CN111471596B - 一种具有除草活性的双色平脐蠕孢菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有除草活性的双色平脐蠕孢菌及其应用。一种双色平脐蠕孢菌(Bipolaris bicolor(Mitra)Shoem)SYNJC‑2‑2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年9月2日，保藏号：CGMCC No.18160。根据作物安全性测试，该双色平脐蠕孢菌SYNJC‑2‑2在棉花、油菜、芝麻、烟草、蔬菜等作物田、茶园和中药园可安全使用，用于控制牛筋草、狗尾草、柔枝莠竹等禾本科杂草。这表明双色平脐蠕孢菌SYNJC‑2‑2具有开发为防除牛筋草等禾本科杂草的生物除草剂潜力。

Description

一种具有除草活性的双色平脐蠕孢菌及其应用
技术领域
本发明属于农业生物制剂领域，涉及一种具有除草活性的双色平脐蠕孢菌及其应用。
背景技术
我国是一个拥有着千年历史的农业大国，农业的发展关系着民生和国家的富强。但是农田杂草的肆意生长制约了现代农业的发展，降低了粮食的产量。我国土地辽阔，杂草种类繁多，其中农田杂草255种，造成严重危害的约有10种，而这10种危害性杂草中禾本科约占了40％。牛筋草、狗尾草、千金子、稗草、马唐、菵草等是我国农田危害严重的杂草，会与庄稼争夺阳光、水分和养分。常用的除草方法包括人工除草、化学除草、机械除草等。其中化学除草是目前最经济高效的除草方法，但化学除草剂的长期使用也带来了很多负面问题，包括环境污染、农药残留、杂草抗药等。随着经济的快速发展和人民生活水平的日益提高，人们更加注重绿色可持续发展的理念，因此研发生物除草剂防除杂草是一种极具潜力的新途径。目前国内尚无有效的生物除草剂来防除这些禾本科杂草，而该菌株具有防除此类危害性杂草的潜力，无疑将其开发为生物除草剂将会带来巨大的经济效益与社会价值。
牛筋草(学名：Eleusine indica(L.)Gaertn.)别名蟋蟀草、油葫芦草，主要分布于中国南北各省区及全世界温带和热带地区，是世界十大恶性杂草之一，危害棉花、豆类、薯类、蔬菜、果园、茶园等经济作物。其具有生长速度快、分蘖能力强、结实率高、耐寒耐贫瘠等特点。它的根系尤为发达，防除困难，常形成单优势种群落，严重危害了经济作物的正常生长。
根据生物除草剂的特性，有可能开发生物除草剂的微生物约30种，已商品化或即将商品化的有近20种，其中真菌类有开发潜力的种类主要集中在以下几个属，包括刺盘孢属 (Colletotrichum)、疫霉属(Phytophthora)、镰刀菌属(Fusarium)、交链孢菌属(Alternaria)、孢菌属(Cercospora)、疫霉属(Phytophthora)、柄锈菌属(Puccinia)、叶黑粉菌属(Entyloma)、壳单孢菌属(Ascochyta)、和核盘菌属(Sclerotinia)等。目前世界上运用真菌成功除草的案例有很多，包括1971年澳大利亚从欧洲引入锈菌(Pucciniachondrillina)防治麦田粉苞灯芭(Chondrilla juncea L.)；1979年我国新疆哈密质检站分离出列当镰刀菌(F. umorobanche)并将其制成生防菌剂“F798”，能够有效防除列当，且对其他经济作物无害； 1981在美国登记注册的Devine，运用棕榈疫霉(Phytophthorapalmivora Butl.)制剂进行土壤处理防除柑橘园莫伦藤位(Morreniaodorata Lindl.)，1992年Philom BioS公司商品化的一种长孢状刺盘孢锦葵专化型(Colletortri-chum gloeosporioides f.sp.Malvae)干粉剂可用来防治圆叶锦葵和苘麻。
目前国内平脐蠕孢属已有狗尾草平脐蠕孢、玉蜀黍平脐蠕和稷平脐蠕孢等与生物除草剂相关的专利，没有双色平脐蠕孢菌的申报，也没有将其应用于作物田、中药园和茶园等环境中防治禾本科杂草的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对烟草、棉花、芝麻、油菜、蔬菜等作物田以及茶园和中药园中的牛筋草、狗尾草、马唐、柔 枝莠竹、稗草和狼尾草等禾本科杂草，筛选出的具有绿色可持续、高效低成本且对农作物安全等特点，用于生物除草的双色平脐蠕孢菌株。
为达成以上目的，本发明公开了一种双色平脐蠕孢菌菌株、其筛选方法及其用途，采用的技术方案如下：
一种双色平脐蠕孢菌(Bipolaris bicolor)SYNJC-2-2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年9月2日，保藏号：CGMCC No.18160。
本发明所述的双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2在防除禾本科杂草中的应用；优选所述的双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2在防除农田、中药园以及茶园禾本科杂草中的应用；所述的农田为烟草田、油菜田、棉花田、蔬菜田；所述的禾本科杂草优选自狗尾草、牛筋草、柔 枝莠竹、狼尾草、披碱草、马唐、稗草、早熟禾中的任意一种或多种，进一步优选牛筋草、狗尾草和柔 枝莠竹中的任意一种或多种。
所述应用，进一步优选将所述SYNJC-2-2菌株的孢子悬浮液，喷洒于目标杂草上，或利用该菌株的菌丝体制成各类剂型，用于防除目标杂草；所述的SYNJC-2-2菌株的孢子悬浮液中孢子浓度大于104个/mL。
本发明所述的双色平脐蠕孢菌(Bipolaris bicolor)SYNJC-2-2在制备生物除草剂中的应用。
一种除草剂组合物，包含所述的双色平脐蠕孢菌(Bipolaris bicolor(Mitra)Shoem) SYNJC-2-2和农药学上可接受的助剂。
作为本发明的一种优选，所述的双色平脐蠕孢菌(Bipolaris bicolor)SYNJC-2-2选自 SYNJC-2-2培养物、培养得到的SYNJC-2-2活细胞、SYNJC-2-2培养物滤液或SYNJC-2-2细胞与所述的培养物滤液的组合物中的一种。
作为本发明的一种优选，所述助剂选自表面活性剂、稳定剂和载体中的一种或多种。
作为本发明的一种优选，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、菜籽油或卵磷脂中的一种或多种；所述稳定剂选自抗氧化剂或pH调节剂；所述抗氧化剂优选***胶、明胶等；所述pH调节剂优选碳酸钙、磷酸等；所述载体选自各种植物材料或矿石；所述的植物材料优选稻壳粉、麦麸、木锯屑、黑麦草粉、麦秸秆、玉米秸秆中的一种或多种；所述的矿石优选滑石粉、硅藻土或高岭土。
作为本发明的一种优选，所述的除草剂组合物制备为气雾剂、水剂、微乳剂、粉剂、微囊剂、悬浮剂、颗粒剂等剂型，优选加工成可喷洒使用的剂型。
本发明的除草组合物中，菌株SYNJC-2-2的分生孢子浓度及活性物质含量随剂型和使用方式调整，优选使用浓度大于5×104个/mL的孢子悬浮液。
本发明的除草组合物可与其它适合的菌株或化学除草剂联合使用，扩大杀草谱或降低化学除草剂的使用量。
本发明的主要优点和积极效果如下：
1、双色平脐蠕孢菌牛筋草专化型菌剂用于生物除草可以在作物与禾本科杂草间进行安全地选择。本发明的除草剂对环境友好，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。在供试的22科55种植物中，对双色平脐蠕孢菌很敏感的有5种，敏感的有4种，稍敏感的有2种，不敏感的有44种，其中有敏感性的植物大都集中在禾本科，对于其他科植物如菊科、旋花科、桑科、苋科、大戟科、蔷薇科、葡萄科、鸭跖草科、雨久花科、五加科、梧桐科、廖科茄科、胡麻科、十字花科等植物无敏感性。从形态上看，孢子主要侵染禾本科植物叶片，由于其叶片为平行脉且叶片较薄，孢子接触后容易产生附着胞等侵染结构并迅速扩散穿透叶片，而菊科、旋花科、大戟科、石竹科、玄参科等杂草叶片较宽，具有发达的网状脉侵染结构不易穿透，故而不易被侵染。
2、本发明用于生物除草，是利用活的生物本身，该生物是直接采集于自然环境，是目标作物田及环境中发生的目标杂草的天然致病菌，由于环境中已经存在，故在使用过程中没有生态风险，加之，该菌株专化性强，对作物及其它非目标植物安全性高，不会在环境中有残留危害，其菌体死亡后迅速腐化降解，降解产物均为可循环有机物，不会导致污染。因而，该菌株对环境安全，可用于绿色、有机农产品生产过程目标杂草的防治。
3、该菌株对目标杂草的防治效果可达到90％以上，尤其是苗期的植株防治效果更佳明显。
4、根据作物安全性测试，该双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2对玉米有较高敏感性，对大豆敏感，而在棉花、油菜、芝麻、烟草、蔬菜等作物田、茶园和中药园可安全使用。并能用于控制上述田间牛筋草、狗尾草、柔 枝莠竹等禾本科杂草。这再次表明双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2 具有开发为防除牛筋草等禾本科杂草的生物除草剂潜力。
附图说明
图1为SYNJC-2-2双色平脐蠕孢菌菌株菌落形态图；
图2为SYNJC-2-2双色平脐蠕孢菌菌株的分生孢子形态图；
图3为NJC-2-2双色平脐蠕孢菌菌株的凝胶电泳图，图3中1为ITS序列条带，2为GPDH序列条带。
生物材料保藏信息
SYNJC-2-2,分类命名为双色平脐蠕孢菌菌株Bipolaris bicolor，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年9月2日；保藏号：CGMCC No.18160。
具体实施方式
实施例1
本发明的新菌株是通过以下途径获得的，发明人对江苏、浙江、安徽等主要产茶区的茶园杂草发生情况进行记录，采集严重感病的杂草植株，记录植株发病症状等相关信息后带回实验室，利用植物病理学的实验技术对其寄生真菌进行分离研究，并严格按照柯赫式法则进行了致病性验证。
双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲 (Dothideomycetes)，格孢腔菌亚纲(Pleosporomycetidae)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科(Pleosporaceae)，平脐蠕孢属(Bipolaris)，双色平脐蠕孢菌(Bipolaris bicolor (Mitra)Shoem)在马铃薯葡萄糖培养基上生长较快，28℃黑暗条件下培养4天后，菌落直径为68～72mm，灰绿色，菌丝致密绒状，菌落边缘白色，菌落背面黄褐色。如图1所示为双色平脐蠕孢菌28℃下黑暗培养4天的菌落形态图。分生孢子梗单生或丛生，黑褐色，具分隔，产孢位点有疣状突起。分生孢子簇生于分生孢子梗顶端，直立或弯曲，圆柱状，中间略宽，两端钝圆，具5～8(多数6个)个假隔膜，大小45～80μm×10～15μm。分生孢子两端颜色较浅，隔膜加深。如图2为双色平脐蠕孢菌的分生孢子梗及分生孢子形态图。
首先双色平脐蠕孢菌菌株(Bipolaris bicolor)SYNJC-2-2自然条件侵染牛筋草的致病症状为牛筋草植株叶片上均可见大小不同的病斑，叶片黄化，植株枯萎，可见黑色点状病斑。
用剪刀剪取病叶的病健交界处组织块(约5mm×5mm)，用75％的酒精和2％的次氯酸钠溶液进行表面消毒，最后用无菌水冲洗干净，无菌滤纸洗净水分。将这些组织小块接种在PDA 培养基上，28℃黑暗培养，每隔12h观察一次，待组织块周围长出细小菌丝，用接种针挑取菌丝转接至新的PDA培养基，对分离得到的菌株进行单孢分离纯化培养。
用直径为5mm打孔器取菌落边缘直径为5mm的菌块置于保湿的牛筋草离体叶片上，于 28℃，12h/12h光暗交替的培养箱中培养四天。观察叶片受伤害程度，如叶片产生病害且症状与采集的病叶症状相似，则确定为牛筋草的致病菌株，保存于斜面培养基上，注入无菌的液体石蜡，置于4℃备用。
在光学显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗形态，同时显微照相测定分生孢子的大小。根据《中国真菌志》、《真菌鉴定手册》及相关文献描述的形态特征进行病原菌鉴定。经鉴定该菌株的描述与郭玉杰描述的中国农业微生物菌种保藏中心的菌株编号为ACCC38218的双色平脐蠕孢菌Bipolaris bicolor的描述基本一致，鉴定为双色平脐蠕孢菌Bipolarisbicolor (Mitra)Shoem。描述如下：菌落灰绿色，菌丝致密绒状，菌落边缘白色，菌落背面黄褐色。菌丝黄褐色，具隔膜。分生孢子梗单生或丛生，黑褐色，具分隔，产孢位点有疣状突起。分生孢子簇生于分生孢子梗顶端，直立或弯曲，圆柱状，中间略宽，两端钝圆，具5～8(多数6个) 个假隔膜，大小45～80μm×10～15μm。分生孢子两端颜色较浅，隔膜加深。
采用真菌gDNA提取试剂盒提取，分别利用rDNA ITS序列和GPDH序列进行PCR扩增，其通用引物分别为ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')如SEQ ID NO:3所示、ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')如SEQ ID NO:4所示和gpd1(5'-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3')如SEQ ID NO:5所示、gpd2(5'-GCCAAGCACTTGGTTGTGC-3')如SEQ ID NO:6所示。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳回收，连接至pMD19-T载体，转化大肠杆菌，经过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，摇菌，得到菌液。用菌液PCR扩增，经电泳和凝胶分析仪检测，1％的琼脂糖凝胶上显示单一的明亮条带，如图所示，图中1为ITS扩增序列，目的条带大小约为600bp，2 为GPDH扩增序列，目的条带大小约为650bp。将菌液委托上海生工公司进行测序，所测结果用DNAstar和BioXM编辑，剪切掉上游引物前端和下游引物末端的序列，将获得的完整ITS 序列或GPDH序列与Genbank中核酸数据库相关序列进行同源性比较。经扩增测序比对后，ITS 扩增序列与一模式菌株Bipolaris bicolor(MF490804.1)的同源性为99％，GPDH扩增序列与一模式菌株Bipolaris bicolor(MF490827.1)的同源性为99％，确定菌株为双色平脐蠕孢菌。 ITS扩增序列如SEQ ID NO:1所示，GPDH扩增序列如SEQ ID NO:2所示。
用双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2培养产生的孢子制成孢子悬浮液喷洒在牛筋草上的致病症状为：发病初期叶片上出现黑褐色斑点，发病中期叶片发病面积扩大，叶片发软，颜色加深，发病后期叶片萎缩枯死。从病叶部位重新分离病原菌，分离出的病原菌菌落及孢子形态与所喷施的双色平脐蠕孢菌株形态一致，符合柯赫氏法则。
以上条件下的发病症状与自然采集的病株发病症状相似。
本发明的双色平脐蠕孢菌菌株SYNJC-2-2分离自牛筋草，但它具有广谱的禾本科杂草致病力，同样它的另一个优点在于可以在作物和目标杂草之间做出安全选择，从这一点看，双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2具有与化学除草剂芳香苯氧丙酸类除草剂同样的专一性，且对环境安全。
按其形态特征可鉴定为子囊菌门(Ascomycota)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，格孢腔菌亚纲(Pleosporomycetidae)，格孢腔菌目(Pleosporales)，格孢腔菌科(Pleosporaceae)，平脐蠕孢属(Bipolaris)，双色平脐蠕孢菌(Bipolaris bicolor(Mitra)Shoem)。该专化型菌株主要侵染牛筋草、狗尾草、狼尾草、柔 枝莠竹、马唐和稗草等禾本科杂草，而对烟草、棉花、芝麻、油菜、蔬菜等主要经济作物高度免疫。在供试的22科55种植物中，对双色平脐蠕孢菌很敏感的有5种，敏感的有4种，轻微敏感的有2种，不敏感的有44种，其中有敏感性的植物大都集中在禾本科，对于其他科植物如菊科、旋花科、桑科、苋科、大戟科、蔷薇科、葡萄科、鸭跖草科、雨久花科、五加科、梧桐科、廖科、茄科、胡麻科、豆科、十字花科等植物不敏感。因此该菌株可用于烟草、油菜、芝麻、棉花、蔬菜作物田，以及茶园、果园、中药园用于控制杂草牛筋草、狗尾草、柔枝莠 竹、等禾本科杂草。
实施例2
本发明的双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2用于生物除草,具体的应用方法为将菌种接种于牛筋草汁液培养基，产生分生孢子后制成孢子悬浮液喷施于田间或杂草发生地，使用剂量为104～105个/mL。
其培养方法为：双色平脐蠕孢菌接种于牛筋草汁液培养基，在黑暗条件下28℃培养5天后置于黑光灯下诱导产孢约10天，菌株会产生大量孢子。
牛筋草汁液培养基(1L)
牛筋草叶片30g
琼脂20g
蒸馏水定容至1L
目前，国内外尚无有关双色平脐蠕孢菌应用于生物除草剂的报道，这方面的研究为防除牛筋草提供了一个新的优良的途径。本发明的除草组合物可以与其它适合的化学除草剂配合使用，从而降低化学除草剂的用量，减少对环境的污染。
根据需要，本发明的除草组合物可使用表面活性剂、稳定剂和载体等助剂，表面活性剂如吐温20、吐温80等，稳定剂可使用抗氧化剂或调节剂等，载体可采用植物材料或矿石等。植物材料，如麦麸、稻壳粉、黑麦草粉、小麦秸秆、稻秸秆和锯屑等。矿石，如高岭土、滑石粉、硅藻土等。
实施例3
将菌株SYNJC-2-2接种在牛筋草汁液培养基上，28℃黑暗培养5天后置于黑光灯下诱导产孢约10天，加入无菌水洗脱孢子，用一层擦镜纸过滤菌丝获得孢子悬浮液并用血球计数板计数，经梯度稀释调节孢子悬浮液的浓度为5×105个/mL，5×104个/mL、5×103个/mL、5×102个/mL、5×101个/mL五个浓度梯度，加入0.02％的吐温80。同时在无菌水中加入0.02％的吐温 80作为对照组。另外在直径为9cm的花盆中培养牛筋草幼苗，待其长至3～4叶期时，用手持喷雾器将上述孢子悬浮液或含0.02％吐温80的无菌水均匀喷洒在植株表面。每个处理组处理四盆长势一致的牛筋草幼苗，28℃保湿48h，处理一周后，孢子悬浮液浓度大于5×104个/mL 的处理组植株严重发病且完全死亡。
实施例4
将供试植物(见表1、2)种子播种于直径9cm的花盆中，设置4组重复，在温度为28℃的温室中培育，当供试植物达到3～4叶期时进行接种同实施例2，每种植物保留4盆，喷洒含0.02％吐温80的无菌水作为对照组。安全性试验结果表明，SYNJC-2-2菌株对玉米有较强的致病力，对大豆有致病性，对棉花、烟草、花生、蚕豆、芝麻、油菜、茄子、西红柿、茶树等均无致病性。杀草谱试验结果表明，SYNJC-2-2对牛筋草、柔 枝莠竹、狗尾草、狼尾草有强的致病性，对荩草、马唐、光头稗、黑麦草有一定的致病性，对加拿大一枝黄花、和紫茎泽兰、翅果菊、蒲公英、黄鹌菜、藿香蓟、小飞蓬、鬼针草、苍耳、鸭跖草、蛇莓、茅莓、野大豆、乌蔹莓、牵牛等无致病性。因此，SYNJC-2-2菌株可以应用于棉花、烟草、花生、芝麻、油菜等作物田、以及茶园和中药材田，防治马唐、稗草、披碱草、柔枝莠 竹、牛筋草、狗尾草等禾本科杂草。
表1 作物对菌株SYNJC-2-2Bipolaris bicolor的敏感性测试
Figure BDA0002407635000000081
注：表中所示均为同种植物在不同浓度下的病情指数，数值为平均值±标准差，小写字母为有显著差异(P<0.05)。
表2 杂草对菌株SYNJC-2-2Bipolaris bicolor的敏感性测试
Figure BDA0002407635000000082
Figure BDA0002407635000000091
注：表中所示均为同种植物在不同浓度下的病情指数，数值为平均值±标准差，小写字母为有显著差异(P<0.05)。

Claims (12)

1.一种双色平脐蠕孢菌（Bipolaris bicolor）SYNJC-2-2，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年9 月2 日，保藏号：CGMCC No. 18160。
2.权利要求1所述的双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2在防除禾本科杂草中的应用，所述的禾本科杂草为牛筋草、柔 枝莠竹、狗尾草、狼尾草、荩草、马唐、光头稗、黑麦草中的任意一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的双色平脐蠕孢菌SYNJC-2-2在防除农田、中药园以及茶园禾本科杂草中的应用；所述的农田为水稻田、烟草田、棉花田、花生田、豇豆田、芝麻田、油菜田、辣椒田、茄子田、西红柿田，所述的中药园为板蓝根种植园、金银花种植园。
4.根据权利要求2或3所述应用，其特征在于，将所述SYNJC-2-2菌株的孢子悬浮液，喷洒于目标杂草上，或利用该菌株的菌丝体制成各类剂型，用于防除目标杂草；所述的SYNJC-2-2菌株的孢子悬浮液中孢子浓度大于104个/mL。
5.权利要求1所述的双色平脐蠕孢菌（Bipolaris bicolor）SYNJC-2-2在制备生物除草剂中的应用。
6.一种除草剂组合物，其特征在于包含权利要求1所述的双色平脐蠕孢菌（Bipolarisbicolor）SYNJC-2-2和农药学上可接受的助剂。
7.根据权利要求6所述的除草剂组合物，其特征在于，所述的双色平脐蠕孢菌（Bipolaris bicolor）SYNJC-2-2选自SYNJC-2-2培养物、培养得到的SYNJC-2-2活细胞、SYNJC-2-2细胞与所述的培养物滤液的组合物中的一种。
8.根据权利要求6所述的除草剂组合物，其特征在于，所述助剂选自表面活性剂、稳定剂和载体中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的一种除草剂组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自吐温20、吐温80、菜籽油或卵磷脂中的一种或多种；所述稳定剂为抗氧化剂或pH调节剂；所述抗氧化剂优选明胶和***胶；所述载体选自各种植物材料或矿石。
10.根据权利要求9所述的一种除草剂组合物，其特征在于，所述pH调节剂优选碳酸钙和/或磷酸；所述的植物材料选自稻壳粉、麦麸、木锯屑、黑麦草粉、麦秸秆、玉米秸秆中的一种或多种；所述的矿石选自滑石粉、硅藻土或高岭土。
11.根据权利要求9所述的一种除草剂组合物，其特征在于，所述的除草剂组合物制备为气雾剂、水剂、微乳剂、粉剂、微囊剂、悬浮剂、颗粒剂。
12.根据权利要求11所述的一种除草剂组合物，其特征在于，所述的除草剂组合物制备为可喷洒使用的剂型。
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