CN116396909A - 一株用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌x86 - Google Patents
一株用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌x86 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物制备技术领域，具体为一株用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌X86。该植物乳杆菌X86分类命名为Lactobacillus plantarum；已于2023年02月27号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26704，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该植物乳杆菌X86具有良好的益生基本特性；其发酵液具有良好的体外抑制金黄色葡萄球菌的能力；L.plantarum X86减轻金黄色葡萄球菌性大鼠乳腺炎模型的乳腺、肝脏与结肠病理损伤；L.plantarum X86抑制了乳腺组织促炎细胞因子IL‑1β、IL‑6和TNF‑αmRNA表达等。
Description
技术领域
本发明属于微生物制备技术领域，具体为一株用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌X86。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)是最常见的乳腺炎病原体，它能够在乳腺内长期定植与它具有形成细菌生物被膜的能力、入侵细胞，逃避宿主的免疫反应有关，不适用抗生素治疗。S.aureus形成的细菌生物被膜，是S.aureus性乳腺炎奶牛对抗生素产生耐药性及引起慢性或复发性乳腺炎的主要原因。
寻找抗生素替代品防治乳腺炎是当前亟待解决的重大问题。
发明内容
本发明的目的在提供一株用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌X86，该菌株是一株体外具有抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)的乳源乳酸菌，该菌株可有效的抑制S.aureus浮游菌和细菌生物被膜及有效抗S.aureus性大鼠乳腺炎，是发展替抗产品用于防治S.aureus性乳腺炎的有效菌株。
为了实现本发明的上述目的，本发明的具体技术方案为：
一株用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌X86，该植物乳杆菌X86分类命名为Lactobacillus plantarum；已于2023年02月27号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26704，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
一种用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的抗菌剂，包括所述的植物乳杆菌X86(保藏编号为CGMCC No.26704)和药学上可接受的载体。
进一步的，本申请保护所述的植物乳杆菌X86在制备抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎药物中的应用。
进一步的，本申请保护所述的植物乳杆菌X86在制备抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎菌剂中的应用。
进一步的，本申请保护所述的植物乳杆菌X86在制备抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎口服制剂中的应用。
进一步的，本申请保护所述的植物乳杆菌X86在制备抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎灌胃制剂中的应用。
作为优选，所述的抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的抗菌剂的形态为冻干粉或菌液。
进一步的，所述的植物乳杆菌X86减轻大鼠乳腺、肝脏与结肠病理损伤。
进一步的，所述的植物乳杆菌X86抑制了乳腺组织促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达。
进一步的，所述的植物乳杆菌X86逆转了S.aureus引起的除Bacteroides外的相关菌属物种丰度变化，并增加了Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor的丰度；Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor的丰度与SCFAs含量正相关。
进一步的，用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌X86，该菌株从宁夏地区奶牛生鲜乳中经分离、纯化获得。该新菌株具有良好的益生基本特性。
进一步的，所述植物乳杆菌X86的发酵液具有良好的体外抑制金黄色葡萄球菌的能力。
进一步的，所述植物乳杆菌X86菌株具有抗革兰氏阳性病原菌活性。
进一步的，所述植物乳杆菌X86菌株给泌乳期大鼠灌胃植物乳杆菌X86，L.plantarum X86减轻炎症反应和病理损伤，并增加SCFAs的含量，对S.aureus诱导的大鼠乳腺炎模型具有预防作用。
与现有技术相比，本发明的积极效果体现在：
(一)该植物乳杆菌X86具有良好的益生基本特性；
(二)植物乳杆菌X86发酵液具有良好的体外抑制金黄色葡萄球菌的能力；
(三)所述的植物乳杆菌X86减轻大鼠乳腺、肝脏与结肠病理损伤；
(四)所述的植物乳杆菌X86抑制了乳腺组织促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达；可用于防治乳腺炎；
(五)给泌乳期大鼠灌胃植物乳杆菌X86，所述的植物乳杆菌X86减轻炎症反应和病理损伤，并增加SCFAs的含量，对S.aureus诱导的大鼠乳腺炎模型具有预防作用；
(六)所述的植物乳杆菌X86逆转了S.aureus引起的相关菌属物种丰度变化(Bacteroides例外)，并增加了Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor的丰度；Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor的丰度与SCFAs含量正相关。
(七)利用植物乳杆菌X86，可用于制备微生物预防菌剂，可以以冻干粉或菌液的形式呈现，口服(人类)或灌胃，拌料使用(动物)，用于动物或人类的金黄色葡萄球菌感染所致乳腺炎的预防，具有较好的效果。
附图说明
图1为7株乳酸菌分离株的生长和镜下形态图
图2为乳酸菌分离株的生长曲线和pH曲线图
图3乳酸菌分离株的人工胃液和人工肠液存活率
图4乳酸菌分离株的胆盐溶液存活率
图5乳酸菌分离株对MAC-T细胞的黏附率
图6植物乳杆菌X86对大鼠乳腺外观的影响
图7植物乳杆菌X86对大鼠乳腺组织病理变化的影响
图8植物乳杆菌X86对大鼠肝脏组织病理的影响
图9植物乳杆菌X86对大鼠空肠和结肠组织的影响
图10植物乳杆菌X86对乳腺炎模型大鼠乳腺组织Claudin-1蛋白的影响
图11植物乳杆菌X86降低大鼠乳腺组织中促炎细胞因子的蛋白含量与MPO浓度
图12大鼠肠道菌群的关联网络分析
图13大鼠肠道菌群的KEGG通路富集分析
图14植物乳杆菌X86增加大鼠肠道产SCFAs相关菌属的丰度
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
在本申请中所记载的％，如未特殊说明，均指质量百分含量。实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段如未特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：植物乳杆菌X86的分离筛选及鉴定
1、实验材料
宁夏地区奶牛生鲜乳。
2、实验方法
2.1乳酸菌的分离纯化
在无菌条件下，按3％的接种量，将从宁夏地区奶牛生鲜乳样品接种入MRS液体培养基，37℃，48h培养；取出培养液10倍稀释1次，菌液涂布MRS琼脂平板，37℃，48h培养。获得的单克隆，在MRS琼脂平板上划线后，37℃，48h培养。重复上述步骤获得纯化的乳酸菌菌株。
2.2乳酸菌的16S rRNA基因PCR扩增
采用细菌的16S rRNA通用引物，27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：CTACGGCTACCTTGTTACGA，进行PCR扩增，扩增产物送生工生物工程股份有限公司测序，测序结果在NCBI中进行序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，以同源性≥97％视为同一物种。
2.3乳酸菌的耐酸初筛
将乳酸菌分离株接种pH 3.0的MRS培养基中，37℃，180rpm培养18-24h，挑选菌液有明显混浊的菌株；观察并记录菌株在培养基上的菌落形态。取新鲜培养的菌落，细菌革兰氏染色后，在显微镜下观察，准确记录镜下形态。
3、结果：
3.1分离菌株的种类
共计获得12种，214株乳酸菌。12种乳酸菌分别是海氏肠球菌、粪肠球菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、融合魏斯氏菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、蒙氏肠球菌、肠球菌属某些种类、肠膜魏斯氏菌、食窦魏斯氏菌和鼠李糖乳杆菌。
3.2耐酸菌株分析
具有耐酸及在MRS琼脂和肉汤中生长旺盛的菌株有12株。其中有5株菌来源于同一奶牛个体，只取其中1株，最后共获得7株菌株，标号分别为X86、X130、X133、X135、X145、X275和X277。以L.rhamnosus LGG为对照菌株。乳酸菌分离株在MRS琼脂平板上形成乳白色(L.plantarum X277为淡黄色)、圆形、湿润和光滑、中等大小的菌落；革兰氏染色后镜检，均为革兰氏阳性的中等大小的杆菌。除L.rhamnosus LGG与L.plantarum X275镜下为棒状杆菌外，其余6株乳酸菌均呈短棒状，各株菌的形态略有差异。菌株的菌落形态和革兰氏染色结果见图1。
3.3分离菌株的***发育树
7株乳酸菌分离株和对照菌株L.rhamnosus LGG的***发育树(基于16S rRNA基因全序列)中，分支结点旁边数字为Bootstrap value，bootstrap值>70，代表这个分支是可靠的；进化分支长度越长代表着该分支对应的物种或基因的变化越大。X86、X275和X277聚为一支，并与L.plantarum BF1-13进化距离最近，因此将该3株菌鉴定为L.plantarum。LGG、X130与L.rhamnosus NIMBB006的亲缘关系最近，鉴定为L.rhamnosus。X133、X135和X145与L.paracasei strain Y526聚为一支，均可鉴定为L.paracasei。
实施例2乳源乳酸菌分离株的体外益生特性及抗S.aureus作用
1、实验材料
实验菌株为实施例1中获得的7株耐酸乳源乳酸菌分离株。鼠李糖乳杆菌LGG为对照菌株。
2、实验方法
2.1候选7株乳酸菌分离株的发酵上清液(CFS)的制备
乳酸菌株以2％的比例接种MRS肉汤培养基，37℃180rpm培养12-18h，重复此过程一次。随后，在50mL锥形瓶中，按2％的接种量，接种活化好的乳酸菌种。MRS肉汤培养基装瓶量75％(即37.5mL/50mL)，37℃静置培养48h；6000rpm离心10min，转移上清液至无菌离心管中，4℃保存备用，即为CFS。
2.2乳酸菌分离株的基本益生特性测定
按现有技术进行乳酸菌分离株的生长曲线、pH曲线、耐人工肠胃液、胆盐的测定。
2.3Lactobacillus ssp.对MAC-T细胞黏附及其对S.aureus黏附细胞的抑制作用研究
乳酸菌对MAC-T细胞的粘附能力测定按照现有技术进行。
2.9.1S.aureus对MAC-T细胞的黏附
以LB液体培养基调节金黄色葡萄球菌(ATCC29213、SA2和SA6)浓度为2.5×107CFU/mL，MOI(S.aureus与MAC-T细胞的比率)为200：1。S.aureus的平板计数采用LB固体培养基，平板计数法进行S.aureus计数。
2.9.2乳酸菌抑制S.aureus对MAC-T细胞的黏附
在12孔细胞板各孔中先加入乳酸菌(5×108CFU/mL)黏附MAC-T细胞，37℃孵育2h；随后，PBS清洗细胞2次，再加入S.aureus(2.5×107CFU/mL)，37℃孵育1h；取出细胞培养板，弃菌液，以PBS洗MAC-T细胞4次，用以去除未黏附的S.aureus；每孔中加入0.05％胰酶0.25mL，37℃10min进行细胞消化；最后在细胞中加入100μL的0.01％曲拉通裂解细胞后，收集孔中全部液体，平板计数法进行S.aureus计数。
2.10候选Lactobacillus ssp.的生物学特性赋分评价
将乳酸菌的各项生物学特性划分为5个指标：(一)生长(生长曲线与pH曲线)；(二)基本益生特性(包括人工肠胃液和耐胆盐)；(三)对致病菌的作用(包括对S.aurues菌株的生长抑制与体外抑制)；(四)对细胞的黏附作用(包括乳酸菌的黏附与对病原菌黏附细胞的抑制)；(五)乳酸菌对抗生素的耐药性。以上五个指标，每个指标赋分20分，合计100分，赋分细则见表1。
表1乳酸菌分离株的生物学特性赋分
3.结果
3.1乳酸菌分离株的生长曲线与pH曲线
由图2可见，L.plantarum X86、L.plantarum X275和L.plantarum X277的繁殖速度很快，3h时进入对数期，9h时OD600可达1.3，生长速率与LGG相当；L.plantarum X86与L.rhamnosus LGG在24h时，培养液的pH值就达最低值3.5；L.rhamnosus X130、L.plantarumX275和L.plantarum X277的pH值次之，达3.70；L.paracasei X133为3.80；L.paracaseiX135和L.paracasei X145的pH值在24h时3.90，此后缓慢下降至3.50。在本研究中，L.plantarum X86的产酸能力与速度很快，pH值最低，说明其产酸能力较强，具有良好的应用潜力。
3.2乳酸菌分离株耐人工肠胃液试验和耐胆盐能力测定
由图3可见，L.plantarum X86、X145和X275对pH 3.0的人工胃液具有较强的耐受性，经3h处理后，存活率最高可达71％，X133对人工胃液的耐受性最差，存活率为63％。乳酸菌经pH 8.0的人工肠液作用8h后，X130、X145、X275和X277的存活率几乎不受影响，与起始的接种量比较，存活率达73％，L.plantarum X86与X133的存活率最差，为61％-63％。对照菌株LGG无论是在人工胃液还是人工肠液中，存活率都很高(分别为69％和71％)。由图4可知，不同菌株的耐胆盐能力不同，L.plantarum X275、L.plantarum X277和L.plantarumX86具有最佳的胆盐耐受性，存活率64％-83％之间，X145的耐胆盐能力最差，仅有21％。
3.3乳酸菌分离株CFS对S.aureus的生长抑制
由表2可知，不同的乳酸菌发酵液均对2株S.aureus的生长有明显抑制作用。CFS0.5-1.0的浓度对2株S.aureus的抑制率在85.21％-96.80％之间，随着CFS的浓度下降，抑菌能力亦显著下降。L.plantarum X86 CFS对SA2和L.rhamnosus X130对SA6分别有37.93％和34.44％的抑菌率。
表2乳酸菌分离株CFS对S.aureus的生长抑制率(％)
3.4乳酸菌分离株CFS对S.aureus生物被膜的抑制
不同的乳酸菌发酵液均对2株S.aureus的生物被膜有明显的抑制作用，结果见表3。在CFS 0.5-1.0的浓度下，对2株S.aureus的抑制率在88.39％-101.23％，CFS在0.125的浓度下，L.paracasei X145对SA2，L.rhamnosus X130对SA6仍分别有82.55％和66.34％的抑制率。
表3乳酸菌分离株CFS对S.aureus生物被膜的抑制率(％)
3.5乳酸菌分离株抗生素耐药性
由表4可知，所有乳酸菌分离株与L.rhamnosus LGG均对庆大霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素这4种抗生素耐药，对氨苄青霉素、四环素、利福平和氯霉素4种抗生素敏感(L.rhamnosus LGG对氯霉素耐药)，不同乳酸菌对林可霉素与红霉素的耐药性不一致。由以上结果可知，乳酸菌分离株对抗生素产生了不同程度的抗生素耐药性。总体上来看，L.plantarum X86对所有测试抗生素具有最高的敏感性。
表4Lactobacillus ssp.的抗生素耐药性
3.6乳酸菌分离株对MAC-T细胞黏附及其对S.aureus黏附细胞的抑制作用
3.6.1乳酸菌分离株对MAC-T细胞的黏附
由图5可知，不同乳酸菌对MAC-T细胞的黏附能力不同，L.plantarum X86与L.paracasei X133对MAC-T细胞的黏附能力最强，黏附细胞数达108CFU，而L.rhamnosusX130对MAC-T细胞的黏附能力最差，黏附数低于106CFU，其余乳酸菌分离株的黏附数量在106-107CFU之间。
3.6.2乳酸菌分离株对S.aureus对MAC-T细胞的黏附抑制
7株乳源乳酸菌株和L.rhamnosus LGG对S.aureus菌株(SA2、SA6和ACCC29213)对MAC-T细胞黏附抑制试验表明，S.aureus菌株对MAC-T细胞的黏附力极强，所有菌株的黏附数量均可达105CFU，而各株乳酸菌对其黏附率没有产生明显影响(数据未列)。
3.7L.plantarum X86的生物学特性赋分
通过对乳酸菌的生物学特性进行分指标赋分，建立了乳酸菌的筛选评分体系。通过表5可知，乳酸菌分离株的得分在63.57-76.20间，其中得分最高的是L.plantarum X86，最低的是L.paracasei X145。对照菌株L.rhamnosus LGG 71.45分，主要在胆盐耐受和细胞黏附数量上低于L.plantarum X86的表现。
表5乳酸菌分离株与对照菌株LGG的生物学特性赋分
试验结论：
7株宁夏地区乳源乳酸菌候选菌株的生物学特性，并进行了筛选评分。主要结果如下：(1)所有7株乳酸菌分离株均具有较强的体外生长能力和产酸能力，其中L.plantarumX86的生长很快，9h时OD600即可达到1.3，24h时培养基的pH可降为3.5；(2)7株乳酸菌分离株通过人工肠胃液和胆盐耐受试验的能力不同；(3)7株乳酸菌分离株产的发酵上清液对2株S.aureus的浮游菌和生物被膜均具有很强的抑制作用；(4)对MAC-T细胞的黏附能力，以L.plantarum X86和L.paracasei X133最高，黏附数可达108CFU，最低的L.rhamnosus X130不到105CFU；(5)7株乳酸菌分离株和对照菌株L.rhamnosus LGG对10种抗生素具有不同程度的耐药性；(6)通过综合评分，L.plantarum X86得分最高，具有最佳的益生性和抗乳腺炎的潜力。
将得分最高的L.plantarum X86进行保藏，该菌株已于2023年02月27号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26704，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例3植物乳杆菌X86对S.aureus诱导的大鼠乳腺炎的预防作用
1.实验材料
将保藏的植物乳杆菌X86作为实验菌株，其保藏编号为CGMCC No.26704。S.aureusATCC29213。实验动物为怀孕SD大鼠，SPF级，购自成都达硕实验动物有限公司。饲养于SPF动物屏障***中，适应性饲养一周后进行实验。
2.实验方法
2.1S.aureus诱导的大鼠乳腺炎模型的建立
动物试验已获得四川大学生命科学学院伦理委员会批准(批准号：SCU2203016)。怀孕大鼠饲养在屏障***，适应性饲养7d后(怀孕后14±2d)，24只怀孕SD大鼠随机分为三组：Control、X86+S.aureus和S.aureus，每组8只。X86+S.aureus组大鼠每日灌胃1×109CFU/mL的L.plantarum X86 0.5mL，对照组和S.aureus组大鼠灌胃等量生理盐水，直至大鼠分娩后第14d。灌胃结束次日，X86+S.aureus和S.aureus组大鼠乳腺炎造模。
2.2大鼠乳腺炎模型的建立
植物乳杆菌X86以2％的比例接种在MRS肉汤培养基中，37℃，180rpm培养12h，连续传代2次；然后将植物乳杆菌X86以PBS清洗两次后，以生理盐水调节菌液浓度为1×109CFU/mL；将大鼠每日灌胃上述菌液0.5mL至分泌后第14d；
大鼠乳腺炎模型的建立具体步骤如下：
(1)仔鼠提前2h取出；
(2)大鼠经异氟烷气体麻醉后，维持麻醉状态；
(3)以75％乙醇的脱脂棉球消毒***及周围皮肤；
(4)乳腺灌注方法：在手术显微镜下找到乳腺导管开口后，镊子轻轻夹住***，以30G注射器开始进针，镊子轻轻提起***将乳导管套住针头后进针(进针深度约为针长度的2/3)，然后缓慢推入全部液体。拔出针头后，应无液体从乳导管渗出，触摸***无明显鼓起；
(5)以(4)中方法分别向第4、5两对乳腺灌注S.aureus 100μL(106CFU/mL)，Control组灌注等量的生理盐水；
(6)大鼠放回鼠笼，待其自然苏醒后继续饲养；
(7)24h后，大鼠用戊巴比妥钠行腹腔麻醉，解剖大鼠；
(8)标本采集：首先采集腹主动脉血液，分离血清后，-20℃保存；无菌采集大鼠粪便标本2份于冻存管中，一份用于肠道菌群测定，一份用于肠道SCFAs含量测定，标记后立即投入液氮中；采集乳腺组织，空肠和结肠组织用于病理检测，标本立即投入固定液中固定，2h内换液一次；采集乳腺组织，空肠和结肠组织于冻存管中，用于qRT-PCR和ELISA检测，标本标记后立即投入液氮中；待标本整理后，-80℃保存。
2.3HE染色
组织标本经中性甲醛固定，常规石蜡切片HE染色。光学显微镜下观察各组大鼠的乳腺形态结构，包括乳腺小叶、导管及其***的完整性和炎性细胞浸润程度。结肠标本观察结肠纤毛的完整度和组织结构形态等。
2.4免疫组化
对乳腺与结肠组织中Claudin-1蛋白的表达进行定位和相对定量分析。
2.5粪便、乳腺和血液中L.plantarum与S.aureus的分离、鉴定
粪便标本以10倍的无菌生理盐水制备成匀浆后，低速离心2min；乳腺标本以800μL的无菌水清洗乳腺组织后，去除乳腺组织，12000rpm离心5min，弃上清。吸取粪便标本上清液20μL，均匀涂布MRS平板和LB平板，37℃培养24-48h；无菌棉签蘸取乳腺标本的沉淀物，均匀涂布MRS平板和LB平板，37℃培养24-48h；血液标本：取100μL血液标本，均匀涂布MRS平板和LB平板，37℃培养24-48h。待平板上形成单个菌落后，菌落纯化2次，提取细菌DNA与16SrRNA基因扩增，序列Blast。
2.6ELISA检测促炎细胞因子蛋白含量与MPO浓度
血清中促炎因子(IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α)蛋白含量，按照成都鹏仕达的ELISA试剂盒说明书进行；乳腺组织中的IL-1β、IL-2和IL-6蛋白含量，按照博士德的ELISA试剂盒说明书进行；血清和乳腺组织中的MPO浓度，按照南京建成的MPO检测试剂盒说明书进行。
2.7大鼠组织总RNA提取与反转录
按照天漠生物的RNA提取试剂盒说明书进行组织样品RNA提取，提取的RNA冰上放置，浓度与纯度测定后，-80℃保存备用。反转录按照Takara的反转试剂盒说明书操作，反应液在冰上配置。
2.8qRT-PCR检测基因mRNA的表达
NCBI Primer Blast在线设计相关基因的qRT-PCR引物，以大鼠的GAPDH基因做为内参。引物信息见表6。qRT-PCR使用YEASEN公司Hieff
qPCR SYBR Green MasterMix。
表6qRT-PCR引物序列
2.9L.plantarum X86对S.aureus诱导的乳腺炎大鼠肠道SCFAs的影响
收集1粒大鼠的粪便于冻存管中，标记后，立即投入液氮中速冻，然后转至-80℃保存。称取25mg的粪便样品于2mL研磨管中，加入500μL水(含0.5％磷酸)；冷冻研磨3min(50HZ)两次，超声10min，然后4℃，13000g离心15min；上清液转移到1.5mL离心管中，加入0.2mL正丁醇溶剂(含内标2-乙基丁酸10μg/mL)进行萃取；涡旋10s，低温超声10min，4℃，13000g离心5min；最后，取上清液到进样小瓶开始上机检测。GC-MS检测的程序升温和色谱条件按常规方法进行。
3、结果
3.1植物乳杆菌X86对S.aureus诱导的大鼠乳腺炎模型乳腺形态的影响
X86+S.aureus组和S.aureus组大鼠24h时触摸大鼠造模乳区，质稍硬，未造模的乳区无异常，Control组大鼠正常。大鼠打开皮肤后，乳腺外观如图6所示。S.aureus组大鼠的造模乳区均不同程度充血，质似“***”；X86+S.aureus组和Control组大鼠的乳腺光滑，无明显充血。结果表明，L.plantarum X86改善了乳腺炎大鼠模型乳腺炎症。
3.2L.plantarum X86改善乳腺炎模型大鼠乳腺组织炎症
Control组乳腺组织正常，无炎性细胞浸润；S.aureus组乳腺腺泡及导管显著扩张，上皮细胞严重坏死，腺腔内可见较多中性粒细胞和坏死脱落的上皮细胞。X86+S.aureus组乳腺组织也出现明显病理损伤，但病变程度明显减轻。结果表明，L.plantarum X86能够预防乳腺炎模型大鼠的乳腺炎。各组大鼠乳腺HE切片结果见图7。
3.3L.plantarum X86改善乳腺炎大鼠肝脏组织病变
Control组肝脏组织形态结构正常，无明显淤血扩张及炎性浸润；X86+S.aureus组有1例出现了肝细胞点状坏死，但未见明显淤血扩张及炎性浸润；S.aureus组有4例肝细胞不同程度坏死，见胞核固缩、崩解，且伴有少量炎性细胞浸润和纤维组织轻微增生，炎性细胞以核呈圆形深染的淋巴细胞为主，部分肝细胞胞质空泡化。以上结果表明，S.aureus诱导的大鼠乳腺炎可引起肝脏组织病变，而X86摄入可以较大程度减轻该种症状，对S.aureus引起的肝脏损伤具有明显的保护作用。结果表明，L.plantarum X86具有预防S.aureus乳腺灌注引起的肝脏损伤。各组大鼠肝脏HE切片结果见图8。
3.4L.plantarum X86减轻乳腺炎模型大鼠肠道组织炎症
Control组空肠组织结构完整、肠绒毛密集，细而长；X86+S.aureus组空肠组织亦未见明显炎性浸润及纤维增生；S.aureus组空肠组织仅1例(1/8)绒毛顶部轻微水肿，未见明显炎性浸润及纤维增生。以上结果表明，S.aureus乳腺炎在空肠组织未能引起显著病变。图9中，Control组结肠组织结构较完整和正常；X86+S.aureus组结肠组织未见明显病理改变；S.aureus组有6例(6/8)黏膜层局部点状坏死，结构紊乱，上皮细胞坏死脱落，见胞核固缩、崩解，胞质溶解，可见较多细胞残片，且伴有炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主。以上结果表明，S.aureus乳腺炎可以引起结肠组织的病变，而L.plantarum X86的摄入可以明显减轻这种病变。结果表明，L.plantarum X86具有预防S.aureus乳腺灌注引起结肠炎症的作用。各组大鼠空肠与结肠组织的HE切片结果见图9。
3.5L.plantarum X86预防乳腺炎乳腺组织Claudin-1蛋白含量下降
Claudin-1蛋白主要在细胞膜上表达(棕色)；各组大鼠结肠中Claudin-1蛋白的表达面积差异不显著(p>0.05)；但在乳腺组织中，与Control组相比，Claudin-1蛋白在S.aureus组极显著下降(p<0.01)，X86+S.aureus组差异不显著(p>0.05)。以上结果表明，L.plantarum X86的摄入可以预防S.aureus感染造成的乳腺细胞Claudin-1蛋白表达量下降，因此对乳腺具有保护作用。各组大鼠结肠组织的Claudin-1蛋白免疫组化结果见图10。
3.6L.plantarum X86降低乳腺中促炎细胞因子蛋白含量与MPO浓度
利用ELISA试剂盒对各组大鼠乳腺中3种促炎细胞因子含量和MPO活力进行检测。由图11可见：与Control组相比，S.aureus组大鼠的乳腺中IL-1β和IL-6含量及MPO的活性显著升高(p<0.05)，X86+S.aureus组无显著差异(p>0.05)。结果表明，L.plantarum X86可减轻乳腺中促炎因子蛋白表达水平和MPO含量。促炎因子与MPO水平与乳腺症状严重程度正相关，表明了L.plantarum X86通过抑制促炎因子表达和MPO活化，预防了大鼠的乳腺炎症。
3.7L.plantarum X86增加大鼠粪便SCFAs含量
通过GC-MS对各组大鼠粪便的8种SCFAs含量进行检测。由表7可知，X86+S.aureus组具有最高SCFAs含量，但无统计学差异(p>0.05)。与Control组比，X86+S.aureus组增加了2.5倍的己酸(Hexanoic acid)、1.8倍丁酸(Butanoic acid)、1.4倍异戊酸(Isovalericacid)和戊酸(Valeric acid)；与S.aureus组相比，X86+S.aureus增加了1.6倍的异戊酸(Isovaleric acid)、1.5倍的丙酸(Propanoic acid)和异丁酸(Isobutyric acid)。以上结果表明，摄入L.plantarum X86有增加大鼠肠道SCFAs含量的趋势。
表7L.plantarum X86增加大鼠粪便SCFAs含量
实施例4植物乳杆菌X86对大鼠S.aureus性乳腺炎肠道菌群多样性的影响
1.实验材料
植物乳杆菌X86预防大鼠S.aureus性乳腺炎各组大鼠的粪便标本。
2.实验方法
2.1大鼠粪便基因组DNA的提取
采用
Soil DNA Kit试剂盒提取大鼠粪便DNA，然后采用Nanodrop测定DNA的浓度与纯度，凝胶电泳检测。
2.2PCR扩增、文库构建和Miseq测序
PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。引物序列338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱后，2％琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量***进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit构建文库，基于上海美吉生物的Illumina Miseq PE300测序平台进行测序。
2.3生物信息学分析
测序得到的reads拼接后进行质控和过滤，OTU聚类及区分不同分类水平。生物信息学分析通过美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com)进行。
3.结果
3.1L.plantarum X86对大鼠乳腺炎模型肠道菌群物种组成的影响
在门水平上共检测到了8种优势菌门(丰度≥1％)，即Bacteroidota、Firmicutes、Verrucomicrobiota、Desulfobacterota、Actinobacteriota、Campilobacterota、Proteobacteria和Patescibacteria。与Control组相比，S.aureus组Bacteroidota、Actinobacteriota、Campilobacterota和Patescibacteria丰度增加，而Firmicutes和Proteobacteria的丰度下降；X86+S.aureus组与S.aureus在上述菌门的丰度变化趋势相似；此外，Verrucomicrobiota在X86+S.aureus组中具有最高的相对丰度(7.40％)，以上变化无统计学差异(p>0.5)。在属的水平上，S.aureus诱导的乳腺炎可以影响肠道中主要菌属的丰度发生变化，主要表现为减少了Bacteroides(4.6倍)、Lachnospiraceae group(2.2倍的Lachnoclostridium、3.4倍的Lachnospiraceae_NK4A136_group和2.7倍的norank_f_Lachnospiraceae)、Akkermansia(1.4倍)和Dubosiella(2.1倍)的相对丰度，同时增加norank_f_Muribaculaceae(1.8倍)和norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014(3.7倍)。L.plantarum X86干预后，逆转了上述物种的丰度变化(Bacteroides例外)，尤其是增加了Akkermansia和减少了norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014的相对丰度。
表7L.plantarum X86对大鼠乳腺炎模型肠道菌群属水平的影响
3.2大鼠肠道菌群的关联网络分析
物种相关性网络图(network)主要反映某一环境条件下各分类水平的物种相关性。由图12可知，占比最大的norank_f_Muribaculaceae仅与Prevotellaceae_UCG_001有关联(正相关)；Akkermansia与其它物种关系密切，与Muribaculum、Parasutterella、Klebsiella、Blautia和Bacteroides等正相关，但与Lactobacillus和unclassified_f_Lachnospiraceae负相关；Lactobaicllus与Dubosiella正相关，与Muribaculum和Blautia负相关。
3.3大鼠肠道菌群的KEGG通路富集分析
由图13可知，与Control组相比，在所有6种KEGG L1的代谢通路中，S.aureus组和X86+S.aureus组大鼠均呈下降趋势；其中，X86+S.aureus组在Metabolism和Organismalsystems两个通路显著下降(p<0.05)。结果表明，S.aureus乳腺灌注影响了大鼠的肠道菌群的功能，造成菌群功能下降，表明了乳腺炎可以造成菌群(乳汁或肠道)整体的功能下降。
进一步从KEGG L2水平分析，S.aureus组分别在Metabolism(Nucleotidemetabolism和Biosynthesis of other secondary metabolites)、Cellular Process(Cellular community-prokaryotes)、Genetic Information(Folding，sorting anddegradation)、Human disease(Drug resistance:antimicrobial、Infectious disease:bacterial、Cardiovascular disease和Neurodegenerative disease)及Organismalsystems(Endocrine system和Aging)显著下降(p<0.05)，在Organismal systems(Immunesystem)极显著下降(p<0.01)。在上述KEGG L2通路中，X86+S.aureus组与Control组在Immune system、Aging、Infectious disease:bacterial、Neurodegenerative disease、Cellular community-prokaryotes、Nucleotide metabolism并无差异(以上数据未列出)。结果表明，L.plantarum X86可以一定程度上改善S.aureus诱导的肠道菌群KEGG通路富集水平下降。
3.4L.plantarum X86增加大鼠肠道产SCFAs相关菌属的丰度
由图14可知，Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor与Isovaleric acid呈显著正相关(p<0.05)，Flavonifractor还与Hexanoic acid和Valeric acid显著正相关(p<0.05)，与Butanoic acid极显著正相关(p<0.01)。在Control、X86+S.aureus和S.aureus组中，Akkermansia的相对丰度分别是5.03％、7.43％和3.55％；Muribaculum是1.42％、4.36％和1.14％；Flavonifractor是0.22％；0.28％和0.11％。综上，X86+S.aureus具有最高的丰度的Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor。L.plantarum X86增加了肠道中的Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor菌属丰度，而后者增加了肠道中多种SCFAs的含量。因此，L.plantarum X86增加了大鼠肠道中产SCFAs菌属的丰度，参与了预防大鼠乳腺炎的作用。
试验结论：
研究了L.plantarum X86对S.aureus乳腺炎大鼠肠道菌群的影响。主要结果如下：(1)三组大鼠的肠道菌群组成与多样性无显著差别；L.plantarum X86组与S.aureus组的大鼠菌群结构相似，而与Control组的大鼠菌群距离较远；(2)L.plantarum X86增加了优势菌门Bacteroidota的丰度和降低了Firmicutes的丰度。此外，增加了Verrucomicrobiota的丰度。在属水平上增加了Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor的丰度，减少了Helicobacter、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG_014、Candidatus_Saccharimonas和Alloprevotella等菌属的丰度；(3)Network分析表明，Akkermansia与Muribaculum正相关；(4)Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor 3种菌属与Isovaleric acid的含量显著正相关(p<0.05)，Flavonifractor还与Hexanoic acid和Valeric acid显著正相关(p<0.05)，与Butanoic acid极显著正相关(p<0.01)。本章结果表明，L.plantarum X86可以影响S.aureus诱导乳腺炎大鼠的肠道菌群变化，并增加了产SCFAs菌的丰度，介导了对大鼠乳腺炎的预防作用。
虽然本发明已经通过具体实施方式对其进行了详细阐述，但是，本专业普通技术人员应该明白，在此基础上所做出的未超出权利要求保护范围的任何形式和细节的变化，均属于本发明。
Claims (10)
1.一株用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌X86，其特征在于，该植物乳杆菌X86分类命名为Lactobacillus plantarum；已于2023年02月27号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26704，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的抗菌剂，其特征在于，所述抗菌剂包括如权利要求1所述的植物乳杆菌X86和药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的植物乳杆菌X86在制备抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎药物中的应用。
4.如权利要求1所述的植物乳杆菌X86在制备抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎菌剂中的应用。
5.如权利要求3所述的植物乳杆菌X86在制备抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎口服制剂中的应用。
6.如权利要求3所述的植物乳杆菌X86在制备抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎灌胃制剂中的应用。
7.如权利要求2所述的抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的抗菌剂，其特征在于，所述抗菌剂的形态为冻干粉或菌液。
8.如权利要求2所述的抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的抗菌剂，其特征在于，所述的植物乳杆菌X86减轻大鼠乳腺、肝脏与结肠病理损伤。
9.如权利要求1所述的用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌X86，其特征在于，所述的植物乳杆菌X86抑制了乳腺组织促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达。
10.如权利要求1所述用于抗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的植物乳杆菌X86，其特征在于，所述的植物乳杆菌X86逆转了S.aureus引起的除Bacteroides外的相关菌属物种丰度变化，并增加了Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor的丰度；Akkermansia、Muribaculum和Flavonifractor的丰度与SCFAs含量正相关。
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