CN116751715A - 一株多粘类芽孢杆菌及在植物病原菌防治领域的应用 - Google Patents

一株多粘类芽孢杆菌及在植物病原菌防治领域的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株多粘类芽孢杆菌及在植物病原菌防治领域的应用，属于生防微生物技术领域。目前针对山东莱芜地区的姜腐烂病缺乏有效的防控措施，针对该现状，本发明筛选得到了一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL‑B13008，该菌株能够合成5‑ALA，对阴沟肠杆菌、炭疽菌、链格孢、镰刀菌等多种属的菌株都具有良好的抑制效果，应用于包括姜腐烂病在内的作物疾病防治，具有良好的应用前景。

Description

一株多粘类芽孢杆菌及在植物病原菌防治领域的应用
技术领域
本发明属于生防微生物技术领域，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)NBL-B13008、所述菌株的菌剂及其在植物病原菌防治领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
姜是多年生草本植物，在我国多个地区均有种植，具有非常高的食用、药用以及经济价值。据统计，全球大姜每年的产量在10万吨左右，且80％源自中国。在我国，大姜主产区主要集中在中部、东南部至西南部，种植面积约占世界的43.2％，其中山东是最大的姜种植区。山东莱芜地区为姜的主产区，年产可达50万吨。
姜在种植过程中容易发生多种病虫害，其中以姜腐烂病发生最为严重，田间一般发病率为10％-20％，严重时可达50％以上。在莱芜姜种植区，发明人调查发现姜腐烂病发病率可达70％以上，造成了严重的经济损失。并且由于姜腐烂病难以防治，只能不断更换种植地。目前，生物防治是一种高效、无毒、绿色、经济的防治方案，然而目前应用于姜腐烂病的生防菌较少，且效果不明显。针对上述研究现状，发明人认为，明确山东莱芜地区的姜腐烂病的病原菌，提供精准的生防菌对于提高姜种植业经济效益具有重要意义。
发明内容
本发明从姜种植区采集病样，另外进行土样采集，通过病原菌分离、生防菌株分离，首先明确了导致山东莱芜地区的姜腐烂病的主要病原菌为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)。为了对山东莱芜地区的姜病原菌提供精准的生防菌，本发明针对阴沟肠杆菌的拮抗菌进行了筛选，筛选得到一株多粘类芽孢杆菌，命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008，对阴沟肠杆菌具有良好的抑制效果，可用于姜腐烂病的防控。进一步的，本发明针对菌株NBL-B13008的抗菌性能展开研究，研究表明所述菌株对不同属种的其他9种病原菌同样具有良好的抑制效果，该菌株作为生防菌有望实现多种农作物病害的防治效果。基于上述研究结论，本发明提供如下的技术方案：
第一方面，提供一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008，该菌株已于2023年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC M 2023751。
本发明通过打孔法筛选得到上述菌株，油镜下观察菌体形态，该菌株具有如下的形态学特征：
菌落特征：白色，表面光滑，无光泽，***，边缘不整齐，呈不规则形或近圆形，显微镜下观察产孢。菌体特征：杆状，革兰氏染色为阳性，产椭圆形芽孢。
第一方面所述多粘类芽孢杆菌NBL-B13008具有如SEQ ID NO:1所示的16SrDNA序列。
所述菌株NBL-B13008的生理生化特征如下：阳性项目：V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，柠檬酸，D-木糖，L-***糖，D-甘露糖，葡萄糖，蔗糖，络氨酸；阴性项目：丙酸盐，D-甘露糖，D-***糖，苯丙氨酸。
适宜培养条件为：35～38℃，玉米淀粉培养基，所述玉米淀粉培养基组成如下：玉米淀粉20～30g、豆粕13～17g、CaCO3 5～7g、(NH4)2SO4 4～6g、pH为7.6～7.5，加水定容至1L。
现有研究中不乏多粘类芽孢杆菌作为生防菌的相关报道，主要围绕多粘类芽孢杆菌对镰刀菌属、炭疽菌属等植物病原菌的抑制作用。本发明认为，目前报道的多粘类芽孢杆菌通常只能表现出对单一病原菌属，如炭疽菌属或镰刀菌属的抑制作用，能够实现对多种属病原菌同时具有防治作用的相关报道十分稀少。经验证，本发明提供的菌株NBL-B13008对阴沟肠杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌、芬芳镰刀菌等十种病原菌具有防治效果，上述病原菌包含了肠杆菌、炭疽菌、霉菌及镰刀菌属、链格孢属，各病原菌之间亲缘差异较大。另外，上述病原菌涵盖了作物种植过程中较为常见的致病菌种。
另外，本发明研究还证实，菌株NBL-B13008能够合成5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)，而5-ALA是四氢吡咯(四氢吡咯是构成血红素、细胞色素、维生素B12的物质)的前缀化合物，是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等必不可少的物质，是农业上常用于增加光和效能、促进转色的重要成分。因此，将菌株NBL-B13008应用于农作物种植具有可观的应用前景。
第二方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括第一方面所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008和/或菌的培养物。
优选的，第二方面所述菌剂剂型可以为液体菌剂、粉剂或颗粒剂；进一步的为水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
作为优选，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述农药学上可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
第三方面，提供第一方面所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008、第二方面所述菌剂在抑制植物病原菌方面的应用。
上述植物病原菌包括但不限于阴沟肠杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌或芬芳镰刀菌中的一种或几种。
所述抑制植物病原菌方面的应用，可行的应用方式至少包括以下方面：
(1)施用于阴沟肠杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌或芬芳镰刀菌感染的作物，从而预防、改善或消除作物的疾病状态；
(2)应用于制备阴沟肠杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌或芬芳镰刀菌抑制模型药剂；
(3)应用于制备农药制剂，所述农药制剂用于防治阴沟肠杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌或芬芳镰刀菌所引发的作物疾病。
第四方面，提供一种生防制剂，所述制剂中包括第一方面所述多粘类芽孢杆菌NBL-B13008，和/或第二方面所述菌剂。
所述生防制剂优选为液体菌剂，喷施于作物根部土壤使用。
优选的方案中，所述菌剂为多粘类芽孢杆菌NBL-B13008的发酵液。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述阴沟肠杆菌的显微镜照片；
图2为多粘类芽孢杆菌NBL-B13008形态图；
其中，图2A为多粘类芽孢杆菌NBL-B13008的菌落图；
图2B为多粘类芽孢杆菌NBL-B13008的菌体图；
图3为多粘类芽孢杆菌NBL-B13008的抑菌效果图；
图4为多粘类芽孢杆菌NBL-B13008对九种病原菌的抑制效果图；
其中，图4A为对茶黑斑病菌的抑制效果图；
图4B为对茶炭疽病菌的抑制效果图；
图4C为对层生镰刀菌的抑制效果图；
图4D为对芬芳镰刀菌的抑制效果图；
图4E为对葡萄炭疽病菌的抑制效果图；
图4F为对茶黑斑病菌的抑制效果图；
图4G为对尖孢镰刀菌的抑制效果图；
图4H为对黄瓜黑斑病菌的抑制效果图；
图4I为对黄瓜枯萎病菌的抑制效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：姜腐烂病病原菌的分离、筛选及鉴定
1.1实验材料
姜腐烂病样品；NA培养基；NA斜面；75％酒精；无菌水；等。
1.2实验方法
1.2.1病原菌的分离
选取莱芜地区采集的姜腐烂病样品，田间发病率可达70％，采用表面消毒法进行处理，用无菌水冲洗姜3遍，使用75％酒精消毒20s，然后用牙签挑取腐烂部分划线至NA培养基上，30℃过夜培养，挑取单菌落划线2-3次后，保存至NA斜面。
1.2.2病原菌的形态及分子鉴定
观察菌落在NA培养基上的形态，挑取斜面上保存的菌株制片，进行结晶紫染色，油镜下观察菌体形态，并且进行分子生物学鉴定。
1.2.3病原菌的柯赫氏法则验证
选取健康的姜块组织，切块后使用75％酒精进行消毒，将姜块放至铺有滤纸的培养皿中，使用接种环将病原菌接种到姜块上，封口后放至25℃培养箱，同时将健康的姜块作为对照，7d后观察病害发病症状，挑取发病姜块，进行病原菌分离、纯化、形态学与分子生物学鉴定。
另外，选取健康的姜盆栽，将病原菌进行摇菌，180rpm培养16h，以无菌水为对照，每株使用100ml，106菌液进行灌溉，7D后观察病害发病症状，挑取发病姜块，进行病原菌重新分离、纯化、形态学与分子生物学鉴定。
1.3实验结果
利用组织分离法在姜腐烂样品中共计获得了37株菌，经组织块及盆栽回接验证后发现其中12株菌处理后出现不同程度的致病状况，最终根据柯赫氏法则，确定山东莱芜地区姜腐烂病致病菌为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。
该菌株在显微镜下表现为圆形、无芽孢，单个排列(图1)。
1.4实验结论
本实验首次在山东莱芜地区发现引起姜腐烂病的病原菌为阴沟肠杆菌，由于之前的防治方法多以青枯雷尔氏菌为防治对象，所以可能导致防治效果不理想。因此将筛选阴沟肠杆菌的生防菌，用于防治姜腐烂病。
实施例2：姜腐烂病病原菌生防菌筛选、及性能评价
2.1实验材料
姜腐烂病病土及健康土；1.5％ NA培养基；NB培养基；生理盐水；甘油等。
2.2实验方法
2.2.1生防菌的筛选
土壤悬液的制备：取1g土壤放入带有玻璃珠的盛有99mL无菌生理盐水的三角瓶中，常温下振荡30min；从摇瓶中取0.5mL土壤悬液加入到盛有4.5mL无菌生理盐水的试管中，振荡混匀，依次在试管中稀释成10-3至10-7；从对应梯度的试管中取100μL悬液，用涂布器均匀的涂布NA培养基上，细菌37℃培养，放线菌、真菌30℃培养；
选择平板上的单菌落，在新平板上纯化，编号后，将细菌保存至NA斜面，放线菌保存至高氏斜面上。
2.2.2拮抗菌的筛选
采用打孔法筛选姜腐烂病拮抗菌。具体实验方法如下：对阴沟肠杆菌进行摇板计数，确定菌液摇菌16h后浓度为109，对其进行梯度稀释至106，取17.5ml菌液加入350ml NA培养基中，冷却后在NA培养基上使用打孔器打孔，每个平板放置6种菌液，每孔100μL，设置3个重复，以不加菌液的平板作为空白对照，培养一天后进行抑菌效果观察，筛选抑菌圈最大的菌株进行后续试验。
2.2.2拮抗菌的形态及分子鉴定
观察菌落在NA培养基上的形态，挑取斜面上保存的菌株制片，进行结晶紫染色，油镜下观察菌体形态，并且进行分子生物学鉴定。
2.2.3拮抗菌的抑菌性能鉴定
利用平板对峙法鉴定了该拮抗菌对其他9种病原菌的抑菌性能，具体方法为：将病原菌接种于平板的中心处，在病原菌与培养皿边缘的中心处接种生防菌，生防菌采用划线方法进行，长度为1cm，采用不接种生防菌的平板作为对照，25℃静置培养7d后观察试验结果，并计算抑菌率。
2.2.4拮抗菌的发酵条件探索
多粘类芽孢杆菌在实际生产中，发酵后活菌数较低，为解决这一问题，本实施例通过改进培养基条件以及调节温度等，提升活菌数。
本实施例尝试采用如下培养基进行培养：
培养基1：NB培养基(蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g、pH值7.2，加水定容至1L)，30℃；
培养基2：NB培养基(蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g、pH值7.2，加水定容至1L)，37℃；
培养基3：玉米淀粉培养基(玉米淀粉25g、豆粕15g、CaCO3 6g、(NH4)2SO4 5g、pH值7，加水定容至1L)，30℃；
培养基4：玉米淀粉培养基(玉米淀粉25g、豆粕15g、CaCO3 6g、(NH4)2SO45g、pH值7，加水定容至1L)，37℃。
根据发酵条件探索，对不同条件下的发酵液进行计数，结果如下：
表1
上述培养基中，以培养基4的效果最好。
2.2.5拮抗菌产5-ALA性能的测定
(1)标准曲线绘制
用5-ALA标准品配制0.25g/L 5-ALA母液，准确称取0.0125g 5-ALA标准品。用蒸馏水在容量瓶中定容至50ml，用母液配制浓度为10mg/L，20mg/L，30mg/L，40ml/L，50ml/L的5-ALA标准液，分析吸取2,4,6,8,10ml的5-ALA母液在容量瓶中定容至50ml，每1个浓度需要做3次重复。
在10ml具塞离心管中，2ml 5-ALA标准液+1ml乙酸盐缓冲液+0.5ml乙酰丙酮，沸水浴15min，自然冷却至室温，从离心管取出2ml反应液，加入2ml显色剂。显色反应30min，以水为空白对照，在554nm处测定吸光度OD554。
(2)5-ALA产量测定
菌种摇菌活化培养，取菌液离心12000rpm，10min取2ml上清液+1ml乙酸盐缓冲液+0.5ml乙酰丙酮，沸水浴15min，自然冷却。取2ml反应液+2ml显色剂，显色反应30min，以水为空白对照，在554nm处测定吸光度OD554。该多粘类芽孢杆菌NBL-B13008，可产5-ALA，摇菌3天后测定其含量为8.2mg/L。
2.3实验结果
2.3.1实验结果
本试验获得了一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008对阴沟肠杆菌的抑菌性能最好，共培养1d后，抑菌圈直径为23mm。
上述菌株NBL-B13008的菌落形态为：白色，表面光滑，无光泽，***，边缘不整齐，呈不规则形或近圆形，显微镜下观察产孢。
该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
根据测定，菌株NBL-B13008对多种病原菌具有抑菌性能，如灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌、芬芳镰刀菌等，NBL-B13008使用NB培养基37℃摇菌24h后，在PDA平板上进行抑菌实验，7d后观察抑菌效果，计算抑菌率如下表1所示。
表1
实施例3：多粘类芽孢杆菌对姜腐烂病防控效果盆栽实验
3.1实验材料
姜盆栽、多粘类芽孢杆菌NBL-B13008发酵液、阴沟肠杆菌菌液等。
3.2实验方法
将催好芽的健康姜用多粘类芽孢杆菌NBL-B13008发酵液浸种处理30min，实验组为玉米淀粉培养基发酵的菌株NBL-B13008，使用105,106,107三个梯度进行处理，每个处理组各10株，浸种后分别播种在无菌土中，播种后每盆灌根接种阴沟肠杆菌液50mL，7天后每盆再灌根接种相应的待测菌液50mL，对照组为无菌清水。30d后统计生姜植株的发病状况。发病情况分级：0级：叶片健康，无枯萎；1级：0％-25％的叶片出现枯萎；2级：25％-50％的叶片枯萎；3级：50％-75％的叶片枯萎；4级：75％-100％叶片枯萎。
病情指数＝∑(每处理的病级株数×病级值)/(总株数×发病最高级数)
防效(％)＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100
表2
表3
3.3实验结果
使用多粘类芽孢杆菌NBL-B13008发酵液的实验组病情指数相比于对照组降低，并且随着使用浓度增加，病情指数越低。
实施例4：多粘类芽孢杆菌对姜腐烂病防控效果大田实验
4.1实验材料
多粘类芽孢杆菌NBL-B13008发酵液(从保存的斜面接菌至NB培养基中，制备种子液50ml，接入20L发酵罐中发酵24h，活菌数为60亿。)、姜种植地。
4.2实验方法
选取山东莱芜梅官庄村姜种植地。实验用地共选择300m2，设置3个处理组，以未施用微生物菌剂的农田为对照组，其它管理方式均一致。在姜种植前、生长初期、生长中期各施用1次。处理组使用NBL-B13008菌株发酵液3L，稀释500倍冲施，三次。第一次处理后80天进行病害调查。发病情况分级参考实施案例3。
表4
4.3实验结果
实验结果表明，喷施生防菌后的姜发病率明显降低，证明多粘类芽孢杆菌对姜腐烂病有抑制作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008，该菌株已于2023年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，其生物保藏号为：CCTCC M 2023751。
2.如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008，其特征在于，所述菌株具有如下的形态学特征：
菌落特征：白色，表面光滑，无光泽，***，边缘不整齐，呈不规则形或近圆形，显微镜下观察产孢。菌体特征：杆状，革兰氏染色为阳性，产椭圆形芽孢。
3.如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌NBL-B13008具有如SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列。
4.如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008，其特征在于，所述菌株NBL-B13008的生理生化特征如下：阳性项目：V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，柠檬酸，D-木糖，L-***糖，D-甘露糖，葡萄糖，蔗糖，络氨酸；阴性项目：丙酸盐，D-甘露糖，D-***糖，苯丙氨酸。
所述菌株的适宜培养条件为：37℃，玉米淀粉培养基。
5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1-4任一项所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008和/或菌的培养物。
6.如权利要求5所述菌剂，其特征在于，所述菌剂剂型选自水悬浮剂、可分散油悬浮剂、可湿性粉剂或水分散颗粒剂。
7.如权利要求5所述菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括农药学上可接受的辅料，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
8.权利要求1-4任一项所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008、权利要求5-7任一项所述菌剂在抑制植物病原菌方面的应用，其特征在于，所述植物病原菌包括但不限于阴沟肠道杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌或芬芳镰刀菌中的一种或几种。
9.如权利要求8所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008、所述菌剂在抑制植物病原菌方面的应用，其特征在于，所述应用方式如下：
(1)施用于阴沟肠道杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌或芬芳镰刀菌感染的作物，从而预防、改善或消除作物的疾病状态；
(2)应用于制备阴沟肠道杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌或芬芳镰刀菌抑制模型药剂；
(3)应用于制备农药制剂，所述农药制剂用于防治阴沟肠道杆菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌、葡萄炭疽菌、茶链格孢、茶炭疽菌、黄瓜链格孢、黄瓜镰刀菌、层生镰刀菌或芬芳镰刀菌所引发的作物疾病。
10.一种生防制剂，所述制剂中权利要求1-4任一项所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)NBL-B13008、权利要求5-7任一项所述菌剂；所述生防制剂为液体菌剂，喷施于作物根部土壤使用；
或，所述菌剂为多粘类芽孢杆菌NBL-B13008的发酵液。
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