CN110354139A

CN110354139A - 一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物及其应用

Info

Publication number: CN110354139A
Application number: CN201910755961.6A
Authority: CN
Inventors: 侯永清; 易丹; 吴涛; 丁斌鹰
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2019-10-22
Anticipated expiration: 2039-08-15
Also published as: CN110354139B

Abstract

本发明公开了一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物及其应用，所述组合物包括氧化锌和单月桂酸甘油酯，两者的质量比为0.5~2：1，具有显著的抑制猪流行性腹泻病毒复制、降低猪流行性腹泻病毒毒力的效果，可以作为饲料添加剂或口服剂，克服了接种疫苗可能出现的免疫失败和抗病毒药物使用导致的病毒变异等缺点，对动物体无任何毒副作用，可安全使用。

Description

一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物及其应用

技术领域

本发明属于猪病毒病防治技术领域，更具体涉及一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物及其应用。

背景技术

当前，我国疫病防控形势日趋严峻，而应对措施十分有限，导致养猪生产面临巨大挑战。由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪流行性腹泻(PED)是猪的一种的急性肠道传染病，已在世界各国范围内重复爆发。我国在2010年爆发全国范围内的PEDV感染，给养猪业带来了巨大的经济损失。PEDV感染的主要临床症状为采食量大幅度降低，腹泻呈水样并且伴随着呕吐，严重时甚至脱水，各个年龄和品种的猪只都有可能感染发病，受其危害最为严重的是哺乳期仔猪，发病率高达100％，是当前导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。自然条件下，仔猪感染PEDV的潜伏期是1～2天，人工感染的潜伏期根据攻毒剂量不同在8～24小时之间，潜伏期内的仔猪体温会升高，随后出现呕吐或者腹泻的症状。

目前为止，除了PEDV的灭活和弱毒疫苗，尚无有效的防治措施。虽然大部分养猪户会通过接种疫苗来预防PED，但是由于疫苗质量参差不齐等原因，接种后的效果也不理想。在我国高密度的养殖状况下，大剂量的抗病毒药物滥用，导致病毒株的变异速度超过了疫苗研制的速度，大规模流行病时常爆发。通过给猪饲喂安全有效的抗PEDV感染的功能性营养物质十分必要，应用前景良好。

单月桂酸甘油酯又称为十二酸单甘油酯，属于中链脂肪酸酯，天然存在于母乳、椰子油和美洲蒲葵中，化学合成的产品外观一般为鳞片状或油状、白色或浅黄色的细粒状结晶，是一种优良的食品乳化剂，属于无毒食品添加剂。单月桂酸甘油酯具有优良的乳化功能和广泛的抗菌作用。氧化锌作为一种有效的抗仔猪腹泻物质在饲料上应用广泛，但其添加剂量过大带来的养殖污染引起了公众的关注，政府已对氧化锌作为饲料添加剂中的使用阶段和剂量做出了严格规定。氧化锌价格低廉、使用保持方便、添加效果明显，可以提高仔猪抗氧化应激能力、生长性能和免疫功能，减少肠道食糜中大肠杆菌的数量。尽管目前有月桂酸甘油酯对囊膜病毒有抑制效果的报道，但是有关月桂酸甘油酯抗PEDV的研究还尚未见报道，更没有关于单月桂酸甘油酯和氧化锌复合物抗PEDV感染的研究报道。关于复合单月桂酸甘油酯和氧化锌的发明专利(CN201511015521.5、CN201510268143.5)均是用于氧化锌的制备，并未涉及抗猪流行性腹泻病毒感染的应用。而有关单月桂酸甘油酯的专利更多是集中在饲料的防霉、动物的消化吸收等方面，现有技术并未公开单月桂酸甘油酯和氧化锌组合使用可以对抗流行性腹泻病毒。

发明内容

本发明的目的是提供了一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物，具有安全性高、应用方便，对猪流行性腹泻病毒感染保护率高的效果。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术措施如下：

一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物，包括氧化锌和单月桂酸甘油酯，氧化锌和单月桂酸甘油酯质量比为0.5～2：1。

上述组合物在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用：

将上述比例的氧化锌和单月桂酸甘油酯组合物直接添加至饲料，添加量为猪饲料总重量的0.1％～0.3％；

或将上述比例的氧化锌和单月桂酸甘油酯组合物与载体制成粉剂，以40～120mg/kg体重的剂量给猪口服给药；

所述的载体包括蒙脱石、蛭石、沸石粉、白炭黑、脱脂米糠、玉米芯粉、淀粉、麸皮中的任意一种或其组合物；

或将上述比例的氧化锌和单月桂酸甘油酯组合物与溶剂及辅料混合制成口服液，以40～120mg/kg体重的剂量给猪口服给药；

所述的溶剂包括甲酸、乙酸、无水乙醇、丙二醇、二甲基亚砜、吐温80中的任意一种或其组合物，辅料包括乳糖、甘露醇、可溶性淀粉中任意的一种或其组合物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、虽然单月桂酸甘油酯和氧化锌具有一定的抗PEDV能力，但通过复配单月桂酸甘油酯和氧化锌形成组合物，可充分发挥二者之间的协同抗PEDV作用，一方面氧化锌的锌离子从病毒内部与氨基酸结合，而单月桂酸甘油酯则与病毒包膜结合，协同抑制病毒增殖；另一方面，氧化锌与单月桂酸甘油酯可能在肠道内结合生产脂酸锌，保护肠上皮黏膜层。

2、本发明的抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物，是以营养物质氧化锌和单月桂酸甘油酯为基础通过0.5～2：1复配研制而成，具有显著的抑制PEDV复制、降低PEDV毒力的效果，只需在饲料中添加或经口服即可起到预防与治疗仔猪流行腹泻病毒感染的作用，克服了接种疫苗可能出现的免疫失败和抗病毒药物使用导致的病毒变异等缺点，对动物体无任何毒副作用，可安全使用。

具体实施方式

实施例1

氧化锌和单月桂酸甘油酯组合物对猪流行性腹泻病毒(PEDV)体外增殖的抑制作用

(1)试验材料：非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)用于猪流行性腹泻病毒的培养，PED病毒(YN株)由华中农业大学国家农业微生物重点实验室分离、保存并馈赠；DMEM培养基、EDTA、胰酶、胎牛血清和双抗(青链霉素)均购自GIBCO公司，氧化锌和单月桂酸甘油酯购自Sigma公司。

(2)试验方法：将试验分为三个试验组、一个空白组、一个氧化锌组和一个单月桂酸甘油酯组，试验组分别在培养基中加入不同剂量的组合物(组合物中氧化锌与单月桂酸甘油酯的重量比为1:1)，其中组合物低剂量组(按照100μmol/L培养基添加)、组合物中剂量组(按照1mmol/L培养基添加)、组合物组(按照10mmol/L培养基添加)，空白对照组(培养基中不添加组合物)，氧化锌组(按50μmol/L培养基添加)，单月桂酸甘油酯组(按50μmol/L培养基添加)。

PEDV体外增殖的抑制试验：首先将PED病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7六个稀释度，分别接种于已培养好的Vero细胞单层的96孔板，100μL/孔，每个组分别加入含有不同浓度组合物的DMEM培养液，置37℃含5％CO₂培养箱中继续培养48h，观察细胞病变。统计每个稀释度的细胞孔中病变阳性孔数，利用Reed-Muench法计算出每个组的TCID₅₀，比较不同组TCID₅₀的值确定组合物对PEDV体外增殖的抑制作用，每个组做三个重复。

(3)实验结果：

A、组合物对PEDV体外增殖的抑制作用

表1组合物对不同病毒的TCID₅₀影响

表1结果显示：在细胞培养液中添加不同浓度的组合物显著影响PEDV在Vero细胞上的TCID₅₀值，随着组合物在细胞培养液中添加量的增加，PEDV在Vero细胞上的TCID₅₀显著下降，说明本发明的组合物对PEDV在体外培养的Vero细胞中的增殖具有明显的抑制作用。此外，与单独添加氧化锌或单月桂酸甘油酯相比，组合物对PEDV增殖的抑制作用明显更强，表明二者的协同抗PEDV作用效果更好。

B、组合物对体外PEDV感染Vero细胞活力的影响

表2组合物对PEDV感染Vero细胞OD₄₅₀的影响

由表2可知，在细胞培养液中添加不同浓度的组合物显著影响PEDV感染Vero细胞OD₄₅₀值，随着组合物在细胞培养液中添加量的增加，Vero细胞的OD₄₅₀值显著增加，说明本发明的组合物促进了Vero细胞的增殖，增强了Vero细胞抗PEDV感染的能力。此外，与单独添加氧化锌或单月桂酸甘油酯相比，组合物促进Vero细胞、对PEDV感染的Vero细胞的保护作用更明显。

实施例2

氧化锌和单月桂酸甘油酯组合物对PEDV感染仔猪的保护作用

(1)材料与方法：210头21日龄，一次性断奶的体重和性别一致的断奶仔猪随机分为7组：对照组、PEDV组、PEDV+0.033％氧化锌组、PEDV+0.067％单月桂酸甘油酯组、PEDV+0.1％组合物组(氧化锌与单月桂酸甘油酯的重量比为0.5:1)、PEDV+0.2％组合物组(氧化锌与单月桂酸甘油酯的重量比为2:1)、PEDV+0.3％组合物组(氧化锌与单月桂酸甘油酯的重量比为2:1)。每组分3个重复(栏)，每栏10头。各组饲喂的基础日粮一致。PEDV+0.03％氧化锌组和PEDV+0.07％单月桂酸甘油酯组仔猪分别饲喂含0.033％氧化锌和0.067％单月桂酸甘油酯的基础日粮。PEDV+0.1％组合物组、PEDV+0.2％组合物组和PEDV+0.3％组合物组仔猪分别饲喂含0.1％组合物、0.2％组合物和0.3％组合物的基础日粮。而对照组和PEDV组均饲喂添加0.04％硫酸抗敌素预混剂的基础日粮。饲喂7天后，对PEDV组、PEDV+0.033％氧化锌组、PEDV+0.067％单月桂酸甘油酯组、PEDV+0.1％组合物组、PEDV+0.2％组合物组和PEDV+0.3％组合物组仔猪以10^4.5TCID₅₀/mL的PEDV(YN株)攻毒，每头口服灌注5.0mL，然后隔离饲养，连续观察3天至试验结束。每天观察试验仔猪的腹泻情况，试验期满屠宰试验仔猪观察肠道病变，同时统计死亡猪数，计算生产性能和腹泻率。组合物对PEDV的抑制作用，通过实时定量PCR检测仔猪肠道黏膜中PEDV结构基因N或M的表达量来确定。仔猪的抗病毒能力、免疫功能等通过抗病毒基因表达和ELISA试剂盒法测定。

(2)试验结果

A、生长性能

表1组合物对仔猪生长性能的影响

注：同行肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

由表1可知，应用本发明所述的组合物作为仔猪抗PEDV感染，与PEDV组相比，饲料中添加0.033％氧化锌、0.067％单月桂酸甘油酯、0.1％组合物、0.2％组合物、0.3％组合物分别提高仔猪平均日增重74％、93％、142％、118％、134％(P＜0.05)，降低料重比7.43％、10.40％、20.30％、15.84％、18.32％(P＜0.05)，显著降低腹泻率32.5％、40.9％、79.5％、74.6％、77.4％(P＜0.05)。因此，应用氧化锌和单月桂酸甘油酯组合物，可以改善PEDV感染仔猪的生长性能，减少仔猪的腹泻率，使PEDV感染仔猪生产性能恢复到正常水平，且效果明显优于单独添加氧化锌或者单月桂酸甘油酯。

B、肠道PEDV增殖

表2组合物对仔猪肠道PEDV结构基因N和M表达的影响

由表2可知，与PEDV组相比，饲料中添加0.033％氧化锌、0.067％单月桂酸甘油酯、0.1％组合物、0.2％组合物、0.3％组合物分别使仔猪空肠PEDV结构基因N的表达降低了33.20％、50％、82.52％、83.11％、84.45％(P＜0.05)，使空肠PEDV结构基因M的表达降低了23.00％、25.48％、58.17％、38.50％、34.90％(P＜0.05)，使结肠PEDV结构基因N的表达降低了63.94％、73.45％、92.83％、94.73％、93.72％(P＜0.05)，使结肠PEDV结构基因M的表达降低了54.94％、58.80％、82.53％、81.87％、78.67％(P＜0.05)。因此，饲料中单独添加氧化锌或单月桂酸甘油酯虽然都可降低PEDV毒力，抑制PEDV复制，但本发明的组合物效果更佳。

C、肠道抗病毒基因表达与免疫功能

表3组合物对仔猪肠道抗病毒基因表达与免疫功能的影响

由表3可知，应用本发明所述的组合物作为仔猪抗PEDV感染，与对照组相比，饲料中添加0.2％、0.4％、0.6％的组合物均可提高降低血液炎性因子IL-1β、IL-8和IL-6的含量，缓解了PEDV感染导致的炎性反应。而饲料中单独添加氧化锌或单月桂酸甘油酯缓解PEDV诱导的炎性反应效果不如本发明的组合物。此外，饲料中添加0.1％、0.2％、0.3％的组合物也降低了肠道ISG15、MX1和S100A12的表达，表明本发明组合物抑制了肠道PEDV的复制，降低了PEDV的毒力，使仔猪肠道抗病毒蛋白处于正常水平，增进仔猪的肠道健康。而单独添加氧化锌仅降低了肠道S100A12的表达，对ISG15和MX1的表达作用效果不如本发明的组合物。由此可见，由氧化锌和单月桂酸甘油酯复配形成的抗PEDV感染组合物，可充分发挥二者的协同抗PEDV感染作用。

实施例3

一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物及其应用，其步骤是：

(1)称取单月桂酸甘油酯10g、蒙脱石30g混合均匀；

(2)称取20g氧化锌加入步骤(1)混合物中，混合均匀；

(3)获得一种抗猪流行性腹泻病毒感染的混合物(组合物与载体的质量比例＝1:1)，其中组合物中氧化锌与单月桂酸甘油酯按重量比为2:1；

(4)作为平时预防猪流行性腹泻病毒感染使用，将混合物按照饲料总重量0.2％的添加量添加于饲料中(实际单月桂酸甘油酯与氧化锌组合物的添加剂量为0.1％)，在整个饲养周期使用；

(5)用于临床猪流行性腹泻病毒感染治疗的时候，可以将混合物按照饲料总重量0.6％的剂量添加于饲料中饲喂(实际单月桂酸甘油酯与氧化锌组合物的添加剂量为0.3％)，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

实施例4

(1)称取单月桂酸甘油酯100g、氧化锌50g，混合均匀；

(2)获得一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物，其中氧化锌与单月桂酸甘油酯按重量比为0.5:1；

(3)称取组合物12g、5％乙酸5mL、无水乙醇15mL、吐温-80 30mL、注射用水加至100mL，混合均匀；

(4)获得一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物口服液(120mg/mL)；

(5)作为平时预防猪流行性腹泻病毒感染使用，可以按照40mg/kg体重给猪口服给药，在整个饲养周期使用；

(6)用于临床猪流行性腹泻病毒感染治疗的时候，可以将口服液按照120mg/kg体重剂量直接给猪口服给药；或将口服液按照120mg/kg体重剂量与日粮混合，添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

实施例5

(1)称取单月桂酸甘油酯100g、氧化锌100g，混合均匀；

(2)获得一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物，其中氧化锌与单月桂酸甘油酯按重量比为1:1；

(3)称取组合物50g、可溶性淀粉50g或麸皮50g，混合均匀，过60目筛，分装即得粉剂；

(4)作为平时预防猪病时使用，可以按照40mg/kg体重的剂量给猪口服给药，在整个饲养周期使用；

(5)当用于临床治疗猪病的时候，可以按照120mg/kg体重的剂量将粉剂给猪口服给药；或将粉剂按照120mg/kg体重的剂量溶于水中，或添加于饲料中使用，每天早中晚添加三次，连续使用一周。

Claims

1.一种抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物，其特征在于，包括氧化锌和单月桂酸甘油酯，两者的质量比为0.5~2：1。

2.根据权利要求1所述的抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物，其特征在于，还包括载体，所述的载体包括蒙脱石、蛭石、沸石粉、白炭黑、脱脂米糠、玉米芯粉、淀粉、麸皮中的任意一种或其组合物。

3.根据权利要求1所述的抗猪流行性腹泻病毒感染的组合物，其特征在于，所述的组合物为口服液，还包括溶剂。

4.权利要求1至3中任一项所述的组合物在制备防治猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，氧化锌和单月桂酸甘油酯组合物直接添加至饲料中，添加量为猪饲料总重量的0.1%~0.3%；或氧化锌和单月桂酸甘油酯组合物制成粉剂或水剂后，以40~120mg/kg体重的剂量给猪口服给药。