CN106701987A - 人叶酸代谢相关的三个snp位点基因分型的pcr扩增***和检测试剂盒 - Google Patents

人叶酸代谢相关的三个snp位点基因分型的pcr扩增***和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于人核酸体外检测技术领域，具体为人叶酸代谢相关的三个SNP位点基因分型的PCR扩增***和检测试剂盒。本发明首先设计包含三个SNP位点和三个样本分子标签位点的复合PCR扩增***，三个SNP位点采用等位基因特异性引物，三个分子标签位点采用长度多态性引物，并使这些引物相互兼容能够在同一PCR扩增体系内进行反应；检测试剂盒包括引物组合物容器、PCR反应母液容器、PCR辅助液容器；引物组合物容器包含引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.15组合物贮存液。本发明在免DNA提取情况下，通过一个PCR反应对三个SNP位点同时扩增分型，可显著节省成本、人力和时间，提高工作效率。

Description

人叶酸代谢相关的三个SNP位点基因分型的PCR扩增***和检 测试剂盒
技术领域
本发明属于人核酸体外检测技术领域，具体涉及人叶酸代谢相关的三个SNP位点基因分型的PCR扩增***和检测试剂盒。
背景技术
叶酸（folic acid）维生素B复合体之一，相当于蝶酰谷氨酸（pteroylglutamicacid，PGA），是米切尔（H．K．Mitchell，1941）从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸主要生物学功能是作为甲基供体参与细胞内的甲基化反应和脱氧核糖核酸的合成。叶酸不能被人体直接利用，必需通过一系列活化才能发挥其生理功能。叶酸代谢障碍导致机体叶酸水平的降低，血浆同型半胱氨酸(Hcy)浓度升高。在生育健康相关的危害上主要体现在新生儿出生缺陷。中国是世界上出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20%。
科学研究发现，叶酸利用能力与机体代谢过程中的酶活性相关，如果相应酶活性降低，将导致机体对叶酸的生物利用度下降，表现为相对叶酸摄入不足。研究发现叶酸代谢相关酶的SNP多态性会导致酶活性差异。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成还原酶（MTRR）是叶酸代谢***中的关键酶。rs1801133和rs1801131是MTHFR基因的两个重要多态性位点。rs1801133多态性引起MTHFR基因编码的蛋白质第222个氨基酸由Ala变为Val（此位点又称为MTHFR C677T），rs1801131多态性引起MTHFR基因编码的蛋白质第429个氨基酸由Glu变为Ala（此位点又称为MTHFR A1298C）。这两个多态性将导致MTHFR酶活性和热稳定性下降，使机体对叶酸的生物利用度降低，血浆同型半胱氨酸(Hcy)浓度升高，从而诱发多种疾病如出生缺陷、先天性流产、心脑血管疾病等。
MTRR基因上的rs1801394是近年来又一与叶酸代谢相关的研究热点。该多态性引起MTRR基因编码的蛋白第22个氨基酸由Ile变为Met（此位点又称为MTRR A66G）。该变化导致同型半胱氨酸血症向甲硫氨酸转化出现障碍，形成低甲硫氨酸血症。其水平降低会抑制DNA甲基转移酶活性和DNA甲基化，引起多种胎儿畸形，如唐氏综合征、神经管畸形和唇腭裂等。同时还可能导致同型半胱氨酸血症代谢出现障碍，进而出现高同型半胱氨酸血症，与胎儿畸形、习惯性流产、妊娠期高血压疾病等的发生密切相关。
检测叶酸代谢酶基因多态性，为叶酸代谢途径提供遗传学数据，指导叶酸个体化用药，具有重大的现实意义。早在2008年中国疾病预防控制中心妇幼保健中心就将叶酸代谢相关SNP基因分型检测与风险评估列为临床应用指南（参见《妇幼保健医疗临床遗传检测项目资料汇编》第六卷临床应用指南之二十一《叶酸利用能力》）。该指南为个体化增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供了更高水平的科学手段和临床依据。
传统叶酸代谢相关酶基因位点的检测方法包括直接测序、PCR-RFLP、PCR荧光探针法和芯片杂交法。这些方法都用于人EDTA抗凝全血中MTHFR基因C677T多态性位点基因型的定性检测，检测位点单一、而芯片杂交法所需费用昂贵，操作繁杂。目前已有多项研究表明MTHFR C677T(rs1801133)、MTHFR A1298C（rs1801131）、MTRR A66G（rs1801394）对叶酸代谢途径都有一定的影响。因此有必要建立一种较全面、高效能、快速、低成本的叶酸代谢相关酶基因多态性SNP分型筛查方法，以实现临床快速检测和规模化筛查。本发明利用复合PCR扩增体系联合毛细管电泳法直接检测人干血滤纸片，在一个反应管中可以同时对三个SNP和三个样本分子标签位点进行检测，最终得到基因分型结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、效率高的能够同时对人叶酸代谢相关的三个SNP位点基因分型的复合PCR扩增***，以及检测试剂盒。
本发明提供的对用于人叶酸代谢相关的三个SNP位点基因分型的复合PCR扩增***，所述三个SNP位点分别为：MTHFR基因上的rs1801133、MTHFR基因上的rs1801131和MTRR基因上的rs1801394。为避免同批次实验中待检样本的混淆，在该复合PCR扩增***中同时加入三个样本分子标签位点，所述三个标签位点分别为用于性别判断的Amelogenin基因和1号染色体上两个高度多态性的SNP位点（rs57863450与rs35134728）。该复合PCR扩增体系可将上述6个基因位点可在同一PCR扩增体系相互兼容，同时扩增。6个基因位点相应的PCR扩增引物及其荧光标记如下：
第一个位点rs1801133：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3；FAM荧光素标记SEQ ID No.3；
第二个位点rs1801131：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6；FAM荧光素标记SEQ ID No.6；
第三个位点rs1801394：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9；FAM荧光素标记SEQ ID No.9；
第四个位点Amelogenin：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.10、SEQID No.11；FAM荧光素标记SEQ ID No.11；
第五个位点rs57863450：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.12、SEQID No.13；FAM荧光素标记SEQ ID No.12；
第六个位点rs35134728：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.14、SEQID No.15；FAM荧光素标记SEQ ID No.14。
上述6个基因位点的复合PCR扩增引物及荧光素修饰特征列见表1。
表1. 6个位点15条个PCR扩增引物与荧光素标记特征
。
本发明所述的PCR扩增***中，SNP分型PCR扩增产物长度相互不重叠。调整各PCR引物工作浓度，使之在50〜300nmol/L之间，同一组内纯合子间或杂合子间片段峰高相差在40%以内。
本发明所述的PCR扩增***中，引物组合物由SEQ ID No.1-SEQ ID No15所示寡核苷酸序列的PCR引物的干粉或溶液组成。
本发明还涉及人叶酸代谢相关的三个SNP位点的基因分型方法，即使用所述的复合PCR扩增***检测人干血滤纸片。
具体地，本发明采用一种特别的PCR辅助液，使上述复合PCR体系能够以干血滤纸片为检测底物，实现上述6个基因位点在免DNA提取的情况下进行基因分型。
本发明提供的人类叶酸代谢相关三个SNP位点的免DNA提取基因分型检测试剂盒，其包含引物组合物容器、PCR反应母液容器、PCR辅助液；其中：
所述引物组合物容器包含引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.15组合物贮存液，贮存液浓度为相应工作浓度的2~10倍；
所述PCR反应母液容器内有进行PCR反应的2~5倍反应浓度的PCR反应母液，PCR反应母液包含DNA聚合酶(0.5~5μ)、镁离子(1~5mmol/L)、dNTP(40～400μmol/L)及Tris-HCl缓冲液（20~100mmol/L）。
所述PCR辅助液容器内有可使所述PCR以干血滤纸片为扩增模板进行相应位点基因分型的缓冲体系，该缓冲体系以PBS为基液，包含甜菜碱(浓度为1~2M)、(NH4)2SO4(浓度为10~30mM)以及DMSO(浓度为2%~8%)。
本发明检测试剂盒的使用方法，具体如下：
（1）多重PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：
2×PCR反应母液 10μL
PCR辅助液 2μL
引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.15组合物 2μL
人干血滤纸片1.0×1.0mm /
ddH2O 补足到20μL
（2）PCR反应在普通PCR仪进行，PCR反应条件如下：95℃10分钟启动后，95℃ 30秒、60℃30秒、72℃ 30秒，共28个循环，然后60℃保温40分钟，然后4℃保温；
（3）PCR产物取1μL，按常规操作在遗传分析仪上进行毛细管电泳，得到每一个位点的基因分型图谱。
本发明的有益效果：
依据本发明，实现了一次PCR反应同时完成所述三个叶酸代谢相关SNP分型检测，并且，本发明所提供的检测***包含样本分子标签位点，可有效规避同批次检测中潜在的样本混淆问题，并确保上述6个基因位点在1个反应中各位点扩增均衡，分型图谱良好。同时，依据本发明所提供的检测***，实现了对人干血滤纸片的直接检测，而无需对血样本中的人基因组DNA进行提取，大大节省成本、人力和时间，显著提高了工作效率。
附图说明
图1为本发明试剂盒典型扩增图谱。其中，M98(MTHFR A1298C)、M67(MTHFR C677T)、M66(MTRR A66G)均为杂合型。
图2为本发明试剂盒rs1801131(MTHFR A1298C)突变纯合型样本扩增图谱。其中，M98(MTHFR A1298C)为CC型，M67(MTHFR C677T)为CC型，M66(MTRR A66G)为AG型。
图3本发明试剂盒rs1801133(MTHFR C677) 突变纯合型样本扩增图谱。其中。M98(MTHFR A1298C)为AA型，M67(MTHFR C677T)为TT型，M66(MTRR A66G)为AG型。
图4本发明试剂盒rs1801394(MTRR A66G) 野生纯合型样本扩增图谱。其中， M98(MTHFR A1298C)为AA型，M67(MTHFR C677T)为CT型，M66(MTRR A66G)为AA型。
图5本发明试剂盒rs1801394(MTRR A66G) 突变纯合型样本扩增图谱。其中， M98(MTHFR A1298C)为AA型，M67(MTHFR C677T)为CC型，M66(MTRR A66G)为GG型。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面以人干血滤纸片样本对人叶酸代谢相关三个SNP的免提取基因分型试剂盒的具体实施例作进一步说明。应理解，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。
在本实施例中扩增反应在ABI 9700 热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper ID v3.2 软件。所使用其它试剂和材料如内标、POP7、毛细管电泳缓冲液、Hi-Di均为本领域技术人员常用的常规材料。
：人血干滤纸片制备：
准备3.0×4.0cm的常规滤纸，取外周血2-3滴滴于滤纸中央，晾干，剪取1.0×1.0mm大小干血滤纸片备检。
：PCR体系配制
按以下体系配制PCR反应体系（总反应体系为20μL）：
2×PCR反应母液 10Μl
PCR辅助液 2μL
引物组合物 2μL
人干血滤纸片1.0×1.0mm /
ddH2O 补足到20μL
在试剂盒中取出引物组合物容器、PCR反应母液容器。按总反应数乘以上述反应体系中单个反应需要量分别计算出所需要的PCR反应母液量、引物组合物量、PCR辅助液量和ddH2O量，在一个1.5mL EP管中将上述试剂混均匀，在按每个PCR反应管19μL进行分装、编号，然后按样本编号分别加入样本DNA模板1μL，并再次混匀。
：PCR反应
采用ABI 9700 PCR仪进行PCR反应。
PCR条件如下：95℃10分钟启动后，95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒，共28个循环，然后60℃保温40分钟，然后4℃保温。
：毛细管电泳分型检测
（1）取(1μL内标+10μL Hi-Di)×(样品数+1)配成混合液，混合后按每管10μL分装在96孔板板孔中；
（2）取1μL PCR产物按样本编号加入相应的96孔板板孔中；
（3）样品95℃变性4 分钟，然后迅速冰上冷却4 分钟；
（4）将样品放入基因分析仪的样品托盘中，按常规参数进行毛细管电泳（参见遗传分析仪厂商操作说明书）；
（5）毛细管电泳结束，用GeneMapper 软件分析实验数据得到分型图谱。
具体参见图1-图5所示。
图1为本发明试剂盒典型扩增图谱。以扩增片段从小到大顺序（图谱显示从左到右），第一个位点（AMEL）显示为双峰，指示为男性样本；第二个位点（M98，即MTHFR A1298C）显示为杂合型（双峰），短片段为野生型等位基因，长片段为突变型等位基因；第三个位点（M67，即MTHFR C677T）显示为杂合型（双峰），短片段为野生型等位基因，长片段为突变型等位基因；第四个位点(MID01，即样本标签位点rs57863450)显示为杂合型（双峰）；第五个位点（M66，即MTRR A66G）显示为杂合型（双峰），短片段为野生型等位基因，长片段为突变型等位基因；第六个位点(MID02，即样本标签位点rs35134728)显示为杂合型（双峰）。
图2为本发明试剂盒rs1801131(MTHFR A1298C)突变纯合型样本扩增图谱。第一个位点（AMEL）显示为双峰，指示为男性样本；第二个位点（M98，即MTHFR A1298C）仅有长片段等位基因，即为突变纯合型（CC型）；第三个位点（M67，即MTHFR C677T）仅有短片段等位基因，即为野生纯合型（CC型）；第四个位点(MID01，即样本标签位点rs57863450)显示为长等位基因纯合型；第五个位点（M66，即MTRR A66G）显示为杂合型（双峰），短片段为野生型等位基因，长片段为突变型等位基因；第六个位点(MID02，即样本标签位点rs35134728)显示为短等位基因纯合型。
图3为本发明试剂盒rs1801133（MTHFR C677T）突变纯合型样本扩增图谱。第一个位点（AMEL）显示为短等位基因单峰，指示为女性样本；第二个位点（M98，即MTHFR A1298C）仅有短片段等位基因，即为野生纯合型（AA型）；第三个位点（M67，即MTHFR C677T）仅有长片段等位基因，即为突变纯合型（TT型）；第四个位点(MID01，即样本标签位点rs57863450)显示为短等位基因纯合型；第五个位点（M66，即MTRR A66G）显示为杂合型（双峰），短片段为野生型等位基因，长片段为突变型等位基因；第六个位点(MID02，即样本标签位点rs35134728)显示为长等位基因纯合型。
图4为本发明试剂盒rs1801394(MTRR A66G)野生纯合型样本扩增图谱。第一个位点（AMEL）显示为双峰型，指示为男性样本；第二个位点（M98，即MTHFR A1298C）仅有短片段等位基因，即为野生纯合型（AA型）；第三个位点（M67，即MTHFR C677T）显示为杂合型（双峰），短片段为野生型等位基因，长片段为突变型等位基因；第四个位点(MID01，即样本标签位点rs57863450)显示为短等位基因纯合型；第五个位点（M66，即MTRR A66G）仅有短片段等位基因，即为野生纯合型（AA型）；第六个位点(MID02，即样本标签位点rs35134728)显示为长等位基因纯合型。
图5为本发明试剂盒rs1801394(MTRR A66G) 突变纯合型样本扩增图谱。第一个位点（AMEL）显示为双峰型，指示为男性样本；第二个位点（M98，即MTHFR A1298C）仅有短片段等位基因，即为野生纯合型（AA型）；第三个位点（M67，即MTHFR C677T）仅有短片段等位基因，即为野生纯合型(CC型)；第四个位点(MID01，即样本标签位点rs57863450)显示为短等位基因纯合型；第五个位点（M66，即MTRR A66G）仅有长片段等位基因，即为突变纯合型（GG型）；第六个位点(MID02，即样本标签位点rs35134728)显示为长等位基因纯合型。
备注：Amel为性别判断位点Amelogenin；M98为rs1801131(MTHFR A1298C)；M67为rs1801133 (MTHFR C677T)；MID01为1号染色体上的rs57863450；M66为rs1801394(MTRRA66G) ；MID02为1号染色体上的rs35134728。
：数据分析
在200例无关个体人群中（男性100例，女性100例），各位点检出的基因型分布表如下。
表2. 200例无关个体人群中不同基因位点基因型检出率（%）
。
表3. 200例无关个体人群中2个样本标签位点各基因型检出率（%）
。
本发明所提出的人叶酸代谢相关三个SNP的免提取基因分型试剂盒可在具有PCR仪以及遗传分析的实验室稳定实施，检测时间为2~3小时。同时，本发明所提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构、专业医疗机构用于检测，具备产业化以及推广应用的条件。
本发明已参照其特定的实施例作了描述。对于本领域技术人员而言，依据前面的描述，可能对本发明做各种修改或变换，包括（但不仅限于）：改变不同组别的荧光素标记，改变荧光素标记的引物（如由标记上游引物改变为标记下游引物），依据各SNP分型等扩增片段范围改变检测的分组排布，依据其它的PCR反应母液对PCR扩增条件、引物反应浓度进行优化，以及改变所推荐的反应体系等。很显然，上述修改或变换对于本领域技术人员而言都是可能的，但这些修改和变换并不背离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 上海五色石医学研究股份有限公司
<120> 人叶酸代谢相关的三个SNP位点基因分型的PCR扩增***和检测试剂盒
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(26)
<223> rs1801394位点下游引物，5’端FAM荧光素标记
<400> 9
GGTGGTATTA GTGTCCTTTT GTTTCA 26
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> Amelogenin位点上游引物
<400> 10
CCCTGGGCTC TGTAAAGAAT AGTG 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(24)
<223> Amelogenin位点下游引物，5’端FAM荧光素标记
<400> 11
ATCAGAGCTT AAACTGGGAA GCTG 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> rs57863450位点上游引物，5’端FAM荧光素标记
<400> 12
TCAGAGCAAA TACCCTCTTC AGG 23
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(25)
<223> rs57863450位点下游引物
<400> 13
AAGTTCATGT GCCTTTTGTG TACTA 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(22)
<223> rs35134728位点上游引物，5’端FAM荧光素标记
<400> 14
ATTGTTGGAA TGTCTTCAGC CA 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(18)
<223> rs35134728位点下游引物
<400> 15
CGGGAGGCAC CAGCTCTG 18

Claims (6)

1.一种人叶酸代谢相关的三个SNP位点基因分型的PCR扩增***，其特征在于，所述三个SNP位点分别为：rs1801133、rs1801131、rs1801394；同时包含三个样本分子标签位点：Amelogenin、rs57863450、rs35134728；上述6个基因位点在同一PCR扩增体系相互兼容，同时扩增；6个基因位点相应的PCR扩增引物及其荧光标记如下：
第一个位点rs1801133：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3；FAM荧光素标记SEQ ID No.3；
第二个位点rs1801131：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6；FAM荧光素标记SEQ ID No.6；
第三个位点rs1801394：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9；FAM荧光素标记SEQ ID No.9；
第四个位点Amelogenin：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.10、SEQID No.11；FAM荧光素标记SEQ ID No.11；
第五个位点rs57863450：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.12、SEQID No.13；FAM荧光素标记SEQ ID No.12；
第六个位点rs35134728：相应的PCR扩增引物寡核苷酸序列依次为SEQ ID No.14、SEQID No.15；FAM荧光素标记SEQ ID No.14。
2.如权利要求1所述的PCR扩增***，其特征在于，SEQ ID No.1-SEQ ID No.15所示寡核苷酸PCR扩增引物的工作浓度为50〜300nmol/L。
3.如权利要求1所述的PCR扩增***，其特征在于，引物组合物由SEQ ID No.1-SEQ IDNo15所示寡核苷酸序列的PCR引物的干粉或溶液组成。
4.一种人叶酸代谢相关的三个SNP位点的基因分型方法，其特征在于使用权利要求1-3之一所述的复合PCR扩增***检测人干血滤纸片。
5.一种人叶酸代谢相关的三个SNP位点基因分型检测试剂盒，所述三个SNP位点分别为：rs1801133、rs1801131、rs1801394；同时包含三个样本分子标签位点：Amelogenin、rs57863450、rs35134728；其特征在于，包含引物组合物容器、PCR反应母液容器、PCR辅助液；其中：
所述引物组合物容器包含引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.15组合物贮存液，贮存液浓度为相应工作浓度的2~10倍；这里，SEQ ID No.1-SEQ ID No.15所示寡核苷酸PCR扩增引物的工作浓度为50〜300nmol/L；
所述PCR反应母液容器内有进行PCR反应的2~5倍反应浓度的PCR反应母液，PCR反应母液包含：DNA聚合酶0.5~5u、镁离子1~5mmol/L、dNTP 40～400μmol/L以及Tris-HCl缓冲液20~100mmol/L；
所述PCR辅助液容器内有可使所述PCR以干血滤纸片为扩增模板进行相应位点基因分型的缓冲体系，该缓冲体系以PBS为基液，包含浓度为1~2M的甜菜碱、浓度为10~30mM的(NH4)2SO4，以及浓度为2%~8%的DMSO。
6.一种如权利要求5所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）多重PCR扩增：总反应体系为20μL，反应体系组成如下：
2×PCR反应母液 10μL
PCR辅助液 2μL
引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.15组合物 2μL
人干血滤纸片1.0×1.0mm /
ddH2O 补足20μL
（2）PCR反应在普通PCR仪进行，PCR反应条件如下：95℃10分钟启动后，95℃ 30秒、60℃30秒、72℃ 30秒，共28个循环，然后60℃保温40分钟，然后4℃保温；
（3）PCR产物取1μL，按常规操作在遗传分析仪上进行毛细管电泳，得到每一个位点的基因分型图谱。
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