CN103975075A

CN103975075A - 一种检测病毒在待测样本中整合方式的探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103975075A
Application number: CN201180074786.6A
Authority: CN
Inventors: 李伟阳; 易赏; 曾玺; 陈盛培; 杨焕明
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2011-11-24
Filing date: 2011-11-24
Publication date: 2014-08-06
Also published as: WO2013075313A1; TW201321519A; TW201321566A

Abstract

本发明公开了一种检测病毒在待测样本中整合方式的探针及其制备方法和应用。具体地，所述探针至少具有以下一个特征：(1)每个探针上具有1个或多个生物素标记的dNTP；(2)生物素标记的dNTP在探针集中的丰度为1∶6-1∶2；(3)所述探针集的全部核酸序列覆盖对应病毒基因组序列的70％-100％。

Description

一种检测病毒在待测样本中整合方式的探针及其制备方法和应用技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种检测病毒在待测样本中整合方式的探针及其制备方法和应用。背景技术

乙型肝炎病毒（hepatitis B vims, HBV) 是一种全球性的慢性病毒感染性疾病。我国的乙肝病毒感染率约 60%-70%；而乙肝表面抗原携带率约占总人口的 7.18%，以此计算，全国约有 9300万人携带乙肝病毒，其中乙肝患者大约有 3000万。在全世界，大约有 45%的人群生活在慢性 HBV感染的高发区， 43%的人群生活在慢性 HBV感染的中发区，另有 12%的人群生活在慢性 HBV感染低发区。在慢性 HBV感染的高发区， HBV感染的危险性 > 60%，绝大多数 HBV感染是通过母婴垂直传播；在慢性 HBV感染中发地区， HBV感染的危险性为 20%— 60%；在慢性 HBV感染的低发区， HBV感染的危险性 <20%。

在慢性 HBV感染的过程中，一定比例的 HBV感染发展成肝硬化与肝细胞癌，还有一部分由于肝病变的恶化而发生肝衰竭。因此，在慢性 HBV感染的自然过程中，不少患者会因肝硬化、肝细胞癌，以及肝功能衰竭而导致死亡，给社会和家庭带来巨大的经济损失。

乙肝病毒基因组是一个有部分单链的环状双链 DNA分子，两条单链长度不同， HBV病毒具有多种基因型，常见基因型有八种，分别为 A-H。 A型分布于北欧与西欧； B， C型分布于东南亚； D型分布于南欧，印第安； E型分布于西非与南非； F， H型分布中美，南美； G型分布法国，美国。

现今关于肝癌与 HBV基因组整合研究，发现 HBV-DNA整合入肝癌细胞基因组中。采用单克隆方法发现 HBV基因整合入人类基因组位点周围，发生重排、缺失。 HBV携带者转变为肝癌，研究发现有以下三个途径：

( 1 ) HBV整合入基因组引起染色体不稳定，造成多位点缺失；

( 2) HBV片段***特定位点引起基因***缺失，激活原癌基因，例如细胞增殖分化基因，与端粒逆转录酶基因；

( 3 ) 表达的病毒蛋白可调控肝癌细胞增殖。

HBV病毒基因组整合入人类基因组破坏基因组稳定性引起非正常易位， DNA重排，删除，杂合丢失，以及激活抑制相关基因，从而诱导肝细胞癌（HCC ) 的发生。现已知在 14号、 15号、 18号、 19号和 Y染色体上， HBV DNA的整合位点附近有一些与癌症相关的基因，如 BCL2L2基因与细胞凋亡相关， SMOCl、 Calmodulin-1基因与钙通道相关， FBLN5基因与血管生长相关， NOTCH3与细胞信号转导途径相关。 HCC组织中可以存在多个整合位点， HBV在整合的基础上还可以发生再次整合。如在肝癌患者的肝组织中有时能检测到 HBV DNA整合位点两端发生 17号和 18号染色体的易位，同时 18号染色体在整合位点处有至少 1.3 kb的碱基缺失。通过对肝癌患者的肝组织 HBV整合的研究发现：有的病例中人基因组序列各有 5bp和 19bp的缺失；在 3例病例中检测到 HBV整合片段两侧的人染色体虽然是同一染色体，但是方向相反，发生了重排。

HBV基因组整合入宿主基因组的研究方法目前主要为 Southern Blot, 探针同位素标记、单克隆测序、 ALU-PCR、寡聚核苷酸探针等。目前这些方法存在很多问题，主要体现在： 1. 对于高通量测序来说常规探针定制的供应商主要为 Agilent和 imblegene, 定制价格较高，一般为几百美元 /反应； 2. 尚未做过整合方面的尝试。

目前本领域还没有一种经济简单快速的 HBV基因组整合入宿主基因组的研究方法。因此本领域迫切需要开发新的 HBV基因组整合入宿主基因组的检测方法，为研究 HBV以及肝脏相关疾病提供方便廉价的研究方法与手段。发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测病毒在待测样本中整合方式的探针。

本发明的另一目的是提供所述探针的制备方法和应用。

本发明的另一目的是提供一种检测病毒在待测样本中整合方式的方法。在本发明的第一方面，提供了一种核酸探针集，包括多个探针，所述探针集具有以下特征： (1)每个探针上具有 1个或多个生物素标记的 dNTP; 和 /或

(2)生物素标记的 dNTP在探针集中的丰度为 1 :6-1 :2; 和 /或

(3)所述探针集的全部核酸序列覆盖对应病毒基因组序列的 70%-100%。

在另一优选例中，所述探针集具有 1-20000个核酸探针；较佳地，所述探针集具有 1000-5000个核酸探针；更佳地，所述探针集具有 2500个核酸探针。

在另一优选例中，所述生物素标记的 dNTP在所述探针集中的丰度为 1 :4。在另一优选例中，所述探针之间具有部分重叠。

在另一优选例中，所述探针长度为 100-500bp ; 较佳地，所述探针长度为 200-300bp_; 更佳地，所述探针长度为 250bp。

在另一优选例中，所述探针是以病毒基因组作为模板， PCR法扩增获得，较佳地，所述扩增模板为为乙型肝炎病毒（HBV) 基因组、丙型肝炎病毒（HCV) 基因组、艾滋病病毒（HIV) 基因组、 ***瘤病毒（HPV) 基因组，或其组合；更佳地所述样本为 B型 HBV基因组和 /或 C型 HBV基因组。

在本发明的第二方面，提供了一种表面固定有本发明第二方面所述探针集的核酸芯片。

在本发明的第三方面，提供了本发明的第一方面所述核酸探针集和本发明的第二方面所述核酸芯片的用途，用于检测病毒在待样本中的整合方式；较佳地，所述的整合方式选自下组：重排、异位、 ***、替换，或其组合。

在本发明的第四方面，提供了一种制备本发明的第一方面所述核酸探针的方法，包括步骤：

a. 获得探针来源样本；

b. 对步骤（a)获得的样本进行 PCR扩增， PCR扩增体系的 dNTP为生物素标记的 dNTP, 获得带有生物素标记的 PCR扩增产物；

c 对步骤（b) 获得的生物素标记的 PCR扩增产物进行打断，得到片段化的生物素标记的 PCR扩增产物，即为探针；

在另一优选例中，步骤（a) 所述样本具有以下特征：

样本为含有核酸的病毒样本；和 /或

所述样本为病毒粒子、血清、血液、组织样本、脱落细胞，上皮细胞，或其组合；和 /或所述样本选自下组：乙型肝炎病毒（HBV) 、丙型肝炎病毒（HCV) 、艾滋病病毒（HIV) 、 ***瘤病毒（HPV) ，或其组合；和 /或

所述样本为 B型 HBV和 /或 C型 HBV。

在另一优选例中，步骤（b) 具有以下特征：

步骤（b) 所述的扩增为对样本中病毒 DNA全长进行扩增；和 /或

步骤（b) 所述标记的 dNTP为 biotin-dNTP，且所述标记的 dNTP能够与链霉素亲和磁珠结合；和 /或

步骤（b)所述标记的 dNTP与非标记 dNTP的比例为 1 : 2-8；优选比例为 1 : 3-6；更优选比例为 1 : 4。

在另一优选例中，步骤（c) 所述打断为超声法打断。

在另一优选例中，还包括步骤（d) ：对步骤（c) 获得的探针进行纯化和 /或定量。

在另一优选例中，所述探针的长度为 100-500bp; 较佳地，所述探针的长度为 200-300bp, 更佳地，所述探针的长度为 250bp。

在本发明的第五方面，提供了一种检测病毒在待测样本中基因整合方式的方法，包括步骤：

(i) 获得待测样本；

(ii) 对步骤（i) 获得的样本进行文库构建；

(iii) 将本发明第一方面所述的探针与步骤（ii) 获得的文库进行杂交，捕获与病毒基因整合有关的核酸序列；

(iv) 对步骤（iii) 捕获的核酸序列进行扩增，获得与病毒整合有关的扩增产物；

( V ) 对步骤（iv ) 获得的扩增产物进行测序，获得与病毒整合方式有关核酸

I Ή自、

在另一优选例中，步骤（i) 具有以下特征：

所述待测样本为组织、血液、脱落细胞，上皮细胞；和 /或

所述待测样本来源于人或非人哺乳动物，较佳地来源于人；和 /或

所述待测样本来源于 HBV感染者或肝癌患者。

在另一优选例中，步骤（iii) 具有以下特征：所述探针为变性的单链 DNA; 和 /或

在杂交液中加入接头封闭分子和标签封闭分子；和 /或

所述接头封闭分子的序列如 SEQ ID NO:7所示；和 /或

所述标签封闭分子的序列如 SEQ ID NO:8和 SEQ ID NO:9所示。

在另一优选例中，在步骤（V ) 中，将所述的扩增产物与固相载体上固定的测序探针进行杂交，进行固相桥式 PCR扩增，形成测序簇；然后对所述测序簇用 "边合成-边测序"法进行测序，从而得到与病毒整合方式有关核酸信息。

在另一优选例中，在步骤（ii) 中，所述的文库构建为：对打断的基因组 DNA 进行末端修复，加入接头，对具有接头的片段进行扩增，获得的带有接头的扩增混合物即为样本文库。

在另一优选例中，所述的接头具有如 SEQ ID ΝΟ:1和 SEQ ID NO:2所示的序列；和 /或，所构建的文库具有如 SEQ ID:3和 SEQ ID:4所示的标签序列。

在本发明的第六面，提供了一种可用于本发明第四方面所述方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)第一容器以及位于容器内本发明第二方面所述的核酸芯片，或本发明第一方面所述的探针；

(2)第二容器以及位于容器内的用于构建样本文库的接头；

(3)第三容器以及位于容器内的接头封闭分子；

(4)第四容器以及位于容器内的标签封闭分子；

(5)检测说明书；

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的试剂：

用于进行 PCR扩增所需的试剂、

用于进行封闭反应所需的试剂、

用于进行杂交反应所需的试剂、

用于进行测序反应所需的试剂、

或其组合。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图 1显示了对 HBV全基因组 PCR扩增后的电泳检测结果，基因组全长约为 3·2Κ。

图 2显示了对 HBV全长产物打断后电泳检测结果，打断的片段大小集中于 250bp-300bp之间。

图 3显示了建库杂交后两种文库片断大小检测结果，分别为 271bp和 876bp。图 4显示了本发明检测 HBV在待测样本基因整合方式的流程。

图 5显示了本发明检测 HBV在待测样本基因整合方式的信息分析流程。具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次构建了一种用于检测病毒在待测样本中整合方式的探针及其应用，具体地，所述探针集具有以下特征：

(1)每个探针上具有 1个或多个生物素标记的 dNTP; 和 /或

(2)生物素标记的 dNTP在探针集中的丰度为 1 :6-1 :2; 和 /或

在本发明的一个优选例中，所述探针集具有 1-20000个核酸探针；较佳地，所述探针集具有 1000-5000个核酸探针；更佳地，所述探针集具有 2500个核酸探针。

在另一优选例中，所述探针集还具有以下特征：

(i)所述生物素标记的 dNTP在所述探针集中的丰度为 1 :4; 和 /或

(ii)所述探针之间具有部分重叠；和 /或

(iii)所述探针长度为 100-500bp; 较佳地，所述探针长度为 200-300bp; 更佳地，所述探针长度为 250bp; 和 /或

(iv)所述探针是以病毒基因组作为模板， PCR法扩增获得，较佳地，所述扩增模板为为乙型肝炎病毒（HBV) 基因组、丙型肝炎病毒（HCV) 基因组、艾滋病病毒（HIV) 基因组、 ***瘤病毒（HPV) 基因组，或其组合；更佳地所述样本为 B型 HB V基因组和 /或 C型 HB V基因组。

本发明还提供了所述探针的制备方法及其应用。在此基础上完成了本发明。术语

如本文所用，术语"含有"包括"具有 (comprise)"、 "基本上由…构成"和 "由… 构成"。

如本文所用，术语"以上"和"以下"包括本数，例如" 80%以上"指≥80%， "2% 以下"指≤2%。

丰度

如本文所用，术语 "丰度 "指的生物素标记的 dNTP数量在整个探针集中所占的比例。在本发明的一个优选例中，生物素标记的 dNTP在探针集中的丰度为 1 :6-1 :2；更加地，生物素标记的 dNTP在所述探针集中的丰度为 1 :4。

引物

如本文所用，术语 "引物"指的是能与模板互补配对，在 DNA聚合酶的作用合成与模板互补的 DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的 RNA、 DNA, 也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如 LNA或 ZNA等。

引物"大致上 "(或 "基本上")与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个 3'端与模板互补的引物的 5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

探针及其制备方法

如本文所用， "探针 "一词是指能够检测互补核酸序列的简单 DNA或 RNA分子。探针必须是纯净的，而且不受其他不同序列核酸的影响。典型的探针是克隆的 DNA序列或通过 PCR扩增获得的 DNA，人工合成的寡核苷酸或从体外转录克隆 DNA序列后获得的 RNA，也可以作为探针。探针长度可以从 20-500mer，较佳地 50-300mer，更佳地 250mer。探针设计和合成方法为本领域技术人员所熟知可以使用人工化学合成法合成探针或使用市售探针。

本发明提供了一种用于检测病毒在待测样本中整合方式的探针，所述探针集具有以下特征：

(1)每个探针上具有 1个或多个生物素标记的 dNTP; 和 /或

(2)生物素标记的 dNTP在探针集中的丰度为 1 :6-1 :2; 和 /或

在另一优选例中，所述探针集还具有以下特征：

(ii)所述探针之间具有部分重叠；和 /或

本发明还提供了一种所述探针的制备方法，在一个优选例中，所述方法包括步骤：

a. 获得病毒样本；

b. 获得样本进行扩增，扩增中引入标记的 dNTP, 获得标记的 PCR扩增产物，标记的 dNTP优选为 biotin-dNTP，标记的 dNTP能够与链霉素亲和磁珠结合；

c 对标记的 PCR扩增产物进行片段化，即为探针；

d: 对获得的探针进行纯化和 /或定量。

本发明所述探针的长度为 100-500bp，较佳地，所述探针的长度为 200-300bp，更佳地所述探针的长度为 250bp。

芯片

如本文所用， "芯片 "一词是指可以采用微加工技术在芯片的基底材料上加工出各种微细结构，施加必要的生物化学物质并进行表面处理，将各种探针分子与表面固定化，制得含有大量探针的材料。

本领域技术人员可以使用通用的方法获得芯片。 DNA芯片制备方法通常有 4种。第 1种是光引导原位合成法，在微加工技术中用光刻工艺与光化学合成法相结合。第 2种方法是化学喷射法，将合成好的寡核苷酸探针定点喷射到芯片上并加以固定化来制作 DNA芯片。第 3种方法是接触式点涂法，通过高速精密机械手的精确移动让移液头与玻璃芯片接触而将 DNA探针涂敷在芯片上。第 4 种方法是使用 4支分别装有 A， T， G， C核苷的压电喷头在芯片上并行合成出 DNA 探针。

本发明提供了一种表面固定有用于检测病毒基因整合方式的芯片。在一个优选例中，所述病毒为 HBV，较佳地，为 B型 HBV和 C型 HBV。本发明的芯片用于检测病毒在待测宿主中的基因整合方式。

DNA文库及其制备

如本文所用， "DNA文库制备"一词是指对基因组的目的片段进行打断，获得一组具有一定大小的 DNA片段混合物。

样本文库的制备方法为本领域技术人员所熟知，包括 (但不局限于)步骤：对打断的基因组 DNA末端修复，使之具有平末端；加入接头，对具有接头的片段进行扩增，获得的带有接头的混合物为文库。

在一个优选例中，所述的接头具有如 SEQ ID ΝΟ:1和 SEQ ID NO:2所示的序列。在一个优选例中，所构建的文库具有如 SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4所示的标签序列。

在一个优选例中，还可以对打断产物、末端修复产物、接头产物和富集产物进行纯化。纯化条件及参数为本领域技术人员所熟知，对反应的条件进行一定的变化或优化也在本领域技术人员能力范围之内。

高通量测序

新一代测序技术 (NGS)改变了以往对 DNA/RNA样本的分析模式，几乎成为所有研究领域中必不可少的研究工具。新一代测序技术是通过对上百万条 DNA 短片段的同时的平行测序，使得在短时间内就能够完成每个碱基的测序，且成本大幅度降低。 NGS技术在很多方面得到应用，如基因组学、转录组学、表观基因组学、临床诊断等。

本领域技术人员通常可以采用多种第二代测序平台进行高通量测序：包括但不限于 illumina公司的 Hiseq2000， 454 FLX( oche公司）、 Solexa Genome Analyzer和 Applied Biosystems公司的 SOLID等。这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的 96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取 40万到 400万条序列，根据平台的不同，读取长度从 25bp到 450bp不等，因此不同的测序平台在一次实验中，可以读取 1G到 14G不等的碱基数。其中， Solexa 高通量测序包括 DNA簇形成和上机测序两个步骤： PCR扩增产物的混合物与固相载体上固定的测序探针进行杂交，并进行固相桥式 PCR扩增，形成测序簇；对所述测序簇用 "边合成 -边测序法"进行测序。

DNA簇的形成是使用表面连有一层单链引物 (primer)的测序芯片 (flow cell), 单链状态的 DNA片段通过接头序列与芯片表面的引物通过碱基互补配对的原理被固定在芯片的表面，通过扩增反应，固定的单链 DNA变为双链 DNA，双链再次变性成为单链，其一端锚定在测序芯片上，另一端随机和附近的另一个引物互补从而被锚定，形成"桥"；在测序芯片上同时有上千万个 DNA单分子发生以上的反应；形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在扩增芯片的表面再次扩增，形成双链，双链经变性成单链，再次成为桥，称为下一轮扩增的模板继续扩增；反复进行了 30轮扩增后，每个单分子得到 1000倍扩增，称为单克隆的 DNA簇。

DNA簇在 Solexa测序仪上进行边合成边测序，测序反应中，四种碱基分别标记不同的荧光，每个碱基末端被保护碱基封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应的颜色后，该保护集团被除去，下一个反应可以继续进行，如此反复，即得到碱基的精确序列。在 Solexa多重测序 (Multiplexed Sequencing)过程中会使用 INDEX (标签或 BARCODE)来区分样品，并在常规测序完成后，针对 INDEX部分额外进行 7个循环的测序，通过 INDEX的识别，最多可以在 1条测序甬道中区分 12种不同的样品。

检测方法

本发明还提供了一种检测病毒在宿主细胞中基因整合方式的方法，以 HBV 病毒为例，在本发明的一个优选例中，所述方法主要包括以下步骤： 1. HBV探针制作

对 HBV全长基因组进行 PCR，其中 PCR过程中引入标记的 dNTP;

在一个优选例中，所述标记 dNTP为 biotin-dNTP， biotin-dNTP与普通 dNTP 的比例是 1 : 4，总浓度为 2.5mM;

2. 对 HBV全长产物进行纯化

在一个优选例中，采用 1.5倍体积 AMPURE磁珠纯化，后采用 QIAGEN的 250MinElute PCR Purification Kit纯化；

3. 对 HBV全长产物进行片段化

将 DNA转移至缓冲液中，进行超声片段化；

4. 探针与样本杂交

样品来源可为 HBV患者或肝癌患者的血浆或组织，根据 Illumina公司 Paired-End Sample Preparation Guide (操作流程）进行文库构建；将探针与文库混合，捕获特异性的样本核酸片段。

5. 洗脱

将捕获到的核酸片段洗脱下来；

6. 将上述洗脱下来的 DNA进行 PCR扩增和纯化、定量；

7. 上机测序***及信息分析

将上述纯化后的 PCR产物经进行高通量测序，测序平台采用 ILLUMINA公司的 HISEQ2000, 对于测序长度不限于 PEI101 , 也可采用 PEI91。将下机数据除去重复和被接头污染的 reads，统计下机数据的基本信息（例如：文库长度； reads 长度； reads条数；碱基数；重复率等）；分别截取 PE的两条 reads 前面的 50bp 碱基，形成一对长为 50bp新 reads, B PE50readsc 将新的 PE50 reads运用 soap比对软件（ -r 1 -V 2 )分别与人的参考序列（hgl9)和 HBV各种参考序列进行比对，从比对结果中挑选出一条 read比到人的参考序列并且另一条比对到 HBV参考序列的一对 reads; 这样的 reads很有可能跨过 HBV***的位点；统计这部分 reads 比对信息，找到在人类基因组的***热点区域。图 5显示了本发明检测 HBV在待测样本基因整合方式的信息分析流程。

试剂盒

本发明还提供了一种用于检测病毒在宿主中整合方式的试剂盒，主要包括以下组分：

( 1 )第一容器以及位于容器内的检测芯片或探针集；

(2)第二容器以及位于容器内的用于构建样本文库的接头；

(3)第三容器以及位于容器内的接头封闭分子；

(4)第四容器以及位于容器内的标签封闭分子；

(5)检测说明书。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的试剂：

用于进行 PCR扩增所需的试剂、用于进行封闭反应所需的试剂、用于进行杂交反应所需的试剂、用于进行测序反应所需的试剂、或其组合。

本发明的主要优点包括：

1. 采用本发明制备探针所需的价格仅为现有技术制备价格的 1%-5%；

2. 本发明在制作探针过程中形式灵活，可以按自身需要设计，比例加入 HBV种类以及数量；

3. 制作探针过程简单，通过 PCR以及打断纯化即可得到探针，无须合成；

4. 本发明的探针为双链探针，能够降低因 PCR 原因引起的信息错误及丢失；

5. 本发明的检测方法可以与建库技术联合使用起到富集 HBV片段的作用；具有广泛的适用性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

仪器和试剂

本方面用到的仪器和试剂见表 1。

Cycler/9700

Agilent 2100 2100 Bioanalyzer Agilent

NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 电泳仪 DYY-6C 北京六一仪器厂核酸浓缩仪 5305 Eppendorf 凝胶成像*** Tanon 上海天能科技有限公司

Covaris打碎仪 S-2 Covaris

Thermomixer Thermomixer comfort Eppendorf

Dynabeads M-280

Invitrogen

Strep tavidin磁珠

MinElute PC

28004 QIAGEN

Purification Kit

实施例 1 样本文库制备

1. 样本来源

样品的来源为同一患者的肝癌组织，且此患者肝癌组织有全基因组测序信息。

2. 样本文库制备

文库构建按照 Illumina公司的标准文库制备流程说明书（Paired-End Sample Preparation Guide) 进行构建，具体方法如下：

采用 Covaris s2打断基因组 DNA，末端补平修复，末端加 A，加入接头，建库过程所用的接头为：

SEQ ID NO: l 5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3' _;

SEQ ID NO:2 5，-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3，。对加入接头的片段进行 PCR，得到样本文库，所构建的文库带有 INDEX标签序列。 INDEX序列如下：

SEQ ID NO: 3

ACGTGTGCTCTTCCGATCT-3， SEQ ID NO: 4

5'-CAAGCAG

ACGTGTGCTCTTCCGATCT-3' c

将样本分别做成两种片段大小文库，对构建文库片段进行片段大小检; 主带为 170bp左右和 800bp左右。实施例 2 制备 HBV探针

1. 引物设计

本实施例中，所设计的引物为：

PI ( SEQ ID NO:5 ) ： TTTTTCACCTCTGCCTAATCA

P2 ( SEQ ID NO:6 ) ： AAAAAGTTGCATGGTGCTGG

2. PCR反应体系

PCR反应体系见表 2。

表 2

LA Taq 0.25μ1

10 X LA buffer ( Mg+2.00mM ) 2.5μ1

dNTP (2.5mM) 4μ1

PI ( ΙΟμΜ) 1.5μ1

P2 ( ΙΟμΜ) 1.5μ1

HBV病毒基因组（lng/μΐ) 3μ1

H₂O 12.25μ1

总体积 25 μΐ

(注： dNTP中 biotin-dNTP与普通 dNTP的比例是 1 : 4，总浓度为 2.5mM) 3. PCR反应条件

PCR反应在 AB-9700PCR仪上进行，反应程序见表 3。

表 3

温度时间循环数

94 °C 3min 1

94 °C 30s 35 56 °C 50s

68 °C 150s

72 °C lOmin

4°C 保持

4. PCR纯化及电泳检测

反应结束后，采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，并用 1.2-1.5倍体积 AMPURE BEADS纯化，采用 80ul水溶解。然后采用 250MinElute PCR Purification Kit纯化，采用 60μ1水溶解。 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物是否已经纯化干净检测结果见图 1。

结果表明，扩增并纯化出了大小约 3.2K的 HBV的片段。

5. PCR产物片段化

纯化完成后，将 DNA全部转移至 Covaris打断小管并补加 TE缓冲液至总体积为 8(^l(Nanodrop检测其总量为 5 g)， Covaris S2仪器（基因有限公司）打断，打断条件见表 4。

表 4

6. 片段化产物电泳检测

2%琼脂糖凝胶电泳检测片段的大小，结果表明，片段主带在 250-300bp (图

2) 。所获得的片段化的产物即可用作杂交的探针。

7. 探针保存

使用 MinElute PCR Purification Kit纯化片段产物，溶于 40μ1缓冲液中，用 Nanodrop仪检测探针 DNA的浓度，使得探针的浓度为 120ι¾/μ1左右。得到的探针可以保存在 -20°C或 -80°C。

实施例 3 HBV探针与样本文库进行杂交

1. 探针变性

探针使用前必须 95°C变性 10分钟，然后迅速放于冰上冷却形成单链。 2. 选用已确定的整合文库，文库用量为 l g，探针用量为 600ng (Nanodrop 定量），加入接头封闭分子，接头封闭分子的量与文库量的比值为 lnmol: 1μ_§, 标签封闭分子与文库量的比值为 lnmol: ^g。

接头封闭分子序列为：

SEQ ID NO: 7

5'-AATGATA(

GCTCTTCCGATCT-3'

标签封闭分子序列为

SEQ ID NO: 8

S'-AAGCAGA,

CGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；

SEQ ID NO: 9

5'-AAGCAGA,

CGTGTGCTCTTCCGATCT-3'。

在一个 1.5mL的 EP管中加入 l g的待杂交文库， lnmol接头封闭分子， lnmol 标签封闭分子， 5 g Cot DNA。盖好管盖，用干净的 50ml注射器针在分装的 EP 管盖上戳一个孔，然后置于 60°C旋蒸仪中蒸干。使用新的离心管管盖替换戳孔的管盖，并做好标记。 EP管中分别加入 EZ杂交***中的两种试剂： 2 X SC Hybridiation Buffer杂交缓冲液 7.5 μΐ和 1 X SC Hybridiation Component A 3 μ1，然后 95°C变性 10分钟，在上述杂交混合物加入自制探针 600ng，探针体积共 5μ1。震荡混匀后置于离心机上全速离心 10秒，并将样品全部转移到 200μ1 ΡΟ小管中。

杂交混合物中含有的成分见表 5。文库蒸干混合物 l g (文库） +5 g (Cot DNA) + 2nmol封闭分子

2Χ SC Hybridiation Buffer 7.5μ1

SC Hybridiation Component A 3μ1

探针 600ng

总体积 15μ1 将 200μ1ΡΟ小管放置于 PCR仪上， 47°C条件下杂交 24h。实施例 4 杂交后洗脱

1. 准备链霉亲和素磁珠 (Invitrogen M280)

提前从冰箱中拿出链霉亲和素磁珠；漩涡震荡磁珠 lmin，使其充分混匀；在 1.5mL的 EP管中加入 ΙΟΟμΙ磁珠；将 ΕΡ管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心地去除上清；保持 ΕΡ管在磁力架上，加入 200 μΐ (2倍体积）的结合缓冲液 (购于 Agilent公司）；从磁力架上取下 EP管，漩涡震荡 10s，使其混匀；将 EP 管重新放回磁力架至液体澄清，用移液器小心地去除上清；重复清洗两次；用 100 μΐ 的 Agilent 结合缓冲液 r悬浮磁珠；将其转入 0.2 ml的小管中；用磁力架结合磁珠（将小管靠到磁力架上），直到液体澄清，用移液器小心去除上清；现在磁珠可以用来结合捕获的 DNA了。

2. 将捕获到的 DNA结合到链霉素磁珠上

将杂交混合物吸出来，加到上步准备好的磁珠中；用移液器吹打 10次混匀；将小管放在 PCR仪上 47°C孵育 45 min (每隔 15 min拿出来漩涡震荡 3 s以防止磁珠沉淀)；孵育 45 min后，将混合物从 0.2mL的小管中转入 1.5 mL的 EP管中。

3. 洗涤结合了捕获 DNA的链霉亲和素磁珠

1 ) 将 EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心地去除上清；

2 ) 力口 100 L 预热到 47°C的 I X清洗缓冲液 I；

3 ) 漩涡震荡 10 s，使其混匀；

4 ) 将 EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心地去除上清；

5) 从磁力架上取下 EP管，加入 200 μ1 预热到 47°C的 1 X严谨清洗缓冲液，用移液器吹打混匀 10次（该步操作应迅速以尽量使管中液体温度不低于 47°C )；

6 ) 47°C孵育 5 min;

7 ) 重复步骤 5 ) -7) ，总共用 I X严谨清洗缓冲液洗两次；

8 ) 将 EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心地去除上清；

9 ) 力 P200 L室温下放置的 I X清洗缓冲液 I (不用 47°C预热的），漩涡震荡 2 min, 使其混匀；

10) 将 EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心地去除上清； 1 1 )力 P200 室温下放置的 l X Wash Buffer ll, 漩涡震荡 1 min，使其混匀；

12) 将 EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心的去除上清；

13 ) 力 P200 室温下放置的 I X Wash Buffer III，漩涡震荡 30 s，使其混匀；

14) 将 EP管置于磁力架上至液体澄清，用移液器小心地去除上清；

15) 从磁力架上取下 EP管，加入 76μ1超纯水（不用将 DNA从磁珠上洗脱下来，可以直接进行 PCR，取样 35μ1进行后面的 PCR反应）。实施例 5 PCR反应

预先从 -20°C保存的试剂盒中取出 PFX聚合酶 (购于 Invirtogen公司）， PFX 反应缓冲液（10 X )， dNTP(10mM) o 引物序列为：

PCR Flowcell-Primer F ( 1 Opm/μΐ)

SEQ ID NO: 10 AATGATACGGCGACCACCGAGATC：。

PCR Flowcell-Primer (lOpm/μΙ)

SEQ ID NO: 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGA

在 PCR小管上，每孔按照表格 6配置 PCR反应体系。

表 6

DNA 35μ1

PFX酶 Ιμΐ

PFX 反应缓冲液 (10*) 5μ1

MgSO₄ 2μ1

dNTP(lOmM) 2μ1

Flowcell-primer-F 1 (lOpm/μΙ) 2.5μ1

Flowcell-primer- 1 (lOpm/μΙ) 2.5ul

总体积 50ul

反应条件见表 7。

表 7

温度时间循环

94 °C 2min 1

94 °C 15s 14 58 °C 30s

72 °C 30s

72 °C 5min 1

4°C 保持

PCR结束后，每个样品都用 1.5倍体积的 Ampme Beads纯化，回收的 PCR产物溶于 30μ1超纯水中， Nanodrop 1000测浓度。实施例 6 PCR产物上机测序

上述纯化后的 PCR产物经 2100 Bioanalyzer (Agilent)确定大小及***片段大小见图 3和图 4，纯化产物大小分别为 271bp和 876bp， QPCR精确定量后上机测序。在本实施例中，上机测序按照 Illumina/Solexa官方公布的 c-Bot和 HISEQ2000Hiseq 2000说明书进行操作。实施例 7信息分析

将下机数据除去重复和被接头污染的 reads, 统计下机数据的基本信息（文库长度； reads长度； reads条数；碱基数；重复率等）；分别截取 PE的两条 reads 前面的 50bp碱基，形成一对长为 50bp新 reads, B PE50reads c 将新的 PE50 reads 运用 soap比对软件（ -r 1 -V 2 )分别与人的参考序列（hgl9)和 HBV各种参考序列进行比对，从比对结果中挑选出一条 read比到人的参考序列并且另一条比对到 HBV参考序列的一对 reads; 这样的 reads很有可能跨过 HBV***的位点；统计这部分 reads比对信息，找到在人类基因组的***热点区域。

杂交结果见表 8。

表 8

Chrl9:30315005 , Chrl9:30315005 ,

Chrl9:30314586-30315653 段点位置 30315366 303153661

Chrl4:96085100-96085700 Chrl4:96085140 Chrl4:96085140

表 8的结果为采用上机数据得到结果，样本 L-170, L-800 , Genome均来自同一肝癌样本， L- 170为***片段 170bp， L-800为 800bp文库， genome为全基因组测序。从表 8中可以得出自制探针对于捕获基因片段的准确性，以及片段长度的影响。通过本发明的方法完全可以得到稳定以及可靠的位点，且所需数据量仅为全基因组测序数据的 1%左右。实施例 8 制备试剂盒

一种可用于检测病毒在待测样本中整合方式的试剂盒，包括以下

(1)第一容器以及位于容器内核酸芯片；

(2)第二容器以及位于容器内的用于构建样本文库的接头；

(3)第三容器以及位于容器内的接头封闭分子；

(4)第四容器以及位于容器内的标签封闭分子；

(5)第五容器以及位于容器内的用于进行 PCR扩增所需的试剂；

(6)第六容器以及位于容器内的用于进行封闭反应所需的试剂；

(7)第七容器以及位于容器内的用于进行杂交反应所需的试剂；

(8)第八容器以及位于容器内的用于进行测序反应所需的试剂。

(9)检测说明书。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1. 一种核酸探针集，包括多个探针，其特征在于，所述探针集具有以下特征:

(1)每个探针上具有 1个或多个生物素标记的 dNTP; 和 /或

(2)生物素标记的 dNTP在探针集中的丰度为 1 :6-1 :2; 和 /或

(3所述探针集的全部核酸序列覆盖对应病毒基因组序列的 70%-100%；优选地，所述探针集具有 1-20000个核酸探针；较佳地，所述探针集具有 1000-5000个核酸探针；更佳地，所述探针集具有 2500个核酸探针；

优选地，所述生物素标记的 dNTP在所述探针集中的丰度为 1 :4;

优选地，所述探针之间具有部分重叠；

优选地，所述探针长度为 100-500bp; 较佳地，所述探针长度为 200-300bp; 更佳地，所述探针长度为 250bp;

优选地，所述探针是以病毒基因组作为模板， PCR法扩增获得，较佳地，所述扩增模板为为乙型肝炎病毒（HBV) 基因组、丙型肝炎病毒（HCV) 基因组、艾滋病病毒（HIV) 基因组、 ***瘤病毒（HPV) 基因组，或其组合；更佳地所述样本为 B型 HB V基因组和 /或 C型 HB V基因组。

2. —种表面固定有权利要求 1所述探针集的核酸芯片。

3. 权利要求 1所述核酸探针集或权利要求 2所述核酸芯片的用途，其特征在于，用于检测病毒在待样本中的整合方式；较佳地，所述的整合方式选自下组：重排、异位、 ***、替换，或其组合。

4. 一种制备权利要求 1所述核酸探针的方法，其特征在于，包括步骤：

(a) 获得探针来源样本；

(b) 对步骤（a) 获得的样本进行 PCR扩增， PCR扩增体系的 dNTP为生物素标记的 dNTP, 获得带有生物素标记的 PCR扩增产物；

(c)对步骤（b) 获得的生物素标记的 PCR扩增产物进行打断，得到片段化的生物素标记的 PCR扩增产物，即为探针；

较佳地，步骤（a) 所述样本具有以下特征：

样本为含有核酸的病毒样本；和 /或

所述样本为病毒粒子、血清、血液、组织样本、脱落细胞，上皮细胞，或其组合；和 /或

所述样本选自下组：乙型肝炎病毒（HBV) 、丙型肝炎病毒（HCV) 、艾滋病病毒（HIV) 、 ***瘤病毒（HPV) ，或其组合；和 /或

所述样本为 B型 HBV和 /或 C型 HBV;

较佳地，步骤（b) 具有以下特征：

步骤（b)所述标记的 dNTP与非标记 dNTP的比例为 1 : 2-8；优选比例为 1 : 3-6；更优选比例为 1 : 4；

较佳地，步骤（c) 所述打断为超声法打断。

5. 如权利要求 1所述的方法，其特征在于，还包括步骤（d) ：

对步骤（c) 获得的探针进行纯化和 /或定量。

6. 如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述探针的长度为 100-500bp; 较佳地，所述探针的长度为 200-300bp，更佳地，所述探针的长度为 250bp。

7.一种检测病毒在待测样本中基因整合方式的方法，其特征在于，包括步骤:

(i) 获得待测样本；

(ii) 对步骤（i) 获得的样本进行文库构建；

(iii)将权利要求 1所述的探针集包括的探针与步骤（ii)获得的文库进行杂交，捕获与病毒基因整合有关的核酸序列；

I Ή自、 .；

较佳地，步骤（i) 具有以下特征：

所述待测样本为组织、血液、脱落细胞，上皮细胞；和 /或

所述待测样本来源于 HBV感染者或肝癌患者；

优选地，步骤（iii) 具有以下特征：所述探针为变性的单链 DNA; 和 /或

在杂交液中加入接头封闭分子和标签封闭分子；和 /或

所述接头封闭分子的序列如 SEQ ID NO:7所示；和 /或

所述标签封闭分子的序列如 SEQ ID NO:8和 SEQ ID NO:9所示。

8. 如权利要求 7所述的方法，其特征在于，在步骤（V ) 中，将所述的扩增产物与固相载体上固定的测序探针进行杂交，进行固相桥式 PCR扩增，形成测序簇；然后对所述测序簇用 "边合成-边测序"法进行测序，从而得到与病毒整合方式有关核酸信息。

9. 如权利要求 7所述的方法，其特征在于，在步骤（ii) 中，所述的文库构建为：对打断的基因组 DNA进行末端修复，加入接头，对具有接头的片段进行扩增，获得的带有接头的扩增混合物即为样本文库；

较佳地，所述的接头具有如 SEQ ID NO:l和 SEQ ID NO:2所示的序列；和 /或所构建的文库具有如 SEQ ID:3和 SEQ ID:4所示的标签序列。

10. 一种可用于权利要求 7-9任一所述方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)第一容器以及位于容器内权利要求 2所述的核酸芯片，或权利要求 1所述的探针；

(2)第二容器以及位于容器内的用于构建样本文库的接头；

(3)第三容器以及位于容器内的接头封闭分子；

(4)第四容器以及位于容器内的标签封闭分子；

(5)检测说明书；

较佳地，所述试剂盒还包括选自下组的试剂：

用于进行 PCR扩增所需的试剂、

用于进行封闭反应所需的试剂、

用于进行杂交反应所需的试剂、

用于进行测序反应所需的试剂、

或其组合。