CN103387950B - 一株德沃斯氏菌及其降解呕吐毒素的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株德沃斯氏菌及其降解呕吐毒素的应用。本发明提供的菌株属于德沃斯氏属中的新种，该德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001，其保藏编号为CGMCC No.7185。本发明还提供了含有该保藏菌株的菌剂及其制备方法。此外，本发明还提供了所述菌株或菌剂在降解呕吐毒素中的应用。

Description

一株德沃斯氏菌及其降解呕吐毒素的应用

技术领域

本发明涉及一株德沃斯氏菌及其在降解呕吐毒素中的应用。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalnol，DON），化学名称为3α,7α,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮，它主要是由禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）感染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物产生的单端孢霉烯族毒素，因为该物质可以引起动物的呕吐症状，故又名呕吐毒素（vomitoxin）。在全世界范围内，DON是粮食、饲料、食品的主要污染霉菌毒素之一，严重影响人和牲畜的健康。人畜摄入了被呕吐毒素污染的食物后,会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血***造成死亡，其严重危害性已经引起了各国的普遍重视。

呕吐毒素对我国谷物类原料的污染相当普遍，其检出率和检出量都是霉菌毒素中最高的一种，据甄阳光等人调查显示，中国饲料和原料呕吐毒素的超标比例接近70%，玉米中呕吐毒素的超标率为57.1%，毒素平均含量为1.01mg/kg，其最高含量为2.13mg/kg。由于呕吐毒素在谷物、饲料中的普遍存在性、高含量特性和急慢性毒性，降低或者去除其毒性显得尤为重要与迫切。目前，国内外呕吐毒素脱毒方法主要有物理法、化学处理和生物方法三大类。虽然物理、化学方法脱毒已经取得一定程度的成功,但仍然存在脱毒效果有限、可能造成重要营养物质的丢失、成本较高等缺点。生物方法具有可以在温和的条件下使毒素的毒力降低，而且对原料的感官性状、适口性等影响极小等优点，而被认为是最佳脱毒方法。由于微生物种类多，来源广泛，几乎所有的有机污染物都可以被微生物分解，并且具有降解彻底，无二次污染的优点，所以呕吐毒素的微生物脱毒是一种行之有效的脱毒方法。随着物理、化学脱毒手段的弊端不断出现和对迅猛发展的生物技术优点的认识增加，国内外利用微生物进行毒素脱毒的研究正在逐步展开，虽然有关用微生物脱毒的研究成果还不多，但现有成果均表现了良好的开发和应用前景。2011年Yoko等人在土壤中筛选到一株诺卡氏属菌株，该菌株能在好氧条件下利用呕吐毒素为唯一碳源和能源生长，其降解毒素浓度范围为10–1000μg/mL（Nocardioides sp.strain WSN05-2,isolatedfrom a wheat field,degrades deoxynivalenol,producing the novel intermediate3-epideoxynivalenol,Ikunaga Y,Sato I,Grond S,et al.(2011)，Appl MicrobiolBiotechnol89:419–427）。

综上所述，为解决饲料、饲料原料中毒素污染问题，有必要从自然资源中分离筛选高效、安全降解呕吐毒素的微生物菌株，进一步研究其生物特性，毒素降解特性及降解机理，研发适用于饲料行业的霉菌毒素微生物脱毒剂，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产，提高畜牧业经济效益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株能降解呕吐毒素的德沃斯氏菌及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一株德沃斯氏菌（Devosia sp.），命名为DDB001，属于德沃斯氏属中的新种，是从南阳地区种植小麦的土壤中分离得到的，已于2013年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），其保藏编号为CGMCC No.7185。与其它生物的情况一样，本发明具有降解呕吐毒素的菌株DDB001仍然易发生变异。因此，可以利用本领域已知的物理和化学方法得到该菌株的突变株。例如，可以通过用化学药剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍处理得到其突变株，这些诱变突变株，只要保留了呕吐毒素降解能力这样一个特征，也属于本发明的一部分。

本发明还提供一种菌剂，它的活性成分为德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001，其保藏编号为CGMCC No.7185。该菌剂可以是液体型菌剂也可以是固体型菌剂，并通过现有技术中已公开的制备方法来制备。具体地，本发明提供一种上述菌剂的制备方法，该方法包括：

（1）将保藏编号为CGMCC No.7185的德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001在固体培养基上活化；

（2）将活化后的菌种接种于种子培养基中培养至对数生长期，制得种子液；

（3）将所述种子液接种于发酵培养基中培养至稳定期，制得液体型菌剂。

进一步地，该方法还包括将上述液体型菌剂与吸附剂混合，干燥后制得固体型菌剂。其中，所述液体型菌剂与吸附剂的重量比为1:2–10，所述吸附剂可以是玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、蛭石、轻质碳酸钙或泥炭中的一种或几种。

进一步地，在上述制备方法中，用来培养德沃斯氏菌培养物的培养基是多种多样的，但是从生产的经济、细胞生物量、脱毒活性角度看，优选某些培养基。例如，优选的碳源为葡萄糖，但也可以使用麦芽糖、甘油、果糖、半乳糖、甘露糖、α-乳糖等。优选的氮源为酵母膏、酪蛋白胨，但也可以使用玉米浆、酵母膏、牛肉膏等。可掺入培养基中的营养无机盐有能够产生下列离子的常规可溶性盐：锌离子、钠离子、镁离子、钙离子、铁离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。在本发明的一个实施方式中，所述的种子培养基由下列组分按照体积比组成：酵母膏0.8%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.2%，氯化钠0.4%，PH7.2–7.4；所述的发酵培养基由下列组分按照体积比组成：酵母膏0.8%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.2%，NaCl0.4%，K₂HPO₄·3H₂O0.3%，KH₂PO₄0.075g/L，PH7.2–7.4。

进一步地，在上述制备方法中，所述活化后的菌种按种子罐中种子培养基的1–10%接种量接种入种子罐；所述种子液按发酵罐中发酵培养基的1–10%接种量接种入发酵罐。

进一步地，步骤（3）发酵培养条件为：无菌空气的通气量为1:0.5–1.2，搅拌速度为80–240转/分，培养温度约28–37℃，液体型菌剂中活细胞数量至少达到10⁹CFU/ml以上。

本发明还提供了所述德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001或其菌剂在降解呕吐毒素中的应用。

具体地，在降解呕吐毒素时，采用如下（a）或（b）方式中的任一种：

（a）．将液体型菌剂喷施于待脱毒的谷物或者饲料及饲料原料，降解呕吐毒素，所述液体型菌剂的活细胞数量至少达到10⁷CFU/ml；

（b）．将固体型菌剂按照质量百分含量为0.01–5%的添加量加入到待脱毒的谷物或者饲料原料及饲料中，混合均匀，降解呕吐毒素。

上述应用中，所述谷物为玉米、小麦、大麦、稻谷或高梁。所述饲料原料及饲料为玉米、小麦、大麦、稻谷或高梁等饲料原料及它们加工而成的饲料。

本发明的优点在于：本发明提供的保藏号为CGMCC No.7185的德沃斯氏菌株对呕吐毒素有良好的降解效果。使用保藏号为CGMCC No.7185的菌株生产降解呕吐毒素的固体型或液体型微生物制剂，具有生产使用成本低、简单、易操作，呕吐毒素降解安全、高效等优点。本发明提供的菌株和菌剂可以用于谷物、饲料、饲料原料中呕吐毒素的去除，对于解决饲料及其原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。

附图说明

图1：DDB001的电镜照片（×15,000）；

图2：基于16S rRNA基因序列采用临近法构建的DDB001和相近菌株的***发育进化树；

图3：DDB001在呕吐毒素浓度为200μg/mL的TY中毒素降解效果；

图4：DDB001液体型菌剂和固体型菌剂对谷物中呕吐毒素的降解效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001获得与鉴定

从河南南阳小麦田地里采集土样，以96微孔板为培养载体，首先通过6次连续毒素浓度梯度的富集培养法，获得具有降解呕吐毒素的菌悬液，然后将菌悬液按稀释涂布法以合适的稀释度涂布在TY琼脂平板（酵母提取物4g/L，胰蛋白胨8g/L，琼脂粉15g/L，pH7.2，121℃灭菌30min）上，挑取分离程度良好且菌落形态、颜色不同的菌落，在DON浓度为200μg/mL的TY液体培养基（酵母提取物4g/L，胰蛋白胨8g/L，pH7.2，121℃灭菌30min）中进行脱毒试验，乙酸乙酯提取残留毒素并进行HPLC检测，验证各个纯培养物的毒素降解效果，最终成功获得能够降解呕吐毒素的菌株DDB001，挑取DDB001单菌落于TY液体培养基中，培养至对数期中期时，用50%的甘油与培养物等体积混合后置于-80℃保存。

采用16S rRNA序列分析、生理生化、化学组成特征等分类法对降解菌株进行分类鉴定，结果表明该菌株的分类地位归属于生丝微菌科（Hyphomicrobiaceae）中的德沃斯氏属（Devosia）中的新种成员，其16S rRNA序列的Genbank登录号为JX392051。2013年1月22日将Devsoia sp.DDB001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），其保藏编号为CGMCC No.7185。

培养特征和形态特征：该菌株于TY固体培养基上，在30℃温度下，经3天的培养其菌落形态：象牙色，圆形且边缘整齐，表面光滑且凸起，大小0.5–1.5μm；显微形态：棒状，大小0.7–1.3μm×0.5–0.8μm，单根极生鞭毛（如图1所示），无孢子形成，革兰氏阴性、严格好氧。

生理特征：接触酶和氧化酶都呈阳性，可以在有盐或者无盐的TY培养基中生长，在含有3%的氯化钠的TY培养基仍然可以生长，但5%的浓度下未见生长现象；pH耐受范围为5.0–9.0，已测生长温度范围15–40℃。能利用的碳源有L-***糖、D-纤维二糖、L-海藻糖、D-半乳糖、α-D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、葡萄糖酸、α-羟丁酸、D,L-乳酸、D-葡萄糖二酸、N-乙酰-D-葡萄糖胺、核糖醇、龙胆二糖、α-D-乳糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、琥珀酸单甲酯、葡糖醛酰胺、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-***糖醇、D-果糖、D-甘露醇、乳果糖；不能利用的碳源有糊精、乙酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、棉籽糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、顺式乌头酸、D-氨基葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸。

16S rRNA序列分析：利用引物F9(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和R1544(5'-AGAAAGGAGGTGATCCA-3')进行PCR扩增，长度为1479bp的16SrRNA序列与Genbank数据库中已有序列进行Blast比对，该序列与Devosia属16S rRNA相似度较高，相似性范围在94.6–96.0%之间。在德沃斯氏属公认的所有的16个种中，相似性最高是Devosia insulae DS-56^T。***发育树显示(图2),DDB001被聚类在Devosia这个组内，DDB001与Devosia insulae DS-56^T(EF012357)被分在一个分支中,但它们的16S rRNA序列相似性仅达到96%（<97%）,不能归属为同一个种。

化学组成：DDB001的主要脂肪酸包括11-甲基ω7c十八碳单不饱和脂肪酸(28.16%)、饱和十六碳脂肪酸(21.72%)、ω8c型环式十九饱和脂肪酸(16.69%)和饱和十八碳脂肪酸(14.95%)（见表1）；呼吸醌主要类型是辅酶Q10；极性脂主要类型是磷脂酰甘油（PG）和双磷脂酰甘油（DPG）；G+C mol%为64.6%。

表1

根据以上所有结果表明，DDB001与以前公认的16个种的典型菌株不同，足以使其成为德沃斯氏属中的一个新种，这一分类是基于直接的实验室比较和对已发表的类似物种的描述所作的检索。

实施例2德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001在TY培养基中的脱毒效果

将活化后的DDB001以1%的接种量接种至含有200μg/mL呕吐毒素的50mL的TY液体培养基中，在200转/分的振荡条件下进行两天的脱毒培养，乙酸乙酯抽提残余呕吐毒素，最终培养物中呕吐毒素的剩余含量经HPLC检测结果表明：TY中的呕吐毒素完全降解，降解率达100%，并产生保留时间约为9min的毒素代谢物（如图3所示）。

实施例3德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001液体型菌剂的制备

固体培养基组分及配比：酵母膏0.8%，蛋白胨0.4%，NaCl0.5%，琼脂粉1.5%，pH7.2–7.4，121℃下高温蒸汽灭菌30min。

种子培养基组分及配比：酵母膏0.8%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.2%，氯化钠0.5%，pH7.2–7.4；发酵培养基组分及配比：酵母膏0.8%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，K₂HPO₄·3H₂O0.3%，KH₂PO₄0.075g/L，pH7.2–7.4。

（1）菌种活化：将保藏号为CGMCC No.7185的德沃斯氏菌DDB001接种于固体培养基上，于30℃条件下培养3天，并测定其毒素降解性能，再接种于试管斜面上备用。

（2）种子培养：从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中，于30℃条件下培养至对数期，制得菌种；然后，用500升的种子罐，种子培养基投料量350升，投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的菌种以10%（体积百分比）的接种量接种入种子罐，搅拌速度为200转/分，培养温度30℃，无菌空气通入量为1:0.8（体积比），约48–60小时培养至对数生长期，获得种子液。

（3）发酵培养：采用容积为5000升的生产罐，发酵培养基投料量3500升，在1.1kg/cm²的压力、121℃的温度下，进行高压湿热灭菌，灭菌后冷却30℃，将种子液按10%的接种量接种入发酵罐，发酵条件：无菌空气的通气量为1:0.8–1.2，搅拌速度为240转/分，培养温度30℃，培养时间约48–60小时，放罐后形成具有呕吐毒素降解的液体型菌剂。该液体型菌剂中活细胞数量至少达到10⁹CFU/ml以上。

实施例4德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001固体型菌剂的制备

将实施例3生产出来的DDB001液体型菌剂与玉米芯粉按照1:4的重量比混合均匀后，40℃以下低温干燥至水分为8%以下，形成固体状，从而制成DDB001的固体型菌剂。

实施例5德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001液体型菌剂对谷物中呕吐毒素的降解效果

将实施例3制备的DDB001液体型菌剂先进行稀释，稀释后的液体型菌株活细胞数量至少达到10⁷个/ml，按重量比1:1的比例喷洒到污染DON的玉米粉中作为试验组，无菌发酵培养基以同样的比例喷洒到污染毒素的玉米粉中作为对照组，每组三个重复，混合均匀后于30℃的温度下脱毒3天后，分别从对照组和试验组准确称量5g样品于离心管中，加入20ml85%的乙腈至脱毒样品中，振荡使毒素充分抽提，4000转/分，离心15分钟，上清转移至新离心管中；再次加入12ml的85%乙腈溶液，振荡混匀再次抽提，同样条件离心，合并上清自然蒸发至乙腈完全挥发，加入12ml的饱和氯化钠并混合均匀，而后用12ml的乙酸乙酯抽提两次，合并两次乙酸乙酯相自然挥干后，1ml甲醇定容溶解，用高效液相色谱检测呕吐毒素的含量，结果表明DDB001液体型菌剂对呕吐毒素污染玉米粉经过3天的脱毒，其降解率可达92.4%，而对照组无任何降解现象（结果见图4）。

实施例6德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001固体型菌剂对谷物中呕吐毒素的降解效果

将实施例4制备的固体型菌剂按照4%的重量比添加到污染呕吐毒素的试验组玉米粉中，发酵培养基和玉米芯粉（以1:4比例混合）混合物同样以4%的重量比加入到污染呕吐毒素的对照组玉米粉中，将对照组和试验组均按1:1的比例加入蒸馏水，每组三个重复，混合均匀后于30℃的温度下脱毒3天，分别从对照组和试验组准确称量5g样品放入50ml离心管中，加入20ml85%的乙腈至样品中，振荡使毒素充分抽提，4000转/分，离心15分钟，上清转移至新离心管中；固形物再次加入12ml的85%乙腈溶液，振荡混匀再次抽提，同样条件下离心，合并上清自然蒸发至乙腈完全挥发，加入12ml的饱和氯化钠并混合均匀，而后用12ml的乙酸乙酯抽提两次，合并两次乙酸乙酯相自然挥干后，1ml甲醇定容溶解，用高效液相色谱检测呕吐毒素的含量，结果表明DDB001固体型菌剂对污染玉米粉经过3天的脱毒，其降解率可达84.9%，对照组无任何降解现象（结果见图4）。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001在降解呕吐毒素中的应用，其特征在于，所述德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001的保藏编号为 CGMCC No. 7185，16S rRNA在GenBank上的登录号为JX392051。

2.活性成分为德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001的菌剂在降解呕吐毒素中的应用，其特征在于，所述德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001的保藏编号为 CGMCC No. 7185，16S rRNA在GenBank上的登录号为JX392051。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述活性成分为德沃斯氏菌（Devosia sp.）DDB001的菌剂为液体型菌剂或固体型菌剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，液体型菌剂的制备方法包括：

（1）将保藏编号为CGMCC No. 7185的德沃斯氏菌（Devosiasp.）DDB001在固体培养基上活化； 

（2）将活化后的菌种接种于种子培养基中培养至对数生长期，制得种子液；

（3）将所述种子液接种于发酵培养基中培养至稳定期，制得液体型菌剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，还包括将液体型菌剂与吸附剂混合，干燥后制得固体型菌剂。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（3）发酵培养条件为：无菌空气的通气量为1 : 0.5-1.2，搅拌速度为80-240 转/分，培养温度28-37℃，液体型菌剂中活细胞数量至少达到10⁹CFU/ml。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述液体型菌剂与吸附剂按1：2-10的重量比进行混合，其中，所述吸附剂为玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、蛭石、轻质碳酸钙、泥炭中的一种或几种。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在降解呕吐毒素时，采用如下（a）或（b）方式中的任一种：

（a）．将液体型菌剂喷施于待脱毒的谷物或者饲料及饲料原料，降解呕吐毒素，所述液体型菌剂的活细胞数量至少达到10⁷CFU/ml；

（b）．将固体型菌剂按照质量百分含量为0.01-5%的添加量加入到待脱毒的谷物或者饲料原料及饲料中，混合均匀，降解呕吐毒素。