CN106591176B - 一种戊糖乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种戊糖乳杆菌，所述戊糖乳杆菌于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.12837。所述戊糖乳杆菌的耐酸范围为2.0‑4.5。本发明进一步提出了所述的戊糖乳杆菌的应用及其耐酸性研究。

Description

一种戊糖乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体是一种新发现的戊糖乳杆菌及其应用。
背景技术
反刍动物饲养业中，粗饲料资源的缺乏以及品质低下，是影响产业发展的重要因素。青贮调制作为一种简单易行的技术，具有提高适口性、消化率和降低成本等特点，秸秆青贮技术已被广泛地研究和应用，越来越多的添加剂被应用于青贮饲料中，其中，乳酸菌是应用最多的一种发酵促进剂。乳酸菌在青贮发酵中有着极其重要的作用，直接影响着青贮饲料的质量。
发明内容
本发明发现了一种新的戊糖乳杆菌及其用途。
具体地，本发明在玉米秸秆青贮饲料中提取分离得到一株产酸能力强且稳定的菌株，经鉴定为一种新的戊糖乳杆菌，其于2016年8月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO：12837。
本发明的戊糖乳杆菌16S rDNA序列SEQ NO 1所示。
MRS培养基，培养基配方为：葡萄糖30g，蛋白胨10g，酵母粉7.5g，无水乙酸钠5g，K2HPO42g，硫酸镁0.8g，硫酸锰0.2g，柠檬酸二铵2g，PH7.0-7.5，培养温度为37℃。
菌种的形态：
所述戊糖乳杆菌在培养基上培养36h，生成的的菌落图如图1所示，菌落边缘整齐，黄色透明，表面光滑；将单菌落取样在电子显微镜下(放大倍数为1800倍)进行观察，观察结果如图2所示，细胞形态为杆状，革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性，无芽孢和鞭毛。
本发明进一步发现了该戊糖乳杆菌对pH的耐受性。
本发明的植物乳杆菌16SrDNA序列如序列表所示。通过对该菌株的16SrDNA进行PCR扩增，回收扩增产物测序，序列与GenBank数据库中已经登录的序列进行同源性比较，该菌株的16SrDNA序列与戊糖乳杆菌同源性达99％。
本发明新发现的戊糖乳杆菌是从玉米秸秆青贮饲料中分离得到的，最适生长温度为32～37℃，菌种为直或弯的杆状或成链状，最适pH 6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。相比其他乳酸菌，此菌抗逆性强，产酸量高，在MRS液体培养基中，戊糖乳杆菌产酸能力最强，戊糖乳杆菌在发酵8h后pH值可以达到4.1，在12h发酵后pH值能降低到2.5，从而可以将植物表面的可溶性碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸，导致饲料pH值降低，来抑制腐败微生物菌群的生产繁殖，从而达到保持作物营业特性的目的，青贮饲料中腐败菌很多，主要分解青贮饲料中的蛋白质和氨基酸，尤其以芽孢杆菌和大肠杆菌为主，其中芽孢杆菌属于细菌，对青贮饲料的好气性变质起重要作用，但是加入此戊糖乳杆菌进行青贮发酵，戊糖乳杆菌产生大量的乳酸，并且在青贮过程中能快速使pH下降从而起到很有效的防腐、抑制致病菌生长繁殖的功效，大大改善玉米秸秆青贮饲料气味酸香、柔软多汁、颜色黄绿、适口性好等优点。
附图说明
图1为戊糖乳杆菌菌落图；
图2为戊糖乳杆菌镜检图。
具体实施方式
以下是通过具体实验详细说明了戊糖乳杆菌的筛选及其耐酸性的研究。
本发明在从玉米秸秆青贮饲料中分离乳得到的一种戊糖乳杆菌，经鉴定为一种新的戊糖乳杆菌，其于2016年8月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO：12837，分类命名为戊糖乳杆菌Lactobacilluspentosus。
筛选：将10g青贮饲料样品加入90mL 0.85％的无菌生理盐水，密封，以120rpm在摇床上振荡4h，用无菌生理盐水，从10-1至10-8进行连续稀释，取3个合适梯度涂板于GYP(含溴甲酚紫)培养基，置于无菌厌氧盒中在32℃恒温培养箱中培养2～3d。将培养基中具有黄色透明环的菌株分离，在MRS固体培养基上划线培养，
分离纯化：纯化试验重复3次，获得纯化菌株。革兰染色为阳性。
镜检：将单菌落取样在电子显微镜下(放大倍数为1800倍)进行观察，观察结果如图2所示，细胞形态为杆状，革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性，无芽孢和鞭毛。
过氧化氢酶促试验：将15％的过氧化氢滴在菌株上，观察，过氧化氢酶促阴性。
初步认定该菌株为乳酸菌。
本发明的植物乳杆菌16SrDNA序列如序列表所示。通过对该菌株的16SrDNA进行PCR扩增，回收扩增产物测序，序列与GenBank数据库中已经登录的序列进行同源性比较，该菌株的16SrDNA序列与戊糖乳杆菌同源性达99％。
本发明进一步发现了该戊糖物乳杆菌耐酸性强。
实施例1 pH为4.5时，戊糖乳杆菌生长情况
以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于添加MRS培养基中，37℃静置培养20h至对数中后期。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，以5％的接种量分别接种至pH为7的发酵培养基与pH为4.5发酵培养基中。发酵20h小时后，取样测定OD 600值，pH为7的发酵培养基样品OD值比pH为4.5的发酵培养基样品提高约6.8％。
实施例2 pH为4.0时戊糖乳杆菌生长情况
以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于添加MRS培养基中，37℃静置培养20h至对数中后期。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，以5％的接种量分别接种至pH为7的发酵培养基与pH为4.0发酵培养基中。发酵20h小时后，取样测定OD 600值，pH为7的发酵培养基样品OD值比pH为4.0的发酵培养基样品提高约5.8％。
实施例3 pH为3.5时戊糖乳杆菌生长情况
以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于添加MRS培养基中，37℃静置培养20h至对数中后期。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，以5％的接种量分别接种至pH为7的发酵培养基与pH为3.5发酵培养基中。发酵20h小时后，取样测定OD 600值，pH为7的发酵培养基样品OD值比pH为3.5的发酵培养基样品提高约6.1％。
实施例4 pH为3时戊糖乳杆菌生长情况
以2％接种量取-70℃甘油贮存液接种于添加MRS培养基中，37℃静置培养20h至对数中后期。取37℃静置培养20h(对数中后期)的发酵液，以5％的接种量分别接种至pH为7的发酵培养基与pH为3.0发酵培养基中。发酵20h小时后，取样测定OD 600值，pH为7的发酵培养基样品OD值比pH为3.0的发酵培养基样品提高约5.7％。
初步得到，该菌株对酸有很好的适应作用，耐酸能力显著。
本发明进一步将该菌株用于青贮饲料发酵。
1)发酵制备青贮饲料，分别在3个处理组中接入对数期生长的乳酸菌。第一组为对照组，常规青贮；第二组为对照组，添加嗜酸乳杆菌，含量为1×107CFU/g，添加量为1g/kg；第三组添加戊糖乳杆菌，含量为1×107CFU/g，添加量为1g/kg。玉米秸秆青贮发酵过程中微生物的动态及pH的变化，分别在装填后10、20、30天进行测试。青贮饲料的感官评定及pH值、乳酸菌变化分析在30天后进行。
表1感官评定
组别 色泽 气味 酸味 结构 等级
第一组 褐色 醋酸味 较浓 较黏，有结团 劣质
第二组 暗绿色 淡香味 较浓 松散，多汁 一般
第三组 暗绿色 醋酸味 较浓 松散，多汁 优良
2)pH值在青贮过程中的测定
间隔一定的天数，分别取3个实验的样品，以1∶5比例加入无菌水，4℃浸泡24h，以无菌纱布过滤，离心取上清液，一般pH值越低，青贮效果越好，用pH计测得该样品的pH值并记录下。
表2不同添加剂玉米青贮饲料的pH值
组别 青贮时间 pH值
第一组 30天 3.92
第二组 30天 3.21
第三组 30天 2.91
3)青贮发酵过程中微生物的变化
青贮发酵过程中微生物的测定需在超净化工作台内进行，将3个青贮样品分别按照四分法取样10g，装入90mL的无菌水中并充分搅拌振荡30min，将此溶液按照稀释平皿涂布法进行稀释涂布于MRS培养上，每个梯度做3个平行。
表3不同添加剂玉米青贮饲料中微生物情况CFU/g
组别 乳酸菌 细菌 酵母菌 霉菌
第一组 24.5万 80万 5.02万 42.5万
第二组 890万 75万 3850 1525
第三组 1150万 60万 1420 898
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏绿科生物技术有限公司
<120> 一种戊糖乳杆菌及其应用
<130> 20161107
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> Lactobacillus plantarum
<400> 1
gtggcgggtc tataatgcag tcgaacgaac tctggtattg attggtgctt gcatcatgat 60
ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gtggcgggtc tataatgcag 120
tcgaacgaac tctggtattg attggtgctt gcatcatgat ttacatttga gtgagtggcg 180
aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc cagaagcggg ggataacacc tggaaacaga 240
tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca tggtccgagc ttgaaagatg gcttcggcta 300
tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag ctagatggtg gggtaacggc tcaccatggc 360
aatgatacgt agccgacctg agagggcaat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa 420
actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa 480
cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat 540
ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta tttaaccaga aagccacggc taactacgtg 600
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg 660
agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc 720
ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat 780
gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct 840
gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac 900
gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca 960
ttccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 1020
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 1080
tactatgcaa atctaagaga ttagacgttc ccttcgggga catggataca ggtggtgcat 1140
ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1200
attatcagtt gccagcatta agttgggcac tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag 1260
gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1320
aatggatggt acaacgagtt gcgaactcgc gagagtaagc taatctctta aagccattct 1380
cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga 1440
tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag 1500
agtttgtaac acccaaagtc ggtggggtaa ccttttagga accagccgcc taaggtgaca 1560
gaaatg 1566

Claims (2)

1.一种戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)，其特征在于，所述戊糖乳杆菌于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.12837，所述戊糖乳杆菌的耐酸范围为2.0-4.5。
2.权利要求1所述的戊糖乳杆菌在青贮饲料发酵中的应用。
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