CN105675774A - 唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用；包括以下步骤：从唾液样品中去除高丰度蛋白，滤去黏蛋白，分离提取外泌体，对所得外泌体进行表征，提取外泌体蛋白，对蛋白进行鉴定，并应用与肺癌生物标志物的发现。目前尚没有规范化的唾液外泌体制备技术，现有制备技术存在高丰度蛋白干扰和背景杂质干扰，导致外泌体回收率低、鉴定蛋白少等不足，难以反映真实的外泌体蛋白组学信息。本发明以成人健康志愿者和肺癌患者的唾液为样本，采用亲和层析色谱和膜分离结合技术，在去除了唾液的高丰度蛋白和黏蛋白后，通过离心提取唾液中的外泌体，并对其蛋白组进行分析，鉴定到了更多的外泌体蛋白。

Description

唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用。
背景技术
外泌体(ExtracellularVesicles)是指由细胞分泌到细胞外微环境的一种具有膜结构的囊泡，是细胞在向外出芽和细胞膜裂变的过程中释放出的含有胞膜成分的微小颗粒，能携带多种特异性蛋白质、microRNA、脂质等物质。外泌体的尺寸介于0.05～1.00μm之间，近年来的癌症机理研究证实外泌体与细胞间的物质、能量、信息传递相关，特别是癌症细胞之间或癌症细胞与正常细胞之间的相互影响。外泌体广泛存在于组织和体液中，在疾病的临床诊断、预后推测、健康管理等方面具有重要的指导作用。特别是肿瘤细胞来源的外泌体，其作为肿瘤细胞与外界环境信号交流的媒介，将肿瘤细胞所特有的蛋白、mRNA和miRNA等生物活性物质传递给周围的环境和细胞，在入侵其他细胞的同时改造微环境，使其向更有利于肿瘤发展的方向转变{M.Baj-Krzyworzekaetal.，Tumour-derivedmicrovesiclescarryseveralsurfacedeterminantsandmRNAoftumourcellsandtransfersomeofthesedeterminantstomonocytes.CancerImmunologyImmunotherapy55，808-818(2006)；K.Al-Nedawi，B.Meehan，J.Rak，MicrovesiclesMessengersandmediatorsoftumorprogression.CellCycle8，2014-2018(2009)；N.S.Barteneva，N.Maltsev，I.A.Vorobjev，Microvesiclesandintercellularcommunicationinthecontextofparasitism.FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology3，(2013).}。因此对于外泌体的研究已经成为癌症机理研究、疾病诊断的重要组成部分{E.Colombo，B.Borgiani，C.Verderio，R.Furlan，Microvesicles：novelbiomarkersforneurologicaldisorders.FrontiersinPhysiology3，63(2012)；B.Frey，U.S.Gaipl，Theimmunefunctionsofphosphatidylserineinmembranesofdyingcellsandmicrovesicles.SeminarsinImmunopathology33，497-516(2011)；J.Conde-Vancells，E.Gonzalez，S.C.Lu，J.M.Mato，J.M.Falcon-Perez，Overviewofextracellularmicrovesiclesindrugmetabolism.ExpertOpiniononDrugMetabolism&Toxicology6，543-554(2010).}。
目前对外泌体的研究还处于初级阶段，由于对其组成成分尚不完全清楚，对其生物学功能研究亟待加强。唾液作为一种含有大量生物信息的体液，其用于临床诊断优势明显，因具有在于非侵入、安全、简便等特点，在疾病的分子诊断领域具有广阔的应用前景。同时，唾液中蕴藏着丰富的外泌体，对其进行研究有望为各种疾病发现早期诊断的生物标志物。
目前，唾液外泌体的提取方法存在提取方法繁琐、提取效率较低、背景干扰严重等不足。例如超高速离心方法需要的离心力为200000g以上，且需要30mL的大量生物样本才能得到10μg的蛋白{M.Gonzalez-Begneetal.，ProteomicAnalysisofHumanParotidGlandExosomesbyMultidimensionalProteinIdentificationTechnology(MudPIT).JournalofProteomeResearch8，1304-1314(2009).}。采用沉淀的方法虽然提高了提取效率，但是却无法解决背景杂质的干扰问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一种唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用。具体而言，本发明使用亲和层析色谱技术与滤膜一体化技术，去除了唾液中的高丰度蛋白和黏蛋白，再用冷冻离心的方法制备了唾液外泌体，并对其在分子诊断中的应用进行了研究，如根据肺癌患者和健康人的蛋白组学差异寻找肺癌的生物标志物。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种唾液外泌体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、通过亲和层析色谱法去除唾液中的高丰度蛋白，结合滤膜去除黏蛋白；
S2、对步骤S1处理后的唾液进行冷冻离心，提取唾液外泌体及唾液外泌体蛋白。
在本发明中，上述冷冻离心可重复操作3～5次。所述高丰度蛋白包括唾液淀粉酶。
优选的，所述亲和层析色谱法以淀粉为固定相，以磷酸盐缓冲液为流动相。洗脱速度为700～900μL/min。
优选的，所述滤膜为1.0～5.0μm聚偏氟乙烯膜。该滤膜连接在亲和层析色谱柱后以完成色谱和膜分离技术的一体化。在本发明中，采用该孔径的滤膜，可有效去除黏蛋白。
优选的，所述冷冻离心的条件为4℃、离心力10000～20000g、30～90分钟。更优选为60～80分钟。
优选的，提取唾液外泌体蛋白包括裂解释放唾液外泌体中的蛋白、对裂解液(上清液)进行沉淀获得唾液外泌体蛋白的步骤。
优选的，所述裂解为用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)对所述唾液外泌体进行冰上裂解30～90分钟。更优选每150μL唾液外泌体加入1μLTriton-100进行冰上裂解30～60分钟。裂解时，还加入了2.5μL蛋白酶抑制剂(每150μL唾液外泌体)。裂解后，加入10倍裂解液体积的冰乙醇过夜沉淀。
优选的，步骤S2后，还包括采用液相色谱和质谱联用技术进行外泌体蛋白种类鉴定的步骤。
本发明还涉及一种上述方法制备的唾液外泌体在制备生物标志物中的用途。
优选的，所述生物标志物为用于研究癌症用途的生物标志物。所述生物标志物为用于研究癌症，同时不是用于诊断用途的生物标志物。
优选的，所述生物标志物为肺癌、口腔癌、胃癌或肝癌的生物标志物。
优选的，通过所述制备方法提取得到唾液外泌体蛋白，差异对比，获得相应癌症的唾液外泌体生物标志物。
本发明针对的是唾液样本，由于其中50～60％的蛋白为唾液淀粉酶和黏蛋白，严重影响唾液外泌体的分离提取。为特异性地去除唾液淀粉酶，本发明选取淀粉为基质制成亲和层析色谱柱，通过亲合作用去除背景干扰。同时，在亲合层析色谱柱之后连接滤膜，构成一体化柱色谱和膜过滤***，除去唾液内含有的大量黏蛋白，减少相关蛋白的团聚和唾液外泌体的粘附，从而大大提高外泌体的提取效率。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供了一种操作简单、回收率高的唾液外泌体及其蛋白的制备方法。
2、利用本发明的一体化唾液处理技术，可以有效分离提取唾液内的外泌体，避免高丰度蛋白和黏蛋白的影响，有利于将正常人与肺癌病人唾液中的外泌体进行对比，进而从唾液的外泌体蛋白中发现肺癌相关的生物标志物。
3、本发明采取以淀粉为基质的亲和层析色谱技术与过滤离心方法相结合，建立了亲和层析色谱和膜结合***，在提高了提取效率的同时，去除了高峰背景蛋白的干扰，鉴定到了更多种类的外泌体蛋白，有助于对外泌体蛋白组开展深入研究。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明方法的流程示意图；
图2为分别利用常规离心方法和本发明所述方法进行外泌体分离后外泌体蛋白的对照SDS-PAGE；其中，a为蛋白marker，b为1.0μg唾液蛋白，c为1.0μg用本发明方法得到的唾液外泌体蛋白，d为1.0μg常规离心方法得到的唾液外泌体蛋白；
图3为分别利用常规离心方法和本发明所述方法进行外泌体分离后外泌体蛋白的粒度分布图；其中，A为本发明方法制备的唾液外泌体，B为离心方法制备的唾液外泌体；
图4为HPLC对唾液外泌体蛋白肽段的分离对比图，其中，A是离心方法制备的唾液外泌体蛋白肽段，B是本发明方法制备的唾液外泌体蛋白肽段。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
1、提取唾液外泌体
唾液外泌体的制备方法如图1所示，采集成人健康志愿者和肺癌患者的唾液样本，通过亲和层析色谱和膜分离结合技术去除高丰度的蛋白和黏蛋白等背景干扰蛋白，具体方法为以1∶1的淀粉和蛋白比例制备亲和层析色谱柱的固定相，后连接5μm的PVDF膜以完成色谱和膜分离技术的一体化。首先用流动相PBS进行色谱柱的平衡和膜的活化。后在色谱进样端进相应比例的唾液样本，并以800μL/min的速度，总体积为2mL的流动相PBS洗脱唾液样本。收集洗脱的样本在4℃，20000g离心60分钟，弃上清，保留外泌体。用磷酸盐缓冲液缓慢重悬外泌体，在4℃，20000g离心60分钟，弃上清保留外泌体，重复上述步骤2-3次。取10μL唾液外泌体悬浮液，Nanosight测定唾液外泌体粒度。结果如图2所示；本发明方法得到了尺寸分布更宽的唾液外泌体。
2、提取唾液外泌体蛋白
取300μL唾液提取的外泌体，加入100μL磷酸盐缓冲液。再加入2μLTriton-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、5μL蛋白酶抑制剂cocktail冰上裂解30分钟。在4℃，20000g离心60分钟，上清即为外泌体蛋白裂解液。再加入10倍体积的冰乙醇过夜沉淀得到唾液外泌体蛋白。取1.0μg唾液外泌体蛋白进行SDS-PAGE表征。结果如图3所示，唾液外泌体和唾液的组成不同，且本发明方法得到更多的唾液外泌体蛋白。
3、外泌体蛋白鉴定
取10μg唾液外泌体蛋白进行溶液内酶解，并采用q-TOF-MS/MS，对得到了唾液外泌体肽段进行鉴定，肽段分离结果如图4所示，本发明方法得到了更多的肽段组分。
表1本发明方法和离心方法提取外泌体蛋白的对比
表2是与肺癌患者唾液外泌体蛋白对比后的63个差异蛋白
由表1可知，本发明的方法相比离心得方法更稳定可信且得到了更多的外泌体蛋白，说明本方法有助于唾液外泌体及外泌体蛋白的提取。
由表2可知，通过对健康人与肺癌患者的唾液外泌体蛋白组的差异分析，发现了63种差异蛋白，其中有12种蛋白(绿色标记)已有文献报道与肺癌相关。说明本方法有助于发展基于外泌体的肺癌唾液分子诊断技术。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种唾液外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、通过亲和层析色谱法去除唾液中的高丰度蛋白，结合滤膜去除黏蛋白；
S2、对步骤S1处理后的唾液进行冷冻离心，提取唾液外泌体及唾液外泌体蛋白。
2.根据权利要求1所述的唾液外泌体的制备方法，其特征在于，所述亲和层析色谱法以淀粉为固定相，以磷酸盐缓冲液为流动相。
3.根据权利要求1所述的唾液外泌体的制备方法，其特征在于，所述滤膜为1.0～5.0μm聚偏氟乙烯膜。
4.根据权利要求1所述的唾液外泌体的制备方法，其特征在于，所述冷冻离心的条件为4℃、离心力10000～20000g、60～80分钟。
5.根据权利要求1所述的唾液外泌体的制备方法，其特征在于，提取唾液外泌体蛋白包括裂解释放唾液外泌体中的蛋白、对裂解液进行沉淀获得唾液外泌体蛋白的步骤。
6.根据权利要求5所述的唾液外泌体的制备方法，其特征在于，所述裂解为用聚乙二醇辛基苯基醚对所述外唾液泌体进行冰上裂解30～90分钟。
7.根据权利要求1所述的唾液外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S2后，还包括采用液相色谱和质谱联用技术进行外泌体蛋白种类鉴定的步骤。
8.一种如权利要求1所述的方法制备的唾液外泌体在制备生物标志物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征是，所述生物标志物为用于研究癌症用途的生物标志物。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征是，所述生物标志物为肺癌、口腔癌、胃癌或肝癌的生物标志物。
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