CN110408547B - 一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉、应用及辣椒栽培方法 - Google Patents

一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉、应用及辣椒栽培方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉、应用及辣椒栽培方法。一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉，分类命名为Trichoderma virens，株号HZA14，保藏号为CCTCC M 2019484。本发明通过筛选获得了一株可用于防治辣椒疫霉病的绿木霉，分类命名为Trichoderma virens，株号HZA14，保藏号为CCTCC M 2019484，该绿木霉对辣椒疫霉菌丝生长具有高效的抑制作用，用于防治辣椒疫病能够显著降低辣椒疫霉的发病率和发病程度，具有良好的生防应用前景。

Description

一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉、应用及辣椒栽培方法
技术领域
本发明涉及植物病害的生物防治技术领域，特别是涉及一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉、应用及辣椒栽培方法。
背景技术
辣椒(Capsicum frutescens L.)在我国已有多年的栽培史是我国目前栽培面积最大的蔬菜之一，年种植面积已达142万公顷。辣椒在营养价值上富含丰富维生素C和较多的抗氧化物质，有加速新陈代谢、保健皮肤、控制心脏病、降低胆固醇、预防癌症及其他慢性病的疗效。在生产价值上来看生产适应性强、丰产潜力大、商品性好，适宜进行长季节、抢早和秋延后丰产栽培。
辣椒疫病，俗称“死秧病”是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一种毁灭性土传病害。最早于1918年在美国的新墨西哥洲(Leonian，L.H.1992)以及加利福尼亚地区(Tompkins，C.m.，and Tucker，C.M.1937)被发现。现在已经遍布于世界各地的辣椒种植区。疫病发生时造成植株主、侧根呈淡褐色或变黑，根毛减少，重时腐烂。一般病株死亡率为15％～30％，严重时可高达80％以上甚至绝收。这给辣椒生产带来严重的损失。我国于1940年最早在江苏报道辣椒疫病的发生，自20世纪80年代以来，随着我国辣椒产业化规模的快速发展，栽培措施的不断强化以及不同辣椒新品种的持续推广，目前辣椒疫病己在我国普遍发生且发病程度呈日益加重趋势，主要分布于新疆、青海、黑龙江、北京、上海、甘肃、贵州、云南、陕西、广东以及长江流域等地区。
辣椒疫霉属卵菌门(Oomycota)、卵菌纲、腐霉目、腐霉科、疫霉属。其细胞壁成分主要是纤维素，而非几丁质。疫霉的营养菌丝粗大，无隔膜，孢子囊梗产生无性游动孢子囊；有性生殖产生卵孢子。卵孢子球形，厚壁，外有藏卵器。卵孢子可越冬以及渡过不良环境。病原菌生长最低温度是10℃最适温度为24-28℃最高温度是35℃。
农业栽培措施防治结合化学农药防治一直是防治辣椒枯萎病的主要手段。农业栽培措施包括轮作、土壤日晒、土壤改良、阻止病原菌传播的栽培技术(滴灌、高垅和覆膜)等，但这些方法仅能以减轻病害的发生为主。用溴甲烧熏蒸土壤是唯一有效的防治手段，然而，溴甲烧对大气臭氧层有破坏作用，很多国家现已明文禁止使用或减少使用。该病害还是主要采用化学合成杀菌剂施用。这些常规防控技术已难以有效控制，且易引起生态、环境问题。
生物防治是目前公认安全有效的的生物防治措施，木霉菌丝有多种拮抗机制，包括重寄生作用、产生降解病原菌细胞壁的酶(几丁质酶、木聚糖酶和葡聚糖酶等)和产生抗菌素等。然而，针对不同病原菌，不同木霉菌在不同种和株系间的拮抗机制和活性是不同的，特别是，生产抗生素的能力在同菌的不同分离系之间以及不同菌种的不同分离系之间会有变化(Dennis and Webster，1971)，因此对于不同的病原体，筛选木霉菌的分离株。具有高度拮抗活性并表征其拮抗机制是其作为生物防治剂应用的重要工作(Vinale et al.，2008)。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉、应用及辣椒栽培方法。
一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉，分类命名为Trichoderma virens，株号HZA14，保藏号为CCTCC NO：M 2019484。
本发明绿木霉(Trichoderma virens)HZA14是采自杭州市多年种植辣椒种的土壤中。该菌株的生物学特征为：菌落生长迅速，呈淡深蓝绿色，背面无色到浅黄色；分生孢子单孢，光滑，椭圆形，聚集呈绿色，大小为3.2～6.1×2.6～4.3μm，分生孢子梗通常轮生，呈金字塔形，轮间间隔较短；产孢体安瓶形到烧瓶形。通常有大量厚垣孢子产生。在PDA培养基中通常有色素黄色产生，但无明显气味。最适生长温度在25～30℃。
本发明又提供了所述的绿木霉在抑制辣椒疫霉生长中的应用。本发明绿木霉HZA14在与辣椒疫霉对峙培养时，HZA14生长迅速，明显引起菌丝塌陷和降解，显示了很高拮抗活性。
本发明又提供了所述的绿木霉在防治辣椒疫霉病中的应用。
本发明还提供了一种辣椒栽培方法，包括以下步骤：
(1)制备所述绿木霉的木霉孢子悬浮液；
(2)在辣椒幼苗的根部浇灌步骤(1)中木霉孢子悬浮液。
所述木霉孢子悬浮液的制备方法包括以下步骤：培养所述绿木霉获得木霉孢子粉，将木霉孢子粉分散在水中制备木霉孢子悬浮液，其中每10ml水中加入1g木霉孢子粉。
步骤(2)浇灌时每株辣椒幼苗周围浇灌10ml木霉孢子悬浮液。
步骤(2)浇灌时间为辣椒生长到6～8片叶阶段。
本发明通过筛选获得了一株可用于防治辣椒疫霉病的绿木霉，分类命名为Trichoderma virens，株号HZA14，保藏号为CCTCC NO：M 2019484，该绿木霉对辣椒疫霉菌丝生长具有高效的抑制作用，用于防治辣椒疫病能够显著降低辣椒疫霉的发病率和发病程度，具有良好的生防应用前景。
附图说明
图1为接种5d后拮抗等级为1的15株分离系(HZA1-HZA15)(底部)对辣椒疫霉菌菌丝(上部)在PDA上的拮抗效果图，其中，图a～o分别为分离系HZA1～15。
图2为分离系HZA14(底部)引起辣椒疫霉(上部)菌落的塌陷(*)和降解结果图，其中，图A和B分别为两次重复实验结果。
图3为拟多萝西木霉菌在12h黑暗/12光照条件下在9cm直径培养皿的PDA或CMD或SNA培养基中培养4d后的形态学观察结果图，其中a-c：在PDA培养基上(a)，在CMD培养基上(b),在SNA培养基上(c)；d-m：在CMD培养基上；d-f：分生孢子堆，在分生孢子堆中可以看到单个羽状分生孢子梗(f)；g-k：分生孢子梗和瓶梗，在g(箭头)和j(箭头)可以看到顶端增生的瓶梗；l：分生孢子；m：厚垣孢子，比例尺：d和e＝1mm、f＝500μm、g～m＝10μm。
图4为活性组份C的全扫描质谱图，失去两个硫原子的胶霉毒素的峰在m/z263处。
图5为不同浓度胶霉毒素对辣椒疫霉在培养基上菌丝生长的抑制活性检测结果图，其中，a：使用0.5μg/ml胶霉毒素；b：使用1.0μg/ml胶霉毒素；c：使用5.0μg/ml胶霉毒素；d：使用10.0μg/ml胶霉毒素；e：使用15.0μg/ml胶霉毒素；f：对照组，未加胶霉毒素。
图6为接种绿木霉HZA14分离系孢子粉悬浮液对辣椒疫病发病率和严重度的影响结果图，其中a-b：病原菌接种14d后；a：绿木霉HZA14孢子粉悬浮液与辣椒疫霉游动孢子悬浮液共同接种处理的植株病变向上蔓延(箭头)；b：只接种辣椒疫霉游动孢子悬浮液的植株；c：接种15d后的发病率和发病程度；严重度(DS％)＝Σ(病害等级×植物数量)/(最大等级值×植物总数)×100，竖线代表平均值的标准偏差(n＝3)，根据最小二乘法(LSD)，在p<0.05时，随条有不同字母的值具有显著差异。
具体实施方式
实施例1
菌株的分离、筛选和鉴定。
1、木霉菌的分离
40个土样采集于浙江省杭州市8个地点田块，这些田块受辣椒枯萎病病原菌严重侵染。取回后样品后保存于4℃冰箱。取1g土样溶于9ml无菌水中，配成系列土壤悬浮液，取1ml土壤悬浮液均匀涂布于木霉菌筛选培养基(TSM：0.2g MgSO4 7H2O；0.9g K2HPO4；3.0g葡萄糖；0.25g氯霉素；0.3g对二甲氨基苯二氮杂磺酸钠；0.2g五氯硝基苯；0.15g孟加拉红；20g琼脂；加水定容到1L)，在27±1℃培养4d，然后将培养基上长出的菌落转移到马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上进行单孢分离。为短期保存菌株，放到4℃冰箱。长期保存，放在-40℃的冰箱中(孢子+17％脱脂奶粉+硅胶颗粒)。
2、木霉菌的筛选
用对峙培养法测试分离菌株的拮抗能力，将土样中分离得到的木霉菌株在PDA培养基上培养三天后，从菌落边缘取直径5mm的菌饼放在直径9cm的PDA培养皿一侧，取辣椒疫霉菌饼放在培养皿另一侧，在25±1℃下培养。试验重复三次，7d后观察和纪录拮抗作用。拮抗效果的评价用1～5级分级标准：
①木霉菌完全生长在疫霉上，覆盖整个培养基表面；②至少三分之二的培养基上生长有木霉菌；③木霉菌和疫霉菌各占培养基的一半，两者都没有明显的生长优势；④每一种木霉菌和病原菌在培养基中都有近一半的定殖，而没有任何一种微生物在培养基的生长占优势；⑤病原体完全生长在木霉菌上，并在培养基的整个表面定殖。
筛选结果显示，依据拮抗活性，最后获得15株对辣椒疫霉具有显著拮抗作用的的菌株(图1)，它们被命名为HZA1、HZA2、HZA3、HZA4、HZA5、HZA6、HZA7、HZA8、HZA9、HZA10、HZA11、HZA12、HZA13、HZA14、HZA15。其中，分离系HZA14引起辣椒疫霉菌菌落塌陷和降解(图2)。
3、分离系的形态学观察
在20～25℃，12h光照、12h黑暗周期条件下(Jaklitsch，2009)。将分离的菌株培养于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，燕麦琼脂培养基(CMD)和合成低营养培养基(SNA)上。使用具有Axiocam CCD摄像头和Axiovision成像***的的蔡司显微镜(AxioVision SoftwareRelease 3.1.，v.3–2002；Carl Zeiss Vision Imaging Systems)观察与测量真菌的无性结构，如分生孢子梗、瓶梗、分生孢子和厚垣孢子等。通过形态学分类学特征比较***发育树上密切相关的分类单元。
在PDA和SNA培养基上生长的最适温度为27-30℃。在PDA上生长的菌落在96h内产生分生孢子，但大量的气生菌丝体没有同心环(图3a)；在CMD培养基上，非同心圆的气生菌丝体中富含黄色分生孢子(图3b)；在SNA培养基上，分生孢子上开始形成小孢子堆，在接种的菌饼周围有显著的同心圆(图3c)。在任何培养基上均未观察到扩散色素或检测到独特气味。在SNA上，分生孢子堆绿色到深绿色。分生孢子生产几乎是连续的，倾向于形成密集、絮状的孢子堆，孢子堆大小为1-2mm(图3d和3e)。通常在孢子堆中可见长的和完全可育的分支(图3f)。分生孢子梗具有一个可识别的主轴，沿主轴有可育分枝，或多或少地成对出现在较长或较短的节间(图3g)。较长的分枝出现在梗基附近，较短的分枝出现在顶端(图3h)；分枝重新分枝或直接产生瓶体(图3i)；有时，一个位置产生几个瓶体在一起成簇状(图3k)。瓶体大小为(9.76-)9.69-11.43(-11.92)×(2.54-)3.06-3.89(-4.36)μm，细长、直，中间稍微膨大。在某些情况下，瓶体倾向于及顶增殖形成新的瓶体(图3i和3j)。分生孢子大小(3.19-)3.34-3.91(-4.18)(平均长3.63μm)×(2.86-)3.07×3.48(-3.56)(平均宽3.28μm)μm，球形到近球形，偶尔椭圆形，光滑(图3l)。厚垣孢子大量产生在菌丝末端或内部，球状到近球形(图3m)。
实施例2
代谢产物抑菌活性检测。
将筛选纯化的15菌株用打孔器取直径5mm的菌饼加入含有100ml PDB培养基的三角瓶中，在ZWY-211B摇床中在27±1℃和150rpm震荡培养4d。先用灭菌的纱布将菌丝过滤和离心，获得含有代谢物的上清液。将所得上清稀释为50％和20％浓度，用孔径0.22μm的细菌过滤器过滤，将1ml 50％和25％的代谢产物溶液与10ml融化的PDA培养基一起倒入9cm培养皿中，然后接入直径5mm辣椒疫霉菌饼，在25℃条件下培养。用无代谢物的处理作对照，当对照处理的疫霉菌丝生长接近培养皿边缘时进行测量。
15株木霉代谢物对辣椒疫霉菌丝生长的抑制作用试验显示，来自不同分离系的代谢产物显示出不同水平的抑制活性(p<0.05)(表1)。绿木霉(T.virens)HZA14产生的代谢产物在稀释20或40倍后都完全抑制菌丝生长，显示出最高的抑制百分比(100％)。其次是T.afroharzianum HZA3，抑制率分别为44.85％(40倍)和78.96％(20倍)，橘绿木霉(T.citrinoviride)HZA9，抑制率分别为42.44％(40倍)和77.81％(20倍)，还有拟多萝西木霉(T.dorothopsis)HZA5、HZA8、HZA15，抑制率分别为34.67-39.59％(40倍)和70.92-71.33％(20倍)，拟康宁木霉(T.koningiopsis)HZA6，抑制率分别为37.29％(40倍)和72.18％(20倍)，抑制百分率最低的菌株为深绿木霉(T.atroviride)HZA1，HZA2和HZA13，棘孢木霉(T.asperellum)HZA10和哈茨木霉(T.harzianum)HZA11，其抑制率分别为0.62-1.59％(40倍)和5.18％-7.40％(20倍)。
表1 15株木霉分离株产生的代谢物对辣椒疫霉菌丝生长的抑制效果
Figure GDA0002675830430000061
a接种5d后辣椒疫霉菌丝在含有稀释培养液的PDA培养基上径向生长的百分比抑制率(％)，b将培养液稀释40倍或20倍，经LSD检验，列中值后的字母表示在p<0.05时显示差异显著。
实施例3
活性代谢物的纯化与鉴定。
1、活性代谢物的纯化与活性测试
基于抑制活性的结果，分离，纯化和鉴定由绿木霉HZA14产生的可能的活性化合物。将筛选的绿木霉HZA14接种到含有PDB的锥形瓶中，并在摇床中培养14d，用上述方法。获得2L培养液，并使用乙酸乙酯提取代谢物。用减压蒸发法获取代谢物残留物。通过硅胶柱色谱法(颗粒大小200-300目)纯化残留物，并通过制备型硅胶TLC(GF254)纯化获得A、B、C、D四个组份。用少量的A、B、C、D组份溶解在DMSO(二甲基亚砜)中用于生物活性测定。用1ml每个组份(100μg/ml)溶液加入10ml熔融PDA的培养皿中。将含有辣椒疫霉菌丝的菌饼(5mm)置于每个PDA平板的中心。在25℃培养4d后观察，通过平板上菌丝生长的多少来确定A、B、C、D四个组份中的生物活性。试验结果显示，组份C具有很高的抑制活性，而其余3个儿组份无活性。
2、活性代谢物的化学结构鉴定
为了鉴定C组份的化学结构，进一步对C组份进行纯化。用配有Shim-pack PrepODS柱(20×250mm)的Waters 600高效液相色谱(HPLC)进一步纯化C组分。用Waters2487Dualλ吸光度检测器在254nm监测洗脱液。通过用甲醇和蒸馏水(1：1V/V)的混合物进行等度洗脱，以6mL/min的流速获得活性级分峰的良好半制备分离。用VG Autospec-3000质谱仪(VG，Manchester，UK)和API QSTAR Pulsar 1(Applied Bio-systems，Foster City，USA)分析C组份。将纯化的C组份用甲醇(5mg/ml)溶解注入质谱仪。全扫描质谱结果如图4所示，离子峰(m/z 349)相应于胶霉菌素[M+Na]+钠加成分子量，主子离子峰(m/z 263)相应于去二硫的胶霉菌素[M-2S]+，正如原先通过电子轰击质谱研究结果(Bose et al.，1968；Grovel et al.，2002)。子离子的同位素分布也证实，其组成中缺少两个硫原子(Bose etal.，1968)。子离子峰(m/z 245)的产生是相关于分子量[M-2S-H2O]+(Grovel et al.，2002)，归属于离子峰m/z 28的子离子片(Svahn et al.，2012)。化学结构分析表明，C组份是已报道的胶霉菌素。
3、胶霉菌素活性测定
为了进一步测定胶霉菌素，将纯化的化合物溶解在DMSO中，得到不同的母液，将它们与熔融的V8汁培养基混合，制备终浓度为0.5、1.0、5.0、10.0和15.0μg/ml的平板。将含有辣椒疫霉菌丝的菌饼(5mm)置于每个V8培养基板的中心。每次处理重复五次。在25℃条件下培养4d后，当对照菌落接***板边缘时，测量菌落直径(图5)。
活性测试结果显示，0.5μg/ml的C组份在培养4d后有40％的菌丝生长抑制，1.0μg/ml的胶霉毒素在培养4d后有66％的菌丝生长抑制。而5.0μg/ml或更高浓度的胶霉毒素完全抑制菌丝生长(100％抑制)。
实施例4
筛选菌株在防治辣椒疫病上的应用。
1、木霉菌株孢子粉与病原接种体的制备
将筛选的绿木霉HZA14接种到装有用灭菌的麦粒制成的麦粒培养基中，在25℃温度条件，12h光/暗周期条件下培养15d左右，获得木霉孢子粉。
将含有辣椒疫霉菌丝的5个菌块放入装有10mL无菌水的的培养皿中，并将培养皿置于25℃、光照条件下培养3d，用于疫霉游动孢子囊的产生；然后，将培养好的游动孢子囊放入4℃冰箱中，使其释放游动孢子。用棉纱布过滤悬浮液除去菌丝和碎片，用血球计数板观察并制得浓度为2000游动孢子/mL的疫霉菌游动孢子悬浮液。
2、植物栽培和防治试验
辣椒种子用2％次氯酸钠溶液进行表明消毒，再用无菌水冲洗2—3次，将种子置于含有湿润灭菌滤纸的平板上，25℃条件下培养5-6d，等待种子萌发后，播种于含有营养土基质的穴盘中。其中，营养土基质是由泥炭：蛭石：田间营养土比例为2：1：1构成，穴盘大小为11×11×11cm。并将穴盘置于湿度为80-90％、温度为28-30℃的光生长培养箱中。当植物生长在6-8个叶阶段时，在幼苗根部周围浇灌10mL木霉孢子悬浮液(1g木霉孢子粉溶于10mL无菌水)。接种木霉孢子悬浮液一周后，每株植物接种2ml辣椒疫霉游动孢子悬浮液。用接种无菌水和病原菌处理为对照，每个处理重复3次。
3、防治效果评价
接种试验表明，筛选株系HZA14能够延缓辣椒疫病的发生，显著降低病害发病率和严重度。接种5d后，对照处理中少数幼苗的茎基部观察到褐色病斑。接种10d后，在对照处理中观察到叶子萎蔫的症状，但是在分离株系HZA14和游动孢子悬浮液共处理的辣椒植株中没有发现症状。然而，在接种12d后，在分离株系HZA14和游动孢子悬浮液共接种的辣椒植株的茎基部出现典型症状，14d后病斑明显扩展(图6a)。在此期间，对照植物严重枯萎和倒伏(图6b)。接种15d后，分离系HZA14和游动孢子悬浮液共接种的辣椒植物上的发病率和严重度分别为29.84±2.6％和14.18±0.6％，而对照处理的发病率和严重度分别为92.48±2.1％和88.38±2.9％(图6c)。显然，分离系绿木霉HZA14显著降低了辣椒疫霉的发病率(62.64％)和发病程度(64.2％)。
将本申请分离到的绿木霉HZA14命名为Trichoderma virens，株号HZA14，于2019年6月24号保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M 2019484。

Claims (7)

1.一种用于防治辣椒疫霉病的绿木霉（Trichoderma virens），其特征在于，分类命名为Trichoderma virens，株号HZA14，保藏号为CCTCC NO：M 2019484。
2.如权利要求1所述的绿木霉在抑制辣椒疫霉生长中的应用。
3.如权利要求1所述的绿木霉在防治辣椒疫霉病中的应用。
4.一种辣椒栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备如权利要求1所述绿木霉的木霉孢子悬浮液；
（2）在辣椒幼苗的根部浇灌步骤（1）中木霉孢子悬浮液。
5.如权利要求4所述的辣椒栽培方法，其特征在于，所述木霉孢子悬浮液的制备方法包括以下步骤：培养如权利要求1所述绿木霉获得木霉孢子粉，将木霉孢子粉分散在水中制备木霉孢子悬浮液，其中每10ml水中加入1g木霉孢子粉。
6.如权利要求5所述的辣椒栽培方法，其特征在于，步骤（2）浇灌时每株辣椒幼苗周围浇灌10ml木霉孢子悬浮液。
7.如权利要求4所述的辣椒栽培方法，其特征在于，步骤（2）浇灌时间为辣椒生长到6~8片叶阶段。
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