CN110452830B - 发酵乳杆菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵乳杆菌菌株LTP1332及其应用。该菌株保藏编号是CCTCCM 2019029，可以以活体形式存在，也可以以非活体形式存在，活体形式存在优选以冻干粉形式存在，可以应用在食品、保健品、药品、食品补充剂、药品方面的应用，优选用于消炎抗菌和益生菌。LTP1332对胃肠道环境的耐受能力强，具有较强的胃肠道耐受能力，能够顺利通过机体胃肠道，发挥益生功能，具有较好的修复结肠黏膜损伤能力，作为益生菌能够在DSS诱导的小鼠体内发挥抗炎作用，下调促炎症细胞因子的水平，且效果优于模式菌株CCIC22537。

Description

发酵乳杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域；具体涉及发酵乳杆菌菌株及其应用。
背景技术
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)属于乳杆菌科中的乳杆菌属，是人和动物肠道、 口腔和***的正常菌群，具有维持肠道内微生物群稳定、改善宿主机体内环境的能力，是促 进人体健康最主要的乳酸杆菌种类之一。
发酵乳杆菌发挥抑菌作用的途径主要有：发酵产生的有机酸降低机体微环境pH值，抑 制不耐酸的致病菌和腐败菌；与致病菌竞争胃肠道结合位点和营养物质，防止致病菌的粘附定 植。另外，发酵乳杆菌还具有抗氧化活性、免疫活性、降胆固醇、降血压、调节肠道菌群结 构等多种益生功能。研究表明，益生菌定植肠道后能修复粘膜损伤，刺激隐窝细胞增殖，调 节炎症因子的表达水平。发酵乳杆菌作为形成健康肠道菌群的重要益生菌之一，也被作为治 疗炎症性肠病的候选菌。此外，发酵乳杆菌还被用于治疗过敏性皮肤炎、抗生素相关性腹泻 等多种疾病。发酵乳杆菌在食品领域，多用于豆乳和香肠等发酵食品中。用发酵乳杆菌发酵 豆乳时，不仅能够赋予产品以独特的风味、保留大豆本身的营养成分，还能使产品具有降胆 固醇、调整肠道菌群等益生功能。另外，发酵乳杆菌所具有的抑菌性能够抑制食品中腐败菌 的生长，延长产品的货架期。
虽然发酵乳杆菌及其产品的应用已经涉及到医疗保健、食品工业、畜牧生产等多个领 域，但是真正高质量、符合市场需求的发酵乳杆菌产品相对较少。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一株发酵乳杆菌菌株。
本发明的第二个目的是提供以上发酵乳杆菌菌株的应用。
本发明的第三个目的是提供一种发酵乳杆菌培养基。
所述发酵乳杆菌菌株的保藏编号是CCTCC M 2019029，其核苷酸包含SEQ ID NO：1至 SEQ ID NO：16所示的特征序列。
该发酵乳杆菌菌株可以以活体形式存在，也可以以非活体形式存在。活体形式存在优选 以冻干粉形式存在。
所述发酵乳杆菌菌株在食品、保健品、药品、食品补充剂、药品方面的应用，所述应用 优选用于消炎抗菌和益生菌。
本发明发酵乳杆菌菌株LTP1332对胃肠道环境的耐受能力强，在4h模拟胃液中的存活率 为72.03％，之后在12h模拟肠液中的存活率为47.63％，远远超过了发挥益生功能的活菌数要 求，说明LTP1332具有较强的胃肠道耐受能力，能够顺利通过机体胃肠道，发挥益生功能。 LTP1332具有较好的修复结肠黏膜损伤能力，作为益生菌能够在DSS诱导的小鼠体内发挥抗 炎作用，下调促炎症细胞因子的水平，且效果优于模式菌株CCIC22537。
附图说明
图1 LTP1332的细胞形态
图2 LTP1332特异性引物PCR验证结果
图3 LTP1332核苷酸PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
图4 LTP1332全基因组图谱
图5 LTP1332菌株生长曲线
图6 LTP1332制剂在模拟胃液中耐受性
图7 LTP1332制剂在模拟肠液中耐受性
图8各组小鼠每日体重变化，*与模型组相比，具有显著差异(P＜0.05)，**与模型组相 比，具有极显著差异(P＜0.01)；#与健康对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)，##与健康 对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
图9结肠病理组织切片，A：DSS+CCIC22537组，B：DSS+LTP1332组，C：DSS组； D：DSS+SASP组；E：健康对照组；ME：外肌层，SM：粘膜下层，MM：正常粘膜，Cr： 隐窝，GC：杯状细胞，○：炎症因子浸润。
图10组织学损伤程度评分
图11结肠细胞中促炎症因子TNF-α的含量(n＝10)
图12结肠细胞中促炎症因子IFN-γ的含量(n＝10)
LTP1332，分类命名为发酵乳杆菌LTP1332(Lactobacillus fermentiumLTP1332)，已于 2019年1月8日在位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO：M 2019029。
具体实施方式
本发明具体实施方式中的试验结果数据皆以平均值±标准差(Means±SD)表示。统计分析 使用单因子变异数分析[One-way analysis of variance(One-way ANOVA)]。“+”表示90％菌株 阳性；“-”表示90％菌株阴性；“d”表示11％～89％菌株阳性。*与模型组相比，具有显著 差异(P＜0.05)，**与模型组相比，具有极显著差异(P＜0.01)；#与健康对照组相比，具有 显著差异(P＜0.05)，##与健康对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)。
本发明具体实施方式中，“NCBI”表示美国国家生物技术信息中心。“BLAST”是“Basic Local Alignment Search Tool”的缩写，一种生物信息分析软件名称。所有核苷酸的测序单位是 生工生物工程(上海)股份有限公司，使用的测序仪器是Illumina公司的Hiseq-2500 150PE测 序平台。
本发明实施例中所采用的实验方法，如果没有给出特殊说明，均为本领域常规方法；所 用的实验材料，如果没有给出特殊说明，说明可从商业途径获得。
实施例1菌种筛选与鉴定
1.菌种筛选与鉴定
收集广西巴马县2个月以内未服用任何抗生素或乳酸杆菌制剂，且居住地位置分散、年龄 在100岁～128岁之间的健康老人粪便样品，冷冻保藏。粪便样品解冻后用无菌磷酸盐缓冲溶 液溶解并稀释成梯度浓度，以2％接种量接种到改良的MRS固体培养基上，37℃培养。所述 “改良的MRS固体培养基”是指MRS固体培养基中含碳酸钙(CaCO3)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)，CaCO3的质量百分比浓度是0.8％，X-gal的浓度是每200mL培养基 含2％X-gal 200μl。
挑取有溶钙圈或浅蓝色的单菌落划线多代纯化。纯化得到的菌株编号为LTP1332。革兰 氏染色后观察到细胞为革兰氏阳性菌，棒状，直径0.5-0.9μm，大多数单个生长，也有成对出 现。见图1。
对LTP1332进行过氧化氢酶实验、明胶液化实验、硝酸盐还原试验、石蕊牛奶实验、葡 萄糖产酸产气实验、碳水化合物发酵产酸试验(结果见表1和表2)并检测LTP1332接种于pH 4.5、pH 7.0和pH 9.0的改良MRS液体培养基，和在15℃、45℃下的改良MRS液体培养 基培养的生长情况。参照《伯杰士细菌学手册》及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中乳杆 菌属部分，对LTP1332初步鉴定，结果为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。
表1 LTP1332菌株的生理生化实验鉴定结果
Figure BSA0000181256500000031
表2 LTP1332菌株的糖发酵实验结果
Figure BSA0000181256500000032
特异性引物PCR验证LTP1332
进一步对LTP1332进行特异性引物聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)验 证。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图2。发酵乳杆菌专用引物特异性PCR后片段长度分 别为337bp，图2中相应处出现荧光条带，且无明显拖尾现象，说明PCR扩增成功，并从特 定引物角度确认了上述生理生化和糖发酵实验鉴定结果。
设计的特异性引物如下：
F：5’-AAT ACC GCA TTA CAA CTT TG-3’
R：5’-GGT TAA ATA CCG TCA ACG TA-3’
2. 16S rDNA序列鉴定
利用通用引物对LTP1332的16S rDNA PCR扩增，相应基因序列扩增产物电泳结果见图 3。图3显示在约1500bp处出现荧光条带，且无明显拖尾现象，说明PCR扩增成功，能满足后 续16S rDNA测序需要。
通用引物如下：
27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
1492R：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′
将LTP 1332的16S rDNA序列与GenBank数据库中已知乳酸杆菌标准菌株的16SrDNA序 列进行同源性比对(结果见表3)。表3表明LTP1332与干酪乳杆菌IFO 3956的同源百分比高 于99％。
表3 LTP1332与GenBank数据库中标准菌株的基因序列同源性比对结果
Figure BSA0000181256500000041
实施例2 LTP1332的特征序列
LTP1332基因组由1条染色体和2个质粒组成，其中染色体基因组为环状，鸟嘌呤(G) 和胸嘧啶(C)之和的平均含量为51.3％，长度为2,149,768bp，含2,218个独立编码区(CDSs)，平均长度为835bp，编码区总长度占全基因组的比例为86.18％。LTP1332全基因 图见图4。
将LTP1332核苷酸序列与NCBI数据库比对，LTP1332基因组DNA中有16段核苷酸序列，体现了LTP1332基因组的专有特征，这16段特征序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：16 所示。
实施例3 LTP1332生长曲线和传代周期
以1％接种量将LTP1332种子液接种于MRS液体培养基，每隔3h测定发酵液中活菌数 及还原糖含量，以发酵时间(h)为横坐标，以活菌数对数值(Log CFU/mL)和还原糖含量(g/L)为纵坐标，绘制如图5所示的发酵乳杆菌LTP1332生长曲线。由图5得出，培养6 h，LTP1332进入生长对数期，24h左右进入稳定期，菌体浓度达到最大，24～39h，菌体浓 度无明显变化，39h菌体浓度开始下降，进入衰亡期。
实施例4 LTP1332在模拟胃液中耐受性
取LTP1332冻干菌粉，溶解于pH 2.5的人工模拟胃液中，37℃恒温培养4h，测定活菌 数。收集模拟胃液中的菌体，重悬于人工模拟肠液，37℃恒温培养，测定活菌数。活菌数表 达单位是CFU/mL。结果见图6和图7。人工模拟胃液的组成为NaCl 2.0g/L、胃蛋白酶(pepsin 1∶3000)3.2g/L，调整pH值为2.5，过滤除菌。人工模拟肠液组成为KH2PO4 6.8g/L、胰蛋白 酶(Trypsin 1∶250)1.0g/L、胆盐0.3g/L，调整pH值为8.0。
图6和图7表明经过4h模拟胃液处理后，LTP1332存活率为72.03％，再经12h模拟肠液处 理后最终的存活率为47.63％，说明LTP1332具有较强的胃肠道耐受能力，能够顺利通过胃肠 道，在体内发挥其益生作用。
实施例5 LTP1332在DSS诱导小鼠结肠炎模型中的效果
将LTP1332和模式菌株CCIC 22537(购自中国工业微生物菌种保藏中心)分别于MRS 培养基37℃恒温培养，离心收集菌体，重悬于无菌生理盐水中，利用分光光度计配制菌体浓 度约为2×109CFU/mL的菌悬液。
将50只C57BL/6J小鼠随机分为5组，分别是正常对照组、右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)模型组、CCIC22537组、LTP1332组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组，每组10只，雌雄各半。 正常对照组用无菌生理盐水灌胃；DSS模型组用DSS造模；CCIC22537组(模式菌株对照 组)用DSS造模加灌胃2×109CFU/mL CCIC22537；LTP1332组用DSS造模加灌胃2×109 CFU/mL LTP1332；SASP组(阳性对照组)用DSS造模加灌胃200mg/(kg·d)SASP。DSS造 模方法：3.0％DSS溶液(w/v)自由饮用7天。生理盐水、试验菌株LTP1332以及SASP的 灌胃从造模开始前两天开始进行。
每天观察小鼠进食、活动等情况，记录体重变化，并观察粪便性状及是否隐血。图8为 造模后各组小鼠体重变化。造模第三天，除正常组小鼠体重略有上升外，其余各组开始迅速 下降，DSS模型组的下降幅度最大，其次是CCIC22537组；造模第五天LTP1332组、SASP组、CCIC22537组小鼠体重下降速度均减缓，试验结束时，模型组小鼠体重下降了 3.2±1.1g，与正常组小鼠体重的改变相比有显著差异(P＜0.05)，说明用DSS诱导小鼠结肠 炎有效。LTP1332组和SASP组小鼠体重改变与DSS模型组相比，有显著性差异 (P＜0.05)，CCIC22537组小鼠体重改变比模型组幅度减小，但差异无统计学意义，说明 LTP1332能够缓解由DSS引起的小鼠体重下降，且效果优于模式菌株CCIC22537。
按照Bauer的DAI评分标准(表4)计算DAI积分，初步评估造模情况及结肠炎的严重程度。其中，DAI＝便血分数+大便性状分数+体重下降分数。脾是参与免疫反应的重要淋巴器 官。DSS诱导的小鼠结肠炎能够增加小鼠脾的活动，从而引起脾重量增加。试验结束后测得 的各组小鼠DAI积分及脾脏系数结果如表5所示。其中脾脏系数＝脾脏重量(mg)/体重(g)。
表4疾病活动指数(DAI)评分标准
Figure BSA0000181256500000051
表5各组小鼠DAI评分，脾脏系数的比较(x±s，n＝8)
组别 DAI 脾脏系数/％
DSS+CCIC 22537 6.75±0.69<sup>*##</sup> 3.83±0.25<sup>##</sup>
DSS+LTP1332 4.53±1.06<sup>**##</sup> 3.93±0.26<sup>##</sup>
DSS 7.95±1.37<sup>##</sup> 4.20±0.32<sup>##</sup>
DSS+SASP 3.43±1.24<sup>**##</sup> 3.40±0.33<sup>##</sup>
正常对照组 0 2.14±0.18
DSS模型组小鼠DAI积分比正常组显著升高(P＜0.01)，CCIC22537、LTP1332、SASP的干预均能降低小鼠DAI积分，SASP的干预效果最好，LTP1332其次，CCIC22537效果略 差，但三组小鼠DAI积分较模型组均有显著差异(P＜0.01)。DSS、CCIC22537、LTP1332、 SASP四组小鼠的脾脏系数较正常对照组显著升高，说明造模引起小鼠脾脏肿胀。
试验结束后，取出小鼠***至盲肠末端整个结肠和直肠段，用预冷的生理盐水清洗结 肠。取结肠1cm(距***1cm处开始)，用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色， 镜检观察。图9是小鼠结肠病理学切片图。正常组小鼠肠黏膜上皮完整，腺体结构排列规 则，隐窝正常，无充血、水肿、糜烂、溃疡(图E)。DSS模型组小鼠隐窝破坏变形，腺体 紊乱，杯状细胞减少，大量中性粒和淋巴细胞浸润，主要累及粘膜、粘膜下层，少数可达浆 膜层(图C)。SASP(图D)、LTP1332(图B)、CCIC22537(图A)三组小鼠的结肠粘 膜病理学损伤均有不同程度的缓解，结肠粘膜缺失较少、组织结构较完整，隐窝炎和隐窝脓 肿明显减少，病变范围缩小，炎症细胞浸润亦显著减少。
参考Dieleman等的评分标准，用以下四个方面的乘积表征组织学损伤程度，包括：炎症 (无记0分；轻度记1分；重度记2分)、病变深度(无记0分；粘膜下层记1分；肌层记2分；浆膜层记3分)、隐窝破坏评分(无记0分；基底1/3隐窝破坏记1分；基底2/3隐窝破坏记2分；仅有完整表面上皮记3分；全部隐窝和上皮被破坏记4分)、病变范围(1-25％记1分；26-50％记2分；51-75％记3分；76-100％记4分)。结果见图10。图10中DSS模型组小鼠的组织学损伤评分显著高于正常组(P＜0.01)，CCIC22537组、LTP1332组、SASP组评分均显著降低 (P＜0.01)，各组排序为：SASP＜LTP1332＜CCIC22537。说明LTP1332具有较好的修复结 肠黏膜损伤能力。
取小鼠结肠组织，剥除浆膜层和肌层，将分离好的新鲜结肠黏膜固定于UssingChamber 装置上，整个装置处于37℃恒温环境，并持续向两侧液体中通入95％氧气和5％二氧化碳混合 气体直至试验结束，两侧分别加入5mL的Kreb液(2.25mmol/L KH2PO4，108mmol/L NaCl， 3mmol/L KCl，2mmol/L CaCl2·2H2O，22mmol/L NaHCO3，8.9mmol/L葡萄糖，pH7.4)。 调节电压钳零电压，以1mV刺激电压每隔60s刺激0.5s，待***稳定后，记录跨膜电阻抗 (TER)。结果见表6
表6各组小鼠结肠上皮跨膜电阻值(n＝5)
Figure BSA0000181256500000061
DSS模型组小鼠结肠上皮TER值明显低于正常组(P＜0.05)，结合图9(E)DSS组小鼠结肠切片可以判断，DSS组小鼠的肠上皮粘膜屏障受到了损伤，上皮细胞旁通透性增加。CCIC22537、LTP1332、SASP组小鼠的结肠上皮TER值较DSS组均有不同程度的增加 (P＜0.05)，其中LTP1332干预组增加幅度明显高于SASP组和CCIC22537干预组，说明该菌 株具有较强的修复肠粘膜损伤能力。
采用ELISA法测定各组小鼠结肠样品中促炎症细胞因子IFN-γ、TNF-α的浓度。TNF-α浓 度的检测结果见图11，IFN-γ浓度的检测结果见图12。图11和12中DSS模型组小鼠的IFN-γ、 TNF-α水平较正常组显著升高(P＜0.01)。SASP组、LTP1332组的IFN-γ、TNF-α浓度较模型 组均显著降低(P＜0.05)，CCIC22537组的TNF-α浓度较模型组差异显著(P＜0.05)，而IFN- γ浓度差异不显著。可知，DSS诱导的急性溃疡性结肠炎模型会增加小鼠体内炎症细胞因子的 水平，LTP1332、CCIC22537、SASP的干预均能不同程度地降低IFN-γ、TNF-α浓度。 LTP1332、CCIC22537作为益生菌能够在DSS诱导的小鼠体内发挥抗炎作用，下调促炎症细胞 因子的水平，且LTP1332效果优于CCIC22537。
实施例6冻干菌粉制备
将LTP1332发酵菌液6000rpm离心10min去上清，经无菌生理盐水洗涤两次后，获得菌 泥，用原发酵液1/10体积的生理盐水重悬，将保护剂和菌泥分别按照8∶1比例混合，放入真空 冷冻干燥机中冷冻干燥24h，得LTP1332冻干菌粉。复水后采用平板计数法检测冻干存活率及 每克冻干菌粉中的活菌数。其中保护剂为脱脂乳、海藻糖、L-谷氨酸钠、吐温80的混和物， 其比例为脱脂乳120g/L，海藻糖70g/L，L-谷氨酸钠10g/L，吐温8010g/L。此条件下得到的 冻干菌存活率为75.21±1.42％，远高于未添加保护剂的菌体冻干后存活率。
Figure ISA0000181256520000011
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Figure ISA0000181256520000111
Figure ISA0000181256520000121

Claims (3)

1.一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)菌株，其特征是：保藏编号是CCTCCNO：M2019029。
2.权利要求1所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)菌株在制备抗结肠炎的药物中的应用。
3.权利要求1所述发酵乳杆菌(Lactobacillus Fermentium)菌株在制备食品中的应用。
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