CN110468050B

CN110468050B - 一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法

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Publication number: CN110468050B
Application number: CN201910644259.2A
Authority: CN
Inventors: 王光强; 艾连中; 夏永军; 熊智强; 张汇
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2022-10-18
Anticipated expiration: 2039-07-17
Also published as: CN110468050A

Abstract

本发明提供了一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，包括：菌种活化，得单菌落；将单菌落接种培养，得种子液；将种子液转接至MRS液体培养基中扩大培养，得扩大培养液；将扩大培养液离心，得菌体沉淀；菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤后重悬于多糖保护剂溶液中，转移至容器中，冷冻干燥，其中，菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，多糖保护剂溶液为大豆多糖溶液或者***胶溶液。本发明所提供的一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，将植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1在冷冻干燥后复水的存活率显著提高，能够用大分子化合物替代小分子保护剂，这拓宽了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1的保护剂的范围和种类。

Description

一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法

技术领域

本发明属于冷冻干燥领域，具体涉及一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法。

背景技术

植物乳杆菌属于益生菌，能有效定植于人体肠道中，不仅能抑制有害菌的增殖，保护肠道等作用，还能有效降低胆固醇、提高免疫力等功能。因此目前植物乳杆菌不仅广泛应用于发酵产品中，在功能性食品及临床应用方面也具有巨大潜力。但植物乳杆菌的储存是面临的难点。为了稳定益生菌类的不稳定的产品，必须降低储存样品中的水含量使其达到休眠状态。

冷冻是一种可以将水分冻结的单元操作，从而降低样品中的水含量使其达到休眠状态。然而，在冷冻状态下维持和运输样品是昂贵的，且可能导致产品的价值损失。或者，样品可通过高加工温度在空气中干燥，但是传统干燥方式会引起样品物理和化学性质的变化。而冷冻干燥正好结合了冷冻和干燥的优点，提供干燥、活性高、耐贮存和易溶解的产品。现在冷冻干燥被广泛用于保存乳酸菌，成为保藏生物材料最有效的方法之一。

冷冻干燥虽有许多优点，但由于细胞暴露于极端环境的胁迫，会造成一定的生理损伤，从而降低细胞活力和功能活性。冷冻干燥过程中的主要损害可归因于细胞膜完整性的变化，流动性，以及敏感蛋白质的结构等等。细胞体积小、比表面积大的特性，决定了细胞膜水渗透率高的特点。在冷冻干燥过程中，当温度降低以及真空度增大时，细胞内水分冻结及蒸发，胞内溶质、电解质等也逐渐被浓缩，导致细胞过度失水，严重皱缩变形，甚至死亡；另外，在当电解质被高度浓缩时，细胞内的一些对电解质敏感的蛋白的高级结构会发生改变，特别是与代谢相关的关键酶，会丧失其生理功能，使生理代谢调控失常，进而导致细胞冷冻干燥存活率的下降。

为提高细胞对冷冻干燥的抗性，通常会通过使用保护剂以减轻冷冻干燥带来的损伤。保护剂的种类有很多，但目前主要以小分子糖类或者醇类为主。例如，Dimitrellou等人用海藻糖保护干酪乳杆菌，Carvalho等人用蔗糖、山梨醇等保护德氏乳杆菌等。其中糖类大部分是还原性糖类，这可能会诱发破坏性的美拉德反应，影响样品的稳定性等。因此，蔗糖和海藻糖等非还原性糖，被广泛用作冷冻干燥保护剂。非还原性糖的保护效果主要归因于它们具有较高的玻璃化转变温度，尤其是海藻糖，可以显著减少低温下细胞内外冰晶的形成，稳定磷脂双分子层和膜蛋白结构。相比于小分子糖类保护剂，多糖保护剂的稳定性更好，而且不会与细胞发生交互作用，多糖本身还可以当作天然的膳食纤维，还可以有多种功能。

在冷冻干燥过程中，不同的保护剂对不同种类的菌种的保护作用差别很大，如何针对特定的菌种去研究特定的高效保护剂对于菌种的保藏至关重要。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法。

本发明提供了一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，具有这样的特征，包括如下步骤：步骤1，菌种活化，得单菌落；步骤2，将单菌落接种培养，得种子液；步骤3，将种子液转接至MRS液体培养基中扩大培养，得扩大培养液；步骤4，将扩大培养液离心，得菌体沉淀；步骤5，菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤后重悬于多糖保护剂溶液中，转移至容器中，冷冻干燥，其中，步骤1中菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，步骤5中多糖保护剂溶液为大豆多糖溶液或者***胶溶液。

在本发明提供的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，大豆多糖溶液的浓度为1％～10％。

在本发明提供的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，***胶溶液的浓度为1％～3％。

在本发明提供的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，菌种活化的方法为将植物乳杆菌通过固体MRS培养基中反复划线活化2～5次。

在本发明提供的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，单菌落接种培养的方法为挑取已经活化好的单菌落接种培养12h～16h。

在本发明提供的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤3中扩大培养的条件为在35℃～40℃下培养12h～16h。

在本发明提供的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法中，还可以具有这样的特征：其中，冷冻干燥的参数为：预冷温度-45℃～-35℃，预冷时间2h～4h，以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至-30℃～-25℃以进行一次干燥，时间持续700min～900min，然后以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至20℃～25℃进行二次干燥，时间持续2h～3h，冷阱温度-85℃～-70℃左右，真空度10Pa～30Pa。

本发明还提供了一种多糖保护剂在提高植物乳杆菌冷冻干燥存活率中的应用，其特征在于，多糖保护剂为大豆多糖或***胶，植物乳杆菌为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，采用大豆多糖或者***胶作为保护剂保护植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1，有效减少了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1在冷冻干燥过程中的细胞膜损伤。因此，本发明中的植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1在冷冻干燥后复水的存活率显著提高，能够用大分子化合物替代小分子保护剂，这拓宽了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1的保护剂的范围和种类。

此外，大豆多糖及***胶属于多糖，来源广泛，价格便宜。

附图说明

图1是本发明的实施例中利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法的流程图；

图2是本发明的实施例1～3及对比例1～6中的植物乳杆菌AR113的存活率示意图；以及

图3是本发明的实施例4～6及对比例7～12中的植物乳杆菌WCFS1的存活率示意图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法作具体阐述。

实施例及对照例中所有化学试剂均为化学纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

图1是本发明的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法的流程图。

如图1所示，一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法包括如下步骤：

步骤1，菌种活化，得单菌落。其中，菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，菌种活化的方法为将植物乳杆菌通过固体MRS培养基中反复划线活化2～5次。

具体操作为：将菌种通过固体MRS培养基中反复划线活化3次，得单菌落。其中，菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1。

步骤2，将单菌落接种培养，得种子液。

具体操作为：挑取已经活化好的单菌落接种培养12h～16h，得种子液。

步骤3，将种子液转接至MRS液体培养基中扩大培养，得扩大培养液。扩大培养的条件为在35℃～40℃下培养12h～16h。

具体操作为：将种子液转接至MRS液体培养基中扩大培养，在37℃下扩大培养12h～16h，得扩大培养液。

步骤4，将扩大培养液离心，得菌体沉淀。

具体操作为：使用酶标仪调节扩大培养液菌浓，使其OD₆₀₀＝1，在离心力为4000rpm的条件下用离心管收集菌体沉淀，得菌体沉淀。

步骤5，菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤后重悬于多糖保护剂溶液中，转移至容器中，冷冻干燥。其中，多糖保护剂溶液为浓度为1％～10％大豆多糖溶液或者浓度为1％～3％***胶溶液。

冷冻干燥的参数为：预冷温度-45℃～-35℃，预冷时间2h～4h，以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至-30℃～-25℃以进行一次干燥，时间持续700min～900min，然后以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至20℃～25℃进行二次干燥，时间持续2h～3h，冷阱温度-85℃～-70℃左右，真空度10Pa～30Pa。

具体操作为：菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤2次后分别重悬于不同的保护剂溶液中，菌悬液浓度10⁹cfu/mL，再转移到西林瓶中用于冷冻干燥。冷冻干燥程序设置为：预冷温度-40℃，预冷时间3h，以1℃/min的速率升温至-30℃以进行一次干燥，时间持续800min，然后以1℃/min的速率升温至25℃进行二次干燥，时间持续2h，冷阱温度-80℃左右，真空度20Pa。

在下述实施例及对照例中使用到的菌种来源如下：

植物乳杆菌AR113：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心入册编号CGMCC No.13909。

植物乳杆菌WCFS1：购自ATCC(American type culture collection)。

在下述实施例及对照例中使用到的MRS培养基成分如下：

MRS培养基：蛋白胨10.0g、磷酸氢二钾2.0g、牛肉浸出粉10.0g、酵母膏5.0g、硫酸锰0.25g、无水乙酸钠5.0g、葡萄糖20.0g、柠檬酸二胺2.0g、硫酸镁0.58g、吐温801mL、去离子水1000mL。其中，固体培养基需在此基础上加2％的琼脂，液体培养基则不加。

培养基在使用前均在115℃下灭菌20min。

在下述实施例或对照例中使用到的溶液配方如下：

10％山梨醇保护剂溶液：山梨醇10.0g，去离子水100mL；

10％甘露醇保护剂溶液：甘露醇10.0g，去离子水100mL；

10％甘露糖保护剂溶液：甘露糖10.0g，去离子水100mL；

10％海藻糖保护剂溶液：海藻糖10.0g，去离子水100mL；

10％蔗糖保护剂溶液：蔗糖10.0g，去离子水100mL；

1％***胶保护剂溶液：***胶1.0g，去离子水100mL；

1％大豆多糖保护剂溶液：大豆多糖1.0g，去离子水100mL；

10％大豆多糖保护剂溶液：大豆多糖10.0g，去离子水100mL；

PBS缓冲溶液：磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，用水定容至1000mL。

上述保护剂中，山梨醇、甘露醇及甘露糖属于小分子保护剂；海藻糖及蔗糖属于非还原性二糖保护剂；***胶与大豆多糖属于多糖保护剂。

PBS缓冲溶液作为空白对照的参考溶液。

<实施例1>

本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为1％***胶溶液。

<实施例2>

本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为1％大豆多糖溶液。

<实施例3>

本实施例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为10％大豆多糖溶液。

<实施例4>

本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为1％***胶溶液。

<实施例5>

本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为1％大豆多糖溶液。

<实施例6>

本实施例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为10％大豆多糖溶液。

以下为本发明中的对照例，除菌种和保护剂的种类不同外，其余与实施例中完全相同。

<对照例1>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为PBS溶液。

<对照例2>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为10％山梨醇溶液溶液。

<对照例3>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为10％甘露醇溶液溶液。

<对照例4>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为10％甘露糖溶液溶液。

<对照例5>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为10％海藻糖溶液溶液。

<对照例6>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌AR113，保护剂溶液为10％蔗糖溶液溶液。

<对照例7>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为PBS溶液。

<对照例8>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为10％山梨醇溶液溶液。

<对照例9>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为10％甘露醇溶液溶液。

<对照例10>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为10％甘露糖溶液溶液。

<对照例11>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为10％海藻糖溶液溶液。

<对照例12>

本对照例选用菌种为植物乳杆菌WCFS1，保护剂溶液为10％蔗糖溶液溶液。

<测试例>

冷冻48h后，将实施例1～6以及对照例1～12冷冻干燥后的菌粉加PBS复水；再将菌液稀释至适宜梯度后涂布，于37℃培养36h后计数。试验重复3次，每次3个平行。根据N₂/N₀×100％计算冷冻干燥存活率，N₀是冷冻前细胞数，N₂为冷冻干燥后细胞数。测试结果见图2、图3及表1。

图2是本发明的实施例1～3及对比例1～6中的植物乳杆菌AR113的存活率示意图。

表1 冷冻干燥后复水细胞存活率

数据以平均值±标准偏差(n＝3)的形式进行表示。不同字母表示差异显著(p<0.05，Duncan)。

如图2、图3及表1所示，对于植物乳杆菌AR113而言，蔗糖和10％大豆多糖保护剂效果最好，两种保护剂溶液显著提高了AR113的冷冻干燥存活率，与PBS相比，提高了50％左右。其次是1％***胶、1％大豆多糖、海藻糖、甘露糖和山梨醇等保护剂，与PBS相比，将AR113冷冻干燥存活率提高了10％～50％左右。甘露醇效果最差，与PBS相比，没有显著性差异。这表明，大分子和小分子的糖类保护剂，对提高植物乳杆菌AR113的冷冻干燥存活率均有显著的效果，而醇类的保护效果显著低于糖类。10％大豆多糖的保护效果和蔗糖的效果相当，因此可以用大分子化合物替代小分子保护剂。

对植物乳杆菌WCFS1而言，蔗糖和1％***胶两种保护剂对植物乳杆菌WCFS1的保护效果最显著，能将冷冻干燥存活率提高到70％以上。其次是海藻糖、10％大豆多糖、甘露糖和1％大豆多糖等保护剂，与PBS相比，将WCFS1冷冻干燥存活率提高到40～60％左右。然后是山梨醇，与PBS相比，两者之间没有显著性差异。甘露醇效果最差，冷冻干燥存活率显著低于PBS。这表明，大分子和小分子的糖类保护剂，对提高植物乳杆菌WCFS1的冷冻干燥存活率均有显著的效果，而醇类的保护效果显著低于糖类。1％***胶的保护效果和蔗糖的效果相当，因此可以用大分子化合物替代小分子保护剂。

实施例的作用与效果

根据本发明的实施例所涉及的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，采用大豆多糖或者***胶作为保护剂保护植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1，有效减少了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1在冷冻干燥过程中的细胞膜损伤。因此，本发明的实施例中的植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1在冷冻干燥后复水的存活率显著提高，能够用大分子化合物替代小分子保护剂，这拓宽了植物乳杆菌AR113及植物乳杆菌WCFS1的保护剂的范围和种类。

此外，大豆多糖及***胶属于多糖，来源广泛，价格便宜。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，菌种活化，得单菌落；

步骤2，将所述单菌落接种培养，得种子液；

步骤3，将所述种子液转接至MRS液体培养基中扩大培养，得扩大培养液；

步骤4，将所述扩大培养液离心，得菌体沉淀；

步骤5，所述菌体沉淀经PBS缓冲液洗涤后重悬于多糖保护剂溶液中，转移至容器中，冷冻干燥，

其中，所述步骤1中菌种为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，

所述步骤5中所述多糖保护剂溶液为大豆多糖溶液或者***胶溶液，

所述大豆多糖溶液的浓度为1％～10％，

所述***胶溶液的浓度为1％～3％。

2.根据权利要求1所述的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：

其中，所述菌种活化的方法为将植物乳杆菌通过固体MRS培养基中反复划线活化2～5次。

3.根据权利要求1所述的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：

其中，所述单菌落接种培养的方法为挑取已经活化好的单菌落接种培养12h～16h。

4.根据权利要求1所述的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：

其中，所述步骤3中扩大培养的条件为在35℃～40℃下培养12h～16h。

5.根据权利要求1所述的利用多糖提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法，其特征在于：

其中，所述冷冻干燥的参数为：预冷温度-45℃～-35℃，预冷时间2h～4h，以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至-30℃～-25℃进行一次干燥，时间持续700min～900min，然后以0.8℃/min～1.5℃/min的速率升温至20℃～25℃进行二次干燥，时间持续2h～3h，冷阱温度-85℃～-70℃，真空度10Pa～30Pa。

6.一种多糖保护剂作为唯一有效成分在提高植物乳杆菌冷冻干燥存活率中的应用，其特征在于，所述多糖保护剂为大豆多糖或***胶，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌AR113或植物乳杆菌WCFS1，大豆多糖溶液的浓度为1％～10％，***胶溶液的浓度为1％～3％。