CN110361459A - 枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：1)供试品溶液的制备；2)色谱条件及***适用性试验；3)将供试品溶液注入液相色谱仪，测定，得到指纹图谱。通过对枇杷叶标准汤剂的超高效液相色谱指纹图谱的研究，得到了一种较好的枇杷叶标准汤剂指纹图谱，为控制该制剂质量提供了新的技术方法。

Description

枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，主要涉及一种枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法。

背景技术

标准煎液是以中医理论为指导、临床应用为基础，按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮而成的单味中药饮片水煎液。其制备流程具有规范化和标准化的特点，能够保证工艺的统一，且保障其质量的统一和稳定；标准煎液可以作为一种化学基准，用于标化临床用药，保障用药的准确性和剂量的一致性；也可作为药效基准的阳性对照药，可用于评价不同饮片用药形式，以解决因制备方法不同而造成的“不同质”的尴尬局面，以倒逼不同饮片用药形式达到“形不同，质相同”的效果，实现临床疗效的一致性。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它可以较全面地反映药材所含化学成分的种类和数量，有效地体现中药成分的整体性和综合作用，以其快速、准确等特点已被广泛运用于中药分析鉴定和质量控制等方面。

枇杷叶(学名：Eriobotrya japonica Thunb.)为蔷薇科植物枇杷的叶子，又名巴叶、芦桔叶(《中药材手册》)，原植物枇杷又名：卢橘(广东)，有清肺止咳，和胃利尿，止渴的功效，有治疗肺热痰嗽，咳血，衄血，胃热呕哕作用。但是，在枇杷叶药材分析技术领域，还仍未有用超高效液相色谱方法(UPLC)对枇杷叶标准汤剂进行质量控制分析以及报道其指纹图谱。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种枇杷叶标准汤剂指纹图谱建立方法，通过对枇杷叶标准汤剂的超高效液相色谱指纹图谱的研究，得到了一种较好的枇杷叶标准汤剂指纹图谱，为控制该制剂质量提供了新的技术方法，旨在解决目前对枇杷叶标准汤剂的质量控制技术不足的问题。

本发明的技术方案如下：

一种枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，其中，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取枇杷叶标准汤剂，加水，进行超声或回流提取，放冷，用水补足减失的重量，离心，过滤；

2)色谱条件及***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05～0.2％乙酸水溶液为流动相B；柱温为25～35℃；流速为0.4ml/min，检测波长为230nm-360nm；供试品溶液的进样量1-2μl；

其中，梯度洗脱程序如下：0～2min，流动相B：95％；2～5min，流动相B：95％；5～13min，流动相B：91％；13～25min，流动相B：78％；25～39min，流动相B：20％；39～39.1min，流动相B：95％；39.1～40min，流动相B：95％；

3)将供试品溶液注入液相色谱仪，测定，得到指纹图谱。

优选地，步骤1)中，每0.2g枇杷叶标准汤剂，加浓度为50％～100％甲醇10ml，超声提取15～40分钟；所述超声提取过程中功率为400W，频率为40kHz。

优选地，步骤1)中，加浓度为70％甲醇，超声提取30分钟。

优选地，步骤2)中，采用Waters Cortecs T3色谱柱，填料粒径为1.6μm，内径2.1，柱长100mm。

优选地，步骤2)中，以0.1％乙酸水溶液为流动相B；柱温为30℃；检测波长为326nm。

优选地，步骤3)中供试品溶液的进样量为1μl。

优选地，还包括以下步骤：

4)将得到的指纹图谱与对照图谱进行相似度计算；所述对照图谱如图20所示。

有益效果：本发明中，利用中药色谱指纹图谱相似度评价***建立枇杷叶标准汤剂的UPLC指纹图谱，可用于枇杷叶标准汤剂的质量控制。本发明枇杷叶标准汤剂的指纹图谱构建方法，具有以下显著的优点：(1)本发明首次利用UPLC技术，对枇杷叶标准汤剂进行指纹图谱研究，为枇杷叶标准汤剂质量控制提供了新的分析方法。(2)优化指纹图谱的构建方法，使得到的指纹图谱基线平稳、分离度好、峰型较好、出峰量多。(3)本发明供试样品制作简单，色谱条件容易实现，精密度高，而且其稳定性和重现性较好，本发明采用的检测波长出峰较多，反映的信息完全。(4)在线分析时间短，节省了材料成本和时间成本。

附图说明

图1为本发明实施例中全波长扫描的俯视图。

图2为本发明实施例中全波长扫描的3D视图。

图3为本发明实施例中色谱柱为Waters CORTECS UPLC T3时的色谱图。

图4为本发明实施例中色谱柱为Waters UPLC BEHC18时的色谱图。

图5为本发明实施例中色谱柱为Thermo AcclaimTM RSLC PolarAdvantageⅡ时的色谱图。

图6为本发明实施例中水相为水时的色谱图。

图7为本发明实施例中水相为0.1％甲酸时的色谱图。

图8为本发明实施例中水相为0.1％乙酸时的色谱图。

图9为本发明实施例中流动相B为0.05％乙酸时的色谱图。

图10为本发明实施例中流动相B为0.1％乙酸时的色谱图。

图11为本发明实施例中流动相B为0.2％乙酸时的色谱图。

图12为本发明实施例中柱温为25℃时的色谱图。

图13为本发明实施例中柱温为30℃时的色谱图。

图14为本发明实施例中柱温为35℃时的色谱图。

图15为本发明实施例中专属性实验阴性对照溶液的色谱图。

图16为本发明实施例中专属性实验对照品溶液的色谱图。

图17为本发明实施例中专属性实验供试品溶液的色谱图。

图18为本发明实施例中不同柱温的指纹图谱对比图。

图19为本发明实施例中15批不同批次枇杷叶标汤指纹图谱。

图20为本发明实施例中生成的对照图谱。

具体实施方式

本发明提供一种枇杷叶标准汤剂指纹图谱、特征图谱建立及含量测定方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。

枇杷叶标准汤剂的制备：

取枇杷叶饮片200g，称定，加入2400mL水浸泡30min，采用陶瓷保健壶，先武火(500w)煮沸，再文火(200w)煎煮30min，选择400目标准筛趁热滤过；药渣再加2000mL水，武火煮沸后，再文火煎煮25min，400目标准筛趁热过滤，合并两次滤液，62℃下减压浓缩；滤液减压浓缩至含固量为10％～15％，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得枇杷叶标准汤剂。

实施例1：指纹图谱建立

一、枇杷叶标准汤剂色谱条件的考察

1、色谱条件及***适用性试验

拟定的色谱条件：：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(2.1×100mm，1.6μm)，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％冰醋酸水溶液，按表1程序进行线性梯度洗脱；流速0.4ml/min，柱温30℃；检测波长326nm，进样量为1-2μl(本实施例中进样量均采用1μl)。理论板数以绿原酸计不低于5000。

表1流动相梯度表

时间(min)	流速(ml/min)	流动相B(％)
			0	0.4	95
2	0.4	95
			5	0.4	91
13	0.4	90
			25	0.4	78
39	0.4	20
			39.1	0.4	95
40	0.4	95

(1)检测波长的选择

实验过程：在以上拟定的实验条件基础上，利用PDA检测器对供试品溶液进行190～600nm波段扫描，并提取供试品溶液的色谱图，如图1和图2所示。

结果表明：枇杷叶标汤的色谱峰的紫外吸收集中在230nm-360nm附近，并且230nm～300nm，基线不稳，杂质干扰大，因此本发明中选择326nm作为枇杷叶标准汤剂特征图谱的检测波长。

(2)色谱柱的选择

在相同梯度下，分别考察色谱柱为Waters CORTECS UPLC T3(2.1×100mm，1.6μm)、Waters UPLC BEHC18(2.1×100mm，1.7μm)、Thermo AcclaimTM RSLC PolarAdvantageⅡ(PA2)(2.1×100mm，2.2μm)时，对色谱图的影响。结果如图3～5所示。

结果表明：使用Waters CORTECS T3柱时，色谱峰整体分离效果最好，因此，本发明中选择Waters CORTECS T3(Waters Cortecs T3，1.6μm，2.1*100mm)为枇杷叶特征图谱的液相色谱柱。

(3)流动相水相酸的选择

分别考察水相为水、0.1％甲酸、0.1％乙酸时，对色谱峰的影响。结果如图6～8所示。

结果表明：当流动相B为水时，2.2分钟和2.8分钟两个峰消失；当流动相B为0.1％甲酸时，4-6分钟峰较杂；当流动相B为0.1％乙酸时，4-6分钟为两个分离响应较好的峰，并且整体基线较平稳。因此，选择流动水相为0.1％冰醋酸水溶液。

(4)乙酸浓度的选择

考察流动相B分别为0.05％乙酸、0.1％乙酸、0.2％乙酸，其他条件同上，测定结果如图9～图11所示。

结果显示，流动相B乙酸浓度为0.05％～0.2％对图谱影响不大。本研究流动相B为0.1％乙酸。

(5)柱温的选择

分别考察柱温为25℃、30℃、35℃时，对色谱图峰的影响。

从图12～图14可看出，柱温在25～30℃时，色谱峰均能达到较好的分离。柱温在25～30℃时，对测定结果影响不大。本研究采用柱温为30℃。

综上所述，枇杷叶标准汤剂指纹图谱色谱条件确定为：色谱柱Waters Cortecs T3(2.1×100mm，1.6μm)，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％冰醋酸水溶液，按表1程序进行线性梯度洗脱；流速0.4ml/min，柱温30℃；检测波长326nm。

二、供试品溶液制备方法的建立

1、提取方式选择

称取枇杷叶标准煎液4份，每份0.2g，分成A、B两组，分别精密加甲醇10mL，称重，A组超声30分钟、B组水浴回流30分钟。冷却至室温，称重，用甲醇补足减失的重量。过滤，取续滤液，测定。结果如下表2所示。所述超声提取过程中功率为400W，频率为40kHz。

表2提取方式考察结果

结果表明：超声提取较回流提取效果好。故选择超声提取。

2、提取溶剂选择

称取枇杷叶标准煎液3份，每份0.2g，分别精密加甲醇、乙醇、水各10mL，称重，超声30分钟。放至室温，称重，用相应溶剂补足减失的重量。过滤，取续滤液，测定。结果如下表3所示。

表3提取溶剂对峰面积的影响

溶剂	称样量(g)	总峰面积(mAu*min)	峰面积/称样量
				甲醇	0.2002	55.9460	279.45
乙醇	0.2006	30.2430	150.76
				水	0.2020	56.2032	278.23

结果表明：提取溶剂为乙醇时，色谱峰较少；提取溶剂为甲醇和水时，色谱峰数量响应相差不大。水提取时，大极性色谱峰较高；甲醇提取时，低极性色谱峰较高，为保证与后续药材研究相对应，本发明方案中优选为采用甲醇提取。

3、提取溶剂浓度考察

称取枇杷叶标准煎液3份，每份0.2g，分别精密加甲醇、50％甲醇、70％甲醇各10mL，称重，超声30分钟。放至室温，称重，用相应溶剂补足减失的重量。滤过，取续滤液，测定。结果如下表4所示。

表4提取溶剂浓度的考察结果

结果表明：不同浓度甲醇提取效果差别不大。但50％甲醇提取时，溶液较难滤过；甲醇提取溶剂效应较高，因此选择用70％甲醇超声提取。

4、提取时间考察

称取枇杷叶标准煎液3份，每份0.2g，分别精密加70％甲醇10mL，称重，分别超声15分钟、30分钟和45分钟。放至室温，称重，用相应溶剂补足减失的重量。过滤，取续滤液，测定。结果如下表5所示。

表5超声时间对峰面积的影响

时间(min)	称样量(g)	总峰面积(mAu*min)	峰面积/称样量
				15	0.2022	20.3438	100.61
30	0.2003	20.5994	102.84
				45	0.2012	20.0104	99.46

结果表明：30分钟的提取效果最好，因此，最终选择提取时间为30分钟。

综上所述，枇杷叶标准汤剂指纹图谱供试品溶液的制备方法确定为：取枇杷叶标汤0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇10ml，称定重量，超声30min后放冷，称重，用70％甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

三、方法学验证

1、专属性试验

精密吸取阴性对照溶液(70％甲醇)、对照品溶液(绿原酸，97.314μg/ml)、供试品溶液各1μl，按既定色谱条件下进样测定。如图15～17所示，阴性对照溶液应在无相应的色谱峰。说明供试品溶液指纹图谱测定无干扰，方法专属好。

结果表明，阴性对照溶液无相应色谱峰，证明方法专属性良好。

2、精密度试验

(1)仪器精密度

取供试品溶液1份(B10)，按“4.2.1.6”项色谱条件连续测定6次。记录指纹图谱，带入相似度软件，每个指纹图谱应有11个特征峰，并分别计算与对照指纹图谱的相似度。其结果如下表6所示。

表6精密度实验结果

序号	1	2	3	4	5	6	均值	RSD
									相似度	0.989	0.989	0.987	0.987	0.988	0.987	0.988	0.10％

结果显示，6次测定结果中，每个指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.98，且RSD小于3％。表明方法的精密度良好。

(2)重复性

实验员甲按要求配制枇杷叶标准煎液(B10)指纹图谱供试品溶液6份，在ThermoUHPLC上按既定色谱条件下测定。记录指纹图谱，带入相似度软件，每个指纹图谱应有11个特征峰，并分别计算与对照指纹图谱的相似度。其结果如下表7所示。

表7重复性实验结果

结果显示，6次测定结果中，每个指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.98，且RSD小于3％。表明方法的重复性良好。

(3)中间精密度

实验员乙按要求配制枇杷叶标准煎液(B10)指纹图谱供试品溶液6份，在WaterACQUITY H-class UPLC上按既定色谱条件下测定。记录指纹图谱，带入相似度软件，每个指纹图谱应有11个特征峰，并分别计算与对照指纹图谱的相似度。其结果如下表8所示。

表8指纹图谱中间精密度实验结果

序号	1	2	3	4	5	6	均值	RSD	与重复性RSD
										相似度	0.991	0.995	0.991	0.993	0.993	0.992	0.993	0.15％	0.44％

结果显示，在不同人员配制下，测得每个指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.98，RSD小于3％，与重复性计算RSD小于3％。，表明该方法中间紧密度良好。

(4)耐用性

(a)稳定性考察

在以上拟定的实验条件基础上，取供试品溶液1份，，分别在0、2、4、8、16、24小时测定。记录指纹图谱，带入相似度软件，每个指纹图谱应有11个特征峰，分别计算每个时间段指纹图谱与0小时指纹图谱相似度。结果如下表9所示。

表9指纹图谱稳定性实验相对保留时间结果

时间(h)	0	2	4	8	16	24	均值	RSD
									相似度	1.000	0.999	0.999	0.999	1.000	0.999	0.999	0.05％

结果显示，不同时间段测定结果中，每个指纹图谱与0小时的指纹图谱相似度均大于0.99，且RSD均小于3％。表明样品在24小时内测定结果稳定。

(b)柱温

在以上拟定的实验条件基础上，取供试品溶液1份，在不同柱温条件下进样，记录指纹图谱，计算相似度。

结果：25℃和35℃色谱图与30℃色谱图相似度均大于0.99，色谱图如图18所示，表明该方法柱温的轻微变化对实验结果影响很小。

三、对照图谱的建立

采用拟定的方法对15批样品进行单针指纹图谱的测定，记录指纹图谱，如图19所示，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价***”(2.0版)相似度软件，采用平均值为对照图谱生成方式，多点校正，生成对照图谱，并找到11个共有指纹峰，如图20所示。其中，峰1：新绿原酸；峰3：绿原酸；峰4：隐绿原酸峰。

四、测定

采用中药色谱指纹图谱相似度评价***，对15批枇杷叶标准汤剂样品生成UPLC图谱，与对照图谱进行匹配，其匹配结果如表10所示。实验结果表明15批枇杷叶标准汤剂(冻干粉)相似度均高于0.9，各批质量均一稳定。

表10 15批枇杷叶标准汤剂的指纹图谱匹配结果

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取枇杷叶标准汤剂，加水，进行超声或回流提取，离心，过滤；

2)色谱条件及***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.05～0.2％乙酸水溶液为流动相B；柱温为25～35℃；流速为0.4ml/min，检测波长为230nm-360nm；供试品溶液的进样量为1-2μl；

其中，梯度洗脱程序如下：0～2min，流动相B：95％；2～5min，流动相B：95％；5～13min，流动相B：91％；13～25min，流动相B：78％；25～39min，流动相B：20％；39～39.1min，流动相B：95％；39.1～40min，流动相B：95％；

3)将步骤(1)制备所得供试品溶液注入液相色谱仪，以步骤(2)条件为基础进行测定，得到指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1)中，每0.2g枇杷叶标准汤剂，加浓度为50％～100％甲醇10ml，超声提取15～40分钟；所述超声提取过程中功率为400W，频率为40kHz。

3.根据权利要求3所述的枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1)中，加浓度为70％甲醇，超声提取30分钟。

4.根据权利要求1所述的枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2)中，采用Waters Cortecs T3色谱柱，填料粒径为1.6μm，内径2.1，柱长100mm。

5.根据权利要求1所述的枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2)中，以0.1％乙酸水溶液为流动相B；柱温为30℃；检测波长为326nm。

6.根据权利要求1所述的枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤3)中供试品溶液的进样量为1μl。

7.根据权利要求1所述的枇杷叶标准汤剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，还包括以下步骤：

4)将得到的指纹图谱与对照图谱进行相似度计算；所述对照图谱如图20所示。