CN110498803B

CN110498803B - 一种基于罗丹明内酰肼结构的化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110498803B
Application number: CN201910843109.4A
Authority: CN
Inventors: 唐波; 刘炬; 王慧; 李平; 李婧
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2039-09-06
Also published as: CN110498803A

Abstract

本发明提供一种基于罗丹明内酰肼结构的化合物及其制备方法与应用。其中，所述化合物结构式如下：

本发明的基于罗丹明内酰肼结构的化合物能够检测Pd²⁺，且是具有普适性的，即该策略可以应用于罗丹明内酰肼结构检测活细胞中的金属离子的问题。荧光探针在检测Pd²⁺的应用中展现出了响应倍数高、选择性好等诸多优势，并且成功应用到了活细胞的共聚焦荧光的成像当中，是一种新型的成像工具，为今后发展检测金属离子荧光探针提供了新思路和新策略。具有良好的实际应用之价值。

Description

一种基于罗丹明内酰肼结构的化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于有机化合物合成及荧光检测技术领域，具体涉及一种基于罗丹明内酰肼结构的化合物及其制备方法与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

钯是一种重金属，它在生活中是极其常见的，且发挥着重要作用。其优势体现在它具有稳定的性质、良好的生物相容性以及可变的化学性质，因而它在合金材料、各种珠宝、医用牙冠、化学燃料电池、反应催化剂，以及汽车的催化转换器中得到了广泛应用。

但是值得一提的是，钯的广泛使用同时也给人及其他生物的健康带来一定危害，主要是因为钯不能够被生物降解。所以，以上各种途径中产生的各类产品中的钯可能就在食物链中不断积累。当钯的量积累到一定程度时，就可能会使得细胞中的线粒体以及DNA的降解，另一方面也会导致部分酶的作用受到抑制。所以，国家对成年人每天食物中摄入的钯的量作出了一定的限制，这个值应该低于1.5-15μg。所以，发展一种高效且对钯具有良好选择性和低检测限的方法是刻不容缓的。

荧光分子探针的反应原理明确，荧光开关容易控制，且具有高灵敏性，不被电磁场干扰，能够进行远距离的实时在线监测。基于上述的优点，荧光分子探针在生命科学、化学及医学等领域受到了科研工作者的极大关注，成为了一个研究热点，并广泛应用于各个领域。然而，发明人发现，目前检测Pd²⁺的方法普遍存在检测限高或选择性不好的问题，同时由于检测探针使用的化合物往往具有较高的细胞毒性，使其在应用于活细胞检测时受到限制。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种基于罗丹明内酰肼结构的化合物及其制备方法与应用，该化合物可作为荧光探针，且能对Pd²⁺进行成像，且具有灵敏度高、选择性高以及合成简便的优点。具有良好的实际应用之价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一种式(I)化合物，其结构式为：

本发明的第二个方面，提供上述式(I)化合物的制备方法，所述方法包括以罗丹明B、水合肼和8-羟基喹啉-2-甲醛为原料，按照如下反应路线进行反应制备：

本发明的第三个方面，提供式(I)化合物的用途，为下述1)-7)中的至少一种：

1)由式(I)化合物制成的荧光探针；

2)式(I)化合物在作为荧光探针或作为检测钯离子的荧光探针中的应用；

3)含有式(I)化合物的光学传感器；

4)式(I)化合物在制备光学传感器或检测钯离子的光学传感器中的应用；

5)式(I)化合物在检测钯离子中的应用；

6)上述1)的荧光探针在检测钯离子中的应用；

7)上述3)的光学传感器在检测钯离子中的应用。

其中，式(I)化合物、1)所述荧光探针和3)所述光学传感器均可用于检测钯离子，所述检测环境可以是液相环境，更进一步的，可以应用于活细胞内钯离子的检测。

当式(I)化合物作为荧光探针或作为光学传感器，遇到Pd²⁺时，罗丹明B内酰肼结构被诱导开环，PET效应被禁阻，荧光辐射增强，体现出off-on型的荧光信号。

本发明的有益效果为：

1.本发明提供了一种基于罗丹明内酰肼结构的能够检测Pd²⁺的设计策略，是具有普适性的，即该策略可以应用于罗丹明内酰肼结构检测活细胞中的金属离子的问题。

2.荧光探针在检测Pd²⁺的应用中展现出了响应倍数高、选择性好等诸多优势，并且成功应用到了活细胞的共聚焦荧光的成像当中，经试验验证，其对其他常见金属及类金属离子荧光响应度极低，表明其适用于对Pd²⁺进行高灵敏度和高选择性的检测，因此其作为一种新型的成像工具，为今后发展检测金属离子荧光探针提供了新思路和新策略。

3.本发明的探针的生物相容性好，对细胞和活体损伤小。

本发明的设计策略和合成路线简便，且原料均为廉价易得的，有望应用于市场化的生产，因此具有较强的推广价值和应用价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例1制备的荧光探针的荧光发射光谱图，其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光发射强度。

图2是本发明实施例1制备的荧光探针的紫外吸收谱图，其中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为紫外吸收强度。

图3是本发明实施例1制备的荧光探针与各种金属离子的选择性测定图。已检测的金属离子从左到右依次是：Zn²⁺、Sn²⁺、Pt²⁺、Ni²⁺、NH₄ ⁺、Na⁺、Mg²⁺、Li⁺、La⁺、K⁺、Eu³⁺、Fe²⁺、Er³⁺、Cs⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Pd²⁺，其中Pd²⁺的浓度为50μM，其他离子浓度均为1mM。

图4是本发明实施例1制备的荧光探针对人脐静脉内皮细胞的毒性图；

图5是本发明实施例1制备的荧光探针在人脐静脉内皮细胞内对Pd²⁺随时间变化的共聚焦荧光成像图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

正如背景技术所介绍的，现有技术中对于检测Pd²⁺的荧光探针特别是对于活细胞内Pd²⁺检测探针的研究较少，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种新型的基于罗丹明内酰肼结构细胞内检测Pd²⁺的荧光探针的设计策略及合成方法。

本发明的一个典型实施方式中，提供一种式(I)化合物，其结构式为：

本发明的又一具体实施方式中，提供上述式(I)化合物的制备方法，以罗丹明B、水合肼和8-羟基喹啉-2-甲醛为原料，按照如下反应路线进行反应制备：

本发明的又一具体实施方式中，罗丹明B和水合肼反应体系的溶剂为乙醇；优选为无水乙醇。

本发明的又一具体实施方式中，罗丹明B与水合肼的物质的量比为1：5-10。

本发明的又一具体实施方式中，罗丹明B和水合肼的反应温度为75℃-85℃，反应的时间为8h-12h。

本发明的又一具体实施方式中，式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛反应体系的溶剂为乙醇；优选为无水乙醇。

本发明的又一具体实施方式中，式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛反应的温度为75℃-85℃(优选为80℃)，反应时间为3-8h(优选为6h)，通过优化反应温度(使反应温度接近乙醇的沸点)和反应时间，从而使反应更为充分，产率更高。

本发明的又一具体实施方式中，式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛的物质的量之比为1:1。

本发明的又一具体实施方式中，式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛反应的催化剂为乙酸，使用该催化剂能够为反应提供一个弱酸环境，且中和反应中产生的碱。

本发明的又一具体实施方式中，提供式(I)化合物的用途，为下述1)-7)中的至少一种：

1)由式(I)化合物制成的荧光探针；

3)含有式(I)化合物的光学传感器；

5)式(I)化合物在检测钯离子中的应用；

6)上述1)的荧光探针在检测钯离子中的应用；

7)上述3)的光学传感器在检测钯离子中的应用。

其中，1)所述荧光探针和3)所述光学传感器均可用于检测钯离子，所述检测环境可以是液相环境，更进一步的，可以是应用于活细胞内钯离子的检测。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1荧光探针的合成

取原料罗丹明B(1.0g)及水合肼(0.5ml)溶于25mL的无水乙醇中，80℃下回流12h。反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂。随后用乙酸乙酯：石油醚＝1:1作为洗脱剂，柱层析法提纯化合物即得白色固体中间产物罗丹明内酰肼(90％)。

取中间产物罗丹明内酰肼(0.944g)与8-羟基喹啉-2-甲醛(0.346g)，溶于3ml乙醇中，加入乙酸(0.01ml)，80℃回流加热6h。反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂。随后用乙酸乙酯：石油醚＝1:1，柱层析法提纯化合物得浅黄色粉，即为最终探针(80％)。

核磁及质谱表征：

1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.67(s,1H),8.03(dt,J＝18.6,8.7,4H),7.55–7.45(m,2H),7.35(t,J＝7.9,1H),7.21(d,J＝8.1,1H),7.15(d,J＝7.2,1H),7.07(d,J＝7.4,1H),6.55(d,J＝8.8,2H),6.50(d,J＝2.1,2H),6.25(dd,J＝8.9,2.3,2H),3.31(q,J＝6.9,8H),1.14(t,J＝7.0,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ＝165.40,153.15,152.54,152.17,149.09,146.02,137.54,135.86,133.87,128.68–128.29,128.10,127.89,123.98,123.65,118.86,117.71,110.10,108.09,105.61,98.06,66.16,44.35,34.14,31.58,29.73,22.30,14.09,12.63,11.80.LRMS(ESI)m/z:[M+H]calculated for C38H37N5O3,612.29found612.80

效果实验：

通常，可以将染料分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙腈、二甲亚砜等水溶性有机溶剂，然后加入适当缓冲液及其他有机试剂进行测试。分别研究了探针在pH＝7.4缓冲水溶液及各种常见的有机试剂中的光物理性质并将其用于活细胞成像实验。活细胞的染色方法是将培养好的细胞放于含有探针分子的缓冲溶液中孵育，孵育一定的时间后除去孵育液，进行共聚焦成像实验。

探针与Pd²⁺反应的紫外吸收、荧光发射及选择性实验：

对照组：探针(50μM)、PBS缓冲溶液(10mM)、pH＝7.4；实验组：探针(50μM)、PBS缓冲溶液(10mM)、pH＝7.4、Pd²⁺(50μM)。将对照组和实验组都在37℃下孵育30min，然后分别以其最大吸收为单光子激发波长，测量其紫外吸收与荧光发射光谱图，其光谱图显示于图1和图2。横坐标为波长(nm)，图1纵坐标为荧光强度、图2纵坐标为紫外吸收强度。图3为探针对多种的金属离子的响应情况，已检测的金属离子从左到右依次是：Zn²⁺、Sn²⁺、Pt²⁺、Ni²⁺、NH₄ ⁺、Na⁺、Mg²⁺、Li⁺、La⁺、K⁺、Eu³⁺、Fe²⁺、Er³⁺、Cs⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Pd²⁺，其中Pd²⁺的浓度为50μM，其他离子浓度均为1mM。如图3所示，只有当Pd²⁺存在时，荧光强度有显著的增强且响应倍数高达230倍。这个说明与生物体内其他组分相比，探针对Pd²⁺有极好的选择性，可以用在复杂的细胞及活体生物环境中，特异性检测Pd²⁺。

探针的细胞毒性实验：

人脐静脉内皮细胞HUVEC是由高糖的DMEM培养液培养的，在细胞中加入3-(4,5-二甲基噻哩-2)-2,5-二苯基四氮挫溴盐(MTT)，通过细胞的存活率来验证了探针对细胞的毒性。探针选取了五个浓度分别为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、20μM、50μM。结果如图4，细胞的存活率都在80％以上，探针对细胞毒性很小。由此证实了探针的毒性很低，可以用于细胞内的荧光检测。

探针对活细胞共聚焦荧光成像实验：

人脐静脉内皮细胞HUVEC是由高糖的DMEM培养液培养的。37℃下探针(5μM)孵育细胞30min，随后用Hepes缓冲溶液冲洗细胞至少三次，洗掉多余的没有进入细胞的探针，以防对成像产生干扰。然后在玻底皿中加入Pd²⁺，浓度为5μM，放到显微镜下进行激光共聚焦荧光成像。每隔5min拍一次，结果如图5所示，可以观察到，荧光的亮度随着时间的增长而明显增强，表明探针在细胞内可以检测Pd²⁺。单光子激发光为514nm，红色通道收集530nm-600nm。

实施例2荧光探针的合成

取原料罗丹明B(0.8g)及水合肼(0.8ml)溶于15mL的无水乙醇中，85℃下回流10h。反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂。随后用乙酸乙酯：石油醚＝1:1作为洗脱剂，柱层析法提纯化合物即得白色固体中间产物罗丹明内酰肼(60％)。

取中间产物罗丹明内酰肼(0.653g)与8-羟基喹啉-2-甲醛(0.478g)，溶于10ml乙醇中，加入乙酸(0.1ml)，70℃回流加热4h。反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂。随后用乙酸乙酯：石油醚＝1:1，柱层析法提纯化合物得浅黄色粉，即为最终探针(40％)。

实施例3荧光探针的合成

取原料罗丹明B(1.2g)及水合肼(0.4ml)溶于35mL的无水乙醇中，70℃下回流8h。反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂。随后用乙酸乙酯：石油醚＝1:1作为洗脱剂，柱层析法提纯化合物即得白色固体中间产物罗丹明内酰肼(76％)。

取中间产物罗丹明内酰肼(0.944g)与8-羟基喹啉-2-甲醛(0.2g)，溶于5ml乙醇中，加入乙酸(0.001ml)，80℃回流加热6h。反应完毕后，旋转蒸发除去溶剂。随后用乙酸乙酯：石油醚＝1:1，柱层析法提纯化合物得浅黄色粉，即为最终探针(55％)。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种荧光探针在检测钯离子中的应用，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述荧光探针的制备方法为：以罗丹明B、水合肼和8-羟基喹啉-2-甲醛为原料，按照如下反应路线进行反应制备：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：罗丹明B和水合肼反应体系的溶剂为乙醇。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述乙醇为无水乙醇。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：罗丹明B与水合肼的摩尔比为1：5-10。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：罗丹明B和水合肼反应的温度为75-85℃，反应的时间为8-12h。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛反应的温度为75-85℃，反应的时间为3-8h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛反应的温度为80℃，反应的时间为6h。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛反应的溶剂为乙醇。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述乙醇为无水乙醇。

11.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛的物质的量之比为1:1。

12.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：式(II)化合物与8-羟基喹啉-2-甲醛反应的催化剂为乙酸。

13.一种光学传感器，其特征在于：所述光学传感器包括权利要求1所述应用中的荧光探针。

14.根据权利要求13所述的光学传感器，其特征在于：所述光学传感器为检测钯离子的光学传感器。