CN110358690B - 一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用，该耐抑制物的酿酒酵母，命名为ZR/SC‑UV‑2，分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.17924，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其选育方法为：以能够利用木糖的酿酒酵母菌为出发菌株，经过紫外诱变筛选得到所述耐抑制物的酿酒酵母菌。所述紫外诱变的条件为：避光条件下，采用15～20W紫外灯在15～20cm的照射距离下照射30～600s，进行紫外诱变。与现有技术相比，本发明酿酒酵母菌对纤维素水解液中的抑制物耐受性强、对木糖的降解率高、发酵时间短，适用于农业秸秆制备乙醇的产业化生产。

Description

一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用
技术领域
本发明涉及一种酿酒酵母菌，尤其是涉及一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用。
背景技术
燃料乙醇是由生物资源经过一系列的物理、生物、化学变化过程而获得，是一种洁净、可再生、生产过程不净排放碳的交通燃料，是目前使用量最大的生物运输燃料。其中，以农作物秸秆等为代表的木质纤维素类生物质具有廉价、来源丰富的特点，是燃料乙醇产业规模化发展公认的原料来源(Hossain Zabed,Jaya Narayan Sahu,Akter Suely,etal.Bio-ethanol production from renewable sources:current perspectives andtechnological progress.Renewable and Sustainable Energy Reviews,2017,71:475-501.)。
木质纤维素原料经过预处理和水解转化为单糖，主要是葡萄糖和木糖，微生物发酵单糖可产生乙醇。酿酒酵母具有优秀的产乙醇能力和环境耐受力等优点，广泛用于乙醇的生产，但酿酒酵母用于纤维素原料的燃料乙醇生产，面临两个重要问题，一是木糖的发酵，二是对各种抑制物的耐受能力。木质纤维素原料在预处理和水解过程中产生各种副产物，主要包括弱酸类(甲酸、乙酸和乙酰丙酸)、呋喃类(糠醛、5～羟甲基糠醛)和酚类(丁香醛、香草醛和苯酚等)，它们的存在会严重阻碍酿酒酵母菌株的细胞生长和乙醇发酵(Palmqvist E,Hahn
Figure BDA0002141941230000011
B.Fermentation of Lignocellulosic hydrolysates.I:inhibition and detoxification.Bio-resource Technology,2000,74(1):17-24.)，因此提高酿酒酵母的抑制物耐受性对燃料乙醇工业化生产尤为重要。
因此，需要考虑纤维素水解液中存在各种抑制物可能抑制菌株对木糖的利用，需要进一步改进和提高酿酒酵母性能，提高其对抑制物的耐受性，从而构建一种耐抑制物的酿酒酵母。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种耐抑制物的酿酒酵母菌及其选育方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种耐抑制物的酿酒酵母菌，命名为ZR/SC-UV-2，分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.17924，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明的一个实施方式中，所述抑制物包括弱酸类物质、呋喃类物质或酚类物质中的一种或几种。
在本发明的一个实施方式中，所述弱酸类物质包括甲酸、乙酸和乙酰丙酸等。
在本发明的一个实施方式中，所述呋喃类物质包括糠醛、5-羟甲基糠醛等。
在本发明的一个实施方式中，所述酚类物质包括丁香醛、香草醛和苯酚等。
在本发明的一个实施方式中，所述抑制物为木质纤维素水解液中存在的抑制物。
本发明还提供一种耐抑制物的酿酒酵母菌的选育方法，为以能够利用木糖的酿酒酵母菌为出发菌株，经过紫外诱变筛选得到耐抑制物的酿酒酵母菌。
在本发明的一个实施方式中，能够利用木糖的酿酒酵母菌为菌株ZR-1，菌株ZR-1分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.18090，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明的一个实施方式中，所述紫外诱变的条件为：避光条件下，采用15～20W紫外灯在15～20cm的照射距离下照射30～600s，进行紫外诱变。
在本发明的一个实施方式中，照射过程中，对出发菌株的孢子进行搅拌，搅拌速率为50～100r/min，此过程中，菌株的孢子存活率为5～10％。
在本发明的一个实施方式中，所述耐抑制物的酿酒酵母菌的选育方法具体包括以下步骤：
(1)出发菌株初筛：以能够利用木糖的酿酒酵母菌为出发菌株，将出发菌株在涂布于YPD平板上活化，取一环活化好的出发菌株接种于YPD培养基内，搅拌，进行出发菌株预培养；
(2)紫外线诱变育种：取在YPD培养基中培养好的菌株，加入含有EDTA水溶液的培养皿内，在搅拌液体的同时，采用紫外灯照射培养皿，然后将培养皿内液体稀释后涂布于抑制物平板培养基上；
(3)耐抑制物的酿酒酵母菌的分离筛选：将已涂布的抑制物平板培养基避光培养3-4d；在所述抑制物平板培养基上，初步挑取若干个生长快且菌落大的单菌落，接种于抑制物发酵培养基中发酵培养，检测木糖含量；根据木糖利用情况筛选出若干个能高效利用木糖的菌株；
(4)水解液发酵复筛：将步骤(3)筛选得到的菌株分别接种到种子培养基，取部分菌液接种到水解液发酵培养基中进行发酵，检测木糖含量，挑选木糖利用率最高的菌株，得到所述耐抑制物的酿酒酵母菌。
在本发明的一个实施方式中，所述YPD培养基为通用培养基，质量百分含量的组成为：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，余量为水，其pH为4.8～5.0；固体平板需额外添加2％的琼脂。
在本发明的一个实施方式中，所述EDTA水溶液的摩尔浓度为0.5～0.8mol/L。
在本发明的一个实施方式中，所述抑制物平板培养基包括以下质量百分含量的组分：木糖3.0～5.0％，蛋白胨1.0～3.0％，酵母膏1.0～2.0％，抑制物0.15～0.60％，琼脂1.5～2.0％，余量为水，该培养基经高温105～120℃，灭菌10～60min。
在本发明的一个实施方式中，所述抑制物发酵培养基包括以下质量百分含量的组成：葡萄糖6.0～9.0％，木糖3～5％，蛋白胨1.0～3.0％，酵母膏1.0～2.0％，抑制物0.15～0.60％，余量为水，该培养基经高温105～120℃，灭菌10～60min。
在本发明的一个实施方式中，所述种子培养基包括以下质量百分含量的组成：葡萄糖3.0～5.0％，木糖2.0～4.0％，蛋白胨1.0～3.0％，酵母膏1.0～2.0％，余量为水，其pH为4.0～5.5；
在本发明的一个实施方式中，所述水解液发酵培养基通过在木质纤维素水解液中添加蛋白胨和酵母膏制备得到，所述蛋白胨的质量百分含量为1.0～3.0％，酵母膏的质量百分含量为1.0～2.0％，该培养基经高温105～120℃灭菌，10～60min。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述出发菌株的活化温度为28～32℃，优选为30℃，活化时间为20～24h；出发菌株预培养温度为28～32℃，预培养时间为12～18h，搅拌速率为120～180r/min。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，取已培养好的菌株，加入EDTA水溶液，菌株和EDTA水溶液的体积比为1:4～8，优选为1:5。
在本发明的一个实施方式中，所述紫外灯的照射距离为15～20cm，照射时间为30～600s，紫外灯的功率为15～20W，照射过程中搅拌速率为50～100r/min，此过程中，菌株的细胞存活率为5～10％。本发明优化了紫外线照射的强度和时间，因为这会影响细胞的突变，在本发明的照射条件下，能够通过筛选得到想要的菌株。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，在抑制物平板培养基上，初步挑取的单菌落的个数为10～50个，优选为20个；所述抑制物发酵培养基的用量为1～10ml，优选为5ml，菌株的发酵培养时间为48～72h。
在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，所述水解液发酵培养基上的菌株接种量为10～20％；发酵时间为48～72h。
本发明还提供一种耐抑制物的酿酒酵母菌的应用，用于降解木质纤维素水解液中木糖；其中，发酵时间为48～72h的条件下，木糖的降解率为72.6％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)该耐抑制物的酿酒酵母菌对纤维素水解液中的弱酸类、呋喃类以及酚类的耐受性更高，能够直接应用于纤维素水解液中，对木糖进行利用降解，从而提高木质纤维素制备乙醇过程中乙醇的收率；
(2)在纤维素水解液中，对其中的木糖利用率超过70％，提高了对水解液木糖的利用率，适用于农业秸秆制备乙醇的产业化生产；
(3)本发明的菌株的发酵时间短，以纤维素水解液中的木糖为底物，发酵48～72h即可以实现72.6％木糖的利用，较短的发酵周期可以大大提高设备的利用率。
附图说明
图1为紫外线诱变育种后初步挑取的20个单菌落对木糖的消耗率；
图2为水解液发酵复筛过程中挑取的菌株对木糖的消耗率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种耐抑制物的酿酒酵母菌，命名为ZR/SC-UV-2，分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.17924，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述抑制物包括弱酸类物质、呋喃类物质或酚类物质中的一种或几种。所述弱酸类物质包括甲酸、乙酸和乙酰丙酸等。所述呋喃类物质包括糠醛、5-羟甲基糠醛等。所述酚类物质包括丁香醛、香草醛和苯酚等。
本实施例中的耐抑制物的酿酒酵母菌为以能够利用木糖的酿酒酵母菌为出发菌株，经过紫外诱变筛选得到耐抑制物的酿酒酵母菌。
本实施例中，出发菌株为菌株ZR-1，菌株ZR-1分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.18090，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本实施例提供一种耐抑制物的酿酒酵母菌的选育方法，包括以下步骤：
1、选育过程中使用的培养基或者培养液的制备
所述YPD培养基为通用培养基，质量百分含量的组成为：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，余量为水，其pH为4.8～5.0；固体平板需额外添加2％的琼脂。
EDTA水溶液的摩尔浓度为0.5mol/L；
抑制物平板培养基包括以下质量百分含量的组成：木糖3.0％，蛋白胨2.0％，酵母膏1.0％，糠醛0.15％，羟甲基糠醛0.15％，苯酚0.15％，琼脂1.5％，余量为水，该培养基经高温105℃，灭菌60min；
抑制物发酵培养基包括以下质量百分含量的组成：葡萄糖8％，木糖4％，蛋白胨2.0％，酵母膏1.0％，糠醛0.2％，羟甲基糠醛0.2％，苯酚0.2％，余量为水，该培养基经高温105℃灭菌60min；
种子培养基包括以下质量百分含量的组成：葡萄糖3.0％，木糖2.0％，蛋白胨2.0％，酵母膏1.0％，余量为水，其pH为4.8左右；
水解液发酵培养基通过在木质纤维素水解液中添加蛋白胨和酵母膏制备得到，蛋白胨的质量百分含量为2％，酵母膏的质量百分含量为1％，该培养基经高温105℃灭菌60min。
2、酿酒酵母菌的选育
(1)出发菌株初筛：将出发菌株在涂布于YPD平板上于30℃活化22h，用接种环取一环菌体活化好的出发菌株接种于YPD培养基内，搅拌，于30℃、160r/min的搅拌条件下，对出发菌株预培养16h；
(2)紫外线诱变育种：取含有菌株的YPD培养基，按照稀释比为1:5进行加水稀释，然后取1mL加入含有5mL的EDTA水溶液的培养皿内(为了保证后续驯化初始活菌体数量，紫外诱变时准备多个平行样)；在以80r/min的转速条件搅拌液体的同时，采用15W的紫外灯照射培养皿，照射距离为20cm，照射时间为600s；此过程中，菌株的细胞存活率为8％；
(3)耐抑制物的酿酒酵母菌的分离筛选：取上述紫外诱变后的菌液按照稀释比为1:5加水稀释，稀释后涂布于抑制物平板培养基上，30℃下避光培养72h；在抑制物平板培养基上，初步挑取20个生长快且菌落大的单菌落，接种于5ml的抑制物发酵培养基中发酵培养60h，发酵结束后检测木糖含量，检测结果如图1所示，由发酵结果可知，1、2、5、15号菌的木糖利用率明显高于对照菌(对照菌为出发菌株)，说明这4株菌能够在含有抑制物的环境中高效的利用木糖。根据木糖含量的消耗率筛选出这4个能高效利用木糖的菌株；
(4)水解液发酵复筛：将步骤(3)筛选得到的4个菌株分别接种到种子培养基，取部分菌液按照接种量为15％接种到水解液发酵培养基中进行发酵60h，检测木糖含量，检测结果如图2所示，从图2中挑选木糖利用率最高的菌株，得到耐抑制物的酿酒酵母菌。由图2结果可知，与在含抑制物的纯糖培养基中的发酵结果不同，只有1号和2号菌表现出了较高的木糖利用率，其中1号菌在水解液中发酵72h的条件下，木糖的降解率达到了72.6％；而原始的出发菌株，其对木糖的降解率仅为20.6％，因此，本实施例得到的耐抑制物的酿酒酵母菌能够更好的降解纤维素水解液中木糖。
实施例2
本实施例中，出发菌株为菌株ZR-1，菌株ZR-1分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.18090，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本实施例提供一种耐抑制物的酿酒酵母菌的选育方法，包括以下步骤：
1、选育过程中使用的培养基或者培养液的制备
所述YPD培养基为通用培养基，质量百分含量的组成为：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，余量为水，其pH为4.8～5.0；固体平板需额外添加2％的琼脂。
EDTA水溶液的摩尔浓度为0.5mol/L；
抑制物平板培养基包括以下质量百分含量的组成：木糖3.0％，蛋白胨2.0％，酵母膏1.0％，糠醛0.15％，羟甲基糠醛0.15％，苯酚0.15％，琼脂1.5％，余量为水，该培养基经高温105℃，灭菌60min；
抑制物发酵培养基包括以下质量百分含量的组成：葡萄糖6.0％，木糖3％，蛋白胨2.0％，酵母膏1.0％，糠醛0.15％，羟甲基糠醛0.15％，苯酚0.15％，余量为水，该培养基经高温105℃，灭菌60min；
种子培养基包括以下质量百分含量的组成：葡萄糖3.0％，木糖2.0％，蛋白胨2.0％，酵母膏1.0％，余量为水，其pH为4.8；
水解液发酵培养基通过在木质纤维素水解液中添加蛋白胨和酵母膏制备得到，蛋白胨的质量百分含量为2％，酵母膏的质量百分含量为1％，该培养基经高温105℃灭菌60min。
2、酿酒酵母菌的选育
(1)出发菌株初筛：将出发菌株在涂布于YPD平板上于28℃活化24h，用接种环取一环菌体活化好的出发菌株接种于YPD培养基内，搅拌，于28℃、120r/min的搅拌条件下，对出发菌株预培养18h；
(2)紫外线诱变育种：取含有菌株的YPD培养基，按照稀释比为1:4进行加水稀释，然后取1mL加入含有5mL的EDTA水溶液的培养皿内(为了保证后续驯化初始活菌体数量，紫外诱变时准备多个平行样)；在以50r/min的转速条件搅拌液体的同时，采用15W的紫外灯照射培养皿，照射距离为20cm，照射时间为600s；此过程中，菌株的细胞存活率为10％；
(3)耐抑制物的酿酒酵母菌的分离筛选：取上述紫外诱变后的菌液按照稀释比为1:4加水稀释，稀释后涂布于抑制物平板培养基上，28℃下避光培养48h；在所述抑制物平板培养基上，初步挑取10个生长快且菌落大的单菌落，接种于1ml的抑制物发酵培养基中发酵培养72h，发酵培养后检测木糖含量；根据木糖含量的消耗率筛选出4个能高效利用木糖的菌株；
(4)水解液发酵复筛：将步骤(3)筛选得到的4个菌株分别接种到种子培养基，取部分菌液按照接种量为10％接种到水解液发酵培养基中进行发酵72h，检测木糖含量从中挑选木糖利用率最高的菌株，得到耐抑制物的酿酒酵母菌。
本实施例的耐抑制物的酿酒酵母菌用于降解纤维素生产乙醇的过程中的纤维素水解液中木糖；其中，发酵时间为72h的条件下，木糖的降解率达到了55.2％；相比于原始的出发菌株，其对木糖的降解率仅为20.6％，因此，本实施例得到的耐抑制物的酿酒酵母菌能够更好的降解纤维素水解液中木糖。
实施例3
本实施例中，出发菌株为菌株ZR-1，菌株ZR-1分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为：CGMCC No.18090，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本实施例提供一种耐抑制物的酿酒酵母菌的选育方法，包括以下步骤：
1、选育过程中使用的培养基或者培养液的制备
所述YPD培养基为通用培养基，质量百分含量的组成为：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，余量为水，其pH为4.8～5.0；固体平板需额外添加2％的琼脂。
EDTA水溶液的摩尔浓度为0.5mol/L；
抑制物平板培养基包括以下质量百分含量的组成：木糖5.0％，蛋白胨1.0％，酵母膏2％，糠醛0.20％，羟甲基糠醛0.20％，苯酚0.20％，琼脂2.0％，余量为水，该培养基经高温120℃，灭菌20min；
抑制物发酵培养基包括以下质量百分含量的组成：葡萄糖9.0％，木糖5％，蛋白胨1.0％，酵母膏2％，糠醛0.20％，羟甲基糠醛0.20％，苯酚0.20％，余量为水，该培养基经高温120℃，灭菌20min；
种子培养基包括以下质量百分含量的组成：葡萄糖5.0％，木糖4.0％，蛋白胨1.0％，酵母膏2.0％，余量为水，其pH为4.8；
水解液发酵培养基通过在木质纤维素水解液中添加蛋白胨和酵母膏制备得到，蛋白胨的质量百分含量为1％，酵母膏的质量百分含量为2％，该培养基经高温120℃灭菌20min。
2、酿酒酵母菌的选育
(1)出发菌株初筛：将出发菌株在涂布于YPD平板上于32℃活化20h，用接种环取一环菌体活化好的出发菌株接种于YPD培养基内，搅拌，于32℃、180r/min的搅拌条件下，对出发菌株预培养12h；
(2)紫外线诱变育种：取含有菌株的YPD培养基，按照稀释比为1:8进行加水稀释，然后取1mL加入含有5mL的EDTA水溶液的培养皿内(为了保证后续驯化初始活菌体数量，紫外诱变时准备多个平行样)；在以100r/min的转速条件搅拌液体的同时，采用20W的紫外灯照射培养皿，照射距离为15cm，照射时间为30s；此过程中，菌株的细胞存活率为5％；
(3)耐抑制物的酿酒酵母菌的分离筛选：取上述紫外诱变后的菌液按照稀释比为1:8加水稀释，稀释后涂布于抑制物平板培养基上，于32℃下避光培养24h；在所述抑制物平板培养基上，初步挑取50个生长快且菌落大的单菌落，接种于10ml的抑制物发酵培养基中发酵培养72h，发酵培养后检测木糖含量；根据木糖含量的消耗率筛选出4个能高效利用木糖的菌株；
(4)水解液发酵复筛：将步骤(3)筛选得到的4个菌株分别接种到种子培养基，取部分菌液按照接种量为20％接种到水解液发酵培养基中进行发酵48h，检测木糖含量从中挑选木糖利用率最高的菌株，得到耐抑制物的酿酒酵母菌。
本实施例的耐抑制物的酿酒酵母菌用于降解纤维素生产乙醇的过程中的纤维素水解液中木糖；其中，发酵时间为72h的条件下，木糖的降解率达到了33.6％；相比于原始的出发菌株，其对木糖的降解率仅为20.6％，因此，本实施例得到的耐抑制物的酿酒酵母菌能够更好的降解纤维素水解液中木糖。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (2)

1.一种耐抑制物的酿酒酵母菌，其特征在于，该耐抑制物的酿酒酵母，命名为ZR/SC-UV-2，分类命名为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2019年06月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.17924，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种如权利要求1所述的耐抑制物的酿酒酵母菌的应用，其特征在于，所述耐抑制物的酿酒酵母菌用于降解木质纤维素水解液中木糖；其中，发酵时间为72h的条件下，木糖的降解率为72.6％。
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