CN106290918A - 一种检测沙门氏菌抗体的elisa试剂盒 - Google Patents

一种检测沙门氏菌抗体的elisa试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒包括：包被有重组蛋白PagC的固相载体、酶标抗体、沙门氏菌阴性血清和阳性血清。本发明的检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒及方法，对沙门氏菌属内广泛适用，应用范围广，该试剂盒具有较高的特异性和重复性，且温度对反应板的影响较小，稳定性强，相比以多糖抗原为检测抗原的ELISA方法，本发明可最大限度降低假阳性出现率，避免肠杆菌科其他细菌抗原给检测带来的干扰。与现在临床中使用较多的玻板凝集抗原检测方法相比，本发明具有更高的灵敏度与准确性，同时极大的提高了检测的通量。

Description

一种检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒
一、技术领域
本发明涉及兽医学领域。具体而言，本发明涉及一种快速检测沙门氏菌(Salmonella)的ELISA快速检测试剂盒，以及使用该试剂盒进行检测的方法。
二、背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是一类重要的肠道致病菌，会导致动物的腹泻、肠炎、败血症及母畜流产，同时也会感染人，是导致人食物中毒最主要的病原，对畜禽养殖及公共卫生意义重大。沙门氏菌包含肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌2个种，以及7个亚种和2500多种血清型，我国已报道其中的292种血清型，绝大多数都具有致病性。种类繁多的血清型给沙门氏菌病的诊断带来很大难度。
ELISA检测方法敏感性高，特异性强，是目前血清学检测的热点之一。目前，沙门氏菌ELISA抗体检测方法所用的检测抗原仍然集中在O抗原和H抗原上。O抗原是沙门氏菌脂多糖(LPS)上的侧链多糖，具有种属特异性，但是由于O抗原的抗原表位复杂，在不同种属细菌之间存在一定的相似性，从而导致该方法存在部分的交叉反应。H抗原即沙门氏菌的鞭毛蛋白，包括特异性的第1相和非特异性的第2相，同样存在交叉反应问题。其第1相蛋白fliC的N端和C端在沙门氏菌属内是高度保守的，但是与属间其他细菌的同源性也可以达到85％以上，中间段的氨基酸序列随血清型的特异而特异。因此，现有的沙门氏菌抗体检测方法在效果上均不甚满意，挖掘新型诊断靶点、建立诊断技术对该病的防控很有必要。
PagC是沙门氏菌的外膜蛋白，除了在少部分人源血清型沙门氏菌中不存在外，广泛分布于各类猪源和禽源血清型沙门氏菌中，在属内的同源性可达到95％以上，属间与其他细菌的同源性在50％以下。PagC是一个跨膜通道蛋白，属于外膜蛋白中微孔蛋白的一种，全长185个氨基酸，呈β-桶装结构。pagC基因由phoP调控，具体功能尚不明确，但与细菌在巨噬细胞内的存活有关。已有报道PagC具有良好的免疫原性和反应原性，方便其抗体在血清中检出。因此，外膜蛋白PagC是检测动物源性沙门氏菌抗体的理想抗原。
基于上述考虑，本发明人通过大量实验，建立了检测动物源性沙门氏菌抗体的检测方法。以沙门氏菌的外膜蛋白pagC基因为目标，转化大肠杆菌内原核表达。并在此基础上进一步优化，开发出了沙门氏菌间接ELISA诊断试剂盒。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种检测沙门氏菌抗体的ELISA方法。该方法可快速诊断出沙门氏菌。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒包括：包被有重组蛋白PagC的固相载体、酶标抗体、沙门氏菌阴性血清和阳性血清。
所述重组蛋白PagC的制备方法为：
(1)以鼠伤寒沙门氏菌LT2株的基因组DNA为模板，设计一对特异性引物PagC1/PagC2进行扩增；
P1：5’-CCAGAATTCGATACTAACGCCTTTTCC-3’；
P2：5’-CAACTCGAGTCAGAAACGGTATCCAAC-3’；
(2)将PCR产物回收后用EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切片段***到质粒pET-28a的EcoR I和Xho I酶切位点之间构建原核表达质粒pET-28a-pagC；
(3)将构建的原核表达质粒pET-28a-pagC转化BL21表达菌获得重组表达菌，IPTG诱导其表达目的蛋白；
(4)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于PBS中，经超声破菌后离心取沉淀获得重组蛋白PagC包涵体；
(5)将得到的重组蛋白PagC包涵体采用His标签柱亲和层析、Superdex200increase10/300GL分子筛凝胶过滤层析的方法进行纯化，之后利用浓度梯度递减的尿素溶液进行复性，直至完全除去缓冲液中的尿素，得到重组蛋白PagC作为检测抗原。
所述的固相载体为酶标板，包被有重组蛋白PagC的酶标板的制备方法为：采用方阵滴定法，用包被液将上述方法制备的重组蛋白PagC稀释至终浓度为2μg/mL，加入酶标板各孔，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液洗涤后每孔加入封闭液于37℃封闭后，再用洗涤液洗涤得到包被有重组蛋白PagC的酶标板。
所述的酶标抗体为HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗；所述的沙门氏菌阴性血清和阳性血清用封闭液分别作1：50倍比稀释。
上述的试剂盒中还包括有：洗涤液、TMB显色液、反应终止液。
所述的包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为pH 7.4的PBST溶液；所述的封闭液为5％脱脂奶粉；所述的反应终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
一种检测沙门氏菌抗体的ELISA方法，包括以下步骤：以重组蛋白PagC作为检测抗原，采用方阵滴定法，用包被液将其稀释后，加入酶标板各孔，置于4℃包被过夜后用洗涤液洗涤后；每孔再加入封闭液于37℃封闭后用洗涤液洗涤；将用封闭液稀释后的沙门氏菌阴性血清和阳性血清分别加入各孔中，于37℃孵育后用洗涤液洗涤；将HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗加入到各孔中37℃孵育后用洗涤液洗涤；最后每孔加入TMB显色液，于37℃避光显色后，并向每孔加入反应终止液，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值；血清样品的OD450nm值≥0.328时判为阳性；OD450nm值≤0.281时判为阴性；0.328＞OD450nm值＞0.281时，判为可疑。
上述的检测沙门氏菌抗体的ELISA方法，其在于：
所述的包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为pH 7.4的PBST溶液；所述的封闭液为5％脱脂奶粉；所述的反应终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
所述检测抗原的包被浓度为0.5～16μg/mL，优选为2μg/mL；
所述沙门氏菌阴性血清和阳性血清的稀释度为1:50～1600，优选为1：50；
所述HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗的稀释倍数为1:5 000～1 000，优选为1：1 000；
将用封闭液稀释后的沙门氏菌阴性血清和阳性血清分别加入各孔中，于37℃孵育的时间为15～60min，优选为60min；
每孔再加入封闭液于37℃封闭的时间为2小时；
将HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗加入到各孔中37℃孵育的时间为15～60min，优选为60min。
上述的检测沙门氏菌抗体的ELISA方法，其在于所述重组蛋白PagC的制备方法为：
(1)以鼠伤寒沙门氏菌LT2株的基因组DNA为模板，设计一对特异性引物PagC1/PagC2进行扩增；
P1：5’-CCAGAATTCGATACTAACGCCTTTTCC-3’；
P2：5’-CAACTCGAGTCAGAAACGGTATCCAAC-3’；
(2)将PCR产物回收后用EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切片段***到质粒pET-28a的EcoR I和Xho I酶切位点之间构建原核表达质粒pET-28a-pagC；
(3)将构建的原核表达质粒pET-28a-pagC转化BL21表达菌获得重组表达菌，IPTG诱导其表达目的蛋白；
(4)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于PBS中，经超声破菌后离心取沉淀获得重组蛋白PagC包涵体；
(5)将得到的重组蛋白PagC包涵体采用His标签柱亲和层析、Superdex200increase10/300GL分子筛凝胶过滤层析的方法进行纯化，之后利用浓度梯度递减的尿素溶液进行复性，直至完全除去缓冲液中的尿素，得到重组蛋白PagC作为检测抗原。
本发明针对沙门氏菌的pagC基因的保守区片段设计了上下游引物，通过分子克隆技术将其连接到表达载体pET-28a上，并将重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中进行原核表达。获得大小为23KD的重组蛋白后，并采用亲和层析，凝胶过滤层析的方法将蛋白进行纯化，从而获得较纯的目的蛋白。
以纯化的重组蛋白PagC作为检测抗原建立间接ELISA方法，对该方法的各项反应条件进行了优化。首先，对于ELISA的最佳反应条件，本发明采用方阵滴定法来确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。经试验确定最适抗原包被浓度为2μg/mL，血清最佳稀释度为1：50。
其次是ELISA判定标准的确定：对20份沙门阴性血清进行间接ELISA检测，平均OD450nm值为0.187，标准差为0.047。根据试验结果，血清样品的OD450nm值≥0.328时判为阳性；OD450nm值≤0.281时判为阴性；0.328＞OD450nm值＞0.281时，判为可疑。
本发明的有益效果：
本发明的检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒及方法，对沙门氏菌属内广泛适用，应用范围广，该试剂盒具有较高的特异性和重复性，且温度对反应板的影响较小，稳定性强，相比以多糖抗原为检测抗原的ELISA方法，本发明可最大限度降低假阳性出现率，避免肠杆菌科其他细菌抗原给检测带来的干扰。与现在临床中使用较多的玻板凝集抗原检测方法相比，本发明具有更高的灵敏度与准确性，同时极大的提高了检测的通量。
四、具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。
实施例1：目的基因的原核表达
1.1目的基因pagC的扩增
根据鼠伤寒沙门氏菌LT2株(GenBank:AE006468.1)pagC的基因序列，去掉1-69bp的信号肽，设计一对针对pagC基因的克隆引物PagC1/PagC2，在引物的5’端分别含有限制性内切酶EcoR I和Xho I的酶切位点以及保护性碱基，引物用Primer Premier 5.0软件设计，并由北京鼎国昌盛生物公司合成，引物序列如下：
P1：5’-CCAGAATTCGATACTAACGCCTTTTCC-3’；
P2：5’-CAACTCGAGTCAGAAACGGTATCCAAC-3’。
以鼠伤寒沙门氏菌LT2株基因组为模板，经94℃预变性5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共进行32个循环；然后72℃延伸10min的PCR循环后，得到大小为489bp的目的基因条带。
1.2原核表达质粒的构建
将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切割目的条带，用DNA快速纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。将回收的PCR产物用EcoR I和Xho I进行双酶切，提取质粒pET-28a，进行双酶切。并将酶切后的产物用T4DNA连接酶进行连接。将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，通过PCR鉴定和双酶切鉴定，确定了原核表达质粒构建成功。
1.3目的蛋白的诱导表达
将含有pET-28a-pagC质粒的BL21表达菌1:50接种于4mL LB中(含1:1000稀释的卡那霉素抗性)，37℃振荡培养7h；再将1:50分别接种到4mL LB的试管和400mL LB的锥形瓶中(LB中含1:1000稀释的卡那霉素抗性)；4mL LB试管37℃振荡培养7h，作为未诱导的对照，400mL LB锥形瓶37℃振荡培养3h后，加入IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达，在37℃振荡继续培养4h；结束后各取出500μL新鲜菌液于新的2.0mL EP管中，13000r/min离心60s；去上清,加入40μL PBS重悬沉淀，用枪吹打均匀，加入10μL 5×蛋白Loading Buffer；100℃水浴10min，13000r/min离心5min，最后取10μL上清进行SDS-PAGE检测。
确认菌株表达蛋白后，取剩余的经IPTG诱导的菌液，离心后用PBS洗两遍，最后用20mL PBS重悬，并冰浴下进行超声破菌(200W、超声10s停5s，超声60min，每超声20min将菌液摇匀一次)。超声破碎完成后13000r/min离心20min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测以确定蛋白的表达形式。
1.4目的蛋白的纯化与复性
在确定了重组蛋白PagC以包涵体形式存在后，用包涵体洗涤液将沉淀洗两遍，并用包涵体Binding Buffer于4℃过夜溶解沉淀，离心取上清并用0.45μm滤器过滤。为了尽可能的纯化完全以排除大肠杆菌的干扰，对蛋白先后进行凝胶过滤和亲和层析两种纯化方式。首先对蛋白进行凝胶过滤，收集分子量大小在20KDa-40KDa左右的蛋白。由于重组蛋白PagC上有多聚组氨酸(6×His)的标签，故用Ni2+柱对重组蛋白接着进行亲和层析纯化。对Ni2+柱先用10倍体积的超纯水进行清洗，再用同体积的Binding Buffer进行平衡，将处理好的蛋白样品加入到平衡过的Ni2+柱中，用Binding Buffer处理后再用Elution Buffer将蛋白洗脱下来。通过SDS-PAGE检测确认纯化是否完全。
确认纯化完全的蛋白需要进一步作复性处理，此次采用透析袋梯度透析的方法除去尿素。将纯化好的蛋白加入预先处理好的透析袋中(透析袋经含有1mM EDTA的2％(m/V)NaHCO3溶液煮沸15min)，将透析袋依次放入含有8M尿素的PBS溶液、4M尿素的PBS溶液、2M尿素的PBS溶液、1M尿素的PBS溶液、0.75M尿素的PBS溶液、无尿素的PBS溶液中，每种溶液于4℃搅拌透析12h。最后收集透析袋中的溶液，并于-20℃保存。
实施例2：ELISA反应最佳条件的确立与诊断方法的建立
2.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
采用方阵滴定法，用包被液(pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将1.4最后收集的透析袋中溶液进行2倍比稀释，终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/mL，每孔加入100μL，每个稀释度重复两排，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液(pH 7.4的PBST溶液)洗涤5次，每次3min；每孔加入200μL封闭液(5％脱脂奶粉)于37℃封闭2h；用洗涤液洗涤5次，每次3min；将沙门氏菌阴性血清和阳性血清用封闭液分别作1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1 600倍比稀释，取100μL分别加入各孔中，于37℃孵育1h；用洗涤液洗涤5次，每次3min；将封闭液稀释的HRP标记山羊抗鸡IgG二抗(1：1 000稀释)加入到各孔中，每孔100μL，37℃孵育1h；用洗涤液洗涤5次，每次3min；最后每孔加入100μL的TMB显色液，于37℃避光显色15min，并向每孔加入50μL的反应终止液(2mol/L的H2SO4溶液)，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值(OD450nm)。选择阳性血清孔的OD450nm值在1.0左右，阴性血清孔的OD450nm值在0.1左右，且P/N值最大时的抗原浓度和血清稀释度作为最适抗原包被浓度和血清稀释度。
当重组蛋白PagC抗原包被浓度为2μg/mL，血清稀释度为1：50时，阳性血清OD450mm值接近1，阴性血清OD450mm值接近0.1，且P/N值最大。故确定最适抗原包被浓度为2μg/mL，血清最佳稀释度为1：50。
2.2封闭液的确定
按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃过夜且洗涤后，分别加入5组不同的封闭液：组1为1％的BSA、组2为2％的BSA、组3为1％的FBS、组4为5％的脱脂奶粉、组5为2％的明胶。封闭后用最适血清稀释度进行反应，洗涤后再加入HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗，最后加入TMB显色并加入终止液。读取OD450nm，比较各组的读值以及P/N值，选择P/N值最大时的封闭液最为最适封闭液。
经5％脱脂奶粉封闭后的ELISA板洗涤后无颗粒状沉淀物，且相比较P/N值最大，因此将5％脱脂奶粉其作为最佳封闭液。
2.3血清最佳反应时间的确定
按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清，按照37℃孵育时间不同分成4组：组1为15min、组2为30min、组3为45min、组4为60min。洗涤后再加入HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗，最后加入TMB显色并加入终止液。读取OD450nm，比较各组的读值以及P/N值，选择P/N值最大时的血清反应时间为最适血清反应时间。
当一抗血清在37℃作用60min时P/N值最高，因此确定待检血清最佳作用时间为60min。
2.4酶标二抗反应浓度及时间的确定
按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清作用最佳反应时间，按HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗的稀释倍数不同分成4组：组1为1:5 000、组2为1:3 000、组3为1:2 000、组4为1:1 000。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的OD450nm值和P/N值，选择P/N值最大时的稀释倍数作为酶标二抗的最佳反应浓度。
按照最佳抗原浓度包被酶标板，4℃包被过夜且洗涤后，加入最适封闭液封闭2h，分别加入经过最适稀释倍数稀释的阴性、阳性血清作用最佳反应时间，按HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗在37℃反应时间不同分为4组：组1为15min、组2为30min、组3为45min、组4为60min。保持其他条件不变，读取并比较各组阴阳性血清的OD450nm值和P/N值，选择P/N值最大时的反应时间作为酶标二抗的最佳反应时间。
当HRP标抗的羊抗鸡二抗的稀释度为1：1 000时，其P/N值最大，因此确定1：1 000为二抗最适稀释度。当HRP标抗的羊抗鸡二抗的反应时间为60min时，P/N值最大，因此确定当HRP标抗的羊抗鸡二抗的最佳反应时间为60min。
2.5ELISA操作程序
PagC-ELISA工作表格
实施例3：间接ELISA诊断试剂盒的适用性试验
选取了四种沙门氏菌属属内最常见血清型沙门氏菌的阳性血清，分别为鸡白痢沙门氏菌阳性血清、猪霍乱沙门氏菌阳性血清、鼠伤寒沙门氏菌阳性血清、肠炎沙门氏菌阳性血清，用建立好的方法进行ELISA检测，以确认该方法是否在沙门氏菌属内广泛适用。
结果显示：4种不同血清型沙门菌的阳性血清结果均判断为阳性，说明该方法对沙门氏菌属内广泛适用。
实施例4：间接ELISA诊断试剂盒的特异性试验
用建立好的方法分别检测大肠杆菌阳性血清、猪链球菌阳性血清、马链球菌兽疫亚种阳性血清等3种沙门氏菌属外常见细菌阳性血清，确定是否存在交叉反应，以检验ELISA方法的特异性。结果3种血清结果均判定为非阳性。采用人工感染鸡白痢沙门氏菌的方法制备得到鸡白痢沙门菌的阳性血清29份，
由此可知：该试剂盒具有较高的特异性。
实施例5：间接ELISA诊断试剂盒的重复性试验
5.1重复性试验
5.1.1批内可重复性试验
对同一批抗原包被的板子用建立的ELISA方法连续4天检测相同的4份随机血清样本，进行批内重复性检验，检测结果的变异系数在2.57％-5.89％之间。
5.1.1批间可重复性试验
取不同批次包被的板子在相同条件下用建立的ELISA方法检测另外4份随机血清样本，进行批间重复性检验，检测结果的变异系数在3.24％-9.07％之间。
由此可知：本试剂盒具有很好的重复性。
实施例6：间接ELISA诊断试剂盒的符合性试验
采用人工感染鸡白痢沙门氏菌的方法制备得到鸡白痢沙门菌阳性血清29份，从SPF鸡体内直接采血的方法得到鸡白痢沙门菌阴性血清31份。用建立的ELISA方法评价这批背景明确的沙门氏菌阴、阳性血清，结果除1份鸡白痢阳性血清ELISA结果判定为阴性外，其余59份样本结果均吻合，总体符合率为98.3％。
实施例7:间接ELISA诊断试剂盒的破坏性试验
7.1破坏性试验
7.1.1血清破坏性试验结果
将用作血清稀释液5％的脱脂乳分别在37℃和4℃放置3天进行比较，基本上没有什么区别。但将血清稀释液置于37℃和4℃分别5天时，可以看出前者明显比后者的OD值下降大约0.25左右。
由此可知：5％的脱脂乳在37℃下放置不能超过3天。
7.1.1反应板破坏性试验结果
将同样数目的反应板分别放置在37℃和4℃各3天，各5天的情况下，进行比较后，发现结果差异不显著。
由此可知：温度对反应板的影响较小。

Claims (10)

1.一种检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：包被有重组蛋白PagC的固相载体、酶标抗体、沙门氏菌阴性血清和阳性血清。
2.根据权利要求1所述的检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述重组蛋白PagC的制备方法为：
(1)以鼠伤寒沙门氏菌LT2株的基因组DNA为模板，设计一对特异性引物PagC1/PagC2进行扩增；
P1：5’-CCAGAATTCGATACTAACGCCTTTTCC-3’；
P2：5’-CAACTCGAGTCAGAAACGGTATCCAAC-3’；
(2)将PCR产物回收后用EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切片段***到质粒pET-28a的EcoR I和Xho I酶切位点之间构建原核表达质粒pET-28a-pagC；
(3)将构建的原核表达质粒pET-28a-pagC转化BL21表达菌获得重组表达菌，IPTG诱导其表达目的蛋白；
(4)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于PBS中，经超声破菌后离心取沉淀获得重组蛋白PagC包涵体；
(5)将得到的重组蛋白PagC包涵体采用His标签柱亲和层析、Superdex200increase10/300GL分子筛凝胶过滤层析的方法进行纯化，之后利用浓度梯度递减的尿素溶液进行复性，直至完全除去缓冲液中的尿素，得到重组蛋白PagC作为检测抗原。
3.根据权利要求1或2所述的检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的固相载体为酶标板，包被有重组蛋白PagC的酶标板的制备方法为：采用方阵滴定法，用包被液将权利要求2制备的重组蛋白PagC稀释至终浓度为2μg/mL，加入酶标板各孔，置于4℃包被过夜；然后用洗涤液洗涤后每孔加入封闭液于37℃封闭后，再用洗涤液洗涤得到包被有重组蛋白PagC的酶标板。
4.根据权利要求1所述的检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的酶标抗体为HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗；所述的沙门氏菌阴性血清和阳性血清用封闭液分别作1：50倍比稀释。
5.根据权利要求1所述的检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中还包括有：洗涤液、TMB显色液、反应终止液。
6.根据权利要求3～5中任一所述的检测沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为pH 7.4的PBST溶液；所述的封闭液为5％脱脂奶粉；所述的反应终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
7.一种检测沙门氏菌抗体的ELISA方法，其特征在于包括以下步骤：以重组蛋白PagC作为检测抗原，采用方阵滴定法，用包被液将其稀释后，加入酶标板各孔，置于4℃包被过夜后用洗涤液洗涤后；每孔再加入封闭液于37℃封闭后用洗涤液洗涤；将用封闭液稀释后的沙门氏菌阴性血清和阳性血清分别加入各孔中，于37℃孵育后用洗涤液洗涤；将HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗加入到各孔中37℃孵育后用洗涤液洗涤；最后每孔加入TMB显色液，于37℃避光显色后，并向每孔加入反应终止液，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值；血清样品的OD450nm值≥0.328时判为阳性；OD450nm值≤0.281时判为阴性；0.328＞OD450nm值＞0.281时，判为可疑。
8.根据权利要求7所述的检测沙门氏菌抗体的ELISA方法，其特征在于：
所述的包被液为pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为pH 7.4的PBST溶液；所述的封闭液为5％脱脂奶粉；所述的反应终止液为2mol/L的H2SO4溶液。
9.根据权利要求7所述的检测沙门氏菌抗体的ELISA方法，其特征在于：
所述检测抗原的包被浓度为0.5～16μg/mL，优选为2μg/mL；
所述沙门氏菌阴性血清和阳性血清的稀释度为1:50～1600，优选为1：50；
所述HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗的稀释倍数为1:5 000～1 000，优选为1：1 000；
将用封闭液稀释后的沙门氏菌阴性血清和阳性血清分别加入各孔中，于37℃孵育的时间为15～60min，优选为60min；
每孔再加入封闭液于37℃封闭的时间为2小时；
将HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗加入到各孔中37℃孵育的时间为15～60min，优选为60min。
10.根据权利要求7所述的检测沙门氏菌抗体的ELISA方法，其特征在于所述重组蛋白PagC的制备方法为：
(1)以鼠伤寒沙门氏菌LT2株的基因组DNA为模板，设计一对特异性引物PagC1/PagC2进行扩增；
P1：5’-CCAGAATTCGATACTAACGCCTTTTCC-3’；
P2：5’-CAACTCGAGTCAGAAACGGTATCCAAC-3’；
(2)将PCR产物回收后用EcoR I和Xho I进行双酶切，将酶切片段***到质粒pET-28a的EcoR I和Xho I酶切位点之间构建原核表达质粒pET-28a-pagC；
(3)将构建的原核表达质粒pET-28a-pagC转化BL21表达菌获得重组表达菌，IPTG诱导其表达目的蛋白；
(4)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于PBS中，经超声破菌后离心取沉淀获得重组蛋白PagC包涵体；
(5)将得到的重组蛋白PagC包涵体采用His标签柱亲和层析、Superdex200increase10/300GL分子筛凝胶过滤层析的方法进行纯化，之后利用浓度梯度递减的尿素溶液进行复性，直至完全除去缓冲液中的尿素，得到重组蛋白PagC作为检测抗原。
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