CN112574898B - 一种用于生产叶黄素的重组酵母及其应用 - Google Patents

一种用于生产叶黄素的重组酵母及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于生产叶黄素的重组酵母，在酵母中外源导入八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε‑环化酶基因、番茄红素β‑环化酶基因、胡萝卜素β‑羟化酶基因和胡萝卜素ε‑羟化酶基因。本发明通过基因克隆和密码子优化，获得六个可以在酵母中成功表达的酶，构建得到生产叶黄素的基因工程酵母菌株。在八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε‑环化酶的催化下生产δ‑胡萝卜素，然后在番茄红素β‑环化酶、胡萝卜素β‑羟化酶、胡萝卜素ε‑羟化酶的催化下将δ‑胡萝卜素转化成叶黄素。

Description

一种用于生产叶黄素的重组酵母及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于生产叶黄素的重组酵母及其应用。
背景技术
叶黄素(Lutein)化学名为3,3’-二醇-α-胡萝卜素，能在高等植物和藻类中合成，并且在生理代谢中起着重要作用。作为植物光***的重要组成部分，叶黄素在光合作用中捕获光能，调节植物生长和发育，并以生物信号分子参与植物与环境的相互作用。叶黄素也是视网膜黄斑色素的重要成分，具有吸收蓝光保护眼睛的功能，由于人类自身无法生成叶黄素，所以需要从食物中摄取。研究表明叶黄素可以预防和治疗视网膜损伤，包括年龄相关性黄斑变性、青光眼和糖尿病视网膜病变。叶黄素作为营养保健品，可以改善心血管疾病、动脉粥样硬化和癌症。除了在医疗保健行业的应用，叶黄素还广泛应用于水产养殖、家禽养殖和化妆品。
目前，市场上的叶黄素主要从万寿菊花瓣提取而来，大多数以叶黄素酯的形式存在，但其天然含量低，且植物种植具有季节性、地域限制性、耗费劳动力等缺点。藻类作为自然界叶黄素含量较高的微生物已作为替代来源，目前相关文献主要研究培养基组成、光照强度、盐度和温度对叶黄素积累的影响。虽然通过控制环境参数成功地提高了叶黄素的产量，但藻类的固有生理特性和遗传途径有待进一步研究。同时，培养条件苛刻、提取困难等问题使得利用藻类大面积生产叶黄素也极具挑战性。本发明提供了一种以安全、高效的酵母为细胞工厂异源合成叶黄素的方法，为工业生产叶黄素提供新的思路和方法。
叶黄素的生物合成存在一个关键中间代谢物竞争性利用的问题：中间代谢物番茄红素既可以通过番茄红素ε-环化酶和番茄红素β-环化酶的连续催化形成α-胡萝卜素；又可以直接在番茄红素β-环化酶的两步催化下形成β-胡萝卜素(图1)。在前期研究中，我们发现两种番茄红素环化酶对于番茄红素的催化活性差异很大，在两者共同表达的情况下，副产物β-胡萝卜素大量产生而目标产物α-胡萝卜素几乎不能合成。
植物中大多数的萜烯合成酶在转运肽的引导下以质体作为定位靶点，由于酵母无法水解质体转运肽，所以在合成异植物源基因时会直接切除其转运肽序列，在酵母中异源表达后蛋白会游离于细胞质中。对于堆积在细胞膜上的底物如类胡萝卜素，游离的蛋白与底物接触的机会较少，从而限制了底物的转化效率和产物的合成。
发明内容
本发明提供了一种反应顺序可控的生物合成途径构建方法。该顺序调控***为生物合成的分步骤精细调控奠定了理论和方法基础。
本发明提供了一种将细胞膜定位序列与关键酶融合表达用于有效地进行叶黄素生物合成，提高番茄红素转化效率的应用。
一种用于生产叶黄素的重组酵母，在酵母中外源导入八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε-环化酶基因、番茄红素β-环化酶基因、胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因。在八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶的催化下生产δ-胡萝卜素，然后在番茄红素β-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶的催化下将δ-胡萝卜素转化成叶黄素。
优选的，八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε-环化酶基因、番茄红素β-环化酶基因、胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因的基因序列分别如SEQ ID No.1～6所示。
优选的，八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε-环化酶基因在组成型启动子下表达；番茄红素β-环化酶基因、胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因在半乳糖启动子下表达，且受温敏型转录激活因子Gal4M9调控。
进一步优选的，八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶在组成型强启动子pTEF1或者pPGK1下表达。
进一步优选的，在番茄红素ε-环化酶基因的上游端或下游端***有细胞膜定位序列PM1或PM2，细胞膜定位序列PM1的基因序列如SEQ ID No.7所示，细胞膜定位序列PM2的基因序列如SEQ ID No.8所示。
进一步优选的，将六种酶的基因整合到酵母的染色体上构建稳定表达六种酶的重组酵母。进一步优选的，整合的具***置：八氢番茄红素合酶基因整合在HO位点；八氢番茄红素脱氢酶基因整合在GAL80位点；番茄红素ε-环化酶基因整合在LPP1位点；番茄红素β-环化酶基因整合在TY4位点；胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因整合在GAL1-7位点。
本发明还提供了所述重组酵母在生产叶黄素中的应用。
本发明还提供了一种生产叶黄素的方法，使用带有温敏型转录激活因子Gal4M9调控的启动子的上述重组酵母进行发酵培养，先在温度30℃下，在八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶的催化下，δ-胡萝卜素得到积累；然后，温度转到24℃后，番茄红素β-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶开始表达，将δ-胡萝卜素转化成叶黄素。
本发明通过基因克隆和密码子优化，获得六个可以在酵母中成功表达的酶，分别为八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶、番茄红素β-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶；利用温度敏感型Gal4突变体(Gal4M9)对这些酶的表达进行顺序调控，构建得到生产叶黄素的基因工程酵母菌株；进一步通过番茄红素ε-环化酶的细胞膜定位，促进了叶黄素的合成。本发明所述的顺序调控应用于叶黄素的生物合成，解决了复杂合成途径中关键代谢中间物的竞争性利用难题，同时在关键酶末端引入细胞膜定位的信号序列可以进一步促进储存在细胞膜中的前体物的转化，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为番茄红素到叶黄素生物合成途径示意图。
图2为pUMRI-10-TP质粒与PESC-URA-pPGK1-tADH1质粒的图谱，其中，A为pUMRI-10-TP质粒，B为PESC-URA-pPGK1-tADH1质粒。
图3为细胞膜定位序列的功能验证结果图，其中A为对照，EGFP未连细胞膜定位序列；B：细胞膜定位序列PM1连接在EGFP的N端；C:细胞膜定位序列PM1连接在EGFP的C端；D:细胞膜定位序列PM2连接在EGFP的N端；E：细胞膜定位序列PM2连接在EGFP的C端。
图4为番茄红素ε-环化酶细胞膜定位对α-胡萝卜素比例的影响结果图，其中，PM1-e表示定位序列PM1在番茄红素ε-环化酶的N端；e-PM1表示定位序列PM1在番茄红素ε-环化酶的C端；PM2-e表示定位序列PM2在番茄红素ε-环化酶的N端；e-PM2表示定位序列PM2在番茄红素ε-环化酶的C端。
图5为叶黄素标准品与实验菌株YY01提取物在同一条件下的高效液相色谱洗脱图谱。
图6为叶黄素标准品(a)与菌株YY01提取物(b)在同一保留时间的LC-Q-TOF/MS一级质谱图。
具体实施方式
实施例1：克隆与表达叶黄素生物合成所需要的酶基因
1.植物或藻类叶黄素合成途径中所需的酶，结合实验室已有的酶库：八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素β-环化酶(W.Xie,X.Lv,L.Ye,P.Zhou,H.Yu,Construction of lycopene-overproducing Saccharomyces cerevisiae by combiningdirected evolution and metabolic engineering.Metab.Eng.30,69-78，doi:10.1016/j.ymben.2015.04.009(2015))，在NCBI找到其余相应的核酸序列或者蛋白序列(见表1)，通过密码子优化网站，依据相应的酵母宿主进行密码子优化，将优化后的基因序列送去基因公司合成，获得三个可以在酵母中成功表达的酶，分别是：番茄红素ε-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶。
表1：所需合成的基因
基因名称 来源 检索号 密码子优化后的基因序列
八氢番茄红素合酶 红发夫酵母 AY177204 SEQ ID NO.1
八氢番茄红素脱氢酶 红发夫酵母 AY177424.1 SEQ ID NO.2
番茄红素ε-环化酶 万寿菊 AY099485.1 SEQ ID NO.3
番茄红素β-环化酶 红发夫酵母 AY177204 SEQ ID NO.4
胡萝卜素β-羟化酶 拟南芥 NC_003070.9 SEQ ID NO.5
胡萝卜素ε-羟化酶 拟南芥 NC_003074 SEQ ID NO.6
2.利用表2所列引物，以步骤1中的基因序列为模板，进行PCR来扩增目的基因，并利用酶切(相应的酶切位点已用加粗下划线表示)和连接手段将目的基因克隆至整合型pUMRI-10(GenBank：KM216412)载体质粒或者pUMRI-10-TP(图谱见图2)载体质粒上：八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶在组成型强启动子(pTEF1或者pPGK1)下表达；番茄红素β-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶在半乳糖启动子(pGAL1或者pGAL10)下表达，得到连有目的基因的重组质粒。
3.利用整合引物(详见表2)对重组质粒进行PCR，得到“启动子-目的基因-终止子”表达盒。
4.根据酿酒酵母中CRISPR/Cas9整合工具(Lian,J.,HamediRad,M.,Hu,S.&Zhao,H.Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functionalCRISPR system.Nature Communications 8,1688-1696,doi:10.1038/s41467-017-01695-x(2017).)，将步骤3中的表达盒连同含有相应guide RNA编码序列的质粒和p416-Cas9质粒(详见表3)利用化学法转化到酵母细胞中，涂布于氨基酸缺陷型的SD平板上。
5.选取基因组上的两条引物(详见表2)利用PCR验证，若条带大小正确且单一，则说明目标基因整合正确，该菌株已成功整合。随后进行下一个基因的整合。使用CRISPR/Cas9整合工具整合的位置根据guide RNA序列可以确定，八氢番茄红素合酶基因整合在HO位点；八氢番茄红素脱氢酶基因整合在GAL80位点；番茄红素ε-环化酶基因整合在LPP1位点；番茄红素β-环化酶基因整合在TY4位点；胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因整合在GAL1-7位点。
6.将表1中的基因逐个整合至酿酒酵母基因组上，所构菌株命名为YY00。
表2所用引物
Figure BDA0002789624070000041
Figure BDA0002789624070000051
表3菌种构建所需质粒
Figure BDA0002789624070000052
实施例2：引入温度敏感型Gal4突变体(Gal4M9)
1.利用酿酒酵母同源重组的方式敲除GAL4基因，该过程中构建一个HIS3敲GAL4的敲除盒：GAL4上游同源区段-HIS3表达盒-GAL4下游同源区段。用GAL4-HisF1和GAL4-HisXF1从PUG23(GenBank:AF298783.1)扩增出表达HIS3的片段1，用GAL4-CyF和GAL4-HISR1从酿酒酵母BY4741基因组中扩增出上游同源臂即为片段2，用GAL4-His-XR1和GAL4-XinF1从酿酒酵母BY4741基因组中扩增出下游同源臂即为片段3，将3个片段做重叠延伸PCR得到HIS3敲GAL4片段(引物详见表2)。利用HIS3表达盒敲除实施例1中构建好的酿酒酵母YY00的转录激活因子GAL4。
2.将pUMRI-PACT1-GAL4M9质粒(Zhou,P.et al.Development of a temperature-responsive yeast cell factory using engineered Gal4 as a proteinswitch.Biotechnol.Bioeng.115,1321-1330,doi:10.1002/bit.26544(2018).)作为模板，PCR(引物为：DPP1-gRNA2-pACT1和DPP1-gRNA2-tADH1，详见表2)得到GAL4M9表达盒。
3.将GAL4M9表达盒连同表2中的p426-DPP1-gRNA2与p416-Cas9质粒利用化学法转化到步骤1中的酵母细胞中，涂布于氨基酸缺陷型的SD平板上。
4.利用PCR验证，得到正确整合GAL4M9表达盒的菌株，命名为酿酒酵母YY01。
由此获得的菌株YY01通过温度的变化来控制八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶、番茄红素β-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶的顺序表达：30℃下，在八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶的催化下，δ-胡萝卜素得到积累；温度转到24℃后，番茄红素β-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶开始表达，将δ-胡萝卜素转化成叶黄素。该菌株可以成功异源合成叶黄素，但由于前体α-胡萝卜素积累量较低，该菌株合成叶黄素能力仍有待进一步提高。
实施例3：细胞膜定位序列的验证
1.用引物EGFP-F
Figure BDA0002789624070000062
和EGFP-R
Figure BDA0002789624070000063
以PUG23(GenBank:AF298783)为模板进行PCR扩增出EGFP片段，用NotI和SpeI对EGFP片段和PESC-URA-pPGK1-tADH1质粒(图谱见图2)进行双酶切，连接后转化，克隆得到PESC-URA-pPGK1-EGFP-tADH1。
2.利用步骤1中克隆得到的质粒，表4中的引物，采用高保真酶(Prime STARTM HSDNA polymerase)进行CPEC(Circular polymerase extension cloning)法构建质粒。其中CPEC反应体系(10μl)为：Prime Star缓冲液：2μl；dNTPs(2.5mM)：1μl；引物1：0.4μl；引物2：0.4μl；模板：0.2μl；DNA聚合酶：0.1μl；去离子水：5.9μl。
PCR程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，Tm±5℃退火20s，72℃延伸1kb/min，共20个循环；72℃延伸5min；4℃保存1min。
细胞膜定位序列PM1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；细胞膜定位序列PM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
表4：构建定位序列与EGFP融合质粒所需的引物
Figure BDA0002789624070000061
Figure BDA0002789624070000071
3.将步骤2中构建好的质粒PESC-URA-pPGK1-PM1-EGFP-tADH1，PESC-URA-pPGK1-EGFP-PM1-tADH1，PESC-URA-pPGK1-PM2-EGFP-tADH1，PESC-URA-pPGK1-EGFP-PM2-tADH1，以及步骤1中的质粒PESC-URA-pPGK1-EGFP-tADH1利用化学法分别转入酿酒酵母BY4741(保藏号：ATCC 201388)中，涂布于尿嘧啶陷型的SD平板上。
4.将步骤3中的菌分别挑一个单菌落于SD(-URA)试管中，30℃，220rpm培养。
5.步骤4中的试管培养24h后，按初始OD600＝0.05接一定量的菌液于SD(-URA)摇瓶中，30℃，220rpm培养48h。
6.收集步骤5中的菌体，并用无菌水清洗两次，稀释到合适的浓度，制片，在激光共聚焦显微镜下观察荧光。
图3为不同细胞膜定位序列在EGFP的不同位置所示的情况，A为对照，荧光均匀分布于细胞内，B、C、E中荧光分布于细胞膜周围一圈，D中荧光与对照相同分布于细胞内，说明细胞膜定位序列PM1在EGFP的N端和C端均有定位功能，而PM2仅在C端有定位功能。
实施例4：关键限速酶与细胞膜定位序列的融合表达
在关键限速酶番茄红素ε-环化酶的N-端/C-端通过CPEC法连接上定位序列PM1或者定位序列PM2。利用PCR进行菌落验证得到正确的质粒后，用化学法将其转化到酵母细胞中，涂布于氨基酸缺陷型的SD平板上。
如图4为PM1和PM2在番茄红素ε-环化酶不同位置时对α-胡萝卜素和β-胡罗卜素比例的影响。结果发现，当PM1在番茄红素ε-环化酶的N端时，α-胡萝卜素的产量及其与β-胡罗卜素的比例最高，说明细胞膜定位序列与关键限速酶的融合可以有效且方便地重构代谢流分布，在代谢改造中起着重要作用。
实施例5：从工程酿酒酵母细胞中提取叶黄素并通过HPLC分析叶黄素的产量
酿酒酵母YY01提取叶黄素的具体方法如下：
(1)取20ml酵母发酵液，3000rpm离心5min，弃上清，然后用5ml蒸馏水清洗一次，离心弃上清，加入200μL的蒸馏水，重悬菌体。
(2)在2ml离心管中加入500ml体积的研磨珠(0.1mm和0.5mm的氧化锆珠子各半)，然后将重悬后的菌液全部转移到2ml的离心管中。
(3)将装有珠子和菌体的离心管，置于全自动样品快速研磨仪中，65HZ，研磨5min。
(4)研磨完后，将该离心管置于4℃离心机中12000rpm，10min，弃去上清。
(5)在该离心管中加入1ml的丙酮萃取，充分混匀，并置于超声10min。
(6)超声后，12000rpm离心2min，吸上清到新的2ml离心管中，
(7)在原来的2ml离心管中再加入1ml丙酮，复萃一次至菌体颜色变白，充分混匀，超声10min，12000rpm离心2min后，吸取上清至步骤(6)的新离心管中。
(8)将混合的萃取液用0.22μm有机系滤头过滤，待进HPLC检测。
使用下列条件，通过HPLC检测酿酒酵母中叶黄素及其含量。液相分析仪器为岛津LC-20AT，色谱柱为YMC30。测波长450nm。采用梯度洗脱，流动相为A泵：乙腈和甲醇(75:25)，B泵：甲基叔丁基醚，流速为1ml/min，梯度洗脱条件如下：0-10min，B泵流动相从0升到5％；10-19min,B泵流动相从5％升到14％；19-29min，B泵流动相从14升到25％；29-54min，B泵流动相从25％升到50％；54-66min，B泵流动相从50％升到74％；66.1min，B泵恢复至0。
如图5所示，菌株YY01萃取液在标准品叶黄素的出峰时间(约13min)也出现了一个大峰，推测为叶黄素峰，需进一步利用高分辨率液质进行确认。
液质条件为：正电离模式的APCI源，电压+5.5kV，温度500℃。将气体1(Air)和气体2(Air)的压力为50psi。干燥气体(N2)的压力为35psi。m/z扫描范围设置为50-1500。柱子和温度设置与高效液相色谱一致。流动相是A(甲醇)和B(乙腈:异丙醇＝1:1),B从0到100％在30分钟内线性增加，在第30-40分钟内B下降到0。
如图6所示，菌株YY01与叶黄素标准品在同一时间所出峰的质谱分析情况一致，说明YY01中在13分钟所出的峰即为叶黄素峰。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种用于生产叶黄素的重组酵母及其应用
<160> 68
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2022
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacggctc tcgcatatta ccagatccat ctgatctata ctctcccaat tcttggtctt 60
ctcggtctgc tcacttcccc gattttgaca aaatttgaca tctacaaaat atcgatcctc 120
gtatttattg cgtttagtgc aaccacacca tgggactcat ggatcatcag aaatggcgca 180
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gcaactaggc accttctccc atctctcgcg cttcccaaga ctagatcgtc cgccctttct 360
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ccatcgcccg acccgctcgt gacagatcac tacttctaca tgcgggcact ctccttactc 480
atcaccccac ctaccatgct cttggcagca ttatcaggcg aatatgcttt cgattggaaa 540
agtggccgag caaagtcaac tattgcagca atcatgatcc cgacggtgta tctgatttgg 600
gtagattatg ttgctgtcgg tcaagactcc tggtcgatca acgatgagaa gattgtaggg 660
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cttaccctac tatttgggcc cccgctacac ccttcgcaac ctgacaagat cctttcttcg 1140
cctttacttc ctccttcgca cccttcccga cccacgggaa tgtatcccct cccgcctcct 1200
ccttcgctct cgcctgccga actcgttcaa ttccttaccg aaagggttcc cgttcaatac 1260
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gaactcctta gaggatacac cactgatctt atctttcctt tatcgacaga ggcagtccag 1380
gctcggaaga cgcctatcga gaccacagct gacttgctgg actatggtct atgtgtagca 1440
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cagttggtga acattgctag ggacattaaa ggggacgcaa cagaagggag attttaccta 1620
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gaacctcggc ctcaagattt cgacaaactc ctcagtctat ctccttcgtc cacattacca 1740
tcttcaaacg cctcagaaag cttccggttc gaatggaaga cgtactcgct tccattagtc 1800
gcctacgcag aggatcttgc caaacattct tataagggaa ttgaccgact tcctaccgag 1860
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gtcgtttgga aaggagacgt cggagagaga aggacagttg ccggatggag gagagtacgg 1980
aaagtcttga gtgtggtcat gagcggatgg gaagggcagt aa 2022
<210> 2
<211> 1749
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 1551
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 2022
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggactagtcc ttaaatagtc aagtatgctt tcaacattg 39
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccctcgaggg atgacggctc tcgcatatta cc 32
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tccccgcggg gattactgcc cttcccatcc g 31
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cggaattccg atgtcatcta ttgaaaaacc taaacc 36
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atttgcggcc gctttattat ctttgagaaa ctttcatata caaacc 46
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccggaattcc ggatgttttc atcttcatct aatggt 36
<210> 20
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ataagaatgc ggccgctaaa ctatttatga caaagcagat gaaacttcat cc 52
<210> 21
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aacaagagat cttcggtctc aaccgtgcct aatgcagctc ccataagagt cctcatacta 60
ttatcagggc 70
<210> 22
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatgtgtctt gattgcccat cctttggctg cgttgagacc gacgaatccg ctgaattgga 60
gcgacctcat gc 72
<210> 23
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
actgtcattg ggaatgtctt atgatggttt tttggaatta ttattatcct cctcatacta 60
ttatcagggc 70
<210> 24
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aatataaagt gagatggaga aatctgcagc aatgtcagac gcttgatggt ctgaattgga 60
gcgacctcat gc 72
<210> 25
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtccggcctc tctcttagtc tctttactct attcttcttc agtaagtcct gaccgcgaat 60
ccttacatca cac 73
<210> 26
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gagtgttgga ctgagtaaca tggtcgtctt ctggacctgc atgtttgaca cttcgagcgt 60
cccaaaacct tc 72
<210> 27
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggcagtatta atgaaggttg aatatggatc ttaatataat cgtataagag tgtgcctcgc 60
gccgcactgc 70
<210> 28
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttatattgat cataattaat gttgaaccaa tcggcgtata ttttatgccc cttcgagcgt 60
cccaaaacct 70
<210> 29
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caggcagtta atagaaaaaa tatgatatga atgaatattc cactttcttt cggtgtgaac 60
agcgacaata 70
<210> 30
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tagaaaaaaa tgagaagttg ttctgaacaa agtaaaaaaa agaagtatac taacgaacgc 60
agaattttcg 70
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctacattcat aataaccaaa agctcataac t 31
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgggaaaagc agtggcatta 20
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gttagatccc aggcgtagaa ca 22
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agctagaaat tctcaattga gcatc 25
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cctctattcg gagatatccc tgg 23
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agtcaggcct caagtttcct a 21
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gatgttcact tacatgttac aatgaagcca 30
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tgttttagtg tgaaggtacc tattgcaa 28
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgcagcggtt gaaagcatat caa 23
<210> 40
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aggaccactc ttacataact agaatagcat taagaatc 38
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gcctttttct gttttatgag ctactagtac actctatatt ttt 43
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctatccgtaa tcatggtcgg ctacataaga acacctttgg 40
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aacccagaat cccctatact aa 22
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aaaatataga gtgtactagt agctcataaa acagaaaaag gc 42
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccaaaggtgt tcttatgtag ccgaccatga ttacggatag 40
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aattggatct cccaagagta 20
<210> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
agattagaag atgtcttttt gctcattatc atgatacttc ttaactaccc gatcctcaaa 60
acccttaaaa 70
<210> 48
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tgagatcgtt aatgtaaaac tgacgttcga acggttgttg gtaatacact ctgaattgga 60
gcgacctcat 70
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctggacctgc atgtttgaca 20
<210> 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aatgtcagac gcttgatggt 20
<210> 51
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aatgcagctc ccataagagt 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaatataat cgtataagag 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccttgccaat gagttctaca 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
acggttgttg gtaatacact 20
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atttgcggcc gctttaatgt ctaaaggtga agaatt 36
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggactagtcc ttatttgtac aattcatcca 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctccctctc aacttcagaa tcttctttag aaatgagggc atttctgttt tatatttgt 59
<210> 58
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aagttgagag ggaggcgtca ggaggacgag agtcgctctc ggatgtcaat gagggctgg 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcctccctc tcaacttcag aatcttcttt agaaatgagg gcattttgta caattcatc 59
<210> 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gttgagaggg aggcgtcagg aggacgagag tcgctctcgg taaggactag tatcgatgg 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attgctgttc actttagtcg aggtggtggt ggtggtggta tgtctaaagg tgaagaatt 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagacacatc ttcattttta gatccttgta ccacattgtt ttatatttgt tgtaaaaag 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgaagatg tgtctggctt tagtaatcat catattgctt gttgtaatca tcgtcccca 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagacacatc ttcattttta gatccttgta ccacattgtt ttatatttgt tgtaaaaag 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atttttagat ccttgtacca accaccacca ccaccacctt tgtacaattc atccatacc 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtacaagg atctaaaaat gaagatgtgt ctggctttta aggactagta tcgatggat 59
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatggggacg atgattacaa caagcaatat gatgattact aaagccagac acatcttca 59
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ttgtaatcat cgtccccatt gctgttcact ttagtcgata aggactagta tcgatggat 59

Claims (6)

1.一种用于生产叶黄素的重组酵母，其特征在于，在酵母中外源导入八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε-环化酶基因、番茄红素β-环化酶基因、胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因，
八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε-环化酶基因、番茄红素β-环化酶基因、胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因的基因序列分别如SEQ IDNo.1～6所示，
八氢番茄红素合酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因、番茄红素ε-环化酶基因在组成型启动子下表达；番茄红素β-环化酶基因、胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因在半乳糖启动子下表达，且受温敏型转录激活因子Gal4M9调控，
在番茄红素ε-环化酶基因的上游端***有细胞膜定位序列PM1，细胞膜定位序列PM1的基因序列如SEQ ID No.7所示。
2.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶在组成型强启动子pTEF1或者pPGK1下表达。
3.如权利要求1所述的重组酵母，其特征在于，将六种酶的基因整合到酵母的染色体上构建稳定表达六种酶的重组酵母。
4.如权利要求3所述的重组酵母，其特征在于，整合的具***置：八氢番茄红素合酶基因整合在HO位点；八氢番茄红素脱氢酶基因整合在GAL80位点；番茄红素ε-环化酶基因整合在LPP1位点；番茄红素β-环化酶基因整合在TY4位点；胡萝卜素β-羟化酶基因和胡萝卜素ε-羟化酶基因整合在GAL1-7位点。
5.如权利要求1～4任一所述重组酵母在生产叶黄素中的应用。
6.一种生产叶黄素的方法，其特征在于，使用如权利要求1～4任一所述重组酵母进行发酵培养，先在温度30℃下，在八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素ε-环化酶的催化下，δ-胡萝卜素得到积累；然后，温度转到24℃后，番茄红素β-环化酶、胡萝卜素β-羟化酶、胡萝卜素ε-羟化酶开始表达，将δ-胡萝卜素转化成叶黄素。
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