CN114107375A

CN114107375A - 一种利用CRISPR/Cas9技术降低稻米蛋白质含量提升蒸煮食味品质的方法

Info

Publication number: CN114107375A
Application number: CN202111430116.5A
Authority: CN
Inventors: 严长杰; 杨宜豪; 沈子颜; 郭旻; 孙生远
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2022-03-01

Abstract

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术降低稻米蛋白质含量提升蒸煮食味品质的方法，将水稻谷蛋白合成基因经过基因编辑技术进行突变，以降低水稻谷蛋白合成基因表达量或者阻断其蛋白的产生。本发明的实验证明，稻米谷蛋白含量的下降随着谷蛋白合成基因敲除数目的增多而越明显，稻米总蛋白也发生不同程度的降低；虽然醇溶蛋白和球蛋白有一定的补偿作用，但谷蛋白含量的下降可以快速使自身总蛋白质含量偏高的稻米品种下降到市场上优质稻米的需求，通常7％左右；稻米蛋白质含量的下降降低了米饭的硬度提升了蒸煮食味品质，且对种子的加工和外观品质无任何负面影响。

Description

一种利用CRISPR/Cas9技术降低稻米蛋白质含量提升蒸煮食味品质的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到一种利用CRISPR/Cas9 技术降低稻米蛋白质含量提升蒸煮食味品质的方法。

背景技术

水稻是中国乃至世界范围内最重要的粮食作物之一，对保障世界粮食安全具有举足轻重的作用。近几十年来，我国水稻产量取得重大突破，居世界主要产稻国家前列。

淀粉是稻米的最主要的成分，占稻米胚乳的80％以上。目前生产实践中，稻米食味品质的改良主要是利用Waxy编码的淀粉合成酶GBSSI的不同等位变异来培育具有不同直链淀粉含量的水稻品种，以适应不同消费群体的需求，比如将粳稻的Wxb等位基因带入到籼稻品质中，解决以往籼稻品种中直链淀粉含量偏高的问题；将来自地方品种的Wxmp用于粳稻的品质改良，形成直链淀粉含量在8％-12％之间的“软米”品种。然而，尽管围绕淀粉的稻米品质改良已取得了较大进展，但现有稻米的品质依然满足不了国内消费者的需求，与国外优质籼粳品种仍存在较大差距。

大量研究表明，稻米蛋白质作为仅次于淀粉的第二大贮藏物质，它的含量及组成同样严重影响稻米各项品质性状，特别是蒸煮食味品质。一般情况下，稻米中蛋白质含量越高，稻米的食味品质越差，两者呈极显著负相关。而生产实践中，优质稻米的蛋白质含量均在7％左右，如日本的越光和中国东北的空育131。但由于稻米蛋白质含量极易受环境因素影响，且遗传控制***复杂，迄今为止，可用于稻米蛋白质性状改良的基因资源和方法还很缺乏，严重制约了稻米品质的进一步提升。因此，建立快速、高效的育种方法是作物品质改良获得突破的重要途径。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种制备转基因水稻的方法，包括使受体水稻基因组的谷蛋白合成基因发生突变，以降低谷蛋白表达量或阻断谷蛋白的产生，获得所述转基因水稻。

作为本发明制备转基因水稻的方法的一种优选方案，其中：采用基因编辑的方式使受体水稻基因组的谷蛋白合成基因发生突变；

所述水稻谷蛋白合成基因，包括OsGluA1、OsGluA2、OsGluA3、OsGluB2、 OsGluB6、OsGluB7、OsGluC和OsGluD中的一种或多种。

作为本发明制备转基因水稻的方法的一种优选方案，其中：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9***进行，所述CRISPR/Cas9***为如下任一种：

(a)包括特异gRNA和Cas9蛋白；所述特异gRNA中的靶序列识别区如SEQ ID NO.1中第511～533位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.2中第511～533位核苷酸所示，和/或SEQ IDNO.3中第508～530位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.4 中第874～896位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.5中第874～896位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.6中第967～987位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.7中第 339～361位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.8中第925～945位核苷酸所示；

(b)包括特异DNA分子和Cas9蛋白的编码基因，所述特异DNA分子转录得到所述特异gRNA；

(c)包括具有所述特异DNA分子的质粒和具有所述Cas9蛋白的编码基因的质粒；

(d)包括特异重组质粒，所述特异重组质粒表达所述特异DNA分子和所述 Cas9蛋白的编码基因。

作为本发明制备转基因水稻的方法的一种优选方案，其中：所述 CRISPR/Cas9***中的gRNA的靶序列包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12中的一种或多种。

本发明的另一个目的是提供一种制备转基因水稻的方法，包括，

采用如上述的CRISPR/Cas9***对受体水稻进行基因编辑，得到转基因水稻；

或，将上述所述特异重组质粒导入受体水稻，得到转基因水稻。

作为本发明制备转基因水稻的方法的一种优选方案，其中：所述导入受体水稻，将所述特异重组质粒经农杆菌介导转化作物愈伤组织，通过筛选、分化、生根和阳性检测，种植得到转基因水稻。

作为本发明制备转基因水稻的方法的一种优选方案，其中：所述作物，包括水稻、水稻、玉米中的一种。

本发明的另一个目的是提供一种制备无转基因的基因编辑水稻的方法，包括，

按照上述的方法制备的转基因水稻或按照上述的方法制备的转基因水稻；

将所述转基因水稻自交，得到自交后代；

从所述自交后代中筛选无转基因的基因编辑水稻。

本发明的另一个目的是提供一种水稻的DNA分子，所述水稻的DNA分子包括，

如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第528位碱基删除、如SEQ ID NO.7 所示的DNA分子的第356～357位碱基删除形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第527位后***1个碱基、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第527位后***1个碱基、如SEQ ID NO.4所示的DNA分子的第891位碱基删除形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第525～528位碱基删除、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第528位碱基删除、如SEQ ID NO.5所示的DNA 分子的第890位后***1个碱基、如SEQ ID NO.6所示的DNA分子的第356 位碱基删除形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第526～527位碱基删除、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第528～535位碱基删除、如SEQ ID NO.5所示的 DNA分子的第891位碱基删除、如SEQ ID NO.8所示的DNA分子的第938 位后***1个碱基形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第527位后***1个碱基、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第527位后***1个碱基、如SEQ ID NO.3所示的DNA分子的第525～528位碱基删除、如SEQ ID NO.4所示的DNA分子的第890位后***1个碱基形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第528位碱基删除、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第528位碱基删除、如SEQ ID NO.3所示的DNA分子的第526位碱基删除、如SEQ IDNO.5所示的DNA分子的第887～890位碱基删除、如SEQ ID NO.7所示的DNA分子的第343～381位碱基删除形成的 DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第521～528位碱基删除、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第527～535位碱基删除、如SEQ ID NO.3所示的 DNA分子的第524位后***1个碱基、如SEQ ID NO.4所示的DNA分子的第890位后***1个碱基、如SEQ ID NO.5所示的DNA分子的第874～978 位以及第891位碱基删除、如SEQ ID NO.7所示的DNA分子的第343～381位碱基删除形成的DNA分子。

本发明的另一个目的是提供如上述任一项所述的方法在提升稻米蒸煮食味品质中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用CRISPR/Cas9技术对水稻谷蛋白合成基因家族成员进行多基因敲除以降低稻米蛋白质含量来提升稻米蒸煮食味品质的方法，有望进一步加速稻米品质育种进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1是本发明实施例1的CRISPR/Cas9敲除载体构建示意图。

图2是本发明实施例1的OsGluA1基因突变类型。

图3是本发明实施例1的OsGluA2基因突变类型。

图4是本发明实施例1的OsGluA3基因突变类型。

图5是本发明实施例1的OsGluB2基因突变类型。

图6是本发明实施例1的OsGluB6基因突变类型。

图7是本发明实施例1的OsGluB7基因突变类型。

图8是本发明实施例1的OsGluC基因突变类型。

图9是本发明实施例1的OsGluD基因突变类型。

图10是本发明实施例2的南粳9108背景下谷蛋白合成基因突变组合示意图。

图11是本发明实施例3的不同突变类型稻米蛋白SDS-PAGE分析。

图12是本发明实施例3的不同突变类型稻米蛋白组分含量分析。

图13是本发明实施例4的不同突变类型稻米食味品质相关性状分析；其中，(a)表示直链淀粉含量，(b)表示米饭硬度，(c)表示米饭食味值。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明所编辑的对象为谷蛋白合成相关基因，名称为OsGluA1,OsGluA2,OsGluA3,OsGluB2,OsGluB6,OsGluB7,OsGluC和OsGluD。有研究表明，谷蛋白合成相关基因的表达对稻米蛋白质含量有重要影响。

本发明选用的水稻品种为粳稻品种南粳46(Oryza sativa L.)。该品种近年来以其高产、优质的特点在江苏省广泛种植，但由于稻米蛋白质含量相对较高，稻米品质仍需进一步提高。本发明利用基因编辑技术对南粳46基因组上的 OsGluA1,OsGluA2,OsGluA3,OsGluB2,OsGluB6,OsGluB7,OsGluC和 OsGluD进行编辑，以降低谷蛋白合成相关基因的蛋白表达量或者阻断其蛋白的产生。OsGluA1,OsGluA2,OsGluA3,OsGluB2,OsGluB6,OsGluB7,OsGluC和 OsGluD的基因序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

实施例1

(1)gRNA靶点的选择

根据OsGluA1,OsGluA2,OsGluA3,OsGluB2,OsGluB6,OsGluB7,OsGluC 和OsGluD的基因序列比对，找出相似性高的序列区段。

OsGluA1基因序列的第～位核苷酸、

根据CRISPR/Cas9技术靶位点设计原则，在相似性高的序列区域选择4 个靶序列sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4，靶向上述8个基因。通过 CRISPR/Cas9蛋白的定点切割和随机修复，产生不同的编辑类型。

sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3和sgRNA4的序列如下所示(加粗碱基为PAM 位点)。

其中，sgRNA1靶向OsGluA1基因序列的第511～533位核苷酸、OsGluA2 基因序列的第511～533位核苷酸以及OsGluA3基因序列的第508～530位核苷酸；

sgRNA2靶向OsGluB2基因序列的第874～896位核苷酸和OsGluB6基因序列的第874～896位核苷酸；

sgRNA3靶向OsGluC基因序列的第339～361位核苷酸；

sgRNA4靶向OsGluB7基因序列的第967～987位核苷酸和OsGluD基因序列的第925～945位核苷酸。

(2)表达载体的构建

用Aar I将中间载体SK-gRNA线性化，体系为：10x buffer Aar I 10uL，50xoligonucleotide 2uL，Aar I 1uL，SK-gRNA 1-2ug，ddH₂O补足至100uL，37℃酶切3h，试剂盒纯化酶切产物。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳核查条带大小后，过柱子回收纯化酶切产物，加入50uL灭菌的ddH₂O溶解测定浓度后待用。

根据选定的gRNA靶点序列，合成引物glu1-F，glu1-R，glu2-F，glu2-R，glu3-F，glu3-R，glu4-F和glu4-R，引物序列如下所示。

将引物用水稀释至浓度100uM，前后引各20ul混合在一起，将混合好体系的PCR管放入100℃金属浴5分钟，室温冷却。

利用T4连接酶将准备好的靶位点接头连入中间载体SK-gRNA中，15uL 连接体系为：10×T4 ligation buffer 1.5uL，靶位点接头10uL，酶切过的载体3uL， T4 DNA ligase0.5uL，16℃连接1小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄抗性LB平板过夜培养，挑选阳性菌株送公司测序，得到测序正确的中间载体 SK-gRNA-glu1、SK-gRNA-glu2、SK-gRNA-glu3和SK-gRNA-glu4。

将获得中间载体SK-gRNA-glu1、SK-gRNA-glu2、SK-gRNA-glu3和 SK-gRNA-glu4分别按照如下体系，37℃酶切2小时。

10×NEB Cutsmart Buffer 5uL；SK-gRNA-glu1 15uL；Kpn I 0.5uL；Xho I 0.5uL；ddH₂O至50uL。

10×NEB Cutsmart Buffer 5uL；SK-gRNA-glu2 15uL；Sal I 0.5uL；Xba I 0.5uL；ddH₂O至50uL。

10×NEB Cutsmart Buffer 5uL；SK-gRNA-glu3 15uL；Nhe I 0.5uL；BamH I0.5uL；ddH₂O至50uL。

10×NEB Cutsmart Buffer 5uL；SK-gRNA-glu4 15uL；Kpn I 0.5uL；Bgl II 0.5uL；ddH₂O至50uL。

1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收纯化DNA片段，一步法将4个gRNA组装到一起，NEB公司T4连接酶连接体系为：10×T4 ligation buffer 1.5uL； SK-gRNA-glu2(Xba I/SalI)4uL；SK-gRNA-glu3(BamH I/Nhe I)4uL； SK-gRNA-glu4(Kpn I/Bgl II)4uL；SK-gRNA-glu1(Kpn I/Xho I)1uL；T4 DNA ligase 0.5uL。室温连接1小时，连接产物转化大肠杆菌DH5α，过夜培养。用载体上引物菌落PCR，挑选阳性克隆送公司测序，测序正确的中间载体命名为SK-4G-glu1-glu2-glu3-glu4。并将连接好的中间载体和植物表达载体 pC1300-Cas9按照如下体系，37℃酶切2小时。

10×NEB Cutsmart Buffer 2uL；SK-4G-glu1-glu2-glu3-glu4 15uL；Kpn I0.5uL； BamH I 0.5uL；ddH₂O至20uL。

10×NEB Cutsmart Buffer 2uL；pC1300-Cas9 5uL；Kpn I 0.5uL；BamH I 0.5uL；ddH₂O至20uL。

1％琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收纯化gRNAs片段和14.6kb线性化的 pC1300-Cas9片段。用ddH₂O溶解后测定浓度按如下体系将gRNAs片段连入表达载体，NEB公司T4连接酶连接体系为：10×T4 ligation buffer 1.5uL；SK-4G- glu1-glu2-glu3-glu4(Kpn I/BamHI)5.5uL；pC1300-Cas9(Kpn I/BamH I)2uL；T4 DNA ligase 0.5 uL；ddH₂O至15 uL，室温连接1小时。

连接产物转化大肠杆菌DH5α，过夜培养。用载体上引物进行菌落PCR，挑选阳性克隆送公司测序。测序正确的克隆命名为 pC1300-Cas9-g^glu1-g^glu2-g^glu3-g^glu4，载体示意图如图1所示。

所述载体SK-gRNA和pC1300-Cas9来源于中国水稻所王克剑实验室，已在文献《Wang C*,Shen L*,Fu Y,et al.A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genomeediting in rice.J Genet Genomics,2015,42:703-706.》中公开。

(3)转化农杆菌

将(2)中的重组载体pC1300-Cas9-g^glu1-g^glu2-g^glu3-g^glu4通过热激方法转化农杆菌EHA105菌株中，获得含有重组表达载体的重组农杆菌。

(4)农杆菌介导的水稻转化

利用重组根瘤农杆菌侵染水稻品种南粳9108成熟胚诱导的愈伤组织，在含有潮霉素抗性的培养基上成功再生、生根和PCR检测为阳性的植株为转基因阳性植株。

(5)转基因水稻及突变位点检测

获得10株转基因阳性单株，提取DNA，在谷蛋白合成基因被编辑区域的前后设计扩增引物GluA1-F、GluA1-R、GluA2-F、GluA2-R、GluA3-F、GluA3-R、 GluB2-F、GluB2-R、GluB6-F、GluB6-R、GluB7-F、GluB7-R、GluC-F、GluC-R、 GluD-F、GluD-R，引物序列如下所示。

GluA1-F GCCTTCTACTACCCCATT

GluA1-R GTTTTGCCTTACCCTCAG

GluA2-F GCTGTTGAGATTTGTAACCCTT

GluA2-R TTGTGCGATGGCTCCCTA

GluA3-F CGAGCAAGACCAACAATTGGAAGGC

GluA3-R CGTTCTTCGAATTGTCCCTTGCCTC

GluB2-F AGGGTTCAACAAGTATATGGCAG

GluB2-R TAGACATAATATCATATAAACCGT

GluB6-F ACGAAGAACACCGTCGAACA

GluB6-R ATTCAGCAACACTCTGGGCA

GluB7-F CAGTTCCAGTGCACCGGTAC

GluB7-R CTCGAGCACGCCCTTGAATT

GluC-F GTTTGAGCAAGCTCCAATAT

GluC-R GAAGTTGCTGGTGCTCGTCTCTC

GluD-F TTGGCAACCTGTACTCGCAC

GluD-R GCTCCGCTCTTTAGCCAAGG

对PCR产物进行测序，通过测序峰图以及分析网站(http://skl.scau.edu.cn/)分析靶点突变类型，突变类型如图2～图9所示。由图2～图9可以看出8个基因都发生了不同程度的突变，包括碱基***和缺失，且绝大部分突变都造成了基因的移码突变。图2～图9中，加粗部分为PAM位点，带下划线序列为靶序列，“d”表示碱基删除，“i”表示碱基***，“s”表示碱基替换。

实施例2

将10株转基因阳性单株所获得的T0代种子全部种下后形成243株T1代植株，提取DNA，利用引物筛选无cas9标签的单株共33株，引物序列如下所示。

Cas9-F ACCAGACACGAGACGACTAA

Cas9-R ATCGGTGCGGGCCTCTTC

对目标基因测序分析，选择编辑位点均为纯合突变的单株，共筛选出7种不同的基因突变组合分别命名为I至VI，其突变组合示意图如图10所示。

I为敲除OsGluA1和OsGluC，I的OsGluA1基因为将野生型基因第528 位碱基删除获得的突变基因，I的OsGluC基因为将野生型基因第356～357位碱基删除获得的突变基因；

II为敲除OsGluA1,OsGluA2和OsGluB2，II的OsGluA1基因为将野生型基因第527位后***1个碱基获得的突变基因，II的OsGluA2基因为将野生型基因第527位后***1个碱基获得的突变基因，II的OsGluB2基因为将野生型基因第891位碱基删除获得的突变基因；

III为敲除OsGluA1，OsGluA2，OsGluB6和OsGluC，III的OsGluA1基因为将野生型基因第525～528位碱基删除获得的突变基因，III的OsGluA2基因为将野生型基因第528位碱基删除获得的突变基因，III的OsGluB6基因为将野生型基因第890位后***1个碱基获得的突变基因，III的OsGluC基因为将野生型基因第356位碱基删除获得的突变基因；

IV为敲除OsGluA1，OsGluA2，OsGluB6和OsGluD，IV的OsGluA1基因为将野生型基因第526～527位碱基删除获得的突变基因，IV的OsGluA2基因为将野生型基因第528～535位碱基删除获得的突变基因，IV的OsGluB6基因为将野生型基因第891位碱基删除获得的突变基因，IV的OsGluD基因为将野生型基因第938位后***1个碱基获得的突变基因；

V为敲除OsGluA1，OsGluA2，OsGluA3和OsGluB2，V的OsGluA1基因为将野生型基因第527位后***1个碱基获得的突变基因，V的OsGluA2基因为将野生型基因第527位后***1个碱基获得的突变基因，V的OsGluA3基因为将野生型基因第525～528位碱基删除获得的突变基因，V的OsGluB2基因为将野生型基因第890位后***1个碱基获得的突变基因；

VI为敲除OsGluA1，OsGluA2，OsGluA3，OsGluB6和OsGluC，VI的 OsGluA1基因为将野生型基因第528位碱基删除获得的突变基因，VI的 OsGluA2基因为将野生型基因第528位碱基删除获得的突变基因，VI的 OsGluA3基因为将野生型基因第526位碱基删除获得的突变基因，VI的 OsGluB6基因为将野生型基因第887～890位碱基删除获得的突变基因，VI的OsGluC基因为将野生型基因第343～381位碱基删除获得的突变基因；

VII为敲除OsGluA1，OsGluA2，OsGluA3，OsGluB2，OsGluB6和OsGluC， VII的OsGluA1基因为将野生型基因第521～528位碱基删除获得的突变基因， VII的OsGluA2基因为将野生型基因第527～535位碱基删除获得的突变基因， VII的OsGluA3基因为将野生型基因第524位后***1个碱基获得的突变基因， VII的OsGluB2基因为将野生型基因第890位后***1个碱基获得的突变基因， VII的OsGluB6基因为将野生型基因第874～978位以及第891位碱基删除获得的突变基因，VII的OsGluC基因为将野生型基因第343～381位碱基删除获得的突变基因。

实施例3

为了研究多重基因突变是否能调控稻米蛋白质含量，提取野生型以及7种突变体籽粒中的总蛋白，进行SDS-PAGE分析，具体方法步骤如下。

组分蛋白提取

种子成熟后室温下放置3个月以平衡水分，经砻谷、磨粉、过筛，米粉放置42℃烘箱约2天后用千分之一天平精确称重1g(精确至0.01g)。

(1)清蛋白：将待测米粉放入的10ml离心管，加入3ml H₂O，剧烈震荡 2h，10000g离心20min，取上清液；

(2)球蛋白：向上述沉淀物中加入3ml 0.5M NaCl溶液，震荡2h，10000g 离心20min，取上清液；

(3)醇溶蛋白：向上述沉淀物中加入3ml 70％乙醇，用封口膜封好离心管，在80℃水浴中震荡1h，10000g离心25min，缓慢取上清液；

(4)谷蛋白提取：向上述沉淀物中加入0.1M NaOH溶液，4℃震荡1h， 10000g离心25min，取上清液；

(5)上述每测一种蛋白组分，都重复提取3次，合并上清液并定容至50mL，从定容液中吸取3mL置于10mL试管中，加1mL 0.1％考马斯亮蓝G250比色液定容至10mL，然后用UV–754分光光度计于595nm处比色。

蛋白SDS-PAGE检测及染色

(1)加入少量洗涤剂清洗制胶用的玻璃板(Bio-Rad，厚度：1mm&0.75mm) 或者直接用酒精清洗干净，然后将洗净后的玻璃板在室温下晾干。

(2)将吹干后的玻璃板装好后(底部对齐)放在制胶架上。离心管中制备相应浓度分离胶。

(3)利用移液器小心将配制好的分离胶加到玻璃板中至顶端1.5～2cm处，之后小心加入ddH₂O封胶(加至玻璃板顶端)，使分离胶上方平整。室温下放置至出现分界线即可。

(4)将制胶用的梳子清洗干净，晾干后备用。

(5)小心用滤纸将分离胶上面的ddH₂O吸干在离心管中制备浓缩胶。

(6)小心但快速的将浓缩胶加到玻璃板中的分离胶上，加满后立即小心的***梳子，室温放置梳子与胶之间出现界限即可。

(7)将玻璃板从制胶架上取下后，装入电泳架，小心、直立的将梳子拔出，之后用dH₂O冲洗点样孔，去除可能没有聚合的丙烯酰胺单体。

(8)向电泳架中加满新配制的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，电泳架下方的 1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液可重复使用多次。

(9)蛋白样品的准备，取待检测样品，加入终浓度为1×的蛋白上样缓冲液，混匀后，95℃以上变性5min，之后立即置于冰上冷却2min以上，室温下 12000rpm离心3min后取适量点样，并根据要研究蛋白的大小选择合适的蛋白 Marker，取3～5μl上样。

(10)恒压蛋白电泳，开始时，在浓缩胶中用100-120V电泳，待蛋白移动至分离胶中后可增加电压到120～150V电泳。根据Marker的位置来确定蛋白分离的程度，以最大化的分离目标蛋白。

(11)蛋白电泳开始后，准备染色液及其相关的试剂。

(12)考马斯亮蓝法显影：将电泳后的胶放入固定液中固定15min(10％冰醋酸，40％乙醇，50％蒸馏水)。水洗3-4次，每次15min。染色过夜，染液配方：0.12g考马斯亮蓝G250，10g硫酸铵，10ml磷酸，20ml甲醇，70ml蒸馏水。脱色处理5h以上(在蒸馏水中不断摇晃)。

从凝胶中可以很明显的看到，7个突变体中对应OsGluA1、OsGluA2、 OsGluA3和OsGluB2的37-39kDa条带明显较亲本弱和窄，22-23kDa的谷蛋白 a亚基也有类似的现象。说明与野生型相比，经多基因敲除后谷蛋白的积累明显减少。另外，突变体中21kDaα-球蛋白和10kDa、13kDa和16kDa醇溶蛋白含量有所增加。具体结果如图11所示。

组分蛋白质含量定量分析结果表明，7种不同突变类型的谷蛋白含量分别显著降低了6.9％、19.2％、23.8％、27.1％、35.1％、35.4％和45.6％，且随着敲除基因数量的增加下降幅度更大(图12)。

实施例4

为了研究稻米蛋白质含量的变化是否会影响稻米蒸煮食味品质，进行稻米直链淀粉(AC)含量测定以及米饭食味与硬度的测定。

稻米直链淀粉(AC)含量测定

按农业部部颁标准NY147-88对AC进行测定，步骤稍微改动，具体如下：

(1)种子成熟后室温下放置3个月以平衡水分，再经砻谷、磨粉、过100 目筛；

(2)将过筛后的米粉放置于42℃烘箱中2天；

(3)于万分之一电子天平上精确称取50mg±0.1mg的米粉，置于50ml试管中；

(4)沿管壁缓慢加入0.5ml 95％乙醇溶液，轻轻摇晃使米粉充分弥散于酒精中；

(5)再沿管壁缓慢加入4.5ml 1.0N的NaOH溶液，轻摇混匀，旋转试管，使粘附在试管壁上的米粉充分混匀；

(6)静置一夜；

(7)在100ml容量瓶中加入20ml蒸馏水，吸取5ml过夜后的弥散液于容量瓶中；

(8)再向其中加入1.0ml 1N乙酸溶液，酸化样品；

(9)再向其中加入1.5ml 0.02％碘溶液，摇匀后定容至100ml，静置15min；

(10)吸取相同体积的样品于620mm波长下测定吸光值；

(11)以标准样品的吸光值制作标准曲线，计算待测样品的AC含量。

米饭食味与硬度的测定

采用STA1A型米饭食味计对供试样品进行食味值的测定。

(1)煮饭。用STA1A米饭食味计不锈钢罐蒸煮米饭即称取30g大米放入不锈钢罐内，与洗米装置连接，用流水清洗30s。在不锈钢罐中加水40.5g(即样品量:加水量＝1:1.35)。盖上滤纸，用橡皮筋固定，浸泡30min。放入电饭锅内蒸饭。等待电源自动断开(约30min)再保温10min后拔掉电源。取出不锈钢罐，拿掉滤纸，轻轻搅拌米饭，搅拌后盖上滤纸。放入冷却器中冷却20min，再在室温下放置1h。

(2)制作米饭饼。将8g米饭装入专用金属杯内，压成饭饼。

(3)基准板校正。用黑白板校正食味计。

(4)测定。将饭饼***食味计测定，仪器显示样品的外观、硬度、粘度、平衡和综合评分值。

直链淀粉(AC)含量测定结果表明，除VII型外，所有突变体与对照均无显著差异(图13a)。此外，进一步对反映稻米蒸煮食味品质的两个重要指标食味值和米饭硬度进行了评价，大多数突变体的食味值显著提高，米饭硬度显著降低，表明突变体的蒸煮食味品质得到提高(图13b，c)。

本发明提供的降低稻米蛋白质含量提高稻米蒸煮食味品质的方法，具体是将上述的谷蛋白合成基因利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行多基因敲除，经过对编辑区段进行PCR扩增和测序，同时通过水稻自交剔除基因组上的载体质粒，最终获得不同突变组合的植株。

本发明的实验证明，稻米谷蛋白含量的下降随着谷蛋白合成基因敲除数目的增多而越明显，稻米总蛋白含量也随着谷蛋白含量的降低而不同程度的下降；虽然醇溶蛋白和球蛋白有一定的补偿作用，但谷蛋白含量的下降可以快速使自身总蛋白质含量偏高的稻米品种下降到市场上优质稻米的需求，通常7％左右；稻米蛋白质含量的下降降低了米饭的硬度提升了蒸煮食味品质，且对种子的加工和外观品质无任何负面影响。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种利用CRISPR/Cas9技术降低稻米蛋白质含量提升蒸煮食味品质的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcatcca taaatcgccc catagttttc ttcacagttt gcttgttcct cttgtgcaat 60

ggctctctag cccagcagct attaggccag agcactagtc aatggcagag ttctcgtcgt 120

ggaagtccaa gagaatgcag gttcgatagg ttgcaagcat ttgagccaat tcggagtgtg 180

aggtctcaag ctggcacaac tgagttcttc gatgtctcta atgagcaatt tcaatgtacc 240

ggagtatctg ttgtccgtcg agttattgaa cctagaggcc ttctactacc ccattacact 300

aatggtgcat ctctagtata tatcatccaa gggagaggta taacagggcc aactttccca 360

ggctgtcctg agtcctacca acaacagttc caacaatcag gccaagccca attgaccgaa 420

agtcaaagcc aaagtcaaaa gttcaaggat gaacatcaaa agatccaccg tttcagacaa 480

ggagatgtaa ttgcattgcc tgctggtgta gctcattggt gctacaatga tggtgaagtg 540

ccagttgttg ccatatatgt cactgatctc aacaacggtg ctaatcaact tgaccctagg 600

caaagggatt tcttgttagc tggaaataag agaaaccctc aagcatacag gcgtgaggtt 660

gaggagcggt cacagaacat atttagtggc tttagcactg aactacttag cgaggctctt 720

ggcgtaagca gccaagtggc aaggcagctc caatgtcaaa atgaccaaag aggagaaatt 780

gtccgtgtcg aacacgggct cagtttgctg cagccatatg catcattgca ggagcaggaa 840

caaggacaag tgcaatcaag agagcgttat caagaaggac aatatcagca aagtcaatat 900

ggaagtggct gctctaacgg tttggatgag accttttgca ccctgagggt aaggcaaaac 960

atcgataatc ctaaccgtgc tgatacatac aatccaagag ctggaagggt tacaaatctc 1020

aacacccaga atttccccat tcttagtctt gtacagatga gtgcagtcaa agtaaatcta 1080

taccagaatg cactcctttc accattttgg aacatcaacg ctcacagcgt cgtgtatatt 1140

actcaaggcc gtgcccgggt tcaagttgtc aacaacaatg gaaagacagt gttcaacggc 1200

gagcttcgcc gcggacagct gcttattata ccacaacact atgcagttgt aaagaaggca 1260

caaagagaag gatgtgctta cattgcattc aagaccaatc ctaactctat ggtaagccac 1320

attgcaggaa agagttccat cttccgtgct ctcccaaatg atgttctagc aaatgcatat 1380

cgcatctcaa gagaagaggc tcagaggctc aagcataata gaggagatga gttcggtgca 1440

ttcactccaa tccaatacaa gagctaccaa gacgtttata atgcggcaga atcctcttag 1500

<210> 2

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcatcca taaatcgccc catagttttc ttcacagttt gcttgttcct cttgtgcgat 60

ggctccctag cccagcagct attaggccag agcactagtc aatggcagag ttctcgtcgt 120

ggaagtccga gaggatgtag atttgatagg ttgcaagcat ttgagccaat tcggagtgtg 180

aggtctcaag ctggcacaac tgagttcttc gatgtctcta atgagttgtt tcaatgtacc 240

ggagtatctg ttgtccgccg agttattgaa cctagaggcc tactactacc ccattacact 300

aatggtgcat ctctagtata tatcatccaa gggagaggta taacagggcc gactttccca 360

ggctgtcctg agacctacca gcagcagttc caacaatcag ggcaagccca attgaccgaa 420

agtcaaagcc aaagccataa gttcaaggat gaacatcaaa agattcaccg tttcagacaa 480

ggagatgtta tcgcgttgcc tgctggtgta gctcattggt gctacaatga tggtgaagtg 540

ccggttgttg ccatatatgt cactgatatc aacaacggtg ctaatcaact tgaccctcga 600

cagagggatt tcttgttagc tggaaataag agaaaccctc aagcatacag gcgtgaagtt 660

gaggagtggt cacaaaacat atttagtggc tttagcactg aactgcttag cgaggctttt 720

ggcataagca accaagttgc aaggcagctc cagtgtcaaa atgaccaaag aggagaaatt 780

gtccgcgttg aacgcgggct cagtttgctg caaccatatg catcattgca agagcaggaa 840

caaggacaaa tgcaatcaag agagcattat caagaaggag gatatcagca aagtcaatat 900

gggagtggct gccctaacgg tttggatgag accttttgca ccatgagggt aaggcaaaac 960

atcgataatc ctaaccgtgc tgatacatac aacccaagag ctggaagggt tacaaatctc 1020

aacagccaga atttccccat tcttaatctt gtacagatga gcgccgttaa agtaaatcta 1080

taccagaatg cactcctttc accgttctgg aacatcaacg ctcacagcat cgtgtatatt 1140

actcaaggcc gagcccaggt tcaagttgtc aacaacaatg gaaagacggt gttcaacgga 1200

gagcttcgtc gtggacagct acttattgta ccacaacact atgtagttgt aaagaaggca 1260

caaagagaag gatgtgctta cattgcattc aagacaaacc ctaactctat ggtaagccac 1320

attgcaggaa agagttccat cttccgtgct ctcccaactg atgttctagc aaatgcatat 1380

cgcatctcaa gagaagaggc tcagaggctc aagcataaca gaggagatga gttcggtgca 1440

ttcactcccc tccaatacaa gagctaccaa gacgtttata atgtggcgga atcctcttaa 1500

<210> 3

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcaacca tcaaattccc tatagttttc tccgtcgttt gcttgttcct cttgtgtaat 60

ggttcgttag cccaacttct tagccaaagt actagtcaat ggcaaagttc tcgccgtgga 120

agtccaagag agtgcagatt tgatcggttg caagcatttg agccgattcg cactgtaagg 180

tcccaagctg gtacaactga gttttttgat gtctctaatg agttgtttca atgtactgga 240

gtatttgttg tccgtcgagt tatcgaacct agaggtcttc tgttacctca ctactccaat 300

ggagcaactt tggtatatgt catccaaggc agaggtataa caggaccaac tttcccagga 360

tgtcctgaga cctatcaaca acagtttcag caatccgagc aagaccaaca attggaaggc 420

caaagccaaa gccataaatt tagagatgaa catcaaaaga tccaccgttt tcaacagggg 480

gatgtagttg cattgcctgc tggtgttgct cattggtgct acaatgatgg tgatgcacca 540

attgttgcca tatatgtcac tgatatatac aatagtgcta accaacttga tcctagacac 600

agggatttct ttttagctgg caacaataag ataggtcaac aattgtatag atatgaggca 660

agggacaatt cgaagaacgt ctttggtgga tttagtgttg aactacttag cgaggctctt 720

ggcataagca gtggagtagc aagacaactc cagtgccaaa atgaccaaag aggagaaata 780

gttcgtgttg agcatgggct ttccttgctc caaccatatg catcgttgca agagcaacaa 840

caagaacagg tgcaatcgag agactatggc caaacacaat atcaacaaaa acaacttcaa 900

ggtagttgct ctaatggttt ggatgagacc ttttgtacca tgagggtaag gcaaaatatc 960

gacaacccaa acctcgcaga tacatacaac cccagagcag gaaggatcac atatctaaat 1020

ggccaaaagt tccccattct taatcttgta cagatgagtg ccgttaaagt aaatttatat 1080

cagaacgcac tcctttcacc tttttggaac atcaacgctc atagtgtcgt gtatattact 1140

caaggtcgtg cccgagttca agtcgtcaac aacaatggaa agacagtgtt cgatggagag 1200

ctccgtcgtg ggcagcttct aattatacca caacaccatg tagtcattaa aaaggcacaa 1260

agggaaggat gctcatatat tgcattgaaa accaaccctg actccatggt tagccacatg 1320

gcaggaaaga attccatctt ccgcgcactt cctgacgatg ttgtagcaaa tgcatatcgt 1380

atctcaagag aagaagctag gaggctcaag cacaacaggg gagatgagtt aggtgtgttc 1440

actcctagtc atgcctacaa gagctaccaa gacatatctg tgagtgcata a 1491

<210> 4

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcaacta ccattttctc tcgtttttct atatactttt gtgctatgct attatgccag 60

ggttctatgg cccaactatt taatccaagc acaaacccat ggcatagtcc tcggcaagga 120

agttttaggg agtgtaggtt tgatagacta caagcatttg agccacttcg aaaagtaagg 180

tcagaagctg gggtgactga gtacttcgat gagaagaatg aattattcca atgcacaggt 240

acttttgtca tccgacgtgt cattcaacct caaggccttt tggtacctcg atatagcaat 300

actcctggcc tggtctacat cattcaaggg aggggttcta tgggtttaac cttccccggt 360

tgcccagcga cttatcagca acaattccaa caattttcgt ctcaaggcca aagtcaaagc 420

caaaagttta gggatgagca tcaaaagatc catcaattta gacaaggaga tgttgttgca 480

ctcccagctg gtgttgcaca ttggttctac aatgatggtg atgcatcggt tgttgccata 540

tatgtttatg acataaacaa cagtgcaaat caacttgaac caaggcaaaa ggagttccta 600

ttagctggta acaacaatag ggttcaacaa gtatatggca gctcaattga gcaacactct 660

agccaaaaca tattcaacgg attcggtact gagctactaa gtgaggcttt aggcatcaac 720

acagtagcag caaagaggct gcagagccaa aatgatcaga gaggagagat cgtacatgtg 780

aaaaatggcc ttcaattgtt gaaaccgact ttgacacaac aacaagaaca agcacaagct 840

caataccaag aagttcaata tagtgaacaa caacaaacat cttcccgatg gaacggattg 900

gaggagaact tctgcacaat caaggcaaga gtaaacattg aaaatcctag tcgtgctgat 960

tcatacaacc cacgtgctgg aaggatttca agtgtcaaca gccagaagtt ccccatcctt 1020

aacctcatcc aaatgagtgc taccagagta aacctatacc agaatgctat tctctcacca 1080

ttctggaatg tcaatgctca tagtttggtc tatatgattc aagggcaatc tcgagttcaa 1140

gtcgttagta actttggaaa gactgtgttc gatggtgtcc ttcgccctgg acaactattg 1200

atcattccac aacattatgc tgtcttgaag aaagcagagc gtgaaggatg ccaatatatt 1260

gcaatcaaga caaacgctaa cgccttcgtc agccaccttg caggaaaaaa ctcagtattc 1320

cgcgccttac cagttgatgt ggtcgctaat gcttaccgca tctcacggga gcaagcccga 1380

agcatcaaga acaatagggg agaagagcac ggtgccttca ctcctagatt tcaacaacaa 1440

tactacccag gattctcgaa tgagtccgaa agtgagactt cagagtaa 1488

<210> 5

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgactattt ccgttttctc tcgattttct atatactttt gtgttcttct cttgtgcaat 60

ggatctatgg cccaactatt tgatccagcc acaaaccaat ggcaaactca tcgacaagga 120

agctttaggg agtgtagatt tgagagacta caagcatttg agcctcttca gaatgtgagg 180

tcggaagctg gtgtgaccga gtactttgat gagacgaatg aattgtttca gtgcacaggt 240

acatttgtca tccgacgtgt tattcaacct caaggccttc taatacctcg atacgccaat 300

actcctggca tggtctacat catccaagga agaggttcta tgggtctaac cttccctgga 360

tgccccgcaa cttaccagca gcaatcccaa cagtttttgt ttcaaggcga aagtcagagc 420

caaaagttta tagatgagca ccaaaagatt catcaattta ggcaaggtga tatcgttgta 480

ctcccaacag gtgttgcaca ttggttctac aatgatggtg acacgcctgt tgttgcccta 540

tatgtttatg acataaacaa tagcgctaat caacttgaac caaggcatag ggagttctta 600

ttggctggta agaacaatag ggtacaacaa gtgtatggtc gctcaattca gcaacactct 660

gggcaaaaca tattcaatgg attcagtgtt gagccactaa gtgaggcttt aaacatcaac 720

acagtaacaa caaagaggct acaaagccaa aatgaccaaa gaggagagat catacatgta 780

aagaatggcc ttcaattgct gaaaccaact ttgacacaac gacaagaaca agaacaagct 840

caataccaag aagtccaata tagtgaaaaa ccacaaacat cttcccgatg gaacggttta 900

gaggagaact tgtgcacaat caagacgagg ttaaacattg aaaatccaag tcgtgctgat 960

tcatacgatc cacgtgctgg aaggatcaca agtcttgata gtcagaaatt ccctatcctt 1020

aatatcatcc aaatgagtgc tactagagta aatctatacc agaatgctat tctcacacca 1080

ttctggaatg taaatgctca tagtttgatg tatgtgattc gagggcgtgc tcgagtccaa 1140

gtcgtcagta actttggaaa gactgtgttc gacggtgttc ttcgtccaga acaactattg 1200

attattccac aaaactatgt tgtcttaaag aaagcacaac atgaaggatg ccaatatatt 1260

gcaatcaaca caaacgctaa tgccttcgtg agccaccttg caggggtaga ctcagtattc 1320

catgccttac cagttgatgt tatcgctaat gcgtattgca tctcaaggga agaggctcga 1380

agactcaaga acaacagggg agacgagtat ggtccattcc ctcctagatt acaacaacaa 1440

atctacccag aattctcgaa tgaatctaaa ggcgagactt cagagtaa 1488

<210> 6

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggcaacta ttgcattctc tcgattttct atatgctttt gtgtccttct cctttgccat 60

ggttctatgg ctcagatatt tagtctaggc ataaatccat ggcaaaatcc tcgacaaggg 120

ggttctaggg agtgtaggtt tgataggctc caagcgtttg agccgcttag gaaagtgagg 180

catgaagctg gggttacaga gtactttgat gagaagaatg agcagttcca gtgcaccggt 240

acattagtaa ttcgtcgcat tattgagcct cagggccttc ttttacctcg atactccaac 300

actcctggcc tagtatatat catccaaggg actggtgtac tgggattgac ctttcctggt 360

tgcccagcaa cttaccaaaa gcaatttagg cattttggtc ttgaaggagg aagccaaagg 420

caaggaaaaa aattaagaga tgaaaaccaa aagatccacc aatttaggca aggagatgtt 480

gttgcacttc cttctggtat accacactgg ttctataatg agggtgacac ccctgttgtt 540

gctttgtttg tttttgatgt aaacaacaat gctaatcaac tcgaaccaag acaaaaggag 600

ttcttgttag ctggtaacaa tatagagcaa caagtgtcca acccctcaat caacaaacat 660

tctgggcaaa acatattcaa tggattcaac actaagctat taagtgaggc cttaggcgtt 720

aacatagagg tgaccagaag gctacaaagt caaaatgacc gaagaggaga tatcattcga 780

gtaaagaatg gccttcgatt gataaaacca actatcacac aacaacagga acaaacacaa 840

gatcaatacc aacaaattca atatcataga gagcaacgat caacaagcaa atacaatggc 900

ttggatgaga acttctgtgc aattagggca aggttaaaca tagaaaaccc taatcatgct 960

gatacttaca accctcgtgc tggaaggatt acaaatctca atagccagaa gttctccatt 1020

cttaaccttg tccaaatgag tgctacaaga gtaaatctat accagaatgc tattctctca 1080

ccattctgga atattaatgc tcacagtttg gtgtatacaa ttcaagggcg tgctcgagtt 1140

caggttgtta gcaaccatgg aaaggctgta tttaatggtg ttcttcgtcc agggcaatta 1200

ctaattatac cacaaaatta tgtggttatg aagaaagcag agcttgaagg atttcaattt 1260

atcgcgttta agacaaaccc aaatgccatg gtaaaccaca tcgcggggaa gaactcagtt 1320

ctccgtgcaa tgcctgtgga tgtgatagct aatgcatatc gcatctcaag gcaggaagct 1380

cgtagcttga agaataatag gggagaagag attggtgctt tcactcctag atatcaacaa 1440

caaaaaatcc accaagagta ctcaaatcca aacgaaagtg agactcaaga ggtgatttaa 1500

<210> 7

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggcttcca tgtctaccat tcttccattg tgccttggcc tccttctctt cttccaagtg 60

tccatggcac aattttcatt tgggggaagc ccacttcaga gcccacgtgg atttagggga 120

gaccaagata gtcgtcatca atgtcgtttt gagcacctca ccgcccttga ggcaacacac 180

cagcagagat ctgaagctgg attcactgag tactacaaca ttgaggcaag aaatgagttc 240

cgttgtgccg gagtgagcgt gaggcgctta gtcgtcgaga gcaagggctt agttttacca 300

atgtatgcta atgctcacaa gcttgtctac atcgtccaag gtcggggagt gtttgggatg 360

gcactgcctg gttgtccaga gacgttccag tcagttaggt ctccctttga gcaagaggtg 420

gcaacagctg gtgaggctca atcatcaatc caaaaaatga gagacgagca ccagcaactt 480

caccaattcc accaaggtga tgtaatcgca gtgccagctg gagtagccca ctggctatat 540

aacaatggtg attctcctgt ggttgctttc actgtcatcg acaccagcaa caatgccaac 600

cagctcgatc ctaaaagaag ggagtttttc ttggctggaa agcctagaag tagctggcag 660

cagcaatcgt actcatacca gacagaacaa ctgagcagaa atcagaacat ctttgctggg 720

ttcagcccag atttactttc tgaagccctg agtgtgagca agcaaactgt gttgaggctc 780

caaggcctga gtgacccaag aggtgccatc attagagttg aaaatgggct ccaggcactg 840

cagccctctc tccaagttga gccagtgaaa gaggaacaaa cccaagctta cttgccaacc 900

aagcagctac agcccacctg gttgcgaagt ggtggagctt gcggccagca aaatgtccta 960

gatgaaatta tgtgtgcatt taagttgagg aagaacatag acaacccaca atccagtgac 1020

atatttaacc cccatggtgg aaggatcaca agggccaata gccagaattt cccaatactc 1080

aatatcatcc agatgagtgc caccagaatc gttctccaaa ataatgcctt gcttactcct 1140

cattggacgg taaacgcaca cacggtgatg tacgtgaccg ctggccaagg gcacatccag 1200

gtggtggatc accgtggtag gagtgtcttt gatggtgagc ttcaccaaca gcagatcttg 1260

ttgatcccac agaactttgc agtggtggtg aaggctcgac gtgaaggatt tgcatgggta 1320

tccttcaaga ccaatcacaa tgctgtcgac agtcagatcg cagggaaggc ctccattctt 1380

cgtgctctac ccgttgacgt ggtcgccaat gcttataggc tttcaaggga ggactctagg 1440

catgtaaagt tcaaccgcgg cgatgagatg gctgtctttg ctccgaggcg tgggccgcaa 1500

cagtatgctg agtggcagat caacgagaag taa 1533

<210> 8

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggcaacta ctacctctct attgtcttcc tgtctctgtg ctcttctctt ggctccgctc 60

tttagccaag gtgtagatgc atgggaaagc cgacaagggg cttccaggca gtgcagattt 120

gataggttac aagcatttga gcccctaaga aaggtacgat cggaagctgg ggacacagag 180

tactttgatg agagaaatga gcagtttcga tgcgctggtg tctttgtcat tcggcgcgtg 240

attgagccac aaggccttgt ggtgcctcga tactcgaaca ctcctgctct agcctacata 300

atccaaggaa aaggttacgt aggattgact tttcctggtt gcccagcaac acaccaacaa 360

caattccaac tatttgaaca aagacagagc gaccaagctc ataagtttag agatgagcac 420

cagaagattc acgaatttag gcaaggggat gttgttgcac ttccggctag tgttgcacat 480

tggttctaca atggtggtga tacaccggct gttgttgtct atgtttatga cataaaaagt 540

tttgctaatc agcttgaacc aaggcagaag gagtttttat tagctggtaa caaccagaga 600

gggcaacaaa tatttgaaca ttccatcttt caacactctg gacaaaatat atttagtggg 660

ttcaatactg aggtacttag cgaggccctt ggaataaaca cggaggcttc caagaggctc 720

caaagtcaaa atgaccaaag gggagatatc attcgagtga agcacgggct tcaattgttg 780

aaacccacat taacacaacg acaggaagaa catcgtcaat atcaacaagt ccagtatcgt 840

gaaggacaat ataatggatt ggacgagaat ttctgtacaa taaaggcaag ggtaaacatt 900

gaaaatccta gccgcgctga ctactacaac cctcgtgctg gaaggataac ccttcttaac 960

aaccaaaagt tccctattct caaccttatt ggaatgggtg ctgcaagagt aaacttatac 1020

cagaatgctc ttctctcacc cttctggaac attaatgccc atagtgtagt gtatatcatc 1080

caaggaagtg tgcgagtaca ggttgccaat aatcaaggaa gatctgtgtt taatggtgta 1140

cttcatcagg ggcaactatt aatcatacca caaaaccatg ccgtcattaa gaaagccgag 1200

cacaatgggt gccagtatgt cgcaataaag acaatttcgg accctacggt gagttgggtt 1260

gctggaaaga actccatatt acgtgcattg cctgtagatg ttattgccaa tgcttatcgt 1320

atctcgaggg atgaagcccg acgtctaaag aataataggg cagatgagat tggccctttt 1380

actcctcgtt tcccccagaa gagccagcgg ggttaccagt tcctaactga aggcctctct 1440

ttaatcggca tgtaa 1455

<210> 9

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctcattggt gctacaatga tgg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caaacatctt cccgatggaa cgg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aggtcgggga gtgtttggga tgg 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tacaaccctc gtgctggaag g 21

Claims

1.一种制备转基因水稻的方法，其特征在于：包括使受体水稻基因组的谷蛋白合成基因发生突变，以降低谷蛋白表达量或阻断谷蛋白的产生，获得所述转基因水稻。

2.如权利要求1所述的制备转基因水稻的方法，其特征在于：采用基因编辑的方式使受体水稻基因组的谷蛋白合成基因发生突变；

所述水稻谷蛋白合成基因，包括OsGluA1、OsGluA2、OsGluA3、OsGluB2、OsGluB6、OsGluB7、OsGluC和OsGluD中的一种或多种。

3.如权利要求1或2所述的制备转基因水稻的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9***进行，所述CRISPR/Cas9***为如下任一种：

(a)包括特异gRNA和Cas9蛋白；所述特异gRNA中的靶序列识别区如SEQ ID NO.1中第511～533位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.2中第511～533位核苷酸所示，和/或SEQ IDNO.3中第508～530位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.4中第874～896位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.5中第874～896位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.6中第967～987位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.7中第339～361位核苷酸所示，和/或SEQ ID NO.8中第925～945位核苷酸所示；

(d)包括特异重组质粒，所述特异重组质粒表达所述特异DNA分子和所述Cas9蛋白的编码基因。

4.如权利要求3所述的制备转基因水稻的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9***中的gRNA的靶序列包括SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12中的一种或多种。

5.一种制备转基因水稻的方法，其特征在于：包括，

采用如权利要求3或4中的CRISPR/Cas9***对受体水稻进行基因编辑，得到转基因水稻；

或，将权利要求3所述特异重组质粒导入受体水稻，得到转基因水稻。

6.如权利要求5所述的制备转基因水稻的方法，其特征在于：所述导入受体水稻，将权利要求3所述特异重组质粒经农杆菌介导转化作物愈伤组织，通过筛选、分化、生根和阳性检测，种植得到转基因水稻。

7.如权利要求6所述的制备转基因水稻的方法，其特征在于：所述作物，包括水稻、水稻、玉米中的一种。

8.一种制备无转基因的基因编辑水稻的方法，其特征在于：包括，

按照权利要求1～4的方法制备的转基因水稻或按照权利要求5～7的方法制备的转基因水稻；

将所述转基因水稻自交，得到自交后代；

从所述自交后代中筛选无转基因的基因编辑水稻。

9.一种水稻的DNA分子，其特征在于：所述水稻的DNA分子包括，

如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第528位碱基删除、如SEQ ID NO.7所示的DNA分子的第356～357位碱基删除形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第525～528位碱基删除、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第528位碱基删除、如SEQ ID NO.5所示的DNA分子的第890位后***1个碱基、如SEQ ID NO.6所示的DNA分子的第356位碱基删除形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第526～527位碱基删除、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第528～535位碱基删除、如SEQ ID NO.5所示的DNA分子的第891位碱基删除、如SEQ ID NO.8所示的DNA分子的第938位后***1个碱基形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第528位碱基删除、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第528位碱基删除、如SEQ ID NO.3所示的DNA分子的第526位碱基删除、如SEQ ID NO.5所示的DNA分子的第887～890位碱基删除、如SEQ ID NO.7所示的DNA分子的第343～381位碱基删除形成的DNA分子；

或，如SEQ ID NO.1所示的DNA分子的第521～528位碱基删除、如SEQ ID NO.2所示的DNA分子的第527～535位碱基删除、如SEQ ID NO.3所示的DNA分子的第524位后***1个碱基、如SEQ ID NO.4所示的DNA分子的第890位后***1个碱基、如SEQ ID NO.5所示的DNA分子的第874～978位以及第891位碱基删除、如SEQ ID NO.7所示的DNA分子的第343～381位碱基删除形成的DNA分子。

10.如权利要求1～8中任一项所述的方法在提升稻米蒸煮食味品质中的应用。