆菌中，培养后收集菌体，用适量丙酮进行类胡萝卜素的萃取，HPLC分析其是否含有虾青素。本实施例中大肠杆菌制备及产物检测的方法同实施例3。

HPLC检测图谱如图4所示。经与虾青素标准品所产生的峰图进行比对，发现在含有pET-HpCrtR-b2-BKT1的大肠杆菌中也检测到虾青素。结果表明，含有雨生红球藻来源的HpCrtR-b2基因结合BKT1基因，能够成功的将β-胡萝卜素转化为虾青素。

综上所述，本发明提供了一种β-胡萝卜素羟化酶及其基因与应用，所述HpCrtR-b2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长1177个碱基，可由雨生红球藻的总RNA中通过RT-PCR克隆获得；其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包含297个氨基酸，分子量为32.7kDa。本发明通过大肠杆菌原核表达***，验证其功能，发现HpCrtR-b2蛋白可高效的将β-胡萝卜素转化为具有更高抗氧化性能的玉米黄质；并在β-胡萝卜素氧化酶/酮化酶的协同作用下，将β-胡萝卜素转化为类胡萝卜素中最高抗氧化性能的虾青素。本发明的HpCrtR-b2基因参与到类胡萝卜素的合成代谢中，显著提高本底表达β-胡萝卜素的大肠杆菌中玉米黄质的生物合成效率并能参与到虾青素的合成中，在类胡萝卜素类化合物生物合成行业中具有广阔的应用前景。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110> 申请人

<120> 案件名称

<160> 5

<210> 1

<211> 1177

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

atctccggcc gcactcatca cagcgctcct tgtctgaggc agaatggctt tgtcgaagat 60

gcagccaatg ggggtgcaag gacggcgcat cgcattgcct cgtgacatct caaggcctca 120

gatgccctct caaaggcagc cattggccca ggtgctacgc gtagcagccc cagacacaga 180

ggcggtggag tcctcacggg tgcagccgtc tgtcggtgca ggcaatcagc aaactgcaga 240

cgacgccctc caacagctcg accggtccat cgctctgcgc cgcgctcaac gcaaaaggga 300

gcagctgacc taccaggctg cagccatagc agcgtccgtg ggcatatcaa gccttgccat 360

ccttgccacc tacacacggt tttcaatgca catcacatca gatggcgaga tgccttggag 420

cgacctcttg ggcaccctct cactggtggc aggtggcgcg tttggcatgg agatgtatgc 480

gcgttatgca cacaaggccc tatggcatga gtcccccctg ggttggctgc tgcacaagag 540

ccaccacact ccccgcactg gaccctttga agccaatgac ttattcgcca tcatcaatgg 600

cctgccagcc atgctgctgt gctattatgg gttctgggag cctggcatgg tcggcgcctc 660

atgctttggt gctgggctgg gcatcaccct gtacgggatg gcgtacatgt tcatccatga 720

cggcctagtc caccggcgct ttcccaccgg gcccatctcg gacctgccct acatgaagcg 780

cctgacagtg gcccaccaga tccaccacag cggcaagtat gatggcgcgc cctggggcat 840

gttcctgggg cctcaggagc tggaggcaat cccaggtgcc acagaggagc tggaccgctt 900

ggtggcagac ctggactggt caaagcgcag ggtgtgaggc actgccaagt gagagccagc 960

tctacactgg ttcatggctg agcaagttgg gatcgctgcg gggatgtggc agctggtggc 1020

agctgcggcg tagcagctgt ggcgcaggcg tctgtggagt ggtgtttccc ctcgtgtgga 1080

cacttgtggg cggagcgcca tgcagctggg cagggtacag cagccgtgca gggtgagtgc 1140

ccttggcata gacaccgagg tgtgggccgc tgtttag 1177

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

Met Ala Leu Ser Lys Met Gln Pro Met Gly Val Gln Gly Arg Arg Ile

1 5 10 15

Ala Leu Pro Arg Asp Ile Ser Arg Pro Gln Met Pro Ser Gln Arg Gln

20 25 30

Pro Leu Ala Gln Val Leu Arg Val Ala Ala Pro Asp Thr Glu Ala Val

35 40 45

Glu Ser Ser Arg Val Gln Pro Ser Val Gly Ala Gly Asn Gln Gln Thr

50 55 60

Ala Asp Asp Ala Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ser Ile Ala Leu Arg Arg

65 70 75 80

Ala Gln Arg Lys Arg Glu Gln Leu Thr Tyr Gln Ala Ala Ala Ile Ala

85 90 95

Ala Ser Val Gly Ile Ser Ser Leu Ala Ile Leu Ala Thr Tyr Thr Arg

100 105 110

Phe Ser Met His Ile Thr Ser Asp Gly Glu Met Pro Trp Ser Asp Leu

115 120 125

Leu Gly Thr Leu Ser Leu Val Ala Gly Gly Ala Phe Gly Met Glu Met

130 135 140

Tyr Ala Arg Tyr Ala His Lys Ala Leu Trp His Glu Ser Pro Leu Gly

145 150 155

Trp Leu Leu His Lys Ser His His Thr Pro Arg Thr Gly Pro Phe Glu

160 165 170 175

Ala Asn Asp Leu Phe Ala Ile Ile Asn Gly Leu Pro Ala Met Leu Leu

180 185 190

Cys Tyr Tyr Gly Phe Trp Glu Pro Gly Met Val Gly Ala Ser Cys Phe

195 200 205

Gly Ala Gly Leu Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Met Ala Tyr Met Phe Ile

210 215 220

His Asp Gly Leu Val His Arg Arg Phe Pro Thr Gly Pro Ile Ser Asp

225 230 235 240

Leu Pro Tyr Met Lys Arg Leu Thr Val Ala His Gln Ile His His Ser

245 250 255

Gly Lys Tyr Asp Gly Ala Pro Trp Gly Met Phe Leu Gly Pro Gln Glu

260 265 270

Leu Glu Ala Ile Pro Gly Ala Thr Glu Glu Leu Asp Arg Leu Val Ala

275 280 285

Asp Leu Asp Trp Ser Lys Arg Arg Val

290 295

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

atctccggcc gcactcatca c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

ctaaacagcg gcccacacct c 21

<210> 5

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 5

Met Gln Leu Ala Ala Thr Val Met Leu Glu Gln Leu Thr Gly Ser Ala

1 5 10 15

Glu Ala Leu Lys Glu Lys Glu Lys Glu Val Ala Gly Ser Ser Asp Val

20 25 30

Leu Arg Thr Trp Ala Thr Gln Tyr Ser Leu Pro Ser Glu Glu Ser Asp

35 40 45

Ala Ala Arg Pro Gly Leu Lys Asn Ala Tyr Lys Pro Pro Pro Ser Asp

50 55 60

Thr Lys Gly Ile Thr Met Ala Leu Ala Val Ile Gly Ser Trp Ala Ala

65 70 75 80

Val Phe Leu His Ala Ile Phe Gln Ile Lys Leu Pro Thr Ser Leu Asp

85 90 95

Gln Leu His Trp Leu Pro Val Ser Asp Ala Thr Ala Gln Leu Val Gly

100 105 110

Gly Ser Ser Ser Leu Met His Ile Val Val Val Phe Phe Val Leu Glu

115 120 125

Phe Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Ile Thr Thr His Asp Ala Met His Gly

130 135 140

Thr Ile Ala Met Arg Asn Arg Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gly Arg Val

145 150 160

Cys Ile Ser Leu Tyr Ala Trp Phe Asp Tyr Asn Met Leu His Arg Lys

165 170 175 180

His Trp Glu His His Asn His Thr Gly Glu Val Gly Lys Asp Pro Asp

185 190 195

Phe His Arg Gly Asn Pro Gly Ile Val Pro Trp Phe Ala Ser Phe Met

200 205 210

Ser Ser Tyr Met Ser Met Trp Gln Phe Ala Arg Leu Ala Trp Trp Thr

230 235 240 245

Val Val Met Gln Leu Leu Gly Ala Pro Met Ala Asn Leu Leu Val Phe

250 265 270

Met Ala Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Phe Arg Leu Phe Tyr Phe Gly

275 280 285

Thr Tyr Met Pro His Lys Pro Glu Pro Ser Ala Ala Ser Gly Ser Pro

290 295 300

Pro Val Val Met Asn Trp Trp Lys Ser Arg Thr Ser Gln Ala Ser Asp

305 310 315

Leu Val Ser Phe Leu Thr Cys Tyr His Phe Asp Leu His Trp Glu His

320 325 330 335

His Arg Trp Pro Phe Ala Pro Trp Trp Glu Leu Pro Asn Cys Arg Arg

340 345 350

Leu Ser Gly Arg Gly Leu Val Pro Ala

355 360

Claims

1.一种β-胡萝卜素羟化酶基因，其特征在于，所述β-胡萝卜素羟化酶基因为SEQ IDNO：1的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的β-胡萝卜素羟化酶基因，其特征在于，所述β-胡萝卜素羟化酶基因从雨生红球藻中分离得到。

3.一种重组表达载体，其包括权利要求1-2任一所述的β-胡萝卜素羟化酶基因。

4.一种宿主细胞，其包括权利要求3所述的重组表达载体。

5.一种β-胡萝卜素羟化酶，其特征在于，所述β-胡萝卜素羟化酶为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

6.一种β-胡萝卜素羟化酶的应用，其特征在于，将权利要求5所述的β-胡萝卜素羟化酶用于将β-胡萝卜素转化为玉米黄质。

7.一种β-胡萝卜素羟化酶的应用，其特征在于，将权利要求5所述的β-胡萝卜素羟化酶以及β-胡萝卜素酮化酶，用于将β-胡萝卜素转化为虾青素。