CN111019837B - 绿色木霉菌的新用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了绿色木霉菌的新用途，具体是其在防治作物黄萎病中的应用，所述的绿色木霉菌分类命名为绿木霉菌(Trichoderma virens)HZA14，保藏号为CCTCC NO:M2019484。本发明绿色木霉菌对大丽轮枝菌的菌丝有显著的拮抗效果和对对其微菌核有很高的降解活性，在盆栽实验中，其对茄子黄萎病的防治效果达到74.48％。

Description

绿色木霉菌的新用途
技术领域
本发明涉及生防菌技术领域，尤其涉及一种绿色木霉菌的新用途。
背景技术
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种植物病原菌，属于子囊菌门的真菌。可侵染38科660种植物，其中大田作物包括棉花、向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯等，引起的病害称为黄萎病。该病原菌主要通过越冬的微菌核作为初侵染源，侵染植物的根部，引起维管束变色、叶片坏死、植株萎蔫和死亡。该病害在我国茄子种植区普遍发生，常造成茄子减产，甚至绝收。侵染的病株根部通常产生大量微菌核，它们随着寄主组织完全腐烂，微菌核分散在土壤中，成为来年作物新的接种体。由于病原菌寄主范围广泛，且菌核可在土壤中长期存活，且具有积累效应，该病害成为生产上最难防治的病害之一。
许多研究表明，土壤中病原菌微菌核数量与病害发生程度密切相关，而减少土壤中的微菌核数量，是病害防治的关键。长期以来，农业生产中防治黄萎病主要以培育抗病品种和使用化学杀菌剂为主，但针对大丽轮枝菌的作物抗病性几乎没有获得完全抗病的品种。主要原因是大丽轮枝菌易变异，新培育的抗病品种很快丧失了抗病性。生产上主要依赖化学杀菌剂，而大量使用化学药剂对人类健康潜在的危害、对食品和环境的污染、对非靶标生物的影响以及导致病原菌抗药性的加速发展等问题已经引起社会的日益关注，减量使用化学农药是发展的必然趋势。随着随经济的发展和人类生活质量的提高，对农产品安全和农业的可持续发展越来越关注，这也促使了生物防治的发展。目前研究发现，许多细菌，如假单胞菌属的种(Pseudomonas spp.)、链霉菌属的种(Streptomyces spp.)和芽孢杆菌属的种(Bacillus spp.)以及多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)等被认为对大丽轮枝菌有显著的拮抗活性。然而，从细菌对病原菌的防治机制上看，这些细菌产生拮抗物质主要抑制病原菌菌丝生长和分生孢子萌发，而几乎不涉及病原菌的微菌核。因而，筛选出高效降解病原菌微菌核的生防菌，是有效防治作物黄萎病的关键。
木霉菌是目前为止研究最多的生防真菌，其分布很广，生存于多种生态环境中，尤其能在土壤生长繁殖和存活。木霉菌可在多种基质上生长，具有对一定逆境条件的忍耐能力，这些特点决定了木霉菌在植病生防中的重要地位。其作用机制包括竞争作用，重寄生作用，酶的溶菌作用和抗菌素类的产生。
发明内容
本发明提供了一种绿色木霉菌的新用途，用于防治作物黄萎病。
绿色木霉菌在防治作物黄萎病中的应用。
所述的绿色木霉菌命名为绿木霉(Trichoderma virens)HZA14，保藏号为CCTCCNO:M 2019484；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2019年6月24号。
该菌株的生物学特征为：菌落生长迅速，呈淡深蓝绿色，背面无色到浅黄色；分生孢子单孢，光滑，椭圆形，聚集呈绿色，大小为3.2～6.1×2.6～4.3μm，分生孢子梗通常轮生，呈金字塔形，轮间间隔较短；产孢体安瓶形到烧瓶形。通常有大量厚垣孢子产生。在PDA培养基中通常有色素黄色产生，但无明显气味。最适生长温度在25～30℃。
通过实验发现，本发明菌株对作物黄萎病的致病菌(大丽轮枝菌)具有拮抗作用，因此可以用于防治作物黄萎病。
进一步的，所述作物为棉花、向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草或马铃薯，更进一步的，所述作物为茄子。
本发明还提供了包含所述绿色木霉菌的生防菌剂，所述菌剂可以是粉剂、液体或颗粒型等剂型。
所述生防菌剂除包含一定数量的微生物外，还可以包含其它必要的辅料，如溶剂、赋形剂、粘合剂、稳定剂、偶联剂等。
在其中一个实施例中，所述生防菌剂为水剂。
在其中一个实施例中，所述水剂采用绿色木霉菌的分生孢子制成。
本发明提供了绿色木霉菌在制备防治作物黄萎病菌剂中的应用。
本发明提供了防治作物黄萎病的方法，包括：
在作物播种前，将所述绿色木霉菌接种于供种植作物的土壤中；
或，在作物生长期间，对所述作物灌根绿色木霉菌菌剂。
在其中一个实施例中，所述接种为将所述绿色木霉菌的分生孢子溶于水形成悬液，将所述悬液与土壤混合。
在其中一个实施例中，所述悬液浓度为107个分生孢子/mL。
本发明绿色木霉菌对大丽轮枝菌的菌丝和微菌核均有显著的拮抗效果，在盆栽实验中，其对茄子黄萎病的防治效果达到74.48％。
附图说明
图1为接种15d后各木霉菌株(HZA1-HZA15)(底部)对大丽轮枝菌菌丝(上部)在PDA上的拮抗效果，a.分离系HZA1；b.HZA2；c.HZA2；d.HZA4；e.HZA5；f.HZA6；g.HZA7；h.HZA8；i.HZA9；j.HZA10；k.HZA11；l.HZA12；m.HZA13；n.HZA14；o.HZA15。
图2为不同时间的木霉菌株系HZA14与大丽轮枝菌对峙培养结果，A-E为培养基正面，F-J为培养皿背面，A,F:3d；B,G：6d；C,H:9d；D,I：12d；E,J:15d。
图3为播种30d后绿木霉株系HZA14对茄子黄萎病防治效果，a.接种大丽轮枝菌微菌核+木霉孢子悬浮液，b.仅接种大丽轮枝菌微菌核的对照。
具体实施方式
本发明提供的绿色木霉菌的分离纯化及鉴定方法已经在中国专利文献CN110408547A中公开，关于其分离纯化及鉴定方法在本申请不再赘述。
实施例1不同木霉菌菌株对大丽轮枝菌菌丝和微菌核拮抗活性的比较
(1)供应菌株
本试验供试的16个菌株来自本浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所鉴定和保存的菌株，其中包括15个木霉菌株分别为：T.atroviride HZA1,T.atrovirideHZA2，T.afroharzianum HZA3，T.brevicompactum HZA4,T.dorothopsis HZA5,T.koningiopsis HZA6,T.brevicompactum HZA7,T.dorothopsis HZA8,T.citrinovirideHZA9，T.asperellum HZA10,T.harzianum HZA11,T.brevicompactum HZA12,T.atrovirideHZA13,T.virens HZA14,T.dorothopsis HZA15。1个分离于茄子黄萎病的病原菌株系H6，具有高侵染能力，属于大丽轮枝菌落叶型株系。保存在10％甘油溶液中，-20℃冰箱中保存。
采用对峙培养法测试木霉菌株的拮抗能力，将直径5mm菌饼的接种在含有PDA培养基的培养皿一边(离边缘1.5cm处)，另外一边接种测试木霉菌菌饼，培养基置于25℃下培养。每个木霉菌株处理重复三次。培养15天后观察是否有拮抗作用，拍照记录抑制率。
对峙培养结果显示，不同木霉株系对大丽轮枝菌的菌丝都有不同程度拮抗效果，但绿木霉菌株(Trichoderma virens)HZA14具有最显著的的生长抑制效果(表1)，达到73％。同时，菌株HZA14几乎完全降解了培养皿表面的黑色微菌核，而其余菌株效果不显著(图1)。
表1. 15株木霉株系对大丽轮枝菌的拮抗效果
Figure BDA0002298621750000041
Figure BDA0002298621750000051
-微菌核未降解；+微菌核被降解
实施例2绿木霉菌株HZA14对大丽轮枝菌微菌核拮降解活性的测定
为了进一步证实绿木霉菌株HZA14对大丽轮枝菌微菌核拮降解活性，将直径5mm菌饼的接种在含有PDA培养基的培养皿一边(离边缘1.5cm处)，另外一边接种测试木霉菌菌饼，正如上述描述。培养基置于25℃下培养，每个处理重复三次。每隔3d观察木霉菌降解微菌核的情况。
大丽轮枝菌降解微菌核试验结果表明(图2)，培养6d后，大丽轮枝菌开始降解微菌核，随着培养时间延长，降解程度显著，15d后，培养皿表面的微菌核几乎完全降解。进一步证实了绿木霉菌株HZA14对大丽轮枝菌微菌核具有高的降解活性。
实施例3温室盆栽防治茄子黄萎病试验
(1)接种体的制备
绿木霉菌株HZA14接种制备。将HZA14孢子接种到装有用灭菌的麦粒制成的麦粒培养基容器中，容器放置在25℃温度、12h光/暗周期条件下培养15-20d左右，培养基上产生大量木霉孢子粉。收集木霉孢子粉，将木霉孢子粉制备为107分生孢子/ml分生孢子悬浮液，用于土壤处理。
微菌核的制备。接种大丽轮枝菌株系H6的菌饼于覆盖玻璃纸膜的PDA培养皿中心，黑暗20℃条件下培养20d后，用刀片刮取黑色微菌核，置于无菌水中搅拌，4000rpm的转速离心5分钟，倒掉上清液(除去菌丝片段和分生孢子)。为了杀死菌丝体和分生孢子，加水后将试管置于47℃的水浴中5分钟，然后用血球计数板记录微菌核的浓度。
(2)栽培土壤的处理
用泥炭：蛭石：农场营养土比例为3：1：1的营养土作为栽培基质。依据所用的培基质的量，接种微菌核，使栽培基质的微菌核含量为大约20个/g。分装含有微菌核栽培基质到11×11×11cm的穴盘中，向每盆穴加入木霉分生孢子悬浮液10mL(浓度为107分生孢子/mL的)，搅拌混匀。仅接种10mL灭菌水的处理为对照。
(3)播种
茄子品种是杭茄2010，生产上广泛栽培的品种。种子用2％次氯酸钠溶液表面灭菌(1min)后，再用无菌水冲洗3次。灭菌后的种子播种于上述不同处理的栽培基质穴盘中，并将穴盘置于湿度为80-90％，温度为25-28℃的温室中培养。每种处理重复三次，每个处理重复30盆。出苗后，每天观察病害情况。在病害发生30d后统计病害的发病率和病害严重度。
病害严重度根据以下等级进行评估：0，无病叶；1，<10％；3，11–25％；5，26–50％，7，>50％；9，植物死亡。
病害严重度(％)＝Σ(级值×株数)/(最高级别×总株数)×100。
防治效果＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100
温室防治试验表明，在仅微菌核基质处理中，病害出现在22d后，而在微菌核+木霉孢子处理中，病害出现在25d后，显示株系HZA14延缓了茄子黄萎病的发生。播种30d后，仅微菌核基质处理中，病害发病率为75.43％，病害严重度为43.62％，而微菌核+木霉孢子处理中，病害发病率为27.38％，病害严重度为11.13％，防治效果达74.48％。
表2.绿木霉菌株HZA14茄子黄萎病的防治效果
Figure BDA0002298621750000061

Claims (6)

1.绿色木霉菌在防治作物黄萎病中的应用，其特征在于，所述的绿色木霉菌分类命名为绿木霉菌(Trichoderma virens)HZA14，保藏号为CCTCC NO:M2019484。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述作物为棉花、向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草或马铃薯。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述作物为茄子。
4.如权利要求1所述的绿色木霉菌在制备防治作物黄萎病菌剂中的应用。
5.防治作物黄萎病的方法，其特征在于，包括：
在作物播种前，将如权利要求1所述的绿色木霉菌接种于供种植作物的土壤中；所述接种为将所述绿色木霉菌的分生孢子溶于水形成悬液，将所述悬液与土壤混合；
或，在作物生长期间，对所述作物灌根由如权利要求1所述的绿色木霉菌制成的绿色木霉菌菌剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述悬液浓度为107个分生孢子/mL。
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