CN112608936A - 调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用。本发明通过对酵母中GAL调控***进行改造，从而达到不需半乳糖诱导只通过调节发酵液中的葡萄糖浓度即可控制GAL调控***中GAL启动子所控制的基因表达的目的。本发明只采用葡萄糖激活型启动子HXT1替换GAL80启动子即可达到上述目的。本发明还将该方法用于酿酒酵母β‑胡萝卜素生物合成的调控，验证了所述调控***的有效性。

Description

调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地，本发明涉及酵母基因表达的调控，更具体地，本发明涉 及改良酵母中Gal调控***的方法。
背景技术
酵母菌一直是人们进行遗传分析和基因工程研究的理想材料，对许多酵母基因的表达调节途径人 们已有了较深入的了解。酿酒酵母作为一种公认安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)， 人类对其生理生化、遗传背景都有较为清楚的研究，并且遗传操作相对简单，因此在近些年的合成生 物学和代谢工程研究中有着举足轻重的作用。酿酒酵母除了用以发酵乙醇，制作啤酒，它已经成为高 附加值天然产物的合成方面所常用的宿主。
在大多数研究中，外源基因在酿酒酵母中的表达都采用组成型强启动子，如常用的pTEF1启动子， pHXT7启动子，pTDH3启动子,pPGK1启动子等(Partow,S.,et al.(2010)."Characterization of different promoters for designing a new expression vectorin Saccharomyces cerevisiae." Yeast 27(11):955-964)。采用组成型启动子的缺点在于，其表达强度不可调控，过多的基因组成 型强表达，或者过早表达，会造成宿主的代谢负担，影响细胞的生长，最终影响目标产物的总产量。 因此，采用诱导型启动子进行外源基因的表达是使细胞产能最大化的常用方式。
在酿酒酵母中最为常用的诱导表达***为酿酒酵母半乳糖诱导***(GAL诱导***)。该***中 pGAL1，pGAL7，pGAL10，pGAL2启动子是严谨的诱导型启动子，这些诱导型启动子的转录激活受到GAL4 转录因子的正向激活调控，GAL4转录因子的活性受到GAL80负调控蛋白的抑制，而GAL80蛋白的活 性受到培养基中半乳糖的调控，当细胞生长环境中存在半乳糖时，半乳糖能与GAL80蛋白竞争性结合， 释放GAL4转录因子，GAL4转录因子进一步激活***中pGAL1，pGAL7，pGAL10和pGAL2启动子的转 录(Pilauri,V.,et al.(2005)."Gal80dimerization and the yeast GAL gene switch."Genetics 169(4):1903-1914)。因此，在GAL调控***中，半乳糖是GAL启动子的激活剂。但是，由于半乳 糖本身能被细胞利用，导致诱导能力随着半乳糖被利用后会降低，并且半乳糖价格昂贵，成本过高， 而且需要添加抗生素，因此半乳糖诱导的方式并不合适工业应用。
因此，在合成生物学领域，在酿酒酵母中构建遗传稳定性好、简单、高灵敏度、低成本、可控的 外源基因表达方法，用于调控酿酒酵母生产高附加值产物，是该领域研究人员一直努力的方向。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中不能简单、高效、低成本、可控地实现在不添加昂贵诱导剂的 条件下即可实现酵母中外源基因表达调控的技术难题。
本发明通过遗传修饰酵母宿主菌种和/或改变培养条件而调控外源基因在酵母中的表达。具体而 言，本发明提供了便捷、灵敏度高、可调控范围广、低成本的酵母基因表达调控***和调控方法，可 用于在酵母中进行高附加值产品的发酵合成。通过对酵母中GAL调控***进行改造，使其不再需要通 过添加半乳糖即可达到严谨调控外源基因表达的目的。另外，为了验证这样的调控***和调控方法的 可行性，将这样调控***和调控方法应用于β-胡萝卜素酿酒酵母基因工程菌的构建，实现了高产的 目的。
第一方面，本发明提供了一种用于酵母外源基因表达的GAL调控***，所述调控***中用HXT1 启动子替换GAL80启动子。
在一些实施方案中，所述GAL调控***还包括GAL启动子。优选地，所述外源基因与所述GAL启 动子可操作地连接，可控制外源基因的表达。
所述GAL启动子为异源GAL启动子或者同源GAL启动子。
在一些实施方案中，所述GAL启动子为一个或多个选自GAL1，GAL7，GAL2或GAL10的启动子。 所述GAL1，GAL7，GAL2或GAL10启动子的活性依赖于与转录因子GAL4蛋白的结合而激活，而GAL80 蛋白可以结合到GAL4蛋白上而阻止GAL4蛋白与GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10启动子的结合。因此， 将待表达的外源基因与一个或多个选自GAL1，GAL7，GAL2或GAL10的启动子可操作地连接，可以实 现待表达基因在GAL调控***下的表达。
在一些实施方案中，所述GAL调控***中原有的GAL10基因、GAL1基因和GAL7基因被沉默，优 选地，所述GAL10基因、GAL1基因和GAL7基因被敲除。
在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母。
在一些实施方案中，所述HXT1启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或通过一个或者几个 碱基的增加、删减、取代，但仍然与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述外源基因是与萜类物质的合成有关的基因，所述萜类物质包括但不限于 单萜，倍半萜，二萜等物质的合成，例如β-胡萝卜素，叶黄素，斑蝥黄素，虾青素，番茄红素，青蒿 二烯，青蒿素，紫杉二烯，紫杉醇，达玛烯二醇，α-檀香萜，丹参酮，角鲨烯，人参皂苷。
第二方面，本发明提供了一种酵母细胞，其包含用于外源基因表达的GAL调控***，在所述调控 ***中用HXT1启动子替换GAL80启动子。
在一些实施方案中，所述GAL调控***还包括GAL启动子，使所述外源基因在GAL启动子的控制 下进行表达。优选地，所述外源基因与所述GAL启动子可操作地连接，控制外源基因的表达。
所述GAL启动子为异源GAL启动子或者同源GAL启动子。
在一些实施方案中，所述GAL启动子为一个或多个选自GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10的启动子。 所述GAL1，GAL7，GAL2或GAL10启动子的活性依赖于与转录因子GAL4蛋白的结合而激活，而GAL80 蛋白可以结合到GAL4蛋白上而阻止GAL4蛋白与GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10启动子的结合。因此， 将待表达的外源基因与一个或多个选自GAL1，GAL7，GAL2或GAL10的启动子可操作地连接，可以实 现待表达基因在GAL调控***下的表达。
在一些实施方案中，酵母细胞中原有的GAL10基因、GAL1基因和GAL7基因被沉默，优选地，所 述GAL10基因、GAL1基因和GAL7基因被敲除。GAL10(差向异构酶)，GAL1(激酶)和GAL7(转移 酶)是用于将半乳糖转化为葡萄糖的三种相关酶。
在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母。
在一些实施方案中，所述HXT1启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或通过一个或者几个 碱基的增加、删减、取代，但仍然与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
优选地，所述酵母为YLK-pHXT1-BT2菌株，该菌株分类命名为HEC-YLK9I-07，于2020年11月 18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2020754。
在一些实施方案中，所述外源基因是与萜类物质的合成有关的基因，所述萜类物质包括但不限于 单萜，倍半萜，二萜等物质的合成，例如β-胡萝卜素，叶黄素，斑蝥黄素，虾青素，番茄红素，青蒿 二烯，青蒿素，紫杉二烯，紫杉醇，达玛烯二醇，α-檀香萜，丹参酮，角鲨烯，人参皂苷。
优选地，所述外源基因为与β-胡萝卜素的合成有关的基因。
在一些实施方案中，将β-胡萝卜素合成途径相关基因置于GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10启动子 (统称GAL启动子)下进行表达，可实现葡萄糖对β-胡萝卜素合成途径基因表达的控制，从而实现 通过调控培养体系中葡萄糖浓度来控制合成途径的开关，从而达到控制代谢产物合成的目的。
在一些实施例中，tHMG1基因与pGAL1启动子可操作地连接，BtcrtE基因与GAL10启动子可操作 地连接，BtcrtYB基因与GAL1启动子可操作地连接，以及BtcrtI基因与GAL10启动子可操作地连接； 并且将GAL1基因，GAL7基因，和GAL10基因沉默。
类似地，可以利用所述酿酒酵母工程菌发酵获得所需的其他产物，只需要将与其他目标产物生物 合成相关的基因置于选自GAL1，GAL7，GAL2和GAL10的一种或者多种启动子的控制下进行表达。优 选地，将将GAL1基因，GAL7基因，和GAL10基因沉默。也可以实现，将GAL调控***与培养体系中 的葡萄糖浓度有机结合起来，无需添加诱导物即可完美实现外源基因的高效表达，从而获得所需的发 酵产物。
第三方面，本发明提供了用于调控酵母外源基因表达的方法，所述方法包括在GAL调控***中用 HXT1启动子替换GAL80启动子。
在一些实施方案中，所述方法还包括将外源基因置于GAL启动子的控制下的步骤。优选地，将外 源基因与GAL启动子可操作地连接。
所述GAL启动子为异源GAL启动子或者同源GAL启动子。
在一些实施方案中，所述GAL启动子为一个或多个选自GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10的启动子。 所述GAL1，GAL7，GAL2或GAL10启动子的活性依赖于与转录因子GAL4蛋白的结合而激活，而GAL80 蛋白可以结合到GAL4蛋白上而阻止GAL4蛋白与GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10启动子的结合。因此， 将待表达的外源基因与一个或多个选自GAL1，GAL7，GAL2或GAL10的启动子可操作地连接，可以实 现待表达基因在GAL调控***下的表达。
在一些实施方案中，所述方法还包括将酵母细胞中原有的GAL10基因、GAL1基因和GAL7基因沉 默的步骤，优选地，所述沉默是通过基因敲除实现的。
在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母。
在一些实施方案中，所述HXT1启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或通过一个或者几个 碱基的增加、删减、取代，但仍然与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
优选地，所述酵母为YLK-pHXT1-BT2菌株，该菌株分类命名为HEC-YLK9I-07，于2020年11月 18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2020754。
在一些实施方案中，所述外源基因是与萜类物质的合成有关的基因，所述萜类物质包括但不限于 单萜，倍半萜，二萜等物质的合成，例如β-胡萝卜素，叶黄素，斑蝥黄素，虾青素，番茄红素，青蒿 二烯，青蒿素，紫杉二烯，紫杉醇，达玛烯二醇，α-檀香萜，丹参酮，角鲨烯，人参皂苷。
优选地，所述外源基因为与β-胡萝卜素的合成有关的基因。将β-胡萝卜素合成途径相关基因置 于GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10启动子(统称GAL启动子)下进行表达，可实现葡萄糖对β-胡萝卜 素合成途径基因表达的控制，从而实现通过调控培养体系中葡萄糖浓度来控制合成途径的开关，从而 达到控制代谢产物合成的目的。
在一些实施例中，tHMG1基因与pGAL1启动子可操作地连接，BtcrtE基因与GAL10启动子可操作 地连接，BtcrtYB基因与GAL1启动子可操作地连接，以及BtcrtI基因与GAL10启动子可操作地连接； 并且将GAL1基因，GAL7基因，和GAL10基因沉默。
在一些实施方案中，还包括调节培养体系中的葡萄糖浓度的步骤。优选地，所述培养体系为发酵 液。将GAL调控***与培养体系中的葡萄糖浓度有机结合起来，无需添加诱导物即可完美实现外源基 因的高效表达。可以根据需要调节培养体系中葡萄糖的浓度即可将菌体生长和产物积累两个过程完美 分离，并且实现有机衔接。
在一些实施方案中，培养***中前期基础葡萄糖浓度较高，产物积累时间随之后移，无需额外添 加诱导剂即可达到将菌体生长和产物表达两个阶段有机的分隔开。基础葡萄糖浓度越高，发酵初期菌 体生长和产物积累相对滞后，但目标产物产量明显优于基础葡萄糖较低水平的情况。
在一些实施方案中，培养***中葡萄糖初始浓度在1％-15％的范围内，优选地，在2％-10％的范围 内，更优选地，为10％。
根据本发明利用所述酿酒酵母发酵β-胡萝卜素的实施方案中，随着初始葡萄糖浓度的增加(分别 为2％，4％，6％，8％和10％)，菌丝体生物量呈线性增长趋势，而色素产量与单位OD色素产量在4％-8％ 葡萄糖浓度范围内有一定平台期，产量提升不显著，但在10％葡萄糖浓度下其色素产量显著提升，显 示初始糖浓度对最终类胡萝卜素的积累是有较大影响的。
类似地，可以利用第二方面的酿酒酵母工程菌发酵获得所需的产物，只需要将与产物生物合成相 关的基因置于选自GAL1，GAL7，GAL2和GAL10的一种或者多种启动子的控制下进行表达。优选地， 将GAL1基因，GAL7基因，和GAL10基因沉默。也可以实现，将GAL调控***与培养体系中的葡萄糖 浓度有机结合起来，无需添加诱导物即可完美实现外源基因的高效表达，从而获得所需的发酵产物。
对培养条件无特别限制，可以为分批培养、连续培养、分批补料培养等，优选分批补料培养。
第四方面，本发明提供了第一方面的GAL调控***，和第二方面的酵母细胞在调控酵母外源基因 表达中的用途。
第五方面，本发明提供了第一方面的GAL调控***，和第二方面的酵母细胞在生产萜类物质中的 用途，所述萜类物质包括但不限于单萜，倍半萜，二萜等物质的合成，例如β-胡萝卜素，叶黄素，斑 蝥黄素，虾青素，番茄红素，青蒿二烯，青蒿素，紫杉二烯，紫杉醇，达玛烯二醇，α-檀香萜，丹参 酮，角鲨烯，人参皂苷。
采用HXT1启动子(葡萄糖激活型启动子)替换GAL80基因启动子，将GAL调控***与培养体系 中的葡萄糖浓度有机的结合起来，无需添加诱导物即可完美实现外源基因的高效表达，只需控制发酵 体系中葡萄糖的浓度即可将菌体生长和产物积累两个过程完美的分离，并且有机的衔接起来。
采用本发明的基因表达调控方式，并将其应用于β-胡萝卜素合成菌株的构建。采用通过此方法 改造后的菌株，将β-胡萝卜素合成途径相关基因置于GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10启动子(统称 GAL启动子)下进行表达，可实现葡萄糖对β-胡萝卜素合成途径基因表达的控制，从而实现通过调 控发酵体系中葡萄糖浓度来控制合成途径的开关，从而达到控制代谢产物合成的目的。
根据本发明利用所述酿酒酵母发酵β-胡萝卜素的实施方案中，随着初始葡萄糖浓度的增加(分别 为2％，4％，6％，8％和10％)，菌丝体生物量呈线性增长趋势，而色素产量与单位OD色素产量在4％-8％ 葡萄糖浓度范围内有一定平台期，产量提升不显著，但在10％葡萄糖浓度下其色素产量显著提升，显 示初始糖浓度对最终类胡萝卜素的积累是有较大影响的。
根据本发明利用所述酿酒酵母发酵β-胡萝卜素的实施方案中，葡萄糖抑制调控菌株的β-胡萝卜素 产量最高，铜离子诱导菌株β-胡萝卜素产量次之，半乳糖诱导菌株β-胡萝卜素产量最低。
第六方面，本发明提供了一种利用酵母合成β-胡萝卜素的方法，所述方法包括利用第二方面的 酵母细胞发酵生产β-胡萝卜素的步骤。
所述酵母细胞的GAL调控***中用HXT1启动子替换GAL80启动子。
在一些实施方案中，将β-胡萝卜素合成途径相关基因置于GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10启动子 (统称GAL启动子)下进行表达，可实现葡萄糖对β-胡萝卜素合成途径基因表达的控制，从而实现 通过调控培养体系中葡萄糖浓度来控制合成途径的开关，从而达到控制代谢产物合成的目的。
在一些实施例中，tHMG1基因与pGAL1启动子可操作地连接，BtcrtE基因与GAL10启动子可操作 地连接，BtcrtYB基因与GAL1启动子可操作地连接，以及BtcrtI基因与GAL10启动子可操作地连接； 并且将GAL1基因，GAL7基因，和GAL10基因沉默。
优选地，所述酵母为YLK-pHXT1-BT2菌株，该菌株分类命名为HEC-YLK9I-07，于2020年11月 18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2020754。
在一些实施例中，经液体发酵进行。所述液体培养基包含葡萄糖20-120g/L，硫酸铵5-9g/L， 酵母粉1-4g/L，蛋白胨1-4g/L，玉米浆10-40g/L，磷酸二氢钾3-7g/L，硫酸镁1-4g/L，硫酸 锌0.5-3g/L，维生素B1 150-2500mg/L，维生素B3 150-250mg/L，维生素B6 150-250mg。
在一些实施例中，在发酵过程中将培养基的pH控制在5-6之间。在一些实施方案中，在发酵过 程中在不超过在20-30小时的发酵时间内补充葡萄糖使其浓度维持在不低于2g/l的水平。发明人在 研究过程中发现，葡萄糖浓度低于2g/L时会诱导外源基因表达，因此前期葡萄糖浓度需维持在较高 水平。在一些实施方案中，在发酵过程中将溶氧控制在30％，并且溶氧与搅拌转速相关联。在一些实 施方案中，在发酵20-30小时后将乙醇更换为碳源。
生物材料保藏信息：
YLK-pHXT1-BT2菌株，该菌株分类命名为酿酒酵母HEC-YLK9I-07(Saccharomycescerevisiae HEC-YLK9I-07)，于2020年11月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020754。
附图说明
图1显示了本发明的葡萄糖诱导GAL调控***的原理。
图2显示了根据本发明的实施例制备的Donor DNA片段，用于替换酿酒酵母中的GAL80基因原本 的启动子。
具体实施方式
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对 于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护 范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本申请中，启动子“GAL1”，“GAL7”，“GAL2”，“GAL80”，“HXT1”以及“GAL10”分别与“pGAL1”，“pGAL7”，“pGAL2”，“pGAL80”，“pHXT1”以及“pGAL10”互换使用。
GAL10(差向异构酶)，GAL1(激酶)和GAL7(转移酶)是用于将半乳糖转化为葡萄糖的三种相 关酶，GAL10，GAL1和GAL7表达区域的基因组DNA簇集在酿酒酵母染色体上。GAL10，GAL1和GAL7 基因是从各自的启动子分别转录的，GAL基因的转录是被紧密调控的。
本发明的要点是利用葡萄糖激活型启动子HXT1替换酵母基因组GAL调控***中的GAL80启动子， 将酵母原本的半乳糖诱导模式改变为葡萄糖控制表达的模式。参见图1所示的根据本发明的实施方案 的葡萄糖诱导示意图，可以看出启动子GAL1、GAL2、GAL7、GAL10的活性依赖于转录因子GAL4p 蛋白的结合而激活，GAL80p抑制蛋白可以结合到GAL4p蛋白而阻止GAL4p与上述启动子的结合。
经过本发明基因工程改造后的酵母，当在生长环境中存在高浓度葡萄糖时，HXT1启动子处于激 活状态，GAL80阻遏蛋白表达，与GAL4蛋白结合处于抑制状态，因此GAL1、GAL2、GAL7、GAL10 控制的基因不表达；当酵母生长环境中葡萄糖消耗殆尽时，HXT1启动子活性被抑制，GAL80阻遏蛋白 不表达，使得GAL4蛋白处于游离状态，与下游GAL启动子的UAS结合域结合，激活下游基因的表达， 因此GAL1、GAL2、GAL7、GAL10控制的基因也被诱导表达。因此，本发明实现了在酿酒酵母的培 养过程中通过生长环境的葡萄糖浓度控制目标基因表达的目的。
HXT1是来源于酵母的葡萄糖激活型启动子，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或通过一个 或者几个碱基的增加、删减、取代，但仍然与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸 序列。
可以利用已知的能够实现将酵母基因组GAL调控***中的GAL80启动子替换为葡萄糖激活型启动 子HXT1的方式进行。优选地，利用基因编辑的方式进行。
根据本发明的实施例，所采用的出发菌株为保藏号为CCTCC NO：M2018062的HEC-YLK菌株，保 藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年1月29日(参见中国发明专利申请公开 CN110982721A)。
需要说明的是，虽然本发明的实施例中通过构建包含GAL调控***以及β-胡萝卜素合成相关基因 的酿酒酵母验证了包含GAL调控***的酿酒酵母工程菌株在合成目标产物中对于基因表达的精密调 控，并且相对于现有技术提高了产物的产量，本领域技术人员知晓，本发明的GAL调控***，以及包 含GAL调控***的酵母工程菌株可以广泛用于其他目标产物的合成，以及外源基因的调控。例如，酿 酒酵母的甲羟戊酸途径为异源萜类化合物的合成提供了直接前体。萜类物质的合成，包括但不限于单 萜，倍半萜，二萜等物质的合成，例如β-胡萝卜素，叶黄素，斑蝥黄素，虾青素，番茄红素，青蒿二 烯，青蒿素，紫杉二烯，紫杉醇，达玛烯二醇，α-檀香萜，丹参酮，角鲨烯，人参皂苷。
本发明改变了传统采用半乳糖诱导GAL启动子的模式，实现了由葡萄糖调控GAL启动子所控制的 基因表达。本发明的GAL调控***以及包含GAL调控***的酵母，尤其是，酿酒酵母可以严谨高效地 实现对外源基因表达的调控，高浓度葡萄糖条件下，外源基因基本不表达，本底表达水平低；低浓度 葡萄糖或无葡萄糖条件下，外源基因迅速表达。而且，本发明的GAL调控***以及包含GAL调控*** 的酵母可用于代谢工程中外源基因的表达，通过控制发酵体系中葡萄糖浓度控制基因的表达时间，实 现菌体生长和产物积累阶段的分离，无需添加诱导物即可完美实现外源基因的高效表达，只需控制发 酵体系中葡萄糖的浓度即可将菌体生长和产物积累两个过程完美的分离与有机的衔接起来。此外，因 为以葡萄糖而非半乳糖作为诱导剂，大大降低了生产成本，为利用酵母工业化发酵生产目标产物提供 了可能性。
实施例1基因编辑载体的构建
本发明中所有的基因整合及基因组上DNA片段替换都采用基因编辑的方法，为此，本发明预先构 建一系列的基因编辑载体用于后续的实施例，参见下表1。构建的基因编辑载体均以pCAS9W03为出 发载体(专利申请号：201910754882.3)，采用融合PCR的方式将原载体上的N20序列进行替换，以 获得不同的基因编辑靶向载体，编辑位点的设计采用sgRNA在线设计工具，网站链接为： http://crispr.dbcls.jp/。其中构建基因编辑载体所需要的引物序列如下表所示：其中下划线部分 为N20替换区域，即为在基因组上相应位点的靶向区域。
表1：
Figure BDA0002795352990000081
Figure BDA0002795352990000091
载体的构建过程如下：
先采用上述引物扩增以下表2中的4个片段。
表2：
Figure BDA0002795352990000092
将上述得到的4个片段分别用NheI+NotI进行酶切，并连接到同样酶切的pCAS9W03载体骨架， 转化到大肠杆菌DH5α，涂布于含有100mg/ml的氨苄霉素抗性平板，筛选阳性克隆，所构建成功的 质粒分别命名为pCAS9-HO，pCAS9-GAL7，pCAS9-GAL80和pCAS9-GAL4。
实施例2 Donor DNA片段的制备
1)PHXT1 Donor DNA的制备
以酿酒酵母HEC-YLK(保藏号：CCTCC NO：M2018062)基因组为模板，以PHXT1-F (TTTCTTCATTTACCGGCGCACTCTCGCCCGAACGACCTCAA AATGTCTGCTTGCAGGTCTCATCTGGAATATAATTCC(SEQ ID NO:12))和PHXT1-R(GGAGCTGCATTAGGCACGGTTGAGACCGAAGATCTCTTGTTGTAGTCCATGATTTTACGTATATCAA CTAGTTGACGATTATG(SEQ ID NO:13))序列为引物，采用Takara高保真酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase) 进行PCR扩增，采用GelExtractionKit试剂盒(OMEGA，America)按厂商说明纯化回收PCR产物，得 到PHXT1 Donor DNA，其核苷酸序列参见SEQ ID NO:27。
TTTCTTCATTTACCGGCGCACTCTCGCCCGAACGACCTCAAAATGTCTGCTTGCAGGTCTCATCTGGAATATAATTCCCCCC TCCTGAAGCAAATTTTTCCTTTGAGCCGGAATTTTTGATATTCCGAGTTCTTTTTTTCCATTCGCGGAGGTTATTCCATTCC TAAACGAGTGGCCACAATGAAACTTCAATTCATATCGACCGACTATTTTTCTCCGAACCAAAAAAATAGCAGGGCGAGAT TGGAGCTGCGGAAAAAAGAGGAAAAAATTTTTTCGTAGTTTTCTTGTGCAAATTAGGGTGTAAGGTTTCTAGGGCTTAT TGGTTCAAGCAGAAGAGACAACAATTGTAGGTCCTAAATTCAAGGCGGATGTAAGGAGTATTGGTTTCGAAAGTTTTTC CGAAGCGGCATGGCAGGGACTACTTGCGCATGCGCTCGGATTATCTTCATTTTTGCTTGCAAAAACGTAGAATCATGGTA AATTACATGAAGAATTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCTCTAAAGAGTGTTGACCAACTGAAAAAACCCTTC TTCAAGAGAGTTAAACTAAGACTAACCATCATAACTTCCAAGGAATTAATCGATATCTTGCACTCCTGATTTTTCTTCAAAG AGACAGCGCAAAGGATTATGACACTGTTGCATTGAGTCAAAAGTTTTTCCGAAGTGACCCAGTGCTCTTTTTTTTTTTCC GTGAAGGACTGACAAATATGCGCACAAGATCCAATACGTAATGGAAATTCGGAAAAACTAGGAAGAAATGCTGCAGGG CATTGCCGTGCCGATCTTTTGTCTTTCAGATATATGAGAAAAAGAATATTCATCAAGTGCTGATAGAAGAATACCACTCATA TGACGTGGGCAGAAGACAGCAAACGTAAACATGAGCTGCTGCGACATTTGATGGCTTTTATCCGACAAGCCAGGAAAC TCCACCATTATCTAATGTAGCAAAATATTTCTTAACACCCGAAGTTGCGTGTCCCCCTCACGTTTTTAATCATTTGAATTAGT ATATTGAAATTATATATAAAGGCAACAATGTCCCCATAATCAATTCCATCTGGGGTCTCATGTTCTTTCCCCACCTTAAAATC TATAAAGATATCATAATCGTCAACTAGTTGATATACGTAAAATCATGGACTACAACAAGAGATCTTCGGTCTCAACCGTGCC TAATGCAGCTCC(SEQ ID NO:27)
2)pCRT3 donor DNA的制备
以酿酒酵母HEC-YLK(保藏号：CCTCC NO：M2018062)基因组为模板，以PCTR3-F2(TTTCTTCAT TTACCGGCGCACTCTCGCCCGAACGACCTCA AAATGTCTGCGTATTCCAATGAGAATCGCTAG(SEQ ID NO:14))和 PCTR3-R2(GGAGCTGCATTAGGCACGGTTG AGACCGAAGATCTCTTGTTGTAGTCCATCTTTGTATAGCCCTTAAATG(SEQ ID NO:15))序列为引物，采用Takara高保真酶(PrimeSTARMax DNA Polymerase)进行PCR扩增，采 用GelExtractionKit试剂盒(OMEGA，America)按厂商说明书纯化回收PCR产物，得到pCRT3 donor DNA。 3)pCUP1 donor DNA的制备
以酿酒酵母HEC-YLK(保藏号：CCTCC NO：M2018062)基因组为模板，以046-CUP1p-F(AGGGGCGATTGGTTTGGGTGCGTGAGCGGCAAGAAGTTTCGTAAGCCGATCCCATTACCG(SEQ ID NO:16))和 047-CUP1p-R(AGAAGACAGTAGCTTCATCTTTCAGGAGGCTTGCTTCTCTGTCAGTTTGTTTTTCTTAATATCTATTTCG((SEQ ID NO:17)))序列为引物，采用Takara高保真酶(PrimeSTAR Max DNAPolymerase)进行PCR扩 增，采用GelExtractionKit试剂盒(OMEGA，America)按厂商说明书纯化回收PCR产物，得到pCUP1 donor DNA。
实施例3GAL调控***的编辑改造
1)酿酒酵母电转感受态制备及基因编辑
按照Gietz,R.D.等人的方法(Gietz,R.D.and R.H.Schiestl(2007)."High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method."Nature Protocols 2(1):31-34) 制备酿酒酵母感受态，并进行转化，在含有100μl酵母细胞的离心管中加入以下表3中的物质：
表3：
Figure BDA0002795352990000101
Figure BDA0002795352990000111
将上述混合体系放入到42℃保温40min进行热击。然后加入1ml YPD液体培养基，30℃摇床 复苏培养3h，复苏后取100μl转化液涂布在含有200μg/ml G418的YPD固体平板上，30℃进行 培养，3天后挑取平板上所长出的克隆，进行基因型验证，得到正确基因型的克隆子。将克隆子在YPD 液体培养基中传代培养2次，以丢失其中的CAS9基因编辑载体。
2)用pHXT1启动子替换pGAL80启动子
按实施例3.1酿酒酵母电转化和基因编辑方法，以酿酒酵母HEC-YLK(保藏号：CCTCC NO：M2018062) 为宿主，pCAS9-GAL80为基因编辑载体，PHXT1 Donor DNA为同源整合片段，获得pGAL80启动子被 pHXT1启动子替换的工程菌YLK-pHXT1。
3)铜离子诱导***改造
a.采用上述转化方法，以HEC-YLK(保藏号：CCTCC NO：M2018062)作为宿主，pCAS9-GAL80为 基因编辑载体，Donor DNA为pCRT3 donor DNA，得到pGAL80启动子被pCRT3启动子替换的基因工程 菌株YLK-Cu01。
b.采用上述转化方法，使用YLK-Cu01作为宿主，pCAS9-GAL4为基因编辑载体，Donor DNA为pCUP1 donor DNA，得到pGAL4启动子被pCUP1启动子替换的基因工程菌株YLK-Cu02。
实施例4产β-胡萝卜素菌株的构建
1)铜离子诱导型β-胡萝卜素菌株的构建
按照酿酒酵母的密码子对来源于三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)的β-胡萝卜素合成途径基 因BtcrtE(GGPP合酶，GenBank:：AFC92798.1)，BtcrtI(八氢番茄红素脱氢酶，GenBank::AAX20903.1) 和BtcrtYB(八氢番茄红素合酶/环化酶双功能酶，GenBank::Q67GH9.1)进行密码子优化并进行基因 合成。优化后的基因序列如下表4所示：
表4：
Figure BDA0002795352990000112
Figure BDA0002795352990000121
将BtcrtE基因EcoRI、BglII双酶切连接克隆到酿酒酵母表达载体pESC-URA上，转化大肠杆菌 DH5a，Amp抗性筛选克隆，得到pESC-URA-BtcrtE，以HEC-YLK酵母菌基因组为模板，tHMG1-BamHI (CCCGGATCCAAAAATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAG(SEQ ID NO:21))和tHMG1-SalI (CCCGTCGACTTAGGATTTAATGCAGGTGACG(SEQ ID NO:22))为引物，扩增出HMG1的催化区域tHMG1， BamHI+SalI酶切，凝胶电泳回收，连接到同样酶回收的pESC-URA-BtcrtE载体上，转化大肠杆菌DH5a， Amp抗性筛选克隆，得到pESC-URA-BtcrtE-tHMG1，由于PESC-URA上的启动子为pGAL1-PGAL10双向 启动子，BtcrtE和tHMG1基因分别处于pGAL10和PGAL1启动子的控制下表达。
为了将BtcrtE和tHMG1通过基因编辑的方式整合到HO位置处，设计携带HO切割位点上下游同 源臂的引物HO-donor-F(cttatgatggttttttggaattattattatcctaccatcaagcgtctgacccagctgaattggag cga(SEQ ID NO:23))和HO-donor-R(cgcggaaaaaagtaaacagctattgctactcaaatgaggtttgcagaagcgcagct ggatcttcgagcgtcccaaaacc(SEQ ID NO:24))从pESC-URA-BtcrtE-tHMG1上采用高保真酶扩增出 BtcrtE-tHMG1 donor DNA。
将BtcrtI基因EcoRI、BglII双酶切连接克隆到酿酒酵母表达载体pESC-URA上，转化大肠杆菌 DH5a，Amp抗性筛选克隆，得到pESC-URA-BtcrtI，BtcrtYB基因BamHI、HindIII双酶切，连接到同 样酶切的pESC-URA-BtcrtI载体上，转化大肠杆菌DH5a，Amp抗性筛选克隆，得到pESC-URA-BtcrtI-BtcrtYB。由于PESC-URA上的启动子为pGAL1-PGAL10双向启动子，BtcrtI和 BtcrtYB基因分别处于pGAL10和PGAL1启动子的控制下表达。
为了将BtcrtI和BtcrtYB表达盒通过基因编辑的方式替换基因组上GAL1-GAL7区域，设计携带 GAL1-GAL7切割位点上下游同源臂的引物GAL7-CAS9-F (tgtagataatgaatctgaccatctaaatttcttagtttttcagcagcttgttccgaagttaaatctctttcggttagagcggatc ttagc(SEQ ID NO:25))和GAL1-CAS9-R(gcattttctagctcagcatcagtgatcttagggtacttgaccttgtagaactcattggcaagggcttcttgaccaaacctctggcgaag(SEQ ID NO:26))从pESC-URA-BtcrtI-BtcrtYB上采 用高保真酶扩增出BtcrtI-BtcrtYB donor DNA。
采用实施例3.1中所述的酿酒酵母转化方法，使用YLK-Cu02作为宿主，pCAS9-HO为基因编辑载 体，BtcrtE-tHMG1 donor DNA，得到HO基因被BtcrtE-tHMG1表达盒替换的基因工程菌株YLK-Cu-BT1。
采用实施例3.1中所述的酿酒酵母转化方法，使用YLK-Cu-BT1作为宿主，pCAS9-GAL7为基因编 辑载体，BtcrtI-BtcrtYB donor DNA，得到GAL1-GAL7区域被BtcrtI-BtcrtYB表达盒替换的基因工 程菌株YLK-Cu-BT2。
2)半乳糖诱导型β-胡萝卜素菌株的构建
当不对GAL调控***中的GAL80和GAL4进行改造时，GAL调控***中的pGAL1、pGAL2、pGAL7、 pGAL10等启动子的转录活性需要受到半乳糖的诱导。为了构建一株半乳糖诱导型的Beta-胡萝卜素合 成菌株用于对照实验，采用实施例3.1中所述的酿酒酵母转化方法，以HEC-YLK作为宿主，pCAS9-HO 为基因编辑载体，BtcrtE-tHMG1 donor DNA，得到HO基因被BtcrtE-tHMG1表达盒替换的基因工程菌 株YLK-GAL-BT1。使用YLK-GAL-BT1作为宿主，pCAS9-GAL7为基因编辑载体，BtcrtI-BtcrtYB donor DNA，得到GAL1-GAL7区域被BtcrtI-BtcrtYB表达盒替换的基因工程菌株YLK-GAL-BT2。工程菌株 YLK-GAL-BT2在添加了2％半乳糖的YPD平板上生长3天能明显看到菌落变红，而在没有半乳糖的YPD 平板上培养3天，菌落为白色，说明所构建的菌株确实需要半乳糖的诱导。
3)葡萄糖抑制型β-胡萝卜素菌株的构建
以本专利实施例3.2所得的工程菌YLK-pHXT1为出发宿主，采用实施例3.1中所述的酿酒酵母转 化方法，以pCAS9-HO为基因编辑载体，BtcrtE-tHMG1 donor DNA，得到HO基因被BtcrtE-tHMG1表 达盒替换的基因工程菌株YLK-pHXT1-BT1。接着，以YLK-pHXT1-BT1为宿主，pCAS9-GAL7为基因编辑 载体，BtcrtI-BtcrtYB donor DNA，得到GAL1-GAL7区域被BtcrtI-BtcrtYB表达盒替换的基因工程 菌株YLK-pHXT1-BT2，该菌株分类命名为HEC-YLK9I-07，于2020年11月18日保藏在中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM 2020754。该工程菌在高葡萄糖浓度条件下，菌落颜色 为乳白色；随着葡萄糖的消耗，菌落颜色逐渐变为红色，说明该工程菌外源基因的表达不受半乳糖控 制，而是单纯受到葡萄糖浓度的控制。
实施例5产β-胡萝卜素工程菌摇瓶发酵的比较
1)发酵培养基
YPD培养基：葡萄糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉1.0g/L
YNB培养基：YNB 1.7g/l，无水硫酸铵5.0g/l，葡萄糖20.0g/l
2)酵母类胡萝卜素提取和含量检测
提取方法：取培养物1mL到15ml离心管中，离心去上清收集菌体；然后加入2ml的3M浓 度盐酸，在沸水浴中处理3min，破坏酵母细胞壁；将处理过后的细胞在冰水浴中冷却1min，离心 去上清，并用纯水水洗2遍去除残余的盐酸；再加入5ml丙酮，上下震荡萃取其中的色素。
含量测定：在450nm波长下检测OD值，并按如下公式计算提取液中的β-胡萝卜素含量；
Figure BDA0002795352990000141
A1-----稀释后的β-胡萝卜素在450nm波长下，1cm光程比色皿中的吸光值
A1％-----1％浓度(10mg/mL)的β-胡萝卜素的消光系数，此处的数值为2500AU
N-----测定OD450时的β-胡萝卜素溶液稀释倍数
10g/mL----A1％为2500AU时的β-胡萝卜素溶液浓度
发酵液中β胡萝卜素的含量＝上述所测定的β-胡萝卜素浓度C×提取所用丙酮ml数÷所用发酵 液的ml数。
3)摇瓶发酵
从-80℃冰箱取甘油法保藏的菌种YLK-Cu-BT2、YLK-GAL-BT2和YLK-pHXT1-BT2，室温溶化后， 以1％接种量各接种一瓶50ml YPD液体培养基，30℃250rpm活化15-18h，制得种子液。然后以1％接 种量将种子液转接至50ml/250ml YPD发酵培养基中，30℃250rpm发酵72h。发酵结束后，按实施例 5.2方法提取和检测色素含量。结果如下表5所示：
表5：
编号 菌株 诱导浓度 OD600 色素含量mg/L
1 YLK-GAL-BT2 0.2g/l半乳糖 26.48 245.1
2 YLK-GAL-BT2 0.4g/l半乳糖 26.34 251.2
3 YLK-Cu-BT2 5μM铜离子 27.63 276.8
4 YLK-Cu-BT2 10μM铜离子 25.34 357.2
5 YLK-pHXT1-BT2 N/A 24.96 550.7
6 YLK-pHXT1-BT2 N/A 25.34 545.6
通过对比半乳糖诱导、铜离子诱导和葡萄糖抑制调控三种不同的GAL调控***，可知对于β-胡 萝卜素的积累效果是不同的，其中葡萄糖抑制调控菌株YLK-pHXT1-BT2的产量最高，铜离子诱导菌株 YLK-Cu-BT2次之，半乳糖诱导菌株YLK-GAL-BT2产量最低。
4)不同葡萄糖浓度对YLK-pHXT1-BT2工程菌产色素的影响
从-80℃冰箱取甘油法保藏的菌种YLK-pHXT1-BT2，室温溶化后，以1％接种量各接种一瓶50ml YNB 液体培养基，30℃250rpm活化15-18h，制得种子液。然后以1％接种量将种子液转接至50ml/250ml YNB 发酵培养基中，并依次加入0ml、2ml、4ml、6ml和8ml 50％葡萄糖母液，30℃250rpm发酵120h。发 酵结束后，按实施例5.2的方法提取和检测色素含量。结果如下表6所示：
表6：
Figure BDA0002795352990000151
由上表可知，随着初始葡萄糖浓度的增加，生物量呈线性增长趋势，而色素产量与单位OD色素 产量在4％-8％葡萄糖浓度范围内有一定平台期，产量提升不显著，但在10％葡萄糖浓度下其色素产量 显著提升，说明初始糖浓度对最终β-胡萝卜素的积累是有较大影响的。
实施例6YLK-pHXT1-BT2工程菌50L罐上发酵考察
1)发酵罐培养基
葡萄糖20g/L，硫酸铵7g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，玉米浆30g/L，磷酸二氢钾5g/L， 硫酸镁2g/L，硫酸锌1g/L，维生素B1 200mg/L，维生素B3 200mg/L，维生素B6 200mg/
2)上罐种子液备种
从-80℃冰箱取甘油种子YLK-GAL-BT2、YLK-pHXT1-BT2和YLK-Cu-BT2，室温溶化后，以千分之 五接种量接种一瓶50ml YPD液体培养基，30℃250rpm活化15-18h，制得一级种子。然后以5％接种 量将一级种子转接至300ml YPD种子培养基中，30℃250rpm培养9-12h，制得二级种子。接着以1％ 接种量将二级种子转接至50L发酵罐中发酵。
3)50L罐上发酵考察
发酵试验1(YLK-GAL-BT2)：发酵前期初始葡萄糖浓度为20g/l，待基础碳源消耗完毕，在线监 测溶氧反弹后进行葡萄糖的流加，控制体系中葡萄糖的含量不超过1g/L。发酵过程采用氨水将pH控 制在5-6之间。补葡萄糖后溶氧控制在30％，溶氧与搅拌转速关联，发酵至25-30h，补加终浓度为 0.4g/l的半乳糖，同时更换乙醇为碳源，继续发酵至84h。
发酵试验2(YLK-Cu-BT2)：发酵前期初始葡萄糖浓度为20g/l，待基础碳源消耗完毕，在线监 测溶氧反弹后进行葡萄糖的流加，控制体系中葡萄糖的含量不超过1g/L。发酵过程采用氨水将pH控 制在5-6之间。补葡萄糖后溶氧控制在30％，溶氧与搅拌转速关联，发酵至25-30h，补加终浓度为 10μM的CuSO4溶液，同时更换乙醇为碳源，继续发酵至84h。
发酵试验3(YLK-pHXT1-BT2)：发酵前期初始葡萄糖浓度为20g/l，待基础碳源消耗完毕，在线 监测溶氧反弹后进行葡萄糖的流加，控制体系中葡萄糖的含量不超过1-2g/L。发酵过程采用氨水将 pH控制在5-6之间。补葡萄糖后溶氧控制在30％，溶氧与搅拌转速关联，发酵至20-30h，更换乙醇 为碳源，继续发酵至84h。
发酵试验4(YLK-pHXT1-BT2)：发酵前期初始葡萄糖浓度为100g/l，待基础碳源消耗完毕，在 线监测溶氧反弹后进行葡萄糖的流加，控制体系中葡萄糖的含量不超过1-2g/L。发酵过程采用氨水 将pH控制在5-6之间。补葡萄糖后溶氧控制在30％，溶氧与搅拌转速关联，发酵至20-30h，更换乙 醇为碳源，继续发酵至84h。参见下表7：
表7：
Figure BDA0002795352990000161
结果分析：
1)对比试验1、2、3可知，半乳糖、Cu2+和葡萄糖三种调控模式对β-胡萝卜素的合成效果差别 较大。其中YLK-GAL-BT2工程菌由于后期半乳糖消耗诱导效率降低，导致最终β-胡萝卜素产量最低， 仅为2.04g/l；其次为铜离子诱导的YLK-Cu-BT2工程菌，效果最优为YLK-pHXT1-BT2工程菌，产量 为3.23g/l。
2)对比试验3、4可知，随着前期基础糖浓度的增加，前期色素积累时间随之后移，说明 YLK-pHXT1-BT2工程菌受葡萄糖浓度的严谨调控，无需额外添加诱导剂即可达到将菌体生长和产物表 达两个阶段有机的分隔开。从结果来看，10％基础糖浓度发酵初期菌体生长和色素积累相对滞后，但 最终无论生物量或色素产量明显优于2％，β-胡萝卜素产量达到3.84g/l，是半乳糖诱导YLK-GAL-BT2 工程菌的1.88倍，铜离子诱导YLK-Cu-BT2工程菌的1.46倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 宜昌东阳光生化制药有限公司
<120> 调控酵母外源基因表达的启动子，调控方法及其应用
<130> RYP2010898.8
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1124
<212> DNA
<213> Saccharomyces
<400> 1
ttgcaggtct catctggaat ataattcccc cctcctgaag caaatttttc ctttgagccg 60
gaatttttga tattccgagt tctttttttc cattcgcgga ggttattcca ttcctaaacg 120
agtggccaca atgaaacttc aattcatatc gaccgactat ttttctccga accaaaaaaa 180
tagcagggcg agattggagc tgcggaaaaa agaggaaaaa attttttcgt agttttcttg 240
tgcaaattag ggtgtaaggt ttctagggct tattggttca agcagaagag acaacaattg 300
taggtcctaa attcaaggcg gatgtaagga gtattggttt cgaaagtttt tccgaagcgg 360
catggcaggg actacttgcg catgcgctcg gattatcttc atttttgctt gcaaaaacgt 420
agaatcatgg taaattacat gaagaattct cttttttttt tttttttttt tttttttacc 480
tctaaagagt gttgaccaac tgaaaaaacc cttcttcaag agagttaaac taagactaac 540
catcataact tccaaggaat taatcgatat cttgcactcc tgatttttct tcaaagagac 600
agcgcaaagg attatgacac tgttgcattg agtcaaaagt ttttccgaag tgacccagtg 660
ctcttttttt ttttccgtga aggactgaca aatatgcgca caagatccaa tacgtaatgg 720
aaattcggaa aaactaggaa gaaatgctgc agggcattgc cgtgccgatc ttttgtcttt 780
cagatatatg agaaaaagaa tattcatcaa gtgctgatag aagaatacca ctcatatgac 840
gtgggcagaa gacagcaaac gtaaacatga gctgctgcga catttgatgg cttttatccg 900
acaagccagg aaactccacc attatctaat gtagcaaaat atttcttaac acccgaagtt 960
gcgtgtcccc ctcacgtttt taatcatttg aattagtata ttgaaattat atataaaggc 1020
aacaatgtcc ccataatcaa ttccatctgg ggtctcatgt tctttcccca ccttaaaatc 1080
tataaagata tcataatcgt caactagttg atatacgtaa aatc 1124
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 2
agcatgaggt cgctccaatt cagcttcttt gaaaagataa tgtatgatta tgctttca 58
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 3
tatcaaggcc gatgctgtac 20
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 4
aatgatcgac atttatgacg cgggcaggtt ttagagctag aaatagcaag t 51
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 5
gctctaaaac ctgcccgcgt cataaatgtc gatcatttat ctttcactgc g 51
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 6
aatgatcaag atccatgaat cggttaggtt ttagagctag aaatagcaag t 51
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 7
gctctaaaac ctaaccgatt catggatctt gatcatttat ctttcactgc g 51
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 8
aatgatcgcg tatacaatct cgatagtgtt ttagagctag aaatagcaag t 51
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 9
gctctaaaac actatcgaga ttgtatacgc gatcatttat ctttcactgc g 51
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 10
aatgatctga agctgaaaat ctggggagtt ttagagctag aaatagcaag t 51
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 11
gctctaaaac tccccagatt ttcagcttca gatcatttat ctttcactgc g 51
<210> 12
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 12
tttcttcatt taccggcgca ctctcgcccg aacgacctca aaatgtctgc ttgcaggtct 60
catctggaat ataattcc 78
<210> 13
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 13
ggagctgcat taggcacggt tgagaccgaa gatctcttgt tgtagtccat gattttacgt 60
atatcaacta gttgacgatt atg 83
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 14
tttcttcatt taccggcgca ctctcgcccg aacgacctca aaatgtctgc gtattccaat 60
gagaatcgct ag 72
<210> 15
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 15
ggagctgcat taggcacggt tgagaccgaa gatctcttgt tgtagtccat ctttgtatag 60
cccttaaatg 70
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 16
aggggcgatt ggtttgggtg cgtgagcggc aagaagtttc gtaagccgat cccattaccg 60
<210> 17
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 17
agaagacagt agcttcatct ttcaggaggc ttgcttctct gtcagtttgt ttttcttaat 60
atctatttcg 70
<210> 18
<211> 975
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 18
gaattcatgt tgacatcttc taaatctatt gaatcttttc caaagaatgt ccagccatac 60
ggtaagcact accagaacgg attggagcca gtcggtaagt cacaggaaga cattttgttg 120
gaaccattcc attatttgtg ctctaatcca ggtaaggatg tcagaactaa gatgattgag 180
gcttttaatg catggttaaa agttccaaaa gacgatttaa ttgttataac tagagttatt 240
gagatgttgc attctgcttc tttgttgatt gatgatgtcg aagacgactc agtcttgaga 300
aggggtgttc cagctgctca ccacatttac ggtacaccac agacaattaa ttgtgctaat 360
tacgtttatt ttttggcttt gaaagaaatt gctaaattga ataaaccaaa tatgattaca 420
atttatactg atgaattaat taacttgcat agaggtcaag gtatggaatt gttttggaga 480
gatactttaa cttgtccaac agaaaaagaa tttttggaca tggttaatga taagactggt 540
ggtttgttga ggttggcagt caagttgatg caggaggctt ctcagtcagg tactgactac 600
acaggtttgg tctctaaaat tggtattcat tttcaagtta gagatgatta tatgaattta 660
cagtctaaga attatgctga caacaagggt ttctgcgagg acttgacaga gggtaagttt 720
tcattcccaa ttatacattc tattagatca gatccatcta acagacaatt gttgaatatt 780
ttgaaacaac gttcttcttc tattgagttg aaacaattcg ctttgcaatt gttggaaaat 840
acaaatactt ttcaatattg tagagatttt ttgagagttt tggagaagga ggctagggag 900
gagattaagt tgttgggtgg taatataatg ttggaaaaaa ttatggatgt tttatctgtt 960
aatgaataaa gatct 975
<210> 19
<211> 1761
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 19
gaattcatgt ctgatcagaa aaaacacatt gttgttattg gtgctggtat aggaggtaca 60
gctactgcag ctagattggc aagagagggt ttcagagtta ctgtcgtcga aaagaatgat 120
ttttctggag gaagatgttc atttattcat catgatggtc atagatttga tcaaggtcct 180
tcattgtatt tgatgccaaa attgttcgag gacgctttcg ctgacttgga cgagagaatt 240
ggtgaccatt tagatttgtt gaggtgtgat aataattata aagttcattt tgatgacggt 300
gatgctgttc aattgtcttc tgatttgact aagatgaaag gagagttgga caggattgag 360
ggtccattgg gtttcggtag gttcttagat ttcatgaaag aaactcatgt tcactatgaa 420
caaggtactt ttatagctat aaaaagaaat ttcgaaacaa tttgggattt gattagatta 480
caatatgtcc cagaaatatt tagattgcat ttgtttggta aaatttatga cagagcttca 540
aaatattttc agactaagaa gatgagaatg gcttttacat ttcaaactat gtatatgggt 600
atgtctccat acgacgctcc tgctgtttat tcattgttgc aatatactga atttgcagag 660
ggtatttggt atcctagagg tggttttaac atggttgttc aaaagttgga atctattgca 720
tctaaaaagt atggtgcaga gtttagatat caatctccag ttgcaaaaat taatactgtt 780
gataaggata agagagttac aggtgtcact ttggagtcag gtgaggttat agaagctgac 840
gctgtcgtct gcaatgctga cttggtctac gcttaccacc atttgttgcc accatgtaat 900
tggactaaga aaactttggc atctaagaaa ttgacttcat cttctatttc tttttactgg 960
tctatgtcta caaaggttcc acaattagat gttcacaata tctttttagc agaggcttat 1020
aaagaatcat ttgatgaaat ttttaacgac ttcggtttgc cttctgaagc atctttctac 1080
gtcaacgtcc catcaagaat tgacgagtct gctgctccac ctaacaagga ctctattatt 1140
gtcttagtcc caattggtca tatgaaatct aaaactggta attctgcaga agagaactac 1200
cctgagttgg tcaacagagc tagaaaaatg gttttggaag ttattgaaag aagattgggt 1260
gtcaataatt tcgcaaattt aattgaacac gaggaagtca acgacccatc tgtttggcag 1320
tctaagttta atttgtggag aggttctatt ttaggtttgt cacacgatgt tttccaagtc 1380
ttgtggttta gaccatcaac taaagattct actaataggt acgataactt gttctttgtt 1440
ggtgcttcta ctcacccagg tacaggtgtt ccaattgtct tggctggttc aaagttaaca 1500
tctgatcaag tttgcaaatc attcggtcag aacccattac caaggaagtt acaagactct 1560
caaaagaaat atgctccaga acagacaaga aaaacagaat cacattggat ttactactgc 1620
ttggcttgtt acttcgttac attcttattc ttttatttct tcccaagaga tgatactact 1680
acaccagctt cttttattaa tcaattgtta cctaacgttt ttcaaggtca aaattcaaat 1740
gatattagaa tttaaagatc t 1761
<210> 20
<211> 1839
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 20
ggatccatgt caatattaac atacttggaa tttcatttat actatacatt gccagttttg 60
gcagctttgt gctggttatt aaaacctttt cattctcagc aagataattt gaagtataaa 120
ttcttgatgt tgatggctgc atctacagca tcaatttggg ataactatat tgtttatcat 180
agagcatggt ggtactgccc aacttgcgtt gtcgcagtca ttggttacgt cccattggaa 240
gaatacatgt tttttattat tatgactttg atgactgttg ctttttctaa ctttgttatg 300
agatggcatt tgcatacttt ctttataaga ccaaacacat catggaagca aactttattg 360
gttagattgg ttcctgtctc agctttgtta gctattactt accatgcatg gcatttgaca 420
ttgccaaata aaccatcttt ctacggttca tgcatattat ggtacgcttg cccagtcttg 480
gcaattttgt ggttgggtgc tggtgaatat attttaagaa gaccagttgc agttttgttg 540
tctattgtca ttccatcagt ttatttatgt tgggctgata ttgttgctat atctgcaggt 600
acttggcata tatctttgag aacatcaact ggaaagatgg ttgtcccaga cttgcctgtc 660
gaggaatgtt tgttctttac tttgattaat acagttttgg tctttgctac atgtgctatt 720
gatcgtgctc aagctatttt gcatttgtac aaatcttcag ttcagaacca aaaccctaaa 780
caagctattt ctttgttcca acacgttaag gagttagctt gggcattctg cttgcctgac 840
cagatgttga acaacgaatt gttcgatgat ttgactattt catgggatat tttgagaaaa 900
gcatctaaat cattctatac agcatcagct gtttttcctt cttatgttag acaagatttg 960
ggtgtcttgt acgcattctg cagggcaact gacgatttgt gcgacgacga gtcaaagtct 1020
gtccaagaga ggagagacca attggacttg actagacaat ttgtcagaga tttgttttct 1080
caaaaaacat cagcaccaat tgttattgac tgggaattgt atcaaaacca attgcctgca 1140
tcttgtattt cagcttttag ggcatttact agattaagac acgttttgga ggttgatcca 1200
gttgaagaat tgttggatgg ttataaatgg gatttggaaa gaagaccaat tttggatgaa 1260
caagacttgg aggcttactc agcttgcgtt gcatcttctg tcggtgagat gtgtacaaga 1320
gtcattttag ctcaagatca aaaagagaat gatgcttgga taatagatag agcaagggag 1380
atgggtttgg ttttacaata cgtcaatatt gcaagagata ttgttactga ctctgaaact 1440
ttaggtagat gttatttgcc tcaacagtgg ttgaggaagg aggagacaga acaaattcaa 1500
caaggaaacg cacgttcttt gggtgaccag aggttgttgg gattatcttt gaagttggtc 1560
ggtaaggctg acgcaataat ggtcagagct aaaaaaggta ttgataagtt gccagcaaac 1620
tgccaaggtg gtgttagagc agcttgccag gtttacgctg caataggttc agtcttgaaa 1680
caacagaaaa ctacatatcc tactcgtgct catttgaaag gttcagaaag agcaaaaatt 1740
gctttattgt ctgtttataa tttgtaccag tctgaggaca agccagttgc tttgaggcag 1800
gcaagaaaga ttaaatcttt ctttgttgat taaaagctt 1839
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 21
cccggatcca aaaatggacc aattggtgaa aactgaag 38
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 22
cccgtcgact taggatttaa tgcaggtgac g 31
<210> 23
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 23
cttatgatgg ttttttggaa ttattattat cctaccatca agcgtctgac ccagctgaat 60
tggagcga 68
<210> 24
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 24
cgcggaaaaa agtaaacagc tattgctact caaatgaggt ttgcagaagc gcagctggat 60
cttcgagcgt cccaaaacc 79
<210> 25
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 25
tgtagataat gaatctgacc atctaaattt cttagttttt cagcagcttg ttccgaagtt 60
aaatctcttt cggttagagc ggatcttagc 90
<210> 26
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 26
gcattttcta gctcagcatc agtgatctta gggtacttga ccttgtagaa ctcattggca 60
agggcttctt gaccaaacct ctggcgaag 89
<210> 27
<211> 1224
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial
<400> 27
tttcttcatt taccggcgca ctctcgcccg aacgacctca aaatgtctgc ttgcaggtct 60
catctggaat ataattcccc cctcctgaag caaatttttc ctttgagccg gaatttttga 120
tattccgagt tctttttttc cattcgcgga ggttattcca ttcctaaacg agtggccaca 180
atgaaacttc aattcatatc gaccgactat ttttctccga accaaaaaaa tagcagggcg 240
agattggagc tgcggaaaaa agaggaaaaa attttttcgt agttttcttg tgcaaattag 300
ggtgtaaggt ttctagggct tattggttca agcagaagag acaacaattg taggtcctaa 360
attcaaggcg gatgtaagga gtattggttt cgaaagtttt tccgaagcgg catggcaggg 420
actacttgcg catgcgctcg gattatcttc atttttgctt gcaaaaacgt agaatcatgg 480
taaattacat gaagaattct cttttttttt tttttttttt tttttttacc tctaaagagt 540
gttgaccaac tgaaaaaacc cttcttcaag agagttaaac taagactaac catcataact 600
tccaaggaat taatcgatat cttgcactcc tgatttttct tcaaagagac agcgcaaagg 660
attatgacac tgttgcattg agtcaaaagt ttttccgaag tgacccagtg ctcttttttt 720
ttttccgtga aggactgaca aatatgcgca caagatccaa tacgtaatgg aaattcggaa 780
aaactaggaa gaaatgctgc agggcattgc cgtgccgatc ttttgtcttt cagatatatg 840
agaaaaagaa tattcatcaa gtgctgatag aagaatacca ctcatatgac gtgggcagaa 900
gacagcaaac gtaaacatga gctgctgcga catttgatgg cttttatccg acaagccagg 960
aaactccacc attatctaat gtagcaaaat atttcttaac acccgaagtt gcgtgtcccc 1020
ctcacgtttt taatcatttg aattagtata ttgaaattat atataaaggc aacaatgtcc 1080
ccataatcaa ttccatctgg ggtctcatgt tctttcccca ccttaaaatc tataaagata 1140
tcataatcgt caactagttg atatacgtaa aatcatggac tacaacaaga gatcttcggt 1200
ctcaaccgtg cctaatgcag ctcc 1224

Claims (20)

1.一种用于外源基因表达的GAL调控***，其特征在于，所述调控***中用HXT1启动子替换GAL80启动子。
2.根据权利要求1所述的GAL调控***，其特征在于，还包括GAL启动子，
优选地，所述外源基因与所述GAL启动子可操作地连接，
优选地，所述GAL启动子为一个或多个选自GAL1，GAL7，GAL2或GAL10的启动子。
3.根据权利要求1所述的GAL调控***，其特征在于，其中GAL10基因、GAL1基因和/或GAL7基因被沉默，优选地，所述GAL10基因、GAL1基因和/或GAL7基因被敲除。
4.根据权利要求1所述的GAL调控***，其特征在于，所述HXT1启动子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或通过一个或者几个碱基的增加、删减、取代，仍然与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
5.一种酵母细胞，其特征在于，其包含权利要求1-4任一项的用于外源基因表达的GAL调控***。
6.根据权利要求5所述的酵母细胞，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母。
7.根据权利要求5或6所述的酵母细胞，其特征在于，所述外源基因是与目标产物的合成有关的基因，优选地，所述目标产物是萜类物质，优选地，所述萜类物质选自单萜，倍半萜和二萜，更优选地，选自β-胡萝卜素，叶黄素，斑蝥黄素，虾青素，番茄红素，青蒿二烯，青蒿素，紫杉二烯，紫杉醇，达玛烯二醇，α-檀香萜，丹参酮，角鲨烯和人参皂苷。
8.根据权利要求7所述的酵母细胞，其特征在于，将与目标产物的合成有关的基因与GAL启动子可操作地连接，优选地，所述GAL启动子选自GAL1，GAL7，GAL2和GAL10启动子。
9.根据权利要求7所述的酵母细胞，其特征在于，所述目标产物为β-胡萝卜素，其中tHMG1基因与pGAL1启动子可操作地连接，BtcrtE基因与GAL10启动子可操作地连接，BtcrtYB基因与GAL1启动子可操作地连接，以及BtcrtI基因与GAL10启动子可操作地连接；
优选地，将GAL1基因，GAL7基因，和GAL10基因沉默；
优选地，所述BtcrtE基因具有SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，或通过一个或者几个碱基的增加、删减、取代，仍然与SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
优选地，所述BtcrtI基因具有SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列，或通过一个或者几个碱基的增加、删减、取代，仍然与SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
优选地，所述BtcrtYB基因具有SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列，或通过一个或者几个碱基的增加、删减、取代，仍然与SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
10.根据权利要求5或6的酵母细胞，所述酵母细胞为YLK-pHXT1-BT2菌株，其菌株分类命名为酿酒酵母HEC-YLK9I-07，于2020年11月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020754。
11.一种用于调控酵母外源基因表达的方法，所述方法包括利用权利要求1-4任一项的GAL调控***或利用权利要求5-10任一项的酵母细胞进行外源基因的表达。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，还包括调节培养体系中的葡萄糖浓度的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述培养***中葡萄糖初始浓度在1％-15％的范围内，优选地，在2％-10％的范围内，更优选地，为10％。
14.权利要求1-4任一项的GAL调控***，或权利要求5-10任一项的酵母细胞在调控外源基因表达中的用途。
15.权利要求1-4任一项的GAL调控***，或权利要求5-10任一项的酵母细胞在生物合成目标产物中的用途，优选地，所述目标产物是萜类物质，优选地，所述萜类物质选自单萜，倍半萜和二萜，更优选地，选自β-胡萝卜素，叶黄素，斑蝥黄素，虾青素，番茄红素，青蒿二烯，青蒿素，紫杉二烯，紫杉醇，达玛烯二醇，α-檀香萜，丹参酮，角鲨烯和人参皂苷。
16.一种利用酵母合成β-胡萝卜素的方法，所述方法包括利用权利要求5-10任一项的酵母细胞发酵生产β-胡萝卜素的步骤。
17.根据权利要求16的方法，所述酵母细胞的GAL调控***中用HXT1启动子替换GAL80启动子，并且将β-胡萝卜素合成途径相关基因置于GAL1，GAL7，GAL2或者GAL10启动子控制下进行表达，
优选地，tHMG1基因与pGAL1启动子可操作地连接，BtcrtE基因与GAL10启动子可操作地连接，BtcrtYB基因与GAL1启动子可操作地连接，以及BtcrtI基因与GAL10启动子可操作地连接；
优选地，将GAL1基因，GAL7基因，和GAL10基因沉默；
优选地，所述BtcrtE基因具有SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，或通过一个或者几个碱基的增加、删减、取代，仍然与SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
优选地，所述BtcrtI基因具有SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列，或通过一个或者几个碱基的增加、删减、取代，仍然与SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
优选地，所述BtcrtYB基因具有SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列，或通过一个或者几个碱基的增加、删减、取代，仍然与SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列。
18.根据权利要求17的方法，所述酵母细胞为YLK-pHXT1-BT2菌株，其菌株分类命名为酿酒酵母HEC-YLK9I-07，于2020年11月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020754。
19.根据权利要求16至18任一项的方法，其特征在于，经液体发酵进行，所述液体培养基包含葡萄糖20-120g/L，硫酸铵5-9g/L，酵母粉1-4g/L，蛋白胨1-4g/L，玉米浆10-40g/L，磷酸二氢钾3-7g/L，硫酸镁1-4g/L，硫酸锌0.5-3g/L，维生素B1150-2500 mg/L，维生素B3150-250mg/L，维生素B6150-250mg。
20.根据权利要求16至18任一项的方法，其特征在于，在发酵过程中将培养基的pH控制在5-6之间，优选地，在发酵过程中分阶段补充不同的碳源，优选地，在不超过在20-30小时发酵时间内补充葡萄糖使其浓度维持在不低于2g/L的水平，优选地，在发酵20-30小时之后将乙醇更换为碳源，优选地在发酵过程中将溶氧控制在25-35％。
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