CN110484562B

CN110484562B - 一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法

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Publication number: CN110484562B
Application number: CN201910913802.4A
Authority: CN
Inventors: 许明; 程祖锌; 黄昕颖; 郑金贵
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-09-25
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2039-09-25
Also published as: CN110484562A

Abstract

本发明涉及一种用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法，属于植物基因工程技术领域。本发明从富含三萜皂苷的韩国高丽人参中克隆AP2/ERF类转录因子PgERF1，构建含PgERF1基因的植物表达载体，遗传转化水稻获得转基因植株，荧光定量PCR检测水稻甾醇生物合成相关基因的表达，并对转基因水稻种子的甾醇含量进行测定。本发明获得的转基因水稻甾醇的含量显著提高，最高是非转化对照的1.93倍，从而提供了一种有效提高水稻甾醇的方法，对提高水稻的营养保健价值具有重要意义。

Description

一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法。

背景技术

植物甾醇又称植物固醇，是一种广泛存在于植物中的天然活性物质，具有降低胆固醇、抗氧化、预防心血管疾病等多种生理保健功能。植物甾醇在植物油类、坚果种子类、豆类等食物中较为丰富，而在主食稻米中含量相对较低，并且主要富集在稻米加工后的米糠等附产物中。提高稻米中的甾醇含量对于促进人体健康具有重要意义。

植物甾醇是类异戊二烯途径的代谢产物，与三萜类皂苷具有相同的前期代谢途径，该途径需要多个关键酶共同催化完成：首先由甲羟戊酸(Mevalonic acid)生成的异戊烯二磷酸(IPP)在香草二磷酸合成酶(merase; GPS:geranylgeranyl pyrophoGPS)作用下形成香叶二磷酸(GPP)，接着利用法呢二磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase，FPS)转化成法呢二磷酸(FPP)，然后在鲨烯合成酶(Squalene synthase，SS)的作用下合成鲨烯，再经鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase，SE)催化转变为2,3-氧化鲨烯(2，3-oxidosqualene)。最后，2,3-氧化鲨烯经过2,3-氧化鲨烯环化酶(OSCs)的环化作用得到植物甾醇和三萜类骨架。

大量研究表明，单独调节萜类化合物合成途径中的某一个关键酶基因不能足以提高其代谢终产物产量，但是某些特定的转录因子可以通过与该合成途径多个关键酶基因的启动子结合，调控这些基因的表达和转录的起始，进而调控萜类化合物的合成，AP2/ERF转录因子就是其中重要一员。例如长春花 (Catharanthus roseus )AP2/ERF类转录因子ORCA3 可调控参与萜类吲哚生物碱生物合成相关基因的表达；青蒿 (Artemisia apiacea)AaERF1和AaERF2 转录因子可以促进青蒿素前体紫穗槐-4,11-二烯至青蒿酸的合成，从而提高青蒿素的含量；此外，从紫杉(Taxus cuspidata)中分离的AP2/ERF转录因子TcAP2 转录因子可通过调控紫杉醇生物合成途径中关键酶基因的表达而增加紫杉醇的积累。珠子参(Panax japonicas) PjERF1转录因子可显著增强珠子参皂苷合成途径关键酶基因的表达量，进而提高了珠子参皂苷的产量。人参(Panax ginseng)是三萜皂苷含量最高的药用植物，将其AP2/ERF转录因子转入水稻中，促进水稻甾醇合成途径相关基因的表达，可以为提高稻米的甾醇含量提供一条行之有效的途径。目前尚未发现与本发明主题所提及的利用人参AP2/ERF类转录因子提高水稻甾醇含量的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)采用基因克隆方法获得人参AP2/ERF类转录因子PgERF1；

(2)将PgERF1基因可操作性地连接于表达调控载体，形成含PgERF1基因的植物表达载体；

(3)将含PgERF1基因的植物表达载体转化进根癌农杆菌，获得用于转化水稻的含PgERF1基因植物表达载体的根癌农杆菌工程菌；

(4)利用所构建的根癌农杆菌工程菌株转化水稻愈伤组织，经PCR检测获得转基因水稻植株；

(5)荧光定量PCR测定转基因水稻种子中甾醇生物合成相关基因的表达；

(6)对获得的转基因水稻种子中甾醇含量进行测定，获得甾醇含量显著提高的转基因水稻新种质。

上述步骤（1）中所述人参AP2/ERF类转录因子PgERF1基因序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，上述步骤（2）中所述表达调控载体为pTCK303载体，用SacI和KpnI对PgERF1基因和pTCK303载体分别进行双酶切，然后将PgERF1基因连接至pTCK303载体，获得PgERF1基因的植物表达载体pTCK-PgEFR1。

优选的，上述步骤（3）中所述根癌农杆菌为EHA105。

优选的，上述步骤（5）中所述甾醇生物合成相关基因为水稻的法尼基焦磷酸合成酶基因OsFPS、鲨烯合成酶基因OsSS、鲨烯环氧酶基因OsSE、3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶基因OsHMGR、环阿屯醇合酶基因OsCAS。

本发明的优点在于：

本发明采用基因工程操作技术从富含三萜皂苷的韩国高丽人参中分离出调控三萜类化合物生物合成的AP2/ERF类转录因子PgERF1，并将其转入水稻中，显著上调了OsFPS、OsSS、OsSE甾醇生物合成基因的表达，获得的转基因水稻甾醇含量显著提高，其中甾醇含量最高的转化株系为OE3（19.11mg.100g^-1），是非转基因对照（9.89mg.100g^-1）的1.93倍。本发明提供了一种有效提高水稻甾醇的方法，这对提高水稻的营养保健价值具有重要意义。

附图说明

图1为人参PgERF1基因的PCR扩增结果图，M：DNA marker(DL2000)；1：PCR扩增产物；

图2为人参PgERF1基因的植物表达载体图谱；

图3为转PgERF1基因抗性水稻植株的PCR鉴定结果，M：DNA marker(DL2000)；P：质粒；WT：非转化植株；OE1-OE4：转化植株；

图4为转基因水稻中PgERF1基因表达水平的qRT-PCR分析结果，WT：非转化水稻；OE1-OE4：转化植株；

图5为转基因水稻种子中总甾醇含量检测结果，WT：非转化水稻；OE1-OE4：转化植株。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如：分子克隆实验指南（第三版）（Sambrook等著，黄培堂译，2002）中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

人参PgERF1基因的克隆

（1）人参总RNA的提取与检测

取3年生韩国高丽人参根，液氮中速冻后，迅速用研钵研碎,然后按照北京艾德莱生物科技有限公司提供的EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒使用说明书提取总RNA。用Thermo Fisher公司的NanoDropTM 2000分光光度计检测RNA浓度和纯度。用1.0 %琼脂糖凝胶电泳测定RNA的完整性。

（2）人参PgERF1基因的克隆

用TaKaRa公司的PrimeScript™ RT reagent试剂盒将韩国高丽人参的总RNA反转录为第1链cDNA。根据GenBank数据库中已报道的AP2/ERF类转录因子基因cDNA 序列设计特异性引物，扩增目的基因PgERF1。所用引物序列如下：

PgERF1-F：5’-ATGTGTGGAGGTGCAATCCTAGGTG-3’

PgERF1-R：5’-GTGCTCTTTAAA CGACATCGTCGAA-3’

以韩国高丽人参第一链cDNA为模板，用TaKaRa公司的高保真酶Primer STAR进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃ 5min；随之以94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1.0 min进行30个循环，最后以72℃延伸10min。电泳检测PCR产物，得到约800bp的片段（图1）。将该片段回收纯化后，连接到pMD18-T simple Vector上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。PCR鉴定后选取阳性克隆送往上海铂尚生物技术有限公司用通用引物M13进行测序，测序结果表明，韩国高丽人参PgERF1基因的开放阅读框大小为768bp（序列如SEQ ID No.1所示），编码255个氨基酸（序列如SEQ ID No.2所示），具有一个AP2/ERF 类转录因子特征保守结构域。在NCBI网站上用BLAST程序搜索已有的数据库(GenBank + EMBL + DDBJ + PDB)，结果表明该片段的核苷酸序列与珠子参、三七等植物具有较高的同源性。

实施例2

含PgERF1基因植物表达载体的构建

在PgERF1基因的5'端和3'端分别设计含KpnI和SacI酶切位点的引物，以pMD18-T-PgERF1为模板，按实施例1的条件进行PCR扩增。引物序列如下（用下划线标出酶切位点）：

PgERF1-HF：5’- GGTACCATGTGTGGAGGTGCAATCCTAGGTG -3’；PgERF1-HR：5’-GAGCTCTTAAACGACATCGTCGAAACTCC-3’。

PCR产物经测序验证后，再用SacI和KpnI进行双酶切，回收纯化后,与同样用SacI和KpnI双酶切的pTCK303载体连接，从而获得含PgERF1基因的植物过表达载体pTCK-PgEFR1（见图2）。

实施例3

农杆菌介导PgERF1基因转化水稻获得转基因植株

采用冻融法，将植物过表达载体pTCK-PgEFR1导入到根癌农杆菌EHA105中，挑取单克隆菌落进行验证。结果表明，含PgERF1基因的植物过表达载体已经成功构建到根癌农杆菌菌株中。

挑取农杆菌单菌落转接于YEB固体培养基上（含卡那霉素和利福平各50 mg.L^-1）划线28℃暗培养两天，用适量添加有100μM乙酰丁香酮的AAM培养基将菌液洗脱，悬浮于添加有100μM乙酰丁香酮的20 ml AAM培养基中，并调整菌液浓度至1.5～2.0 OD（600nm），所得菌液用于水稻愈伤组织侵染。

将水稻品种“香血糯”的胚性愈伤组织接到NBD培养基上预培养4天，加入农杆菌工程菌液浸泡30min，用无菌滤纸吸干多余菌液后接于共培养基（含100μM乙酰丁香酮）中，共培养3d，然后用含250 mg.L^-1羧苄青霉素的无菌水洗菌，再转接到含有500 mg.L^-1羧苄青霉素和50 mg.L^-1潮霉素的筛选培养基上，筛选2~3代（二周/代），将抗性愈伤组织转入分化培养基NBC上，分化成苗后，转入1/2MS培养基生根培养，最终获得了4株潮霉素抗性水稻植株（OE1、OE2、OE3、OE4）。采用CTAB法提取转基因水稻的叶片基因组DNA，以实施例2的引物PgERF1-HF/PgERF1-HR进行PCR扩增。结果表明，这4个抗性植株都可以扩增出预期大小的PgERF1目的基因条带(图3)，确定为T0代阳性植株。

实施例4

荧光定量PCR检测转基因水稻中甾醇合成相关基因的表达

根据水稻的法尼基焦磷酸合成酶(Farnesyl diphosphate synthase，OsFPS)基因、鲨烯合成酶(Squalene synthase，OsSS)基因、鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase，OsSE)基因、3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme Areductase，OsHMGR)、环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase，OsCAS)基因等5个甾醇生物合成相关基因和内参基因actin的全序列设计荧光定量PCR引物(表1)。引物扩增基因片段长度在150-200 bp之间。所用引物由上海生工生物工程公司合成。荧光定量PCR引物序列如下：

表1 荧光定量PCR引物

参照实施例1中所述方法，从T1代转基因水稻（OE1、OE2、OE3、OE4）灌浆期的种子提取RNA，用反转录酶XL (AMV)进行第一链cDNA的合成，再将不同样品反转录的cDNA稀释成相同浓度，作为荧光定量模板。采用相对定量的方法，荧光定量反应体系为SYBR Premix ExTaq 25 μL, 10μmol L^–1 上下游引物各2 μL，ROX Dye II 1 μL，cDNA 4 μL，加水至终体积50 μL。反应在ABI PRISM 7500实时定量PCR仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行，程序为95℃变性30 s，94℃变性15 s，60℃退火延伸34 s，40 个循环，于60℃收集荧光，反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线，每个反应重复3 次，采用2^−ΔΔCt算法分析结果。

荧光定量PCR分析结果表明（图4），4个转基因水稻种子中的OsFPS、OsSS、OsSE基因表达量均显著高于对照，OsHMGR基因表达量没有明显变化，OsCAS基因的表达量略高于对照，但未达到显著性水平，说明人参PgERF1基因可能通过上调甾醇合成路径上关键酶基因的表达量来调控甾醇的生物合成。

实施例5

转基因稻米中的甾醇含量检测

（1）磷硫铁显色剂配制：称取2.5g三氯化铁(FeCl₃.6H₂O)，溶于87wt%浓磷酸内，并定容至100ml，得铁贮存液。取铁贮存液8.0ml，加浓硫酸至100ml，即得磷硫铁显色剂。

（2）标准典线的制作：依次精密吸取浓度为0.2、0.4、0.5、0.6和0.8mg/ml的标准豆甾醇对照溶液2ml，于10ml容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度线，沿管壁加入磷硫铁显色剂5.0ml，摇匀，室温下显色30min后，于530nm波长处测定吸光度，以吸光度（Y）对β-谷甾醇质量浓度（X）进行线性回归，得到回归方程为Y=8.208X－0.3584，r= 0.9973，表明β-谷甾醇质量浓度在0.2~0.8mg/ml范围内与吸光度线性关系良好。

（3）样品制备和总甾醇含量的测定：将4个T1代转基因水稻株系和非转基因对照的种子去壳后，研磨成细粉，过60目筛后准确称取 1.0 g的粉未于锥形瓶中，加入20ml的无水乙醇，置于超声波清洗器中50℃条件下超声提取1h，5000g离心10min，吸取上清至新离心管中，然后将上清真空离心浓缩，加入5ml无水乙醇溶解定溶，得到稻米甾醇供试样品。

精密移取2ml β-谷甾醇对照品和供试品溶液，置于10mL具塞刻度试管中，再沿管壁缓慢地向各试管中加入5.0mL磷硫铁显色剂，摇匀，室温下显色30min, 即得对照品或供试品的显色溶液，以无水乙醇同法作空白。于530nm波长处进行检测，按回归方程计算各样品的总甾醇含量。

检测结果显示，转基因株系OE1、OE2、OE3和OE4的总甾醇含量分别为11.73mg.100g^-1、16.31 mg.100g^-1、19.11 mg.100g^-1和14.25 mg.100g^-1，其中株系OE2、OE3和OE4的总甾醇含量比非转基因对照显著提高，分别是非转化对照（9.89 mg.100g^-1）的1.44倍、1.93倍和1.18倍（图4）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法

<130> 18

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 768

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

atgtgtggag gtgcaatcct aggtgatctt accgctcgaa atttcaaccg ccgtgtctcc 60

gccgctgact tctggcccac atctctctcc gacaaactcg acaatttcca gtccgaattt 120

aatcatttcc ctcaggagga gactcgaacc ctcaaaagag cgcagcctaa ttcaggtggt 180

gtacctctcg gaaagacagc aaagaggcag aggaagaaca tgtacagagg aataaggcag 240

cgtccatggg ggaaatgggc agctgagatt agggatccga gaaaaggagt gagggtttgg 300

ctgggtactt tcaacacggc tgaggaggct gccagagcct acgacaaaga agctcgcaag 360

attagaggaa acaaagccaa agttaacttc ccaaatgagg actgctttaa tcaattcaat 420

gtcaaaaata tgaatcaatt tgggtcaaat tctcattctg ggttttctgc attgaacgac 480

caatcactaa gcgatggact tagtattact gagcaggtgg agaaggtaaa agaagaaaaa 540

gaggagagag aaaataaaga gagtgtgatt gatcaagtgg aggaacagaa cgaactgcag 600

aagctctcgg atgagctaat ggcctacgaa tcttacatga aattttatga aattccgtat 660

cttgatggcc agtcggcgac gggggcagca ggtccgacga gtgcggtgct ggaaaacgtc 720

gtcgacggtg gtttgctaaa tctttggagt ttcgacgatg tcgtttaa 768

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> SEQ ID No.2

<400> 2

Met Cys Gly Gly Ala Ile Leu Gly Asp Leu Thr Ala Arg Asn Phe Asn

1 5 10 15

Arg Arg Val Ser Ala Ala Asp Phe Trp Pro Thr Ser Leu Ser Asp Lys

20 25 30

Leu Asp Asn Phe Gln Ser Glu Phe Asn His Phe Pro Gln Glu Glu Thr

35 40 45

Arg Thr Leu Lys Arg Ala Gln Pro Asn Ser Gly Gly Val Pro Leu Gly

50 55 60

Lys Thr Ala Lys Arg Gln Arg Lys Asn Met Tyr Arg Gly Ile Arg Gln

65 70 75 80

Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Arg Lys Gly

85 90 95

Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg

100 105 110

Ala Tyr Asp Lys Glu Ala Arg Lys Ile Arg Gly Asn Lys Ala Lys Val

115 120 125

Asn Phe Pro Asn Glu Asp Cys Phe Asn Gln Phe Asn Val Lys Asn Met

130 135 140

Asn Gln Phe Gly Ser Asn Ser His Ser Gly Phe Ser Ala Leu Asn Asp

145 150 155 160

Gln Ser Leu Ser Asp Gly Leu Ser Ile Thr Glu Gln Val Glu Lys Val

165 170 175

Lys Glu Glu Lys Glu Glu Arg Glu Asn Lys Glu Ser Val Ile Asp Gln

180 185 190

Val Glu Glu Gln Asn Glu Leu Gln Lys Leu Ser Asp Glu Leu Met Ala

195 200 205

Tyr Glu Ser Tyr Met Lys Phe Tyr Glu Ile Pro Tyr Leu Asp Gly Gln

210 215 220

Ser Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Thr Ser Ala Val Leu Glu Asn Val

225 230 235 240

Val Asp Gly Gly Leu Leu Asn Leu Trp Ser Phe Asp Asp Val Val

245 250 255

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> PgERF1-F

<400> 3

atgtgtggag gtgcaatcct aggtg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> PgERF1-R

<400> 4

gtgctcttta aacgacatcg tcgaa 25

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> PgERF1-HF

<400> 5

ggtaccatgt gtggaggtgc aatcctaggt g 31

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> PgERF1-HR

<400> 6

gagctcttaa acgacatcgt cgaaactcc 29

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> OsFPS-qF

<400> 7

caagatgttg aagggcact 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> OsFPS-qR

<400> 8

cgtgtttgag agttgtccat 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> OsSS-qF

<400> 9

gacactgttg aggacgacac ta 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> OsSS-qR

<400> 10

caaggcgaaa cttatccatc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> OsSE-qF

<400> 11

gagagaccta acagagcctg a 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> OsSE-qR

<400> 12

cgctgagcat ctatttcttg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> OsHMGR-qF

<400> 13

gctggactac cttcaggatg 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> OsHMGR-qR

<400> 14

cctcacaaac cacagacttt c 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> OsCAS-qF

<400> 15

tgttccttat gccaggctt 19

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> OsCAS-qR

<400> 16

ccgtatctcc ttctgatgtt c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> OsActin-qF

<400> 17

catcttggca tctctcagca c 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> OsActin-qR

<400> 18

aactttgtcc acgctaatga a 21

Claims

1.一种利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用基因克隆方法获得人参AP2/ERF类转录因子PgERF1；

(4)利用所构建的根癌农杆菌工程菌株转化水稻愈伤组织，获得经PCR检测的转基因水稻植株；

(6)对获得的转基因水稻种子中甾醇含量进行测定，获得甾醇含量显著提高的转基因水稻新种质；

步骤（1）所述人参AP2/ERF类转录因子PgERF1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤（5）中所述甾醇生物合成相关基因为水稻的法尼基焦磷酸合成酶基因OsFPS、鲨烯合成酶基因OsSS、鲨烯环氧酶基因OsSE、3-羟基-3-甲基戊二单酰CoA还原酶基因OsHMGR和环阿屯醇合酶基因OsCAS。

2.根据权利要求1所述的利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法，其特征在于：步骤（2）所述表达调控载体为pTCK303载体，用SacI和KpnI对PgERF1基因和pTCK303载体分别进行双酶切，然后将PgERF1基因连接至pTCK303载体，获得PgERF1基因的植物表达载体pTCK-PgEFR1。

3.根据权利要求1所述的利用人参转录因子提高水稻甾醇含量的方法，其特征在于：步骤（3）中所述根癌农杆菌为EHA105。