CN106544008A - 一种基于罗丹明6g的铬离子检测荧光探针分子、制备方法及用途 - Google Patents
一种基于罗丹明6g的铬离子检测荧光探针分子、制备方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子，该荧光探针分子具有如下所示结构。本发明还公开了所述基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的制备方法以及用于铬离子检测的用途。
Description
技术领域
本发明属于有机功能材料领域，具体涉及一种基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子和制备方法及其用于铬离子检测的用途。
背景技术
三价铬主要存在于葡萄糖耐量因子中，作为活性成分发挥作用。目前的研究表明，一般食物中的铬均为三价铬,三价铬在糖类、蛋白质、脂肪、核酸以及氨基酸的合成代谢起到重要的作用。人体中铬含量甚微，成人含铬总量为1.7～6mg，主要存在于肺、肌肉、肝、心、肾、脑等器官中。铬元素的缺乏会导致葡萄糖耐量降低，生长速度和寿命下降、血清胆固醇水平升高等病症。研究已经证实，六价铬的化合物有毒，具有致癌和诱发基因突变的作用，而三价铬的致癌性和诱发基因突变的作用还没有被实验所证实。不过在体外高浓度三价铬存在的条件下，三价铬也能诱导产生自由基，与DNA发生作用，致使人类衰老和患病。
目前，对于铬离子的常见测试方法中，虽然普遍具有灵敏度较高的特点，但是检测成本高、样品制备复杂、测试过程长等问题仍广泛存在。发明一种简单、快速、灵敏的检测方法，对环境和烟叶及相关制品中铬离子的检测具有十分重要意义。基于分子荧光探针的检测是近年来发展起来的一个具有灵敏度高、选择性好、易于操作的可视化观测方法，可以较好的满足简单、快速、灵敏的检测要求。
发明内容
在本项发明中，我们研究了罗丹明衍生物、制备方法及其应用。罗丹明作为典型的开/关型荧光团，预期在与特定的金属离子(如铬离子)结合后导致C—N键断开，从而产生颜色及荧光的变化，实现对溶液体系中铬离子的选择性识别及检测。该化合物合成方法简单、收率高，化合物本身毒性小，对铬离子的识别具有高效的选择性，分辨时间短，颜色及荧光变化明显。由于该化合物具有良好的细胞穿透能力，因此在溶液实验的基础上，实现了对铬离子在线虫体内荧光成像。基于以上优势，我们认为该罗丹明衍生物1在铬离子高选择性荧光识别检测方面具有良好的应用前景。
本发明所要解决的技术问题是提供一种高选择性的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子和制备方法及其用于铬离子检测的用途。
本发明第一方面涉及一种基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子，该铬离子检测荧光探针分子具有如下结构：
本发明第二方面涉及所述基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗丹明6G和水合肼在甲醇中加热回流4～6小时，得到的絮状沉淀经抽滤后，经硅胶层析柱用第一洗脱剂分离提纯，得到的固体物质为罗丹明6G酰肼化合物；
(2)将步骤(1)得到的罗丹明6G酰肼化合物和2-醛基-8-羟基喹啉溶解到沸腾的乙醇中，加入冰醋酸，在氮气的保护下加热回流6～10小时，得到的沉淀物质经溶剂洗涤过滤后，经硅胶层析柱用第二洗脱剂分离提纯，得到的固体物质为罗丹明6G的衍生物；
(3)将2-氨基吡啶和氯乙酰氯在加有几滴三乙胺的二氯甲烷中室温反应3～5小时，得到的反应液用水萃取三次，得到的有机相再用无水硫酸钠干燥并过滤，然后减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用第三洗脱剂分离提纯，得到化合物2-氯-N-吡啶乙酰胺化合物；
(4)将碳酸钾、碘化钠以及步骤(2)得到的罗丹明6G的衍生物溶解到丙酮中，回流0.5～2小时后，加入步骤(3)得到的2-氯-N-吡啶乙酰胺化合物，在氮气的保护下加热回流12～14小时；反应结束后将反应液冷却至室温，在冰浴条件下用饱和NH4Cl调节pH为7左右，然后用二氯甲烷萃取三次(3×20mL)，得到的有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用第四洗脱剂分离提纯，得到的固体物质即为基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子。
优选地，所述步骤(1)中罗丹明6G、水合肼和甲醇的比例为3g:1mL:50mL，所述第一洗脱剂为正己烷：二氯甲烷：甲醇体积比为10:4:1的混合物。
优选地，所述步骤(2)中罗丹明6G酰肼化合物和2-醛基-8-羟基喹啉以及冰醋酸的摩尔比为3:2:0.1，所述溶剂为乙醇:***积比为1:1的混合物，所述第二洗脱剂为二氯甲烷。
优选地，所述步骤(3)中2-氨基吡啶、三乙胺和氯乙酰氯的摩尔比为1:1.1:1.1，所述第三洗脱剂为二氯甲烷:乙酸乙酯体积比为3:1的混合物。
优选地，所述步骤(4)中罗丹明6G的衍生物4，2-氯-N-吡啶乙酰胺5，碳酸钾以及碘化钠的摩尔比为1:1.2:2:0.56，所述第四洗脱剂为二氯甲烷:乙酸乙酯体积比为3:1的混合物。
本发明第三方面涉及所述的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子用于水体样品、烟草样品、活体内铬离子检测的用途。
优选地，所述活体为秀丽线虫。
本发明的有益效果：
1、本发明的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子合成方法简单、收率高。
2、本发明的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子激发和发射光谱在可见区，对溶剂极性不敏感，并且化学稳定性好。
3、本发明的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子含有多个可与铬离子发生络合作用的胺基基团，可以形成多个氢键进而实现络合识别作用，对铬离子有很好的选择性，对Na+,K+,Ca2+,Mg2+等常见金属离子及其阴离子具有很好的抗干扰能力。
4、本发明的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子络合铬离子前后荧光发射约有13倍的增长，检测灵敏度高，且分辨时间短，可应用于环境水体样品、烟草样品、活体内的铬离子检测，具有广泛应用前景。
5、本发明基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子细胞渗透性好，对细胞本身毒副作用小，可以实现线虫体内铬离子的荧光检测。
附图说明
图1为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的合成路线；
图2为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的1H-NMR谱图；
图3为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的13C-NMR谱图；
图4为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的HRMS(ESI)谱图；
图5为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中对铬离子响应的紫外变化光谱图；
图6为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中对不同金属离子在528nm处紫外强度柱状图；
图7为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中对铬离子响应荧光光谱变化图；
图8为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子1在水溶液体系中对不同金属离子在556nm处荧光强度柱状图；
图9为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中对不同浓度铬离子紫外光谱变化图；
图10为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在528nm处吸光度与相对应Cr3+离子浓度拟合曲线图；
图11为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中对不同浓度铬离子荧光光谱变化图；
图12为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在556nm处荧光强度与相对应Cr3+离子浓度拟合曲线图；
图13为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在线虫体内对铬离子荧光识别图。(其中，a-c为明场，d为只加入10μmol/L的探针化合物的荧光图片，e为先加入750μmol/L Cr3+哺育3h再加入10μmol/L的探针化合物再哺育2h的荧光图片，f为先加入1500μmol/L Cr3+哺育3h再加入10μmol/L的探针化合物1再哺育2h的荧光图片。)
具体实施方式
实施例1：基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的合成
具体合成路线见图1。
(1)2-醛基-8-羟基喹啉的制备：取0.32g的2-甲基-8-羟基喹啉(2mmol)溶解到20mL的二氧六环中。加热到60℃，再称取0.27g的SeO2加入到上述溶液中，然后将温度升至80℃，将反应混合物在氮气的保护下加热回流10小时。反应结束后，将反应液冷却至室温，所得沉淀用8mL的二氧六环和8mL的二氯甲烷清洗、过滤，并真空干燥。所得粗产物通过硅胶层析柱，用石油醚：乙酸乙酯＝9:1(v:v)洗脱，洗脱液经浓缩得到0.14g的浅黄色化合物。产率40.5％。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ10.2(s,1H),8.31-8.33(d,1H),8.15(s,1H),8.05-8.06(d,1H),7.6-7.64(m,1H),7.42-7.44(m,1H),δ7.2-7.3(m,1H)。
(2)罗丹明6G酰肼化合物的制备：称取0.3g罗丹明6G(0.63mmol)，溶解到5mL的甲醇中，再加入0.1mL水合肼。回流4～6小时，得到絮状沉淀。所得沉淀抽滤后，经硅胶层析柱，用正己烷：二氯甲烷：甲醇＝10:4:1(v:v:v)洗脱。洗脱液经浓缩、干燥得罗丹明6G酰肼化合物。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ7.96-7.94(m,1H),7.46-7.44(m,2H),7.06-7.05(m,1H),6.39(s,2H),6.26(s,2H),3.57(s,4H),3.23-3.20(m,4H),1.96-1.88(s,6H),1.36-1.25(m,6H)。
(3)基于罗丹明6G衍生物的合成：称取0.21g 2-醛基-8-羟基喹啉(1.2mmol)和0.307g罗丹明6G酰肼化合物(0.8mmol)溶解到沸腾的乙醇中，加入3滴冰醋酸，将反应混合物在氮气的保护下加热回流8小时。所得黄色沉淀用乙醇：***＝1:1(v:v)的溶剂清洗并过滤，然后经硅胶层析柱，用二氯甲烷洗脱，浓缩洗脱液得0.23g橙黄色化合物。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.87(s,1H),8.69(s,1H),8.24-8.22(d,1H),7.98-7.96(d,1H),7.87-7.85(d,1H),7.62-7.57(m,2H),7.40-7.38(d,2H),7.33-7.31(d,1H),7.09-7.05(t,2H),6.40(s,2H),6.27(s,2H),5.10(s,2H),3.17-3.12(m,4H),1.85(s,6H),1.23-1.19(t,6H)。
(4)2-氯-N-吡啶乙酰胺化合物的合成：取一个50mL的圆底烧瓶，在0℃条件下，加入2mmol(188mg)的2-氨基吡啶，再加入混有三乙胺(0.3mL)的无水二氯甲烷(15mL)。充分搅拌30分钟。然后在冰浴条件下，往上述混合液中逐滴滴加氯乙酰氯2.2mmol(0.175mL，混合5mL二氯甲烷)，滴加完毕后反应混合液在氮气保护及室温条件下反应3小时，点板确认反应结束后，先用30mL饱和食盐水清洗两次反应混和液，再用20mL水洗，并萃取，如此反复三次。得到有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸馏得到固体混合物，最后用二氯甲烷：乙酸乙酯＝3:1(v:v)作为洗脱剂过柱得到0.27g土黄色纯品。产率为78.5％。1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ8.87(s,1H),8.33-8.32(d,1H),8.21-8.18(d,1H),7.77-7.72(m,1H),7.09-7.13(m,1H),4.21(s,2H)。
(5)基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子(即本发明的化合物)的合成：取一个100mL的圆底烧瓶，分别加入1mmol(0.584g)的罗丹明6G衍生物4，2mmol(0.276g)的K2CO3和0.56mmol(0.084g)的NaI。加入30mL丙酮作为溶剂，充分反应1小时后，往上述混合液中逐滴滴加1.2mmol的2-氯-N-吡啶乙酰胺(化合物5，0.2050g，混合5mL丙酮)，加热回流搅拌12小时。点板确认反应结束后冷却至室温，在冰浴条件下用饱和NH4Cl调节pH为7左右，然后用二氯甲烷萃取(3×20mL)，得到的有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸馏得到固体混合物，最后用二氯甲烷：乙酸乙酯＝3:1(v:v)作为洗脱剂过柱得到0.43g橙黄色纯品，产率为60％。1H NMRδ(DMSO-d6):δ10.72(s,1H),8.76(s,1H),8.32-8.28(m,2H),7.98-7.96(d,1H),7.90-7.88(d,1H),7.62(d,1H),7.57(m,1H),7.50-7.48(m,3H),7.21(t,1H),7.06(t,1H),7.05(d,1H),6.35(s,2H),6.26(s,2H),5.08-5.06(t,2H),5.03(s,2H),3.12-3.09(m,4H),1.83(s,6H),1.20-1.16(m,6H).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:165.19,152.34,151.84,147.96,141.75,141.44,122.78,129.89,129.45,128.70,128.22,128.12,127.33,124.16,123.75,118.35,106.67,97.19,66.44,38.78,17.10,15.16.HRMS(ESI):calcd forC43H40N7O4[M+H]+＝718.3136,found m/z 718.3135.其中，DMSO-d6为氘代二甲基亚砜。相关谱图见图2～4。
实施例2：基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子对铬离子紫外检测的选择性
采用CH3CN(乙腈)：Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子用CH3CN:Tris-HCl＝9:1(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为10μmol/L的溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为10μmol/L的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的CH3CN：Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它11组分别加入75μL浓度为0.1mol/L的K+,Na+,Co2+,Ni2+,Zn2+,Pb2 +,Cd2+,Li+,Fe3+,Hg2+和Cr3+的高氯酸盐水溶液。静置3分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其紫外光谱。
基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子对铬离子的紫外选择性检测如图5所示。结果表明基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子仅对铬离子在528nm处出现明显的紫外吸收峰。该结果表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子对铬离子表现出高度的紫外选择性。
我们选用在528nm处各个离子的紫外吸收强度值制作相关柱状图，如图6所示，从图6中可以直观地看出探针的紫外选择性非常好。
实施例3：基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子对铬离子荧光检测的选择性
采用CH3CN(乙腈)：Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子用CH3CN:Tris-HCl＝9:1(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为10μmol/L的溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为10μmol/L的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的CH3CN:Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它11组分别再分别加入75μL浓度为0.1mol/L的K+,Na+,Co2+,Ni2+,Cu2+,Zn2+,Pb2+,Cd2+,Li+,Fe3+,Hg2+和Cr3+的高氯酸盐水溶液。静置3分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。激发波长为495nm，发射波长为556nm。基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子对铬离子荧光选择性检测如图7所示。可见基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在556nm处仅对Cr3+有明显的荧光增强现象(约13倍增强)，表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子对铬离子表现出高度的荧光选择性。
我们选用在556nm处各个离子的荧光强度值制作相关柱形图(图8)，图8可以直观地看出探针的荧光选择性非常好。
实施例4：基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子对铬离子的定量紫外检测
采用CH3CN(乙腈)：Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子用CH3CN：Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为10μmol/L的溶液。
称取0.9169g Cr(ClO)3·6H2O，用20mL去离子水溶解，配制成成浓度为0.1mol/L的Cr3+水溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为10μmol/L的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的CH3CN：Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液，再分别加入0μL～75μL浓度为0.1mol/L的Cr3+水溶液，使测试体系中铬离子浓度为0μmol/L～1500μmol/L。静置3分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其紫外光谱。
图9为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中随铬离子浓度变化的紫外光谱图。将紫外光谱528nm处吸光度与相应铬离子浓度进行拟合，在铬离子浓度为0μmol/L～1800μmol/L范围内得到一拟合曲线(图10)，表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测铬离子浓度。
实施例5：基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子对铬离子的定量荧光检测
采用CH3CN(乙腈)：Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液控制实验条件。
将基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子，用CH3CN：Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为10μmol/L的溶液。
称取0.9169g Cr(ClO)3·6H2O，用20mL去离子水溶解，配制成成浓度为0.1mol/L的Cr3+水溶液。
将样品瓶分为12组，每组各样品瓶分别加入5mL浓度为10μmol/L的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的CH3CN：Tris-HCl(0.01mol/L,pH＝7.4)＝9:1(v:v)溶液，再分别加入0μL～75μL浓度为0.1mol/L的Cr3+水溶液，使测试体系中铬离子浓度为0μmol/L～1500μmol/L。静置3分钟后，将各测试工作液转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。荧光测试光栅缝隙大小为5×5nm。图11为本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中随铬离子浓度变化的荧光光谱图。将荧光光谱556nm处的荧光强度与相应铬离子浓度进行拟合，在铬离子浓度为0μmol/L～1800μmol/L范围内得到一拟合曲线(图12)，表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测铬离子浓度。
实施例6：基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子在线虫体内对铬离子的荧光识别
将培养皿中的线虫用M9缓冲液(每升M9缓冲液中含有15.12克Na2HPO4·12H2O；3克KH2PO4；5克NaCl；0.25克MgSO4·7H2O)洗出来，分三组装到离心管中。再向这三组离心管中加入1mL M9溶液，然后向这三组离心管中分别加入浓度为0.1mol/L的铬离子溶液0μL、7.5μL、15μL，在室温条件下孵育3小时。线虫用M9缓冲液洗涤3次，在3000r/min速度下离心3分钟，之后向装有线虫的离心管内加入浓度为1mmol/L的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子10μL，并在20℃孵育2小时。线虫再次用M9溶液洗涤3次，在3000r/min速度下离心3分钟后转移到载玻片上进行荧光成像实验。结果见图13。图13c中可以看到基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子自身在线虫内基本无荧光发射，当铬离子浓度达到1500μmol/L时，线虫体内发射出黄绿色荧光(图13f)。该实验表明本发明所涉及的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子可以在线虫体内对铬离子进行荧光识别。实验所用仪器为OlympusBX51荧光显微镜。
Claims (8)
1.一种基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子，其特征在于，具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将罗丹明6G和水合肼在甲醇中加热回流4～6小时，得到的絮状沉淀经抽滤后，经硅胶层析柱用第一洗脱剂分离提纯，得到的固体物质为罗丹明6G酰肼化合物；
(2)将步骤(1)得到的罗丹明6G酰肼化合物和2-醛基-8-羟基喹啉溶解到沸腾的乙醇中，加入冰醋酸，在氮气的保护下加热回流6～10小时，得到的沉淀物质经溶剂洗涤过滤后，经硅胶层析柱用第二洗脱剂分离提纯，得到的固体物质为罗丹明6G的衍生物；
(3)将2-氨基吡啶和氯乙酰氯在加有几滴三乙胺的二氯甲烷中室温反应3～5小时，得到的反应液用水萃取三次，得到的有机相再用无水硫酸钠干燥并过滤，然后减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用第三洗脱剂分离提纯，得到化合物2-氯-N-吡啶乙酰胺化合物；
(4)将碳酸钾、碘化钠以及步骤(2)得到的罗丹明6G的衍生物溶解到丙酮中，回流0.5～2小时后，加入步骤(3)得到的2-氯-N-吡啶乙酰胺化合物，在氮气的保护下加热回流12～14小时；反应结束后将反应液冷却至室温，在冰浴条件下用饱和NH4Cl调节pH为7左右，然后用二氯甲烷萃取，得到的有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸馏得到固体混合物，经硅胶层析柱用第四洗脱剂分离提纯，得到的固体物质即为基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中罗丹明6G、水合肼和甲醇的比例为3g:1mL:50mL，所述第一洗脱剂为正己烷：二氯甲烷：甲醇体积比为10:4:1的混合物。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中罗丹明6G酰肼化合物和2-醛基-8-羟基喹啉以及冰醋酸的摩尔比为3:2:0.1，所述溶剂为乙醇:***体积比为1:1的混合物，所述第二洗脱剂为二氯甲烷。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中2-氨基吡啶、三乙胺和氯乙酰氯的摩尔比为1:1.1:1.1，所述第三洗脱剂为二氯甲烷:乙酸乙酯体积比为3:1的混合物。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中罗丹明6G的衍生物，2-氯-N-吡啶乙酰胺，碳酸钾以及碘化钠的摩尔比为1:1.2:2:0.56，所述第四洗脱剂为二氯甲烷:乙酸乙酯体积比为3:1的混合物。
7.一种根据权利要求1所述的基于罗丹明6G的铬离子检测荧光探针分子用于水体样品、烟草样品、活体内铬离子检测的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述活体为秀丽线虫。
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