CN107779419B - 一株防治向日葵菌核病的肉桂色链霉菌zx6及应用 - Google Patents

一株防治向日葵菌核病的肉桂色链霉菌zx6及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治向日葵苗期菌核病的肉桂色链霉菌ZX6，所述菌种的保藏号为CGMCC 13116，属于微生物技术领域。通过实施向日葵菌核病的病原菌核盘菌的分离活化和鉴定、拮抗菌的初筛和复筛实验和拮抗菌的菌种鉴定分析等实验，表明菌株ZX6具有较强的抑制核盘菌菌丝生长的能力。本发明的菌株ZX6发酵原菌液处理过的向日葵种子皮壳侵染发病率降低为40％、菌株ZX6发酵滤液对种子萌发促进率为51.1％、菌株ZX6发酵原菌液的离体叶片防治效果为54％、菌株ZX6发酵原菌液盆栽实验防治效果为58.3％，能有效抑制核盘菌的生长繁殖。本发明的菌株培养条件简单，易保存，对环境友好，具有良好的开发应用价值。

Description

一株防治向日葵菌核病的肉桂色链霉菌ZX6及应用
技术领域
本发明涉及一株防治向日葵菌核病的肉桂色链霉菌(Streptomycescinnamonensis)ZX6的筛选鉴定及应用，更确切地说涉及到该菌株在向日葵菌核病防治中的初步应用，属于微生物技术领域。
背景技术
向日葵菌核病是向日葵最重要的病害之一，在世界各国均有发生，其病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)致病性强，可以穿透寄主植物表皮，杀死细胞，进而侵染向日葵的根、茎、叶、花盘等多个部位，甚至造成植株整体或局部腐烂死亡，若管理不当，会对向日葵造成极大损失。近年来，向日葵菌核病的普遍发生和严重危害极大地影响了向日葵种植业的稳步发展。
向日葵菌核病又称白腐病或烂盘病。向日葵菌核病从病原菌的侵染形态上可分为菌丝体侵染型和子囊孢子侵染型；根据菌核病的发生部位和症状又可分为根腐型、茎腐型、叶枯型和盘腐型，其中根腐型是土壤中或种子中的菌核萌发后，以菌丝体的形式进行侵染而造成的；茎腐型、叶枯型和烂盘型其初侵染源都是子囊孢子，在不同的生态条件下，菌丝体和子囊孢子的侵染能力有明显差异。
向日葵菌核病的致病菌即核盘菌是为土壤习居菌，能在土壤中长期存活和积累，其生活史中有90％的时间是以菌核的形式长期存活于土壤中。菌核可在土壤表层或混入种子间休眠，其生命力很强，在干旱的土壤中可存活6-8年，在潮湿的土壤中可存活3-5年。核盘菌菌丝生长的最适温度范围在20-28℃，最适 pH值4-7，最佳碳源、氮源分别为甘露糖及天门冬酰胺，菌丝生长对缺Cu、Fe 最为敏感，菌丝可在PDA、PSA等天然、半天然培养基上生长旺盛且均匀。菌丝在45℃处理10min，菌核在50℃处理10min，均不再存活。我国向日葵菌核病重病区大部分因向日葵生育后期(7-8月)多雨,因而病原菌以子囊孢子侵染为主。向日葵地上部分的抗病性不同,叶强于茎,茎强于花盘,所以以烂盘型菌核病危害最重,其次是根腐型和茎腐型,叶枯型很少发生,而且只发生在局部叶片上，子囊盘的形成需要一定的散射光,紫外线照射可刺激菌核的萌发。经黑暗无光及自然光处理后,菌核只产生子囊盘柄,而不形成子囊盘,子囊盘具有明显的向光性。若无外源营养时,只要保证一定的湿度和光照,菌核即可萌发产生子囊盘。菌核产生子囊盘可分为针状期—膨大期—漏斗期3个时期,菌核萌发形成子囊盘的适宜温度在18-20℃,高温不易萌发,且菌核的萌发需要适宜的通气条件,一般以覆土0-1cm长出的子囊盘数最多。
在防治方面，由于向日葵菌核病的抗病育种进展缓慢，目前还没有抗病品种和高效耐病品种。化学防治主要使用的有多菌灵、速克灵和菌核净等药剂，但向日葵植株过于高大，田间用药十分困难，药剂对土壤中菌核效果有限，因此防治效果并不理想。在农业防治方面，也缺少经济实用并且效果显著的方法。因此，筛选利用有益微生物及其代谢产物来防治向日葵菌核病是实施绿色环保安全的具体措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够很好的控制向日葵菌核病病害发生的防病促生菌株及应用。
本发明从内蒙古、青海，酒泉地区采集土壤样品，通过稀释涂布平板法在高氏一号、改良高氏二号、TSA、LB、ISP2、PDA培养基上获得不同菌株的单菌落，再采用平板对峙拮抗实验初步筛选出对向日葵核盘菌有明显抑制效果的菌株，对其进行16S rRNA基因序列测定鉴定其所属种属，该菌株对人畜均无致病致癌性，能安全地用于向日葵菌核病的生物防治中。
本发明所提供的技术方案是一株防治向日葵菌核病的肉桂色链霉菌ZX6及应用，根据对其形态学特征观察和16S rRNA基因序列分析，确定该菌株为肉桂色链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)，命名为肉桂色链霉菌ZX6(Streptomyces cinnamonensisZX6)。该菌株于2017年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 13116，保藏单位地址为：北市朝阳区北辰西路1号院3号。
菌株ZX6能在高氏一号、ISP2、LB和PDA等不同培养基上生长。菌株ZX6 在高氏一号培养基上生长良好，菌落较小，基内菌丝为米黄色，气生菌丝前期为粉白色，后期变为浅灰色，无可溶性色素产生；将该菌株接种于ISP2培养基上，生长情况良好，中间突起，菌落较大，基内菌丝白色，气生菌丝为粉色，有浅粉色色素产生；该菌株在LB培养基上菌落较小，有褶皱，湿润，基内菌丝为浅灰色，气生菌丝为褐色，无可溶性色素产生；在PDA培养基上菌落有褶皱，菌落较大，基内菌丝为白色，气生菌丝为褐巧克力色，无可溶性色素产生。在 28-30℃下生长良好，通过革兰氏染色在显微镜下观察菌株ZX6为革兰氏阳性，孢子形状为长圆形。
本发明所述的筛选鉴定方法是利用菌株ZX6的发酵液、发酵液提取物进行的应用。
本发明提供多种对向日葵核盘菌的拮抗菌的筛选鉴定方法，主要涉及菌株 ZX6的发酵液对核盘菌的拮抗实验、离体叶片防效实验和盆栽实验等。
本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的菌株ZX6经鉴定为肉桂色链霉菌(Streptomycescinnamonensis)，该菌株对人畜无致病致癌性，是一种能安全防治向日葵菌核病的拮抗放线菌。应用实施例表明，通过盆栽实验表明，该菌株对向日葵幼苗期的菌核病的防治效果达到了58.3％。目前，国内外对向日葵菌核病的防治主要采取的是化学防治的方法，化学防治主要使用的有多菌灵、速克灵和菌核净等药剂，但向日葵植株过于高大，田间用药十分困难，药剂对土壤中菌核效果有限，因此防治效果并不理想。国内外还没有报道过肉桂色链霉菌对向日葵菌核病的抑制作用。因此，本发明所涉及的菌株ZX6对防治向日葵菌核病具有良好的开发潜力和应用价值。
附图说明
图1:实施例二中的菌株ZX6的初筛中的肉桂色链霉菌ZX6(Streptomycescinnamonensis ZX6)的平板对峙实验结果图。
图2:实施例二中的菌株ZX6的鉴定中的菌株ZX6生长结果图。
图3：实施例二中的16S rRNA基因序列鉴定及序列分析中的ZX6***发育树构建结果图。
图4:实施例三中的向日葵种子发芽实验中ZX6菌液对种子萌发影响结果图 (原为菌株ZX6原菌液，原20为稀释20倍的菌株ZX6原菌液，滤为菌株ZX6 发酵液的滤液，滤20为稀释20倍的滤液)。
图:5:实施例三中的菌株ZX6离体叶片防效复筛实验组结果图。
图6:实施例三中的菌株ZX6离体叶片防效复筛对照组结果图。
图7:实施例三中的向日葵盆栽实验中的原菌液实验组结果图(左边为根部侵染全图、右边为根部侵染局部图)。
图8:实施例三中的向日葵盆栽实验中的空白对照组结果图。
图9:实施例三中的向日葵盆栽实验中的实验对照组结果图。
具体实施方式
下面提供实施例以进一步说明本发明。
实施例一核盘菌的筛选和鉴定
本发明的核盘菌的菌株是从内蒙古地区的向日葵秸秆中分离出来。将从内蒙古地区采摘回来的向日葵秸秆用小刀剖开，从中取出核盘菌菌核，用75％乙醇消毒，再用无菌水冲洗2-3次，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中于25℃恒温培养3-5d至菌丝长出，再将菌丝挑至新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基生长待用，将纯化完成的核盘菌进行ITS区序列测序确定其为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)。
实施例二菌株ZX6的初筛与鉴定
本发明筛选防治向日葵菌核病菌株的方法如下：
一、土壤样品的采集
从内蒙古，青海和酒泉地区各随机采集土样5份。去除表面土壤，采集 5-20cm深处的土样约300g，分装标记后带回实验室。
二、分离菌株的纯化与培养
采用稀释涂布平板法分离菌株，称取1g土样，混合于9mL无菌水中作为 10-1稀释液，进行梯度稀释；分别用10-2、10-3和10-4样品稀释液涂布各个分离培养基平板，每个稀释度涂布2个平板，每块平板涂布量为0.2mL。琼脂平板的表面必须是干的，以便于接种物立刻被吸收；分离平板于28℃倒置培养1-4周，每3-4d定期检查；采用形态学比较，区分形态上明显不一致的菌株，将菌株接种在高氏一号培养基(可溶性淀粉20g,NaCl 0.5g,KNO3 1g,MgSO4.7H2O 0.5g, K2HPO4 0.5g,FeSO4.7H2O 0.01g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,pH 7.2)、改良高氏二号培养基(葡萄糖1g,Na2HPO4 0.01g,胰蛋白胨0.3g,复合维生素0.2ml,琼脂 20g,蒸馏水1000ml,pH 7.2)、LB培养基(胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,琼脂20g, 蒸馏水1000ml,pH7.2)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)(胰蛋白胨15g,大豆蛋白胨5g，氯化钠5g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,pH 7.2)、葡萄糖酵母培养基(Bacto-yeast extract 4g,Bacto-malt extract10g,葡萄糖4g,琼脂20g,蒸馏水 1000ml,pH 7.2)和马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)(马铃薯浸粉3g，葡萄糖 20g,酵母浸粉10g,琼脂20g，蒸馏水1000ml,pH 7.2)上于28℃倒置扩大培养3-5d。
三、拮抗菌株的初筛
采用平板对峙法筛选有效拮抗菌株，在活化好的向日葵核盘菌菌落周围打取直径6mm的菌块接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中央，将培养3-5d的直径为 6mm拮抗菌菌饼等距离接种在核盘菌菌块四周，于25℃恒温培养箱中培养3-5d 后观察，测量并记录抑菌圈直径大小，各处理3次重复。
四、菌株ZX6的鉴定
1、培养形态特征
菌株ZX6在高氏一号培养基、葡萄糖酵母培养基、LB和马铃薯葡萄糖琼脂培养基上均能正常生长。菌株ZX6在高氏一号培养基上生长良好，基内菌丝为米黄色，气生菌丝前期为粉白色，后期变为浅灰色；将菌株ZX6接种于葡萄糖酵母培养基上，生长情况良好，中间突起，基内菌丝白色，气生菌丝为粉色；该菌株在LB培养基上菌落有褶皱，湿润，基内菌丝为浅灰色，气生菌丝为褐色；在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上菌落有褶皱，基内菌丝为白色，气生菌丝为褐巧克力色；在28-30℃下生长良好，通过革兰氏染色在显微镜下观察，菌株ZX6 为革兰氏阳性，孢子形状为长圆形。除在葡萄糖酵母培养基上有浅粉色色素产生为，在其它3种培养基上均无可溶性色素生成。形态特征结果如图1。
2、生理生化实验
具体参照《常见细菌***鉴定手册》和《链霉菌鉴定手册》，经过生理生化实验鉴定：菌株ZX6为革兰氏阳性菌，生理生化实验结果见下表。
表1.菌株ZX6的生理生化特性
Figure BDA0001292359710000071
注：“+”：反应呈阳性或可以生长、利用；“-”：反应呈阴性或不可以生长、利用。
3、16S rRNA基因序列鉴定
将拮抗效果较好的菌株ZX6(图2)进行16S rRNA基因序列鉴定确定其所属种属，鉴定其为肉桂色链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)。
3.1DNA的提取
主要参考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法小量提取总DNA。
(1)从平板或斜面上挑取菌体，用无菌水以12000r/min离心3min，共洗2 次；再用TE Buffer以同样条件离心洗涤1次。
(2)加567μL TE(pH 8.0)缓冲液悬浮菌体沉淀，加30μL 20％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K轻轻混匀，30℃水浴1小时。
(3)加100μL 5M的NaCl混匀，再加80μL CTAB/NaCl(10％/0.7M)溶液轻混，65℃水浴20min。
(4)加入800μL的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，混匀后，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的离心管，重复抽提两次。
(5)将上清转移到新的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，12000 r/min离心15min。
(6)弃上清，加入1mL70％的乙醇，轻轻混匀，12000r/min离心15min。
(7)弃上清，风干，加入50μL无菌水溶解DNA，4℃保存。
3.2 16S rRNA基因序列鉴定
用16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增，正向引物PA为27f(对应E. coli 16SrRNA基因的第8-27位碱基)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物PB为1525r(对应E.coli 16SrRNA基因的第1492-1514位碱基)： 5’-AGAAAGGAGGTGTACCAGCC-3’，50μL反应体系进行PCR扩增：正反向引物各1.0μL，DNA模板2μL，2×Mastermix25μL，ddH2O加至50μL。PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性5min，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环，72℃延伸修复10min，4℃∞终止反应。PCR产物用Wizard PCR Purification System(Promega)纯化，操作方法按说明书上推荐的程序进行。PCR 产物由北京诺赛基因公司测序，序列为1427bp(见菌株ZX6 16S rRNA基因碱基序列所示)。将所测的16S rRNA基因序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已有的序列进行比较，从数据库中找到相关种已经发表的相似菌代表性序列，把所得序列通过多重比对后，采用CLUSTAL X 2.0软件和MEGA version5软件，利用邻位连接法构建菌株ZX6的***发育树(图3)，并且根据形态学特征和生理生化实验等发现其与肉桂色链霉(Streptomyces cinnamonensis)16S rRNA 基因有非常高的一致性(100％)，表明菌株ZX6即为肉桂色链霉菌。
实施例三菌株ZX6的复筛与初步应用
一、向日葵种子皮壳实验
将菌株ZX6接种于在121℃、0.1Mpa下灭菌后的种子培养基(可溶性淀粉2g, 干酪素酶解产物0.3g,葡萄糖0.5g,Bacto-yeast extract 0.2g，Bacto-malt extract 0.5g,碳酸钙0.3g,无菌水100ml,pH7.2)中，放置于全温震荡培养箱以 170rpm/min，29℃恒温培养3-5d。根据5％的接种量(即将10ml的种子培养基加入至190ml对应培养基中)，将种子培养基中的菌株ZX6接种至高氏一号液体培养基(即高氏一号固体培养基中不加入琼脂)中，再放入全温震荡培养箱中进行培养，保持转速170rpm/min，控制温度为29℃，培养3-5d。
菌株ZX6发酵菌液的处理：将放入恒温震荡培养箱中的菌株ZX6发酵菌液取出，加入50ml的离心管中，进行高速离心，转速12000r/min，时长20min，用一次性使用无菌注射器吸取上清液，利用亲水性聚醚砜膜进行过滤，得到不含菌株ZX6菌丝的滤液，最后再对菌株ZX6原菌液和滤液分别稀释20 倍，最终得到原菌液、稀释20倍的原菌液、滤液、稀释20倍的滤液。
向日葵种子初步处理：先将向日葵种子浸泡于无菌水中2min，除去无菌水，加入75％的乙醇溶液，浸泡1min，洗一次，除去乙醇溶液，再加入 2％次氯酸钠溶液，浸泡2min，共浸洗两次，最后，放入无菌水中进行清洗，清洗1min。
向日葵种子再处理：将上述处理完的种子分为五份，一份加入适量的无菌水，一份加入等量的原菌液，一份加入等量稀释20倍的原菌液，一份加入等量的上述过滤后的滤液，最后一份加入等量稀释20倍的滤液。将每份种子均上下颠倒浸泡30min。
配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，在121℃，0.1Mpa下灭菌20min倒板，待培养基冷却凝固后，将核盘菌接种在马铃薯葡萄糖培养基上，培养3-5d 等待菌丝长满后将上述处理好的向日葵种子接入培养基中，每皿10粒向日葵种子。
向日葵种子培养2d后，查看种子皮壳的发病情况，进行记录，同时利用镊子翻转皮壳，按照三个不同级别来观察培养基和向日葵皮壳接触部分真菌菌丝在皮壳上的情况。这三个级别如下：0级：抗菌型，向日葵皮壳上没有菌丝；1级：轻微感病型，向日葵皮壳上能够看到少量的菌丝；2 级：感病型，向日葵皮壳上明显地长满了菌丝，记录实验组与对照组结果。
表2菌株ZX6发酵液不同处理方式对向日葵种子皮壳侵染的影响
Figure BDA0001292359710000101
注：染病指数＝染病个数×染病级数；发病率＝染病个数÷总个数× 100％。
二、向日葵种子发芽实验
通过种子萌发情况研究菌株ZX6抑制核盘菌的能力。利用对照实验分析菌株ZX6的菌丝及其发酵产物对向日葵种子萌发的影响作用。ZX6菌液和向日葵种子的处理方式采取向日葵皮壳实验中的ZX6菌液和种子处理方式，接着将每份种子均上下颠倒浸泡各30min，最后分别把向日葵种子加入对应的已加入滤纸的培养皿中，再在各个种子表面加入适量的无菌水，使其能更好地发芽。
最后将这五份种子放入恒温培养箱中于28℃进行培养。每隔12h观察种子的萌发情况。记录ZX6菌液对种子萌发影响的结果(图4)。
三、菌株ZX6离体叶片防效复筛
将菌株ZX6接入100mL高氏一号液体培养基中，28℃、170r/min培养 24h。将菌体发酵液稀释20倍，作为处理液。挑选叶龄一致的向日葵真叶，用无菌水冲洗后于处理液中浸泡10min，晾干(表面无水珠)，随后接种生长旺盛的向日葵菌核病菌菌丝块(直径6mm)，每张叶片接种1个菌丝块 (每处理各20片，3次重复)，以直径6mm的马铃薯葡萄糖琼脂培养基块为空白对照，放置于水琼脂培养基上，在25℃恒温培养，24h后观察实验组(图5)和对照组(图6)病斑扩展情况。
四、向日葵盆栽实验
栽种五钵向日葵，每个营养钵中加入适量的向日葵种子，放置于阳光充足的地方，保证能让向日葵正常发芽及长出幼苗植株，每隔1d对向日葵进行浇水，至所培养的向日葵植株能够长出两对真叶时，才可以进行后续的实验。
将实验所得的核盘菌的发酵原菌液，加入喷壶中，对实验组、空白对照组和实验对照组的向日葵幼苗根部各喷洒100ml，要保证喷洒时，不能影响到其他植株。实验组：喷洒100ml核盘菌原菌液后再喷洒100ml菌株 ZX6的发酵原菌液作为实验组；空白对照组：喷洒100ml核盘菌原菌液后再喷洒100ml无菌水做为空白对照；实验对照组：喷洒100ml核盘菌原菌液后再喷洒100ml马铃薯葡萄糖琼脂液体培养基作为实验对照组，记录各组实验结果(图7为发酵原菌液实验组、图8为空白对照组，图9为实验对照组)。
从图7、图8和图9的结果对比中可以明显地看出使用菌株ZX6的发酵原菌液能够有效地抑制核盘菌对向日葵根部的侵染，起到杀菌的作用，促进向日葵的生长。

Claims (2)

1.一株防治向日葵菌核病的肉桂色链霉菌(Strepomycescinnamonensis)ZX6，保藏号为CGMCC 13116。
2.根据权利要求1所述的肉桂色链霉菌(Strepomycescinnamonensis)ZX6的应用，其特征在于：菌株ZX6用于向日葵菌核病的防治。
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