CN108473945A - 用于在细菌细胞培养物中生产多糖的培养基和发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在细菌细胞培养物中生产多糖的培养基和发酵方法。在一方面，本发明涉及包含植物水解产物、酵母提取物和碳源的复合培养基。在另一方面，本发明涉及具有大于约50 mM的总氨基酸浓度的确定成分培养基。本发明的另一方面涉及补料分批和灌注发酵方法用于培养产多糖细菌的用途。

Description

用于在细菌细胞培养物中生产多糖的培养基和发酵方法
发明领域
本发明涉及用于在细菌细胞培养物中生产多糖的培养基和发酵方法。在一方面，本发明涉及包含植物水解产物、酵母提取物和碳源的复合培养基。在另一方面，本发明涉及具有大于约50 mM的总氨基酸浓度的确定成分培养基。本发明的另一方面涉及补料分批和灌注发酵方法用于培养产多糖细菌的用途。
发明背景
细胞表面多糖指至少一部分位于最外面的细菌细胞膜或细菌细胞表面（包括肽聚糖层、细胞壁和荚膜）上的多糖。细胞表面多糖，特别是荚膜多糖作为治疗剂已变得越来越重要。通常，细胞表面多糖与体内诱导免疫应答有关。多糖疫苗的一些实例包括：PNEUMOVAX®23，其是一种23价疫苗，用于预防由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)引起的侵袭性疾病诸如肺炎、发热菌血症和脑膜炎；MENCEVAX®，其是一种四价疫苗，用于预防由脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)引起的侵袭性疾病；TYPHERIX®和TYPHIMVI®，这两者均可预防由伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi) Vi引起的伤寒。
尽管多糖本身是免疫原性的，但是多糖与蛋白载体的缀合已经用于改善免疫原性，特别是在婴儿和老年人中。多糖和蛋白载体的化学键合诱导针对在其表面上展示疫苗内包含的多糖的细菌的免疫应答，从而预防疾病。因此，使用来自病原菌的多糖进行接种是增强宿主免疫的潜在策略。
目前有几种多糖-蛋白缀合物疫苗可供使用，并且还有几种正在研发中，以解决需求未得到满足的治疗领域。例如，全球市场上有三种肺炎球菌缀合物疫苗用于保护免于侵袭性肺炎球菌疾病：PREVNAR® (在一些国家中称为PREVENAR®) (七价疫苗)、SYNFLORIX®(十价疫苗)和PREVNAR 13® (十三价疫苗)。MENINGITEC®、MENJUGATE®和NEISVAC-C®是脑膜炎球菌血清组C缀合物疫苗而MENVEO®、MENACTRA®和NIMENRIX®是保护免于脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、Y和W-135的四价脑膜炎球菌缀合物疫苗。HIBERIX® 预防由b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)引起的疾病。
已经在非怀孕成年人的1期和2期临床试验中评估了无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)（也称为B组链球菌（GBS））血清型Ia、Ib、II、III和V的单个单价多糖-蛋白缀合物(Brigtsen, A.K., 等人, Journal of Infectious Diseases, 185(9):1277-1284(2002); Baker, C.J., 等人, J. Infect.Dis., 188(1):66-73 (2003); Baker, C.J.,等人, J. Infect.Dis., 189(6):1103-1112 (2004); Baker, C.J., 等人, Vaccine, 25(1):55-63 (2007))。还已经研究了二价II-TT和III-TT糖缀合物疫苗和包含Ia-CRM197、Ib-CRM197和III-CRM197糖缀合物的三价疫苗(Baker JID 2003; Clicaltrials.govNCT01193920、NCT01412801和NCT01446289)。然而，仍然没有GBS疫苗获得批准。
包含荚膜多糖-蛋白缀合物的疫苗也正在开发中以预防由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的手术部位感染(Anderson, A.S., 等人,Hum.Vaccin.Immunother., 8(11):1585-1594 (2012))。
因此，需要开发通过细菌细胞培养物生产多糖的改进***。
发明概述
为了满足这些和其它需要，本发明涉及用于在细菌细胞培养物中生产多糖的培养基和发酵方法，并且包括2015年11月17日提交的美国临时申请号62/256,347中公开的发明，其全部内容在此通过引用并入。以下条款描述了本发明的一些方面和实施方案。
本发明的一个方面涉及包含植物水解产物、酵母提取物和碳源的产多糖细菌细胞培养基。在一个实施方案中，植物水解产物可以是大豆水解产物，例如HYPEP 1510（KerryGroup Services Ltd.）、HYPEP 4601（Kerry Group Services Ltd.）、HYPEP 5603（KerryGroup Services Ltd.）、HY-SOY (Kerry Group Services Ltd.)、AMI-SOY (Kerry GroupServices Ltd.)、N-Z-SOY (Kerry Group Services Ltd.)、N-Z-SOY BL4 (Kerry GroupServices Ltd.)、N-Z-SOY BL7 (Kerry Group Services Ltd.)、SHEFTONE D (KerryGroup Services Ltd.)、SE50M、SE50MK、大豆蛋白胨、BACTO大豆胨（Difco LaboratoriesInc.）、NUTRISOY 2207（Archer Daniels Midland Company（ADM））、NUTRISOY（ADM）、NUTRISOY FLOUR（ADM）或大豆粉。在另一个实施方案中，大豆水解产物的浓度可以为约5g/L至约75g/L，例如约10g/L至约50g/L、或约28g/L。
在另一个实施方案中，酵母提取物可以是酵母自溶产物、超滤的酵母提取物或合成酵母提取物。在一个具体的实施方案中，酵母提取物是超滤的酵母提取物，诸如AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.)、BD DIFCO (BD Biosciences)、HYPEPYE (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 444 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 504 (Kerry Group ServicesLtd.)或ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)。在仍另一个实施方案中，酵母提取物的浓度为约1 g/L至约50 g/L，例如约5 g/L至约25 g/L、或约10 g/L。
在一个实施方案中，碳源可以是葡萄糖、右旋糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、棉子糖、木糖或甘露糖。在一个具体的实施方案中，碳源是葡萄糖。在另一个实施方案中，碳源的浓度为约25 g/L至约100 g/L，例如约50 g/L至约90 g/L、或约80 g/L。
在一个实施方案中，培养基还包含含磷酸盐成分，诸如Na2HPO4、K2HPO4或KH2PO4。
在另一个实施方案中，培养基还包含至少一种氨基酸、维生素、核苷或无机盐。
本发明的另一方面涉及总氨基酸浓度大于约50mM的化学上确定的产多糖细菌细胞培养基。在一个实施方案中，培养基包含约1.5mM至约60.0mM，例如约5.0mM至约15.0mM，或约7.5mM的总甘氨酸浓度。在另一个实施方案中，培养基包含约1.0mM至约30.0mM，例如约1.0mM至约20.0mM，或约4.0mM的总精氨酸浓度。在进一步的实施方案中，培养基包含约0.1mM至约5.0mM，例如约0.1mM至约3.5mM，或约0.4mM的总半胱氨酸浓度。在还另一个实施方案中，培养基包含约5.0mM至约75.0mM，例如约5.0mM至约15.0mM，或约7.5mM的总丝氨酸浓度。在另一个实施方案中，培养基包含约1.0mM至约30.0mM，例如约1.0mM至约20.0mM，或约4.0mM的总谷氨酰胺浓度。在进一步的实施方案中，培养基包含约0.1mM至约5.0mM，例如约1.0mM至约3.5mM，或约2.9mM至约3.0mM的酪氨酸总浓度。在还另一个实施方案中，培养基包含约5.0mM至约50.0mM，例如约10.0mM至约30.0mM，或约20.0mM的天冬酰胺总浓度。在一个具体的实施方案中，培养基不包含天冬酰胺。
在一个实施方案中，培养基还包含钾盐，诸如氯化钾或硫酸钾。在一个实施方案中，钾盐的总浓度为约0.1 g/L至约25 g/L，例如约0.2 g/L至约1.25 g/L，或约0.9 g/L。
在一个实施方案中，培养基还包含碳源，诸如葡萄糖、右旋糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、棉子糖、木糖或甘露糖。在一个具体的实施方案中，碳源是葡萄糖。在一个实施方案中，碳源的总浓度可以为约25 g/L至约100 g/L，例如约25 g/L至约80 g/L，或约50g/L。
在一个实施方案中，培养基还包含碳酸氢钠。在一个实施方案中，碳酸氢钠的浓度可以为约0.1 g/L至约20 g/L，例如约0.5 g/L至约1.0 g/L，或约0.84 g/L。
在一个实施方案中，培养基还包含酵母提取物，诸如酵母自溶产物、超滤的酵母提取物或合成酵母提取物。在一个具体的实施方案中，酵母提取物是超滤的酵母提取物，诸如AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.)、BD DIFCO (BD Biosciences)、HYPEPYE (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 444 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 504 (Kerry Group ServicesLtd.)或ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)。在进一步的实施方案中，酵母提取物的浓度为约1 g/L至约50 g/L，例如约5 g/L至约25 g/L，或约10 g/L。
在一个具体的实施方案中，培养基包含至少约50 mM的氨基酸、钾盐、碳源和任选地，酵母提取物。
在另一个实施方案中，培养基包含至少约50 mM的氨基酸、约5.0 mM至约15.0 mM的甘氨酸、约0.2 g/L至约1.25 g/L的钾盐、约25 g/L至约100 g/L的碳源和约5 g/L至约25g/L的酵母提取物。
在进一步的实施方案中，培养基包含至少约60 mM的氨基酸、约7.5 mM的甘氨酸、约0.9 g/L的氯化钾、50 g/L的葡萄糖和约10 g/L的超滤的酵母提取物。
本发明的另一方面涉及培养产多糖细菌的方法，其包括a）将本发明的培养基添加到生物反应器中，b）用产多糖细菌接种培养基，和c）通过发酵培养细菌，其中所述培养包括以恒定速率向培养基中添加营养物。在一个实施方案中，营养物是碳源，诸如葡萄糖。在一个实施方案中，进行培养直到细菌具有至少9.0的细胞密度，如由600nm处的光密度（OD）所测定。在另一个实施方案中，培养的细菌具有至少9.0的细胞密度，如通过600nm处的OD测定。在另一个实施方案中，进行培养直至细菌具有至少约250mg/L的多糖浓度。在另一个实施方案中，培养的细菌具有至少约250mg/L的多糖浓度。在进一步的实施方案中，产多糖细菌选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
本发明的还另一方面涉及培养产多糖细菌的方法，其包括a）将如上所述的培养基添加到生物反应器中，b）用产多糖细菌接种培养基，和c）通过灌注培养细菌，其中所述培养包括（i）从培养物中去除用完的培养基，（ii）添加新鲜培养基和（iii）保留细菌。在一个实施方案中，灌注速率为约0.07体积补料/起始培养物体积/小时（VVH）至约2.00 VVH，诸如约0.67 VVH至约1.33 VVH，或约1.20 VVH。在另一个实施方案中，灌注速率是变化的。例如，在一个实施方案中，灌注以第一速率开始并且速率增加到第二速率。在另一个实施方案中，灌注以第一速率开始并且速率降低至第二速率。
在一个实施方案中，灌注持续时间为约1小时至约15小时，例如约1小时至约10小时，或约7小时。
在另一个实施方案中，培养的细菌的细胞生长是分批发酵***中的细胞生长的至少2倍。在一个实施方案中，进行培养直到细菌具有至少20.0的细胞密度，如由600nm处的OD所测定。在进一步的实施方案中，培养的细菌具有至少20.0的细胞密度，如通过600nm处的OD所测定。在还另一个实施方案中，进行培养直至细菌具有至少约600 mg/L的多糖浓度。在还另一个实施方案中，培养的细菌具有至少约600 mg/L的多糖浓度。
在进一步的实施方案中，产多糖细菌选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
发明详述
本发明提供用于通过细菌细胞培养物生产多糖的培养基和方法。具体而言，本发明提供将有荚膜的细菌的荚膜多糖产生最大化的***。
在描述本发明的组合物和方法之前，应该理解本发明并不限于所述的具体方法和实验条件，这是由于此类方法和条件可以变化。还应理解本文所用的术语学仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的。
尽管与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施或检测中，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均以其整体通过引用并入。
本文使用的术语具有本领域技术人员公认和已知的含义，然而，为了方便和完整，下文和整个说明书中阐述了特定的术语及其含义。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a、an)”和“所述/该”包括复数指代。因此，例如，提及“所述/该方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，和/或在阅读本公开内容等时，其对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
术语“约”或“近似”意指在统计上有意义的值范围内。这样的范围可以在给定值或范围的一个数量级内，通常在20％内，更通常仍在10％内，且甚至更通常在5％内。术语“约”或“近似”涵盖的可允许的变化取决于所研究的具体***，并且可以由本领域普通技术人员容易地理解。无论何时在本申请中引用范围，该范围内的每个整数数字也被设想为本发明的实施方案。
如本文所用的术语“分批培养”是指培养细胞的方法，其中将在培养过程开始时提供将最终用于培养细胞的所有组分，包括培养基以及细胞本身。通常在某个时刻停止分批培养，收获培养基中的细胞和/或组分并任选进行纯化。
如本文所用的术语“生物反应器”是指用于细菌细胞培养物生长的任何容器。生物反应器可以具有任何尺寸，只要它可用于培养细菌细胞。通常，生物反应器将是至少1升，并且可以是10；50；100；250；500；1000；2500；5000；8000；10000；12000升或更多，或者之间的任何体积。通常在培养期过程中控制生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度。生物反应器可以由任何适合于在本发明的培养条件下容纳悬浮于培养基中的细菌细胞培养物的材料构成，包括玻璃、塑料或金属。如本文所用的术语“生产生物反应器”是指用于生产目标多糖的最终生物反应器。大规模细胞培养生产生物反应器的体积通常至少为500升，且可以为1000；2500；5000；8000；10000；120000升或更多，或之间的任何体积。本领域普通技术人员将意识到并将能够选择用于实施本发明的合适生物反应器。
术语“荚膜多糖(capsular polysaccharide)”或“荚膜多糖(capsulepolysaccharide)”是指包括通过糖苷键连接的一个或多个单糖的重复单元的糖共聚物。荚膜多糖通常在细菌细胞周围形成荚膜样层。
如本文所用的术语“细胞密度”是指在给定体积的培养基中存在的细胞数目。
如本文所用的术语“细胞活力”是指培养物中的细胞在给定的一组培养条件或实验变化下存活的能力。如本文所用的术语还指相对于在特定时间的培养物中细胞（活的和死的）总数的在那个时间的那部分存活的细胞。
术语诸如“包含(comprises、comprised、comprising)”、“含有(contains、containing)”等可以具有美国专利法中赋予它们的含义；例如，它们可以表示“包括(includes、included、including)”等。这些术语是指在不排除任何其他成分的情况下包含/包括特定成分或一组成分。
术语“由...组成(consists of和consisting of)”具有在美国专利法中赋予它们的含义；即这些术语是封闭式的。因此，这些术语是指包含/包括特定成分或一组成分并且排除所有其他成分。
术语诸如“基本上由...组成(consisting essentially of和consistsessentially of)”具有在美国专利法中赋予它们的含义，例如它们允许包含/包括不会损害本发明的新颖或基本特征的额外成分或步骤，即它们排除了损害本发明的新颖或基本特征的额外的未提及的成分或步骤，并且它们排除了现有技术的成分或步骤，例如本文引用的或通过引用并入本文的本领域中的文献，尤其是当该文献的目标是定义相对于现有技术（例如，相对于本文引用的或通过引用并入本文的文献）具有专利性（例如，新颖性、非显而易见性、创造性）的实施方案。
如本文使用的术语“培养物”、“细胞培养物”和“细菌细胞培养物”是指在适合细胞群存活和/或生长的条件下悬浮于培养基中的细菌细胞群。如本领域普通技术人员将清楚的那样，如本文使用的这些术语可以指包含细菌细胞群和所述群体悬浮于其中的培养基的组合。
如本文所用的术语“二糖”是指由通过糖苷键连接在一起的两个单糖单元或部分构成的多糖。
如本文所用的术语“补料分批培养”是指培养细胞的方法，其中在开始培养过程之后的一些时间点将额外的组分提供给培养物。所提供的组分通常包括在培养过程中已被耗尽的细胞的营养补充剂。通常在某个时刻停止补料分批培养，收获培养基中的细胞和/或组分并任选进行纯化。
如本文使用的这些术语“培养基(medium)”、“细胞培养基”、“细菌培养基”和“培养基(culture medium)”是指含有滋养生长细菌细胞的营养物的溶液。通常，这些溶液提供细胞最低生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能量来源、脂质和微量元素。溶液还可能含有促进高于最低速率的生长和/或存活的组分，包括激素和生长因子。溶液优选配制成最适于细胞存活和增殖的pH和盐浓度。培养基也可以是“确定成分培养基” - 不含蛋白质、水解产物或组成未知的组分的无血清培养基。确定成分培养基不含动物来源组分，并且所有组分都具有已知的化学结构。
如本文所用的术语“代谢废物产物”是指由细胞培养物作为正常或非正常代谢过程的结果产生的化合物，其在某种程度上对细胞培养物是有害的，特别是关于生产荚膜多糖。例如，代谢废物产物可能不利于细胞培养物的生长或活力，或可能减少产生的荚膜多糖的量。示例性代谢废物产物包括由于葡萄糖代谢产生的乳酸和由于谷氨酰胺代谢产生的铵。本发明的一个目标是减缓细菌细胞培养物中代谢废物产物的产生，减少或甚至消除细菌细胞培养物中的代谢废物产物。
如本文所用的“单糖”是指寡糖中的单个糖残基。
如本文所用的“寡糖”是指含有两个或更多个单糖单元或部分的化合物。在寡糖的背景下，单个单体单元或部分是单糖，其通过或可以通过羟基与另一个单糖单元或部分结合。寡糖可以通过化学合成从受保护的单一残基糖制备或通过化学降解生物产生的多糖来制备。或者，可以通过体外酶促方法制备寡糖。
如本文所用的术语“灌注培养”是指培养细胞的方法，其中在开始培养过程之后连续或半连续地向培养物提供额外的组分。所提供的组分通常包含在培养过程中已被耗尽的细胞的营养补充剂。通常在连续或半连续的基础上收获培养基中的细胞和/或组分的一部分，如代谢废物产物，并任选进行纯化。
术语“多糖”（PS）是指至少5个单糖单元或部分的直链或支链的聚合物。为了清楚起见，其中n大于约5，例如大于约10的较大数目的重复单元在本文中将被称为多糖。
如本文所用，术语“糖”是指单糖部分或单糖单元以及共价连接以形成二糖、寡糖和多糖的两个或更多个单一糖部分或单糖单元的组合。术语“糖”可以与术语“碳水化合物”互换使用。
如本文所用的术语“接种”是指将细胞培养物提供给生物反应器或另一容器的过程。细胞可能先前已在另一个生物反应器或容器中繁殖。或者，细胞可以已经被冷冻和在将它们提供给生物反应器或容器之前立即解冻。该术语是指任何数目的细胞，包括单个细胞。
如本文所用的术语“滴度”是指由细菌细胞培养物产生的多糖总量除以给定量的培养基体积。滴度通常以每升培养基中多糖的毫克为单位表示。
可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指包含至少一种诱导动物中的免疫应答的免疫原性组合物的药物组合物。
细菌
根据本发明可以使用任何具有细胞壁多糖的细菌。在一个优选的实施方案中，细菌是有荚膜的细菌。可根据本发明使用的有荚膜的细菌的非限制性实例包括链球菌属物种，例如无乳链球菌和肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌、屎肠球菌和粪肠球菌。在更优选的实施方案中，细菌具有苛刻的生长要求。难养菌包括但不限于链球菌属物种（例如无乳链球菌和肺炎链球菌）。
存在十种不同血清型的无乳链球菌，也称为B组链球菌（GBS），其中任何一种都可用于本发明。那些血清型包括Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX。所有GBS荚膜多糖都具有支链重复结构，其具有细菌毒力所需的末端α2-3连接的唾液酸。考虑用于本发明的GBS菌株的一些实例包括但不限于：090、A909 (ATCC登录号BAA-1138)、515 (ATCC登录号BAA-1177)、B523、CJB524、MB 4052 (ATCC登录号31574)、H36B (ATCC登录号12401)、S40、S42、MB4053 (ATCC登录号31575)、M709、133、7357、PFEGBST0267、MB 4055 (ATCC登录号31576)、18RS21 (ATCC登录号BAA-1175)、S16、S20、V8 (ATCC登录号12973)、DK21、DK23、UAB、5401、PFEGBST0708、MB 4082 (ATCC登录号31577)、M132、110、M781 (ATCC登录号BAA-22)、D136C(3) (ATCC登录号12403)、M782、S23、120、MB 4316 (M-732；ATCC登录号31475)、M132、K79、COH1 (ATCC登录号BAA-1176)、PFEGBST0563、3139 (ATCC登录号49446)、CZ-NI-016、PFEGBST0961、1169-NT1、CJB111(ATCC登录号BAA-23)、CJB112、2603 V/R (ATCC登录号BAA-611)、NCTC 10/81、CJ11、PFEGBST0837、118754、114852、114862、114866、118775、B 4589、B4645、SS1214、CZ-PW-119、7271、CZ-PW-045、JM9130013、JM9130672、IT-NI-016、IT-PW-62和IT-PW-64。
存在超过90种不同的肺炎链球菌血清型，其任一种均考虑用于本发明。实例包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7A、7C、7F、8、9N、9L、9V、10A、10B、11A、11F、12A、12F、14、15A、15B、15C、17A、17F、18C、19A、19F、20、22F、23A、23B、23F、24F、33F 35、38、39、40和42。例如，在一个实施方案中，肺炎链球菌血清型8、10A、11A、12F、15B、22F或33F可用于本发明中。在另一个实施方案中，肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F可用于本发明中。
类似地，金黄色葡萄球菌的任何有荚膜的菌株可以用于本发明中。优选地，考虑产生血清型5或8荚膜多糖的金黄色葡萄球菌菌株，例如Reynolds、Becker、Newman、PS80、JL278和JL812。
脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A、C、Y和W-135的任何菌株均可用于本发明中。
大肠杆菌的任何菌株都可以用于本发明中。
伤寒沙门氏菌Vi的任何菌株都可以用于本发明中。
b型流感嗜血杆菌的任何菌株均可用于本发明中。
肺炎克雷伯氏菌的任何菌株均可用于本发明中。
粪肠球菌可用于本发明中。
可用于本发明中的屎肠球菌的示例性菌株包括表1中列出的那些。
此外，根据本发明可以使用任何数量的可商购和非可商购的具有细胞壁多糖的细菌。本领域技术人员将会理解，一些细菌具有不同的营养需求和/或可能需要不同的培养条件用于最佳生长，并且将能够根据需要改变条件。
在许多情况下，细菌菌株将被选择或工程化以产生高水平的多糖。在一些实施方案中，细菌细胞被基因工程化以产生高水平的多糖。
细胞培养基
本发明提供将细菌细胞培养物中的多糖生产最大化的多种培养基制剂。
复合培养基
细菌细胞培养物特别是难养菌和/或生产细胞壁多糖的那些细菌通常在复合培养基如哥伦比亚肉汤、Luria-Bertani（LB）肉汤、Todd-Hewitt肉汤、GC培养基、血液肉汤或脑心浸出肉汤中生长。因此，开发了一种复合培养基以使细菌生长和多糖生产最大化。在一方面，本发明涉及包含植物水解产物、酵母提取物和碳源的复合培养基。
合适的植物水解产物包括但不限于：HYPEP 1510 (Kerry Group ServicesLtd.)、HYPEP 4601 (Kerry Group Services Ltd.)、HYPEP 5603 (Kerry Group ServicesLtd.)、HY-SOY (Kerry Group Services Ltd.)、AMI-SOY (Kerry Group Services Ltd.)、N-Z-SOY (Quest)、N-Z-SOY BL4 (Kerry Group Services Ltd.)、N-Z-SOY BL7 (Quest)、SHEFTONE D (Kerry Group Services Ltd.)、SE50M、SE50MK、大豆蛋白胨、BACTO大豆胨(Difco Laboratories Inc.)、NUTRISOY 2207 (ADM)、NUTRISOY (ADM)、NUTRISOY粉(ADM)和大豆粉。在一个优选的实施方案中，植物水解产物是大豆水解产物。优选地，大豆水解产物是HYPEP 1510 (Kerry Group Services Ltd.)。
培养基中的植物水解产物的浓度范围可以是约5 g/L至约75 g/L，诸如约5 g/L至约65 g/L、约5 g/L至约55 g/L、约5 g/L至约45 g/L、约5 g/L至约35 g/L、约10 g/L至约70g/L、约10 g/L至约60 g/L、约10 g/L至约50 g/L、约10 g/L至约40 g/L、约15 g/L至约75g/L、约15 g/L至约65 g/L、约15 g/L至约55 g/L、约15 g/L至约45 g/L、约20 g/L至约70g/L、约20 g/L至约60 g/L或约20 g/L至约50 g/L。在一个优选的实施方案中，培养基中的植物水解产物的浓度为约10 g/L至约50 g/L，最优选为约28 g/L。
适用于本发明的酵母提取物可以包括酵母自溶产物、超滤的酵母提取物和合成酵母提取物。在一个方面，酵母提取物是BD BBL (BD Biosciences)、BD BACTO (BDBiosciences)、HY YEST 412 (Kerry Group Services Ltd.)、HY YEST 444 (Kerry GroupServices Ltd.)、HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 455 (KerryGroup Services Ltd.)或HY YEST 504 (Kerry Group Services Ltd.)。在另一方面，酵母提取物是超滤的酵母提取物，诸如AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.)、BDDIFCO (BD Biosciences)、HYPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)或ULTRAPEP YE(Kerry Group Services Ltd.)。在进一步的方面，酵母提取物是合成酵母提取物，诸如BDRECHARGE (BD Biosciences)。最优选地，酵母提取物是超滤的酵母提取物，诸如AMBERFERM5902 (Sensient Technologies Corp.)。
培养基中的酵母提取物的浓度范围可以是约1 g/L至约50 g/L，诸如约1 g/L至约40 g/L、约1 g/L至约30 g/L、约1 g/L至约25 g/L、约1 g/L至约20 g/L、约1 g/L至约15 g/L、约1 g/L至约10 g/L、约5 g/L至约50 g/L、约5 g/L至约40 g/L、约5 g/L至约30 g/L、约5g/L至约25 g/L、约5 g/L至约20 g/L、约5 g/L至约15 g/L、约10 g/L至约50 g/L、约10 g/L至约40 g/L、约10 g/L至约30 g/L、约10 g/L至约35 g/L、约10 g/L至约30 g/L、约10 g/L至约25 g/L、约10 g/L至约20 g/L、约15 g/L至约50 g/L、约15 g/L至约40 g/L、约15 g/L至约30 g/L或约15 g/L至约25 g/L。在一个优选的实施方案中，培养基中的酵母提取物的浓度为约5 g/L至约25 g/L，最优选为约10 g/L。
任何碳源可用于本发明的培养基中。合适的碳源包括葡萄糖、右旋糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、棉子糖、木糖和/或甘露糖。优选地，培养基中的碳源是葡萄糖。
培养基中的碳源的浓度范围可以是约25 g/L至约100 g/L，诸如约25 g/L至约90g/L、约25 g/L至约80 g/L、约25 g/L至约70 g/L、约25 g/L至约60 g/L、约25 g/L至约50g/L、约50 g/L至约100 g/L、约50 g/L至约90 g/L、约50 g/L至约80 g/L、约50 g/L至约70g/L、约60 g/L至约100 g/L、约60 g/L至约90 g/L、约60 g/L至约80 g/L、约70 g/L至约100g/L或约70 g/L至约90 g/L。在一个优选的实施方案中，培养基中的碳源的浓度为约50 g/L至约90 g/L，最优选为约80 g/L。
因此，本发明人发现植物水解产物、酵母提取物和碳源的组合有助于支持最大的细菌细胞生长和多糖生产。在一方面，本发明涉及包含植物水解产物、酵母提取物和碳源的培养基。植物水解产物可以是本领域已知的任何合适的植物水解产物，例如上述那些。优选地，水解产物是大豆水解产物。更优选地，大豆水解产物是HYPEP 1510 ( Kerry GroupServices Ltd.)。可以使用本领域已知的任何酵母提取物，例如上述那些。在一个优选的实施方案中，酵母提取物是AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.)。
在一方面，本发明的复合培养基可以包含含磷酸盐成分，诸如Na2HPO4、K2HPO4或KH2PO4。
在另一方面，培养基可以包含本领域已知的各种其他促进生长的因子，例如氨基酸、维生素、核苷和无机盐。
在仍另一方面，使用本文公开的任何方法进行培养，直至使用本发明的复合培养基的细菌细胞培养物的细胞密度（如由600 nm处的光密度（OD）所测定）为至少15.0，诸如至少16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25.0、26.0、27.0、28.0、29.0或30.0。在一个优选的实施方案中，进行培养直至细胞密度至少为15.0。在仍另一方面，使用本发明的复合培养基的细菌细胞培养物的细胞密度（如由600 nm处的光密度（OD）所测定）可以为至少15.0，诸如至少16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、24.0、25.0、26.0、27.0、28.0、29.0或30.0。在一个优选的实施方案中，细胞密度至少为15.0。
GBS多糖产量可以通过测量唾液酸浓度来测定。通过本领域众所周知的方法消化沉淀的细胞从细胞结合的多糖中释放唾液酸。消化物可以经高效液相色谱（HPLC）通过阴离子交换层析（AEX）进行测定。然后通过将唾液酸值乘以重复单元重量转换因子来测定多糖浓度。例如，每种GBS血清型的转换因子如下：Ia、Ib和III = 3.24；II和V = 4.29；和IV =3.77。肺炎链球菌或其他有荚膜的细菌的多糖定量通过以下来实现：首先通过用去污剂如脱氧胆酸钠（DOC）或N-月桂基肌氨酸钠（NLS）处理；高温下的酸处理；碱处理；和/或机械裂解从细胞壁释放荚膜多糖。然后使用尺寸排阻色谱（SEC）HPLC针对可靠标准品测定粗裂解物中释放的多糖。
在一方面，使用本文公开的任何方法进行培养，直至使用本发明的复合培养基的细菌细胞培养物的（如通过唾液酸浓度测定的）多糖浓度为至少约200mg/L，诸如至少约250mg/L；300 mg/L；350 mg/L；400 mg/L、450 mg/L；500 mg/L；550 mg/L；600 mg/L；650 mg/L或700 mg/L。在一个优选的实施方案中，进行培养直至多糖浓度为至少约600 mg/L。在一方面，使用本发明的复合培养基的细菌细胞培养物的（如通过唾液酸浓度测定的）多糖浓度可以为至少约200mg/L，诸如至少约250 mg/L；300 mg/L；350 mg/L；400 mg/L、450 mg/L；500mg/L；550 mg/L；600 mg/L；650 mg/L或700 mg/L。在一个优选的实施方案中，多糖浓度为至少约600 mg/L。
确定成分培养基
然而，鉴于复合培养基的潜在不一致性，还研究了化学成分确定的培养基以使细菌生长和多糖生产最大化。令人惊讶地发现，美国专利号7,294,484（其通过引用整体并入本文）中公开的申请人的专有哺乳动物细胞培养基提供了出乎意料的高细胞生长和多糖生产。具体而言，本发明人发现总氨基酸浓度大于约50 mM的确定成分培养基提供了出乎意料的高细胞生长和多糖生产。示例性哺乳动物细胞培养基显示在下表2中。与本发明的培养基制剂相比，传统培养基制剂始于相对低水平的总氨基酸。例如，称为DME-F12（Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基和Ham氏F12培养基的50:50混合物）的传统细胞培养基具有7.29mM的总氨基酸含量，并且称为RPMI-1640的传统细胞培养基具有6.44mM的总氨基酸含量 (参见例如,H.J. Morton, In Vitro, 6:89-108 (1970), R.G.Ham, Proc.Nat. Assoc.Sci.(USA),53:288-293 (1965), G.E.Moore 等人, J. Am. Medical Assn., 199:519-24 (1967)，均通过引用并入本文)。
表2. 示例性哺乳动物细胞培养基
因此，本发明涉及具有至少约50 mM的总氨基酸浓度的细胞培养基，诸如至少约55mM、至少60 mM、至少70 mM和至少75 mM。在一个优选的实施方案中，总氨基酸浓度为至少60mM。
在本发明的一方面，细菌细胞培养基中的总甘氨酸浓度的范围可以为约1.5 mM至约60.0 mM，诸如约1.5 mM至约50.0 mM、约1.5 mM至约40.0 mM、约1.5 mM至约30.0 mM、约1.5 mM至约20.0 mM、约1.5 mM至约15.0 mM、约1.5 mM至约10.0 mM、约1.5 mM至约7.5 mM、约1.5 mM至约5.0 mM、约5.0 mM至约60.0 mM、约5.0 mM至约50.0 mM、约5.0 mM至约40.0mM、约5.0 mM至约30.0 mM、约5.0 mM至约20.0 mM、约5.0 mM至约15.0 mM、约5.0 mM至约10.0 mM、约5.0 mM至约7.5 mM、约7.5 mM至约60.0 mM、约7.5 mM至约50.0 mM、约7.5 mM至约40.0 mM、约7.5 mM至约30.0 mM、约7.5 mM至约20.0 mM、约7.5 mM至约15.0 mM或约7.5mM至约10.0 mM。在优选的实施方案中，细菌细胞培养基中甘氨酸的总浓度为约5.0 mM至约15.0 mM，最优选约7.5 mM。
在本发明的一方面，细菌细胞培养基中的总精氨酸浓度的范围可以为约1.0 mM至约30.0 mM，诸如约1.0 mM至约20.0 mM、约1.0 mM至约15.0 mM、约1.0 mM至约10.0 mM、约1.0 mM至约7.5 mM、约1.0 mM至约5.0 mM、约4.0 mM至约20.0 mM、约4.0 mM至约15.0 mM、约4.0 mM至约10.0 mM、约4.0 mM至约7.5 mM、约10.0 mM至约30.0 mM、约10.0 mM至约25.0mM、约10.0 mM至约20.0 mM、约10.0 mM至约15.0 mM、约15.0 mM至约30.0 mM、约15.0 mM至约25.0 mM或约15.0 mM至约20.0 mM。在优选的实施方案中，细菌细胞培养基中精氨酸的总浓度为约1.0 mM至约20.0 mM，最优选约4.0 mM。
在本发明的一方面，细菌细胞培养基中的总半胱氨酸浓度可以为约0.1 mM至约5.0 mM，诸如约0.1 mM至约4.5 mM、约0.1 mM至约4.0 mM、约0.1 mM至约3.5 mM、约0.1 mM至约3.0 mM、约0.1 mM至约2.5 mM、约0.4 mM至约5.0 mM、约0.4 mM至约4.5 mM、约0.4 mM至约4.0 mM、约0.4 mM至约3.5 mM、约0.4 mM至约3.0 mM、约0.4 mM至约2.5 mM或约0.4 mM至约2.0 mM。在优选的实施方案中，细菌细胞培养基中半胱氨酸的总浓度为约0.1 mM至约3.5 mM，最优选约0.4 mM。
在本发明的一方面，细菌细胞培养基中的总丝氨酸浓度可以为约5.0 mM至约75.0mM，诸如约5.0 mM至约50.0 mM、约5.0 mM至约40.0 mM、约5.0 mM至约30.0 mM、约5.0 mM至约20.0 mM、约5.0 mM至约20.0 mM、约5.0 mM至约15.0 mM、约10.0 mM至约75.0 mM、约10.0mM至约50.0 mM、约10.0 mM至约40.0 mM、约10.0 mM至约30.0 mM、约10.0 mM至约20.0 mM、约15.0 mM至约75.0 mM、约15.0 mM至约50.0 mM、约15.0 mM至约40.0 mM、约15.0 mM至约30.0 mM或约20.0 mM至约50.0 mM。在优选的实施方案中，细菌细胞培养基中丝氨酸的总浓度为约5.0 mM至约15.0 mM，最优选约7.5 mM。
在本发明的一方面，细菌细胞培养基中的总谷氨酰胺浓度的范围可以为约1.0 mM至约30.0 mM，诸如约1.0 mM至约20.0 mM、约1.0 mM至约15.0 mM、约1.0 mM至约10.0 mM、约1.0 mM至约7.5 mM、约1.0 mM至约5.0 mM、约4.0 mM至约20.0 mM、约4.0 mM至约15.0mM、约4.0 mM至约10.0 mM、约4.0 mM至约7.5 mM、约10.0 mM至约30.0 mM、约10.0 mM至约25.0 mM、约10.0 mM至约20.0 mM、约10.0 mM至约15.0 mM、约15.0 mM至约30.0 mM、约15.0mM至约25.0 mM或约15.0 mM至约20.0 mM。在优选的实施方案中，细菌细胞培养基中谷氨酰胺的总浓度为约1.0 mM至约20.0 mM，最优选约4.0 mM。
在本发明的一方面，细菌细胞培养基中的总酪氨酸浓度的范围可以为约0.1 mM至约5.0 mM，诸如约0.1 mM至约4.5 mM、约0.1 mM至约4.0 mM、约0.1 mM至约3.5 mM、约0.1mM至约3.0 mM、约0.1 mM至约2.5 mM、约1.0 mM至约5.0 mM、约1.0 mM至约4.5 mM、约1.0mM至约4.0 mM、约1.0 mM至约3.5 mM、约1.0 mM至约3.0 mM、约1.0 mM至约2.5 mM或约1.0mM至约2.0 mM。在优选的实施方案中，细菌细胞培养基中酪氨酸的总浓度为约1.0 mM至约3.5 mM，最优选约2.9 mM或约3.0 mM。
在本发明的一方面，细菌细胞培养基中的总天冬酰胺浓度可以为约5.0 mM至约50.0 mM，诸如约5.0 mM至约40.0 mM、约5.0 mM至约30.0 mM、约5.0 mM至约25.0 mM、约5.0mM至约20.0 mM、约5.0 mM至约15.0 mM、约5.0 mM至约10.0 mM、约10.0 mM至约50.0 mM、约10.0 mM至约40.0 mM、约10.0 mM至约30.0 mM、约10.0 mM至约25.0 mM、约10.0 mM至约20.0 mM、约15.0 mM至约50.0 mM、约15.0 mM至约40.0 mM、约15.0 mM至约30.0 mM、约15.0mM至约25.0 mM或约15.0 mM至约20.0 mM。在优选的实施方案中，细菌细胞培养基中天冬酰胺的总浓度为约10.0 mM至约30.0 mM，最优选约20.0 mM。
在本发明的另一方面，细胞培养基不含天冬酰胺。
本发明人还发现钾是生产多糖的有益盐，其与生长无关。因此，在本发明的一个方面，细胞培养基包含钾盐，如氯化钾或硫酸钾。
在一个实施方案中，细胞培养基中的钾盐的浓度可以是约0.1 g/L至约25 g/L，诸如约0.1 g/L至约20 g/L、约0.1 g/L至约10 g/L、约0.1 g/L至约5 g/L、约0.1 g/L至约1.5g/L、约0.1 g/L至约1.25 g/L、约0.1 g/L至约1.0 g/L、约0.1 g/L至约0.9 g/L、约0.1 g/L至约0.8 g/L、约0.1 g/L至约0.7 g/L、约0.1 g/L至约0.6 g/L、约0.1 g/L至约0.5 g/L、约0.2 g/L至约1.5 g/L、约0.2 g/L至约1.25 g/L、约0.2 g/L至约1.0 g/L、约0.2 g/L至约0.9 g/L、约0.2 g/L至约0.8 g/L、约0.2 g/L至约0.7 g/L、约0.2 g/L至约0.6 g/L、约0.2g/L至约0.5 g/L、约0.3 g/L至约1.5 g/L、约0.3 g/L至约1.25 g/L、约0.3 g/L至约1.0 g/L、约0.3 g/L至约0.9 g/L、约0.3 g/L至约0.8 g/L、约0.3 g/L至约0.7 g/L、约0.3 g/L至约0.6 g/L、约0.3 g/L至约0.5 g/L、约0.5 g/L至约1.5 g/L、约0.5 g/L至约1.25 g/L或约0.5 g/L至约1.0 g/L。在一个优选的实施方案中，细菌细胞培养基中的钾盐的总浓度为约0.2 g/L至约1.25 g/L，最优选为约0.9 g/L。
在本发明的一个方面，本发明的细胞培养基含有碳源。合适的碳源包括葡萄糖、右旋糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、棉子糖、木糖和/或甘露糖。在一个优选的实施方案中，碳源是葡萄糖。
细菌细胞培养基中的碳源的总浓度的范围可以是约25 g/L至约100 g/L，诸如约25 g/L至约90 g/L、约25 g/L至约80 g/L、约25 g/L至约70 g/L、约25 g/L至约60 g/L、约25 g/L至约50 g/L、约50 g/L至约100 g/L、约50 g/L至约90 g/L、约50 g/L至约80 g/L、约50 g/L至约70 g/L、约60 g/L至约100 g/L、约60 g/L至约90 g/L、约60 g/L至约80 g/L、约70 g/L至约100 g/L或约70 g/L至约90 g/L。在一个优选的实施方案中，培养基中的碳源的浓度为约25 g/L至约80 g/L，最优选为约50 g/L。
在另一方面，改良细胞培养基以适应厌氧生长的细菌的碳酸氢钠需求。厌氧生长的产多糖细菌的一些实例包括无乳链球菌和肺炎链球菌。在一个实施方案中，将约0.1 g/L至约20 g/L的碳酸氢钠加入至培养基。例如，碳酸氢钠浓度可以是约0.1 g/L至约15 g/L、约0.1 g/L至约10 g/L、约0.1 g/L至约5.0 g/L、约0.1 g/L至约3.0 g/L、约0.1 g/L至约2.0 g/L、约0.1 g/L至约1.25 g/L、约0.1 g/L至约1.0 g/L、约0.1 g/L至约0.9 g/L、约0.1g/L至约0.8 g/L、约0.1 g/L至约0.7 g/L、约0.1 g/L至约0.6 g/L、约0.1 g/L至约0.5 g/L、约0.5 g/L至约20 g/L、约0.5 g/L至约15 g/L、约0.5 g/L至约10 g/L、约0.5 g/L至约5.0 g/L、约0.5 g/L至约3.0 g/L、约0.5 g/L至约2.0 g/L、约0.5 g/L至约1.25 g/L、约0.5g/L至约1.0 g/L、约0.5 g/L至约0.9 g/L、约0.5 g/L至约0.8 g/L、约0.5 g/L至约0.7 g/L、约0.75 g/L至约20 g/L、约0.75 g/L至约15 g/L、约0.75 g/L至约10 g/L、约0.75 g/L至约5.0 g/L、约0.75 g/L至约3.0 g/L、约0.75 g/L至约2.0 g/L、约0.75 g/L至约1.25 g/L、约0.75 g/L至约1.0 g/L或约0.75 g/L至约0.9 g/L。优选地，碳酸氢钠浓度为约0.84 g/L，或约1.8 g/L至约2.4 g/L。
在本发明的一方面，限定的细菌细胞培养基包含酵母提取物。适用于本发明的酵母提取物可以包括酵母自溶产物、超滤的酵母提取物和合成酵母提取物。在一个方面，酵母提取物是BD BBL (BD Biosciences)、BD BACTO (BD Biosciences)、HY YEST 412 (KerryGroup Services Ltd.)、Y YEST 441 (Kerry、Inc.Kerry Group Services Ltd.)、HY YEST444 (Kerry Group Services Ltd.)或HY YEST 504 (Kerry Group Services Ltd.)。在另一方面，酵母提取物是超滤的酵母提取物，诸如AMBERFERM 5902 (Sensient TechnologiesCorp.)、BD DIFCO (BD Biosciences)、HYPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)或ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)。在进一步的方面，酵母提取物是合成酵母提取物，诸如BD RECHARGE (BD Biosciences)。最优选地，酵母提取物是超滤的酵母提取物，诸如AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.)。
培养基中的酵母提取物的浓度可以是约1 g/L至约50 g/L，诸如约1 g/L至约40g/L、约1 g/L至约30 g/L、约1 g/L至约25 g/L、约1 g/L至约20 g/L、约1 g/L至约15 g/L、约1 g/L至约10 g/L、约5 g/L至约50 g/L、约5 g/L至约40 g/L、约5 g/L至约30 g/L、约5g/L至约25 g/L、约5 g/L至约20 g/L、约5 g/L至约15 g/L、约10 g/L至约50 g/L、约10 g/L至约40 g/L、约10 g/L至约30 g/L、约10 g/L至约35 g/L、约10 g/L至约30 g/L、约10 g/L至约25 g/L、约10 g/L至约20 g/L、约15 g/L至约50 g/L、约15 g/L至约40 g/L、约15 g/L至约30 g/L或约15 g/L至约25 g/L。在一个优选的实施方案中，培养基中的酵母提取物的浓度为约5 g/L至约25 g/L，最优选为约10 g/L。
本发明的一个方面涉及包含至少约50 mM的氨基酸、钾盐、碳源和任选地酵母提取物的限定的细胞培养基。
在一个实施方案中，细胞培养基包含至少约50 mM的氨基酸、约5.0 mM至约15.0mM的甘氨酸、约0.2 g/L至约1.25 g/L的钾盐、约25 g/L至约80 g/L的碳源和约5 g/L至约25 g/L的酵母提取物。
在优选的实施方案中，细胞培养基包含至少约60 mM的氨基酸、约7.5 mM的甘氨酸、约0.9 g/L的氯化钾、50 g/L的葡萄糖和约10 g/L的超滤的酵母提取物。
此外，本领域普通技术人员将认识到，上面列出的任何条件可以单独使用或以彼此的各种组合使用。通过利用展示出上述特征中的一个、一些或全部的培养基制剂，本领域普通技术人员将能够优化细胞生长和/或活力并使多糖的生产最大化。
根据需要，本发明中公开的这些培养基制剂的任一种可以任选地补充有特定离子（例如钠离子、氯离子、钙离子、镁离子和磷酸根离子）、缓冲剂、维生素、微量元素（通常以非常低的终浓度存在的无机化合物）、氨基酸、脂质、蛋白水解产物或葡萄糖或其他能量来源。这些任选的补充剂可以在培养开始时添加，或者可以在稍后时间点添加以补充耗尽的营养物或为了另一个原因。本领域普通技术人员将认识到可能包含在所公开的培养基制剂中的任何期望的或必要的补充剂。
在另一方面，通过本文公开的任何方法进行培养，直至使用本发明的确定成分培养基的细菌细胞培养物的细胞密度（如由600 nm处的光密度（OD）所测定）为至少9.0，诸如至少9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0。在一个优选的实施方案中，培养通过本文公开的任何方法进行，直到细胞密度为至少9.0。
对于含有唾液酸的多糖诸如GBS，多糖产量可以通过测量唾液酸浓度来测定。通过本领域众所周知的方法消化沉淀的细胞从细胞结合的多糖中释放唾液酸。消化物可以经高效液相色谱（HPLC）通过阴离子交换层析（AEX）进行测定。然后通过将唾液酸值乘以重复单元重量转换因子来测定多糖浓度。例如，每种GBS血清型的转换因子如下：Ia、Ib和III =3.24；II和V = 4.29；和IV = 3.77。
在一方面，使用本文公开的任何方法进行培养，直至使用本发明的确定成分培养基的细菌细胞培养物的（如通过唾液酸浓度测定的）多糖浓度为至少约250 mg/L，诸如至少约300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L、500 mg/L、550 mg/L、600 mg/L、650 mg/L、700mg/L、750 mg/L、800 mg/L、900 mg/L、1000 mg/L、1200 mg/L、1500 mg/L或2000 mg/L。在一个优选的实施方案中，使用本文公开的任何方法进行培养，直到多糖浓度为至少约250 mg/L。在一方面，使用本发明的确定成分培养基的细菌细胞培养物的（如通过唾液酸浓度测定的）多糖浓度可以为至少约250 mg/L，诸如至少约300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L、500 mg/L、550 mg/L、600 mg/L、650 mg/L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/L、900 mg/L、1000 mg/L、1200 mg/L、1500 mg/L或2000 mg/L。在一个优选的实施方案中，多糖浓度为至少约250 mg/L。
发酵方法
本发明提供了用于培养产多糖的细菌的发酵方法。在一方面，本发明的培养方法与本文所述的复合和确定成分培养基组合使用以使多糖生产最大化。
种子生长
在一个实施方案中，本发明的方法中产多糖细菌的生长以至少两个阶段进行：种子生长和发酵。种子培养物首先通过从储用培养物例如工作细胞库接种而生长。将种子用于接种第二种子培养物或接种相对大的发酵培养物。如本领域所理解的，使用的种子培养物的数量可取决于例如发酵步骤的大小和体积。
因此，在一方面，本发明涉及培养产多糖细菌的方法。该方法包括在促进细胞生长的条件下在第一培养基中培养产多糖细菌细胞；在所述第一次培养之后用全部或部分所述第一培养基接种第二培养基；在促进细胞生长和/或多糖生产的条件下培养所述接种的第二培养基。该方法可以进一步包括从所述第二培养基中分离多糖。在一个实施方案中，产多糖细菌在被称为种子培养物的第一培养基中生长。在一个实施方案中，种子培养物包括如上所述的培养基和在培养基中生长的来自储用培养物的接种物。在一个实施方案中，第一和第二培养基是相同的。在另一个实施方案中，第一和第二培养基是不同的。
通常进行种子生长阶段（或多个种子生长阶段）以从储存的培养物中放大微生物的量，使得其可以用作发酵阶段的接种剂。如果从活跃生长的培养物（例如种子培养物）中取出，而不是从储存的培养物中取出，可以更精确地控制用于接种发酵培养物的活细胞的体积和量。
另外，可以使用多于一个（例如两个或三个）种子生长阶段来放大用于接种发酵培养基的产多糖细菌的量。或者，如果需要，发酵阶段中产多糖细菌的生长可以通过直接接种从储存的培养物直接进行。
为了开始发酵阶段，可以使用含有产多糖细菌的种子培养物的一部分或全部来接种发酵培养基。本领域技术人员可以确定用于接种发酵培养基的适当浓度的种子培养物。
发酵可用于在大规模环境中产生最大的细胞生长和/或多糖生产。在一个实施方案中，产多糖细菌作为发酵培养物生长。在一个实施方案中，从在第一培养基中生长的种子培养物接种发酵培养物，并且发酵培养物在第二培养基中进行。在一个实施方案中，第二培养基可以是如上所述的复合或确定成分培养基。在另一个实施方案中，第一培养基和第二培养基是相同的。
补料分批发酵方法
在一个实施方案中，使用上述的复合和确定成分培养基，在补料分批培养***中培养产多糖细菌细胞。在补料分批***中，以接种细胞开始培养，补充培养过程中添加的至少一种营养物，并以单次收获细胞终止。在一个实施方案中，营养物以恒定速率添加。
在一方面，碳源是培养期间添加的营养物。碳源可以是用于复合和/或确定成分培养基的上述任何碳源。在一个优选的实施方案中，碳源是葡萄糖。
在本发明的一个方面，分批碳源的量/补料碳源的量可以是约10%/90%、15%/85%、20%/80%、25%/75%或30%/70%。例如，在一个优选的实施方案中，碳源总浓度的20％被分批并且剩余的80％在培养过程中以恒定速率补料。在另一个实施方案中，碳源总浓度的20％被分批并且剩余碳源也可以在培养过程中以非恒定速率补料。
在又另一方面，进行补料分批发酵方法直至细菌细胞培养物的细胞密度（如由600nm的光密度（OD）测定）为至少9.0，例如至少9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0。在一个优选的实施方案中，进行补料分批发酵方法直至细胞密度至少为9.0。
在仍另一方面，通过本发明的补料分批培养***的细菌细胞培养物的细胞密度（如由600 nm处的光密度（OD）所测定）可以为至少9.0，诸如至少9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0。在一个优选的实施方案中，细胞密度至少为9.0。
对于含有唾液酸的多糖诸如GBS，多糖产量可以通过测量唾液酸浓度来测定。通过本领域众所周知的方法消化沉淀的细胞从细胞结合的多糖中释放唾液酸。消化物可以经高效液相色谱（HPLC）通过阴离子交换层析（AEX）进行测定。然后通过将唾液酸值乘以重复单元重量转换因子来测定多糖浓度。例如，每种GBS血清型的转换因子如下：Ia、Ib和III =3.24；II和V = 4.29；和IV = 3.77。肺炎链球菌或其他有荚膜的细菌的多糖产量可以通过以下来定量：首先通过用去污剂如脱氧胆酸钠（DOC）或N-月桂基肌氨酸钠（NLS）处理；高温下的酸处理；碱处理；和/或机械裂解从细胞壁释放荚膜多糖。然后使用尺寸排阻色谱（SEC）HPLC针对可靠标准品测定粗裂解物中释放的多糖。
在一方面，进行补料分批发酵方法，直至细菌细胞培养物的（如通过唾液酸浓度测定的）多糖浓度为至少约250 mg/L，诸如至少约300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L、500 mg/L、550 mg/L、600 mg/L、650 mg/L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/L、900 mg/L、1000mg/L、1200 mg/L、1500 mg/L或2000 mg/L。在一个优选的实施方案中，进行补料分批发酵方法直至多糖浓度为至少约250 mg/L。
在一方面，通过本发明的补料分批培养***的细菌细胞培养物的（如通过SECHPLC测定的）多糖浓度可以为至少约250 mg/L，诸如至少约300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L、500 mg/L、550 mg/L、600 mg/L、650 mg/L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/L、900mg/L、1000 mg/L、1200 mg/L、1500 mg/L或2000 mg/L。在一个优选的实施方案中，多糖浓度为至少约250 mg/L。
灌注发酵方法
在一个实施方案中，将产多糖细菌细胞在灌注培养***中培养。本发明人发现使用上述复合和确定成分培养基可以在灌注培养中获得最大的多糖生产。灌注***的优点是可以连续添加新鲜培养基。另外，代谢废物产物可以在生产过程中被去除，同时维持***中的细胞活力。
灌注培养***可以包括向细胞提供新鲜培养基，同时去除基本上不含细胞或包含比生物反应器中的细胞浓度实质上更低的细胞浓度的用完的培养基。在灌注培养中，可以通过例如过滤、超声过滤、离心或沉降来保留细胞。
在一个实施方案中，将用完的培养基与细胞分离并去除，同时将细胞保留在生物反应器中或将细胞返回到生物反应器。分离步骤可以是常规流过滤器和/或切向流过滤器。在一个实施方案中，所述过滤***包括中空纤维过滤器。在另一个实施方案中，所述过滤***包括平板式盒(flat-sheet cassette)。在另一个实施方案中，通过离心步骤将细胞从用完的培养基中分离。在另一个实施方案中，通过超声分离步骤将细胞从用完的培养基中分离。在另一个实施方案中，经沉降***将细胞从用完的培养基中分离。
在一个实施方案中，灌注速率可以为约0.07 VVH至约2.00 VVH，诸如约0.07 VVH至约1.33 VVH、约0.07 VVH至约1.20 VVH、约0.07 VVH至约1.07 VVH、约0.07 VVH至约0.93VVH、约0.07 VVH至约0.80 VVH、约0.07 VVH至约0.67 VVH、约0.07 VVH至约0.53 VVH、约0.07 VVH至约0.40 VVH、约0.07 VVH至约0.27 VVH、约0.13 VVH至约2.00 VVH、约0.13 VVH至约1.33 VVH、约0.13 VVH至约1.20 VVH、约0.13 VVH至约1.07 VVH、约0.13 VVH至约0.93VVH、约0.13 VVH至约0.80 VVH、约0.13 VVH至约0.67 VVH、约0.13 VVH至约0.53 VVH、约0.13 VVH至约0.40 VVH、约0.13 VVH至约0.27 VVH、约0.27 VVH至约2.00 VVH、约0.27 VVH至约1.33 VVH、约0.27 VVH至约1.20 VVH、约0.27 VVH至约1.07 VVH、约0.27 VVH至约0.93VVH、约0.27 VVH至约0.80 VVH、约0.27 VVH至约0.67 VVH、约0.27 VVH至约0.53 VVH、约0.27 VVH至约0.40 VVH、约0.40 VVH至约2.00 VVH、约0.40 VVH至约1.33 VVH、约0.40 VVH至约1.20 VVH、约0.40 VVH至约1.07 VVH、约0.40 VVH至约0.93 VVH、约0.40 VVH至约0.80VVH、约0.40 VVH至约0.67 VVH、约0.53 VVH至约2.00VVH、约0.53 VVH至约1.33 VVH、约0.53 VVH至约1.20 VVH、约0.53 VVH至约1.07 VVH、约0.53 VVH至约0.93 VVH、约0.53 VVH至约0.80 VVH、约0.53 VVH至约0.67 VVH、约0.67 VVH至约2.00 VVH、约0.67 VVH至约1.33VVH、约0.67 VVH至约1.20 VVH、约0.67 VVH至约1.07 VVH、约0.67 VVH至约0.93 VVH或约0.67 VVH至约0.80 VVH。在一个实施方案中，灌注速率为约0.67 VVH至约1.33 VVH，优选约1.20 VVH。
在一方面，灌注培养的持续时间可以为约1小时至约15小时，诸如约1小时至约14小时、约1小时至约13小时、约1小时至约12小时、约1小时至约11小时、约1小时至约10小时、约1小时至约9小时、约1小时至约8小时、约1小时至约7小时、约1小时至约6小时、约1小时至约5小时、约5小时至约15小时、约5小时至约14小时、约5小时至约13小时、约5小时至约12小时、约5小时至约11小时、约5小时至约10小时、约5小时至约9小时、约5小时至约8小时或约5小时至约7小时。在一个实施方案中，灌注培养的持续时间为约1小时至约10小时，优选约7小时。
在一个具体方面中，灌注速率可以由于培养的持续时间而改变（增加或减少）。在一个实施方案中，灌注***以第一速率开始并且速率增加至第二速率。在另一个实施方案中，灌注***以第一速率开始并且速率降低至第二速率。在另外的实施方案中，灌注速率可以多次改变。
在一方面，灌注速率在培养期间保持恒定。
在本发明的另一方面，灌注***中的细胞生长可以是分批发酵***中的细胞生长的至少1.1倍，诸如1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5倍。在一个优选的实施方案中，灌注***中的细胞生长是分批发酵***中的细胞生长的至少2倍。
在仍另一方面，进行灌注发酵方法直至细菌细胞培养物的细胞密度（如由600nm处的光密度（OD）测定的）为至少20.0，例如至少25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0或60.0。在一个优选的实施方案中，进行灌注发酵方法直至细胞密度至少为20.0。
在仍另一方面，通过本发明的灌注***的细菌细胞培养物的细胞密度（如由600nm处的光密度（OD）所测定）可以为至少20.0，诸如至少25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0或60.0。在一个优选的实施方案中，细胞密度至少为20.0。
在本发明的另一方面，灌注***中的多糖浓度是分批发酵***中的多糖浓度的至少1.5倍，诸如至少1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5倍。在一个优选的实施方案中，灌注***中的多糖浓度是分批发酵***中的多糖浓度的至少2倍。
对于含有唾液酸的多糖诸如GBS，多糖产量可以通过测量唾液酸浓度来测定。通过本领域众所周知的方法消化沉淀的细胞从细胞结合的多糖中释放唾液酸。消化物可以经高效液相色谱（HPLC）通过阴离子交换层析（AEX）进行测定。然后通过将唾液酸值乘以重复单元重量转换因子来确定多糖浓度。例如，每种GBS血清型的转换因子如下：Ia、Ib和III =3.24；II和V = 4.29；和IV = 3.77。肺炎链球菌或其他有荚膜的细菌的多糖产量可以通过以下来定量：首先通过用去污剂如脱氧胆酸钠（DOC）或N-月桂基肌氨酸钠（NLS）处理；高温下的酸处理；碱处理；和/或机械裂解从细胞壁释放荚膜多糖。然后使用尺寸排阻色谱（SEC）HPLC针对可靠标准品测定粗裂解物中释放的多糖。
在一方面，进行灌注发酵方法，直至细菌细胞培养物的（如通过唾液酸浓度测定的）多糖浓度为至少约600 mg/L，诸如至少约650 mg/L；700 mg/L；750 mg/L；800 mg/L,850 mg/L；900 mg/L；950 mg/L；1,000 mg/L；1,500 mg/L；或2,000 mg/L。在一个优选的实施方案中，进行灌注发酵方法直至多糖浓度为至少约600 mg/L。
在一方面，通过本发明的灌注***的细菌细胞培养物的（如通过SEC HPLC测定的）多糖浓度可以为至少约600 mg/L，诸如至少约650 mg/L；700 mg/L；750 mg/L；800 mg/L,850 mg/L；900 mg/L；950 mg/L；1,000 mg/L；1,500 mg/L或2,000 mg/L。在一个优选的实施方案中，多糖浓度为至少约600 mg/L。
实施例
以下实施例说明本发明的一些实施方案。然而，应该理解的是，这些实施例仅用于说明，并不意味着对于本发明的条件和范围是完全限定的。应该理解的是，当已经给出了典型的反应条件（例如温度、反应时间等）时，也可以使用高于和低于规定范围的条件，尽管通常这不太方便。除非另有说明，否则本文中所提及的所有份数和百分数均基于重量，并且所有温度均以摄氏度表示。
此外，除非另有详述，否则以下实施例均使用标准技术进行，所述标准技术对于本领域技术人员是熟知的且常规的。如上所述，呈现以下实施例用于说明性目的，并且不应解释为以任何方式限定本发明的范围。
实施例1：本发明的确定成分培养基 将申请人的专有的哺乳动物确定的细胞培养基（“R17”）针对生长肺炎链球菌进行改良以产生“改良的AS3”培养基（也被称为“mAS3”）。用下表3的组分配制改良的AS3培养基。用30g/L的右旋糖和0.6g/L硫酸镁配制准备用于血清型4、5、6A、6B、14和23F的培养基。在血清型1、3、6B、7F、9V、18C、19A和19F的情况下，将30g/L右旋糖加入到反应器中的培养基中。
下表4中提供了R17粉末中氨基酸、维生素和盐的组成的完整说明。
表4. R17粉末的组成
氨基酸 g/L mM 微量元素 μg/L nM
丙氨酸 0.02 0.20 ***钠 69.16 400.00
精氨酸 0.70 4.00 CuSO4 10.24 64.00
天冬氨酸 0.22 1.65 CuSO4•5H2O 99.88 400.00
半胱氨酸•HCl•H2O 0.07 0.40 FeSO4•7H2O 4170 15000
谷氨酸单钠 0.03 0.20 MnSO4•H2O 33.80 200.00
甘氨酸 0.12 1.54 Na2SiO3•9H2O 284.07 1000
组氨酸•HCl•H2O 0.47 2.26 (NH4)6Mo7O24•4H2O 247.20 200.00
异亮氨酸 0.57 4.36 NH4VO3 2.34 20.00
亮氨酸 1.03 7.87 NiSO4•6H2O 5.26 20.00
赖氨酸•HCl 1.40 7.70 SnCl2•2H2O 0.90 4.00
甲硫氨酸 0.39 2.60 AlCl3•6H2O 0.97 4.00
苯丙氨酸 0.51 3.07 KBr 0.48 4.00
脯氨酸 0.54 4.69 CrCl3 15.83 100.00
丝氨酸 1.05 10.02 NaF 0.17 4.00
苏氨酸 0.56 4.75 GeO2 0.42 4.00
色氨酸 0.27 1.34 KI 33.20 200.00
缬氨酸 0.75 6.40 RbCl 0.48 4.00
H3BO3 12.37 200.00
LiCl 0.17 4.00
其他组分 g/L nM
亚油酸 0.0003 1.04 维生素 g/L mM
硫辛酸 0.0007 3.48 生物素 0.003 0.01
D-葡萄糖 (右旋糖) 5.00 83.33 泛酸钙 0.02 0.05
丙酮酸钠 0.06 0.50 氯化胆碱 0.16 1.14
叶酸 0.03 0.06
无机盐 g/L mM 肌醇 0.16 0.91
CaCl2 0.12 1.05 烟酰胺 0.03 0.22
KCl 0.31 4.19 吡哆醛•HCl 0.002 0.01
Na2HPO4 0.06 0.40 吡哆醇•HCl 0.004 0.18
NaH2PO4•H2O 0.65 4.68 核黄素 0.002 0.01
MgCl2 0.03 0.30 硫胺素•HCl 0.04 0.12
MgSO4 0.14 1.15 维生素B12 0.02 0.02
分批发酵在2L生物反应器中进行，且温度控制在36℃，pH值控制在7.0，NaOH用作碱滴定剂。对于血清型1、3、4、6A、6B、7F、9V、18C、19A和19F，将发酵罐用N2覆盖进行惰化，并且对于血清型6B(2)、14和23F，用空气进行惰化；无覆盖用于血清型5。在200 RPM下搅拌发酵。结果显示在下表5中。
表5. 在改良的AS3培养基中的肺炎链球菌生长和多糖生产
血清型 生长 OD600 多糖 (g/L)
1 9.1 1.38
3 11.5 3.19
4 9.5 0.50
5 7.5 0.40
6A 6.6 1.10
6B 6.0 2.00
6B(2) 6.3 1.20
7F 8.0 0.70
9V 7.4 0.54
14 6.8 1.10
18C 7.0 0.97
19A 5.0 2.40
19F 5.5 0.86
23F 6.5 1.10
使用化学确定的改良AS3培养基，十三种肺炎链球菌血清型在分批培养中成功生长。
实施例2：可商购的确定成分培养基与本发明的确定成分培养基的比较
使用各种血清型的GBS，测试Eagle氏最低必需培养基（EMEM）（一种可商购的确定的细胞培养基）与R17进行比较。将每一制剂根据标签说明进行改良，以适应厌氧生长的GBS的碳酸氢钠需求。每种培养基还补充有高浓度的葡萄糖以支持细菌培养物中可获得的更高的细胞密度。作为细菌培养基改良的EMEM制剂（“细菌EMEM”）如下：20.2 g/L EMEM粉末、1.17 g/L L-谷氨酰胺、0.84 g/L碳酸氢钠和80 g/L葡萄糖。GBS mAS3mAS3的组成（如实施例1中所述）针对GBS生长（下文“GBS mAS3”）如下定制：0.21 g/L L-半胱氨酸HCl（代替300mM酸性胱氨酸原液）、2 mL/L（代替1 mL/L）微量元素E 1000X、0.84g/L碳酸氢钠和80g/L葡萄糖（代替25 g/L无水右旋糖）。
以10L生物反应器规模进行发酵，且温度控制在37℃，并且pH控制在7.0，NaOH用作碱滴定剂。关于分批体积，将发酵罐以0.1 vvm用N2覆盖惰化；在足以达到1 hr-1的kLa的搅动下搅拌发酵物。结果显示在下表6中。
表6. 细菌EMEM和GBS mAS3的比较
GBS mAS3培养基在生长和多糖浓度上相对于细菌EMEM培养基显示出令人惊奇的优越性。
实施例3：复合培养基与本发明的确定成分培养基的比较
针对各种血清型肺炎链球菌，比较实施例1中描述的改良AS3培养基和基于大豆水解产物的复合培养基（BPDv3）。BPDv3由以下构成：28 g/L HYPEP1510 (Kerry Group ServicesLtd.)、54 g/L葡萄糖、3.5 g/L NaCl、0.7 g/L KH2PO4、0.0182 g/L CaCl2 .2H2O、1 g/LMgSO4 .7H2O、0.84 g/L NaHCO3、3 g/L氯化铵、0.25 g/L尿苷、0.25 g/L腺苷、0.03 g/L烟酰胺、0.03 g/L吡哆醇HCl、0.0075 g/L泛酸和0.003 g/L PABA。用于血清型12F的培养基补充有1g/L谷氨酸单钠，将用于血清型8的培养基改良以含有0.5g/L氯化铵和36g/L葡萄糖。尽管与复合培养基相比，改良的AS3培养基中多糖滴度没有一致地改善，但是改良的AS3培养基在几乎所有血清型中均表现出改善的生长（参见表7）。
表7.改良的R17培养基和复合培养基的比较
实施例4：氨基酸消耗
进行GBS血清型III发酵过程中氨基酸消耗分析以确定氨基酸是否耗尽。表8给出了接种前和收获时（如实施例2中）GBS mAS3中的氨基酸浓度的分析。
表8. 氨基酸消耗
氨基酸 初始 (mM) 收获 (mM)
丙氨酸 0 0.6
精氨酸 3.6 0
天冬氨酸 1.8 1.8
天冬酰胺 16.7 14.9
半胱氨酸 < <
谷氨酸 0.3 1.5
谷氨酰胺 9.8 6.2
甘氨酸 1.4 0.2
组氨酸 2.3 2.2
异亮氨酸 4.6 4
亮氨酸 8.6 8
赖氨酸 9.3 6.2
甲硫氨酸 2.9 2.6
苯丙氨酸 3.4 3.1
脯氨酸 5.1 5.1
丝氨酸 10.8 0
苏氨酸 5.8 6.2
色氨酸 1.5 1.5
酪氨酸 1.8 1.9
缬氨酸 6.9 6.1
尽管预测的必需氨基酸没有被耗尽，但是对于无乳链球菌可能是原养型的四种氨基酸被耗尽。精氨酸、甘氨酸和丝氨酸被耗尽至低于定量限。半胱氨酸（其难以通过HPLC方法测量）在任一采样时间都未检测到。所有其他氨基酸在收获时仍过量。
然后将四种耗尽的氨基酸以相对于基础粉末R17制剂的4X浓度（16mM arg、1.6mMcys、6mM gly和40mM ser）补充到各种GBS血清型发酵的GBS mAS3培养基中。结果显示在下表9中。
表9. GBS mAS3和补充有耗尽的氨基酸的GBS mAS3的比较
在用补充的CGRS培养基测试的所有六种血清型中观察到生长的显著改善。虽然所有血清型的多糖滴度没有增加，但生长改善支持了进一步的检测。
实施例5：耗尽的氨基酸的进一步分析
每种耗尽的氨基酸对生长改善的重要性在一个实验中进行评估，在所述实验中使用GBS血清型V作为模型从培养基中依次删除四种中的每一种。出人意料地发现甘氨酸是改善生长的唯一贡献者（参见表10）。
表10. 补充的氨基酸依次删除
添加的氨基酸 生长 (OD600) 多糖 (mg/L)
无 9.7 240
CGRS 15.2 330
GRS 15.6 330
CRS 9.6 200
CGS 14.4 350
CGRS 15.1 360
这在后续研究中得到证实，其中再次使用GBS血清型V作为模型来单独补充四种氨基酸中的每一种。该研究证实，甘氨酸是四种耗尽氨基酸中改善生长和多糖生产的唯一氨基酸（参见表11）。
表11. 个别氨基酸的补充
添加的氨基酸 生长 (OD600) 多糖 (mg/L)
无 9.7 240
CGRS 15.2 330
仅G 13.1 440
仅A 8.8 280
仅C 9.0 310
仅S 9.3 280
然后在几种GBS血清型中测试添加的甘氨酸作为唯一补充物的重要性。比较GBSmAS3、补充有所有四种氨基酸的GBS mAS3和仅补充甘氨酸的GBS mAS3中的性能。结果显示在下表12中。
表12. GBS mAS3、补充有所有四种氨基酸的GBS mAS3和仅补充甘氨酸的GBS mAS3的比较
通常，单独补充甘氨酸足以以约等同于补充所有四种氨基酸的方式改善生长。然而，单独补充甘氨酸令人惊讶地产生比GBS mAS3以及补充所有四种氨基酸更高的多糖滴度。
实施例6：甘氨酸浓度的比较
鉴于单独添加甘氨酸时多糖出人意料的高生产，进行实验以确定向GBS mAS3制剂加入6mM甘氨酸是否获得最大生长和多糖滴度。使用GBS血清型V作为模型，该实验比较了0.15mM至123.2 mM甘氨酸的添加。下表13中的数据显示添加少至1.5 mM甘氨酸或多达61.6 mM支持多糖滴度的相同改善，如添加6 mM甘氨酸时所见。
表13. 甘氨酸浓度的比较
甘氨酸浓度 (mM) 生长 (OD600) 多糖 (mg/L)
0 11.6 334
0.15 11.9 356
1.5 16.1 446
3.1 18.5 521
6.2 19.6 455
15.4 18.4 421
30.8 18.5 396
61.6 19.5 381
123.2 0 0
实施例7：确定GBS mAS3培养基中的非必需组分
实施例56中的GBS mAS3制剂及其含甘氨酸的衍生物含有80g/L葡萄糖以确保碳源在整个发酵过程中和发酵结束时过量。一般而言，当生长和多糖生产停止时，约30g/L葡萄糖仍未消耗（数据未显示）。因此，进行了实验来确定是否可以实现更高效的培养基。用GBS血清型V作为模型测试了葡萄糖浓度为80g/L、70g/L、60g/L和50g/L的补充甘氨酸的GBS mAS3培养基。下表14中的数据显示50g/L的葡萄糖浓度不留下残余葡萄糖，但也不损害多糖滴度。
表14. 葡萄糖浓度的比较
分批的葡萄糖(g/L) 生长 (OD600) 多糖 (mg/L) 残余葡萄糖(g/L)
80 17.6 410 28
70 18.2 420 17
60 18.8 430 10
50 19.4 420 0
类似地，通过在退出实验(drop out experiment)中一次一种地省略每一种来检查添加到R17粉末中的所有氨基酸和盐的重要性。在补充甘氨酸的GBS mAS3培养基中用GBS血清型V进行工作。下表15中的数据表明酪氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸对于生长是必需的，而天冬酰胺不是，并且所有的盐都是非必需的。
表15. 氨基酸和盐的退出
删除的组分 生长 (OD600) 多糖 (mg/L)
无 12.7 570
Asn 12.5 600
Gln 1.0 40
Tyr 0.2 10
Cys 6.2 290
无 13.2 510
硫酸镁 13.5 540
硫酸亚铁 12.3 510
微量元素E 13.1 500
氯化钠 13.1 520
实施例8：维生素和盐/微量元素的消耗
使用GBS血清型III作为模型，在补充甘氨酸的GBS mAS3培养基中进行残留维生素和盐/微量元素相比于起始浓度的评估。共检查了13种维生素：生物素、胆碱氰钴胺、叶酸、烟酸、烟酰胺(niacinamide)、尼克酰胺(nicotinamide)、对氨基苯甲酸、泛酸、吡哆醛、吡哆胺、吡哆醇、核黄素和硫胺素。12种显示在发酵过程中浓度没有显著变化。发现烟酰胺在发酵过程中被耗尽至零，但伴随烟酸积累会表明该维生素家族没有被耗尽（数据未显示）。
分析了32种盐和微量元素。其中的18种低于检测限。这18种如下：银、铝、砷、铍、镉、铬、铜、汞、锂、锰、镍、铅、铷、硒、锡、钛、铊和钒。在14种可检测盐和微量元素中，12种显示从培养基的初始接种到收获后的浓度没有实质下降（见表16）。磷和钾是表现出浓度下降的两种。预期到了磷浓度的下降，因为它被消耗用于细胞生长，但它不是生长限制，因为它在收获时保持过量。然而，钾浓度的下降是出人意料的。
表16. 盐和微量元素消耗
初始(mg/L) 收获(mg/L)
硼 1.5 1.6
钡 4.4 4.0
钙 36.1 23.4
钴 0.9 0.8
铁 0.8 0.7
钾 292.0 22.0
镁 138.0 121.0
钼 0.1 0.1
钠 1134.0 10851.0
磷 159.0 44.0
硫 303.0 349.0
硅 0.0 1.9
锶 0.1 0.1
锌 4.1 4.4
该数据引起了两项研究，其中检查了在GBS血清型III的发酵中向补充甘氨酸的GBS mAS3培养基中加入额外2倍量的氯化钾（对于0.31g/L R17粉末额外的0.6g/L） 的作用。表17中显示的结果表明，KCl浓度的增加以不依赖于生长的方式对于多糖滴度是有益的。
表17. 用KCl补充
额外的研究检查了向R17基础粉末中含有的0.31 g/l KCl额外的全部KCl浓度范围（从0.03 g/L到24 g/L）其对生长和多糖合成的作用。结果显示在表18中，其表明向R17粉末额外的0.3至24g/L的KCl浓度赋予改善的生长和多糖生产。
实施例9：mAS3opt50培养基的配制
配置培养基以在GBS mAS3培养基中引入甘氨酸和KCl的增加、葡萄糖浓度的降低以及省略镁、天冬酰胺和NaCl（“mAS3opt50”）。与GBS mAS3培养基相比，对6种GBS血清型测试了新制剂。如表19中所示，重新配制的培养基提供实质改善的生长和伴随的多糖滴度。
表19. GBS mAS3和mAS3opt50的比较
实施例10：甘氨酸和KCl对mAS3opt50中多糖产量的贡献
使用退出方法来证明在mAS3opt50培养基中补充甘氨酸和KCl对多糖产量的重要性。表20中所示的数据清楚地表明，每一种在支持高产量方面都很重要。
表20. mAS3opt50中甘氨酸和KCl的退出
实施例11：mAS3opt50与复合培养基和补充有酵母提取物的复合培养基的比较
起始复合培养基（“HP”）是基于大豆水解产物的制剂：28 g/L HYPEP 1510 (KerryGroup Services Ltd.)、3.5 g/L NaCl、0.7 g/L KH2PO4、0.0182 g/L CaCl2 .2H2O、1 g/LMgSO4 .7H2O、0.84 g/L NaHCO3和80 g/L葡萄糖。在该培养基中六种GBS血清型的发酵产生的生长和滴度实质低于mAS3opt50中的。因此，将HP补充10 g/L AMBERFERM 5902 (SensientTechnologies Corp.) (“HPYE”)，一种超滤的酵母提取物。与HP培养基相比，HPYE培养基已实质改善了细胞密度和多糖滴度。虽然HPYE与mAS3opt50相比在几乎所有血清型中均表现出生长增加，但HPYE培养基中的多糖滴度有些低。所有数据显示于下表21中。
表21. mAS3opt50与复合培养基和补充酵母的复合培养基的比较
实施例12：酵母提取物在复合培养基中的滴定
进行滴定以确定赋予最佳生长和多糖生产的酵母提取物补充的浓度。使用GBS血清型V作为模型以测量在0 g/L、2.5 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L和40 g/L的用AMBERFERM 5902(Sensient Technologies Corp.)补充酵母提取物的作用。如表22所示，数据表明补充低至2.5g/L的酵母足以刺激生长和荚膜多糖的产生。然而，酵母提取物补充的最佳浓度为10g/L，因为添加更多的量不会带来额外的益处。
表22. 酵母提取物滴定对复合培养基中的生长和多糖生产的作用
酵母提取物浓度(g/L) 生长 (OD600) 多糖 (mg/L)
0 10.9 64
2.5 18.0 259
5.0 19.6 291
10.0 20.4 320
20.0 20.7 282
40.0 23.5 279
实施例13：确定成分培养基的酵母提取物补充
考虑到补充酵母提取物对复合培养基中多糖滴度的正面影响，进行了检查用AMBERFERM 5902 (Sensient Technologies Corp.)补充GBS mAS3的实验。将补充有超滤的酵母提取物（“R17YE”）的GBS mAS3与GBS mAS3和mAS3opt50进行比较。与GBS mAS3和mAS3opt50相比，R17的酵母提取物补充显著改善了多糖滴度（见表23）。
表23. 酵母提取物补充的GBS mAS3、GBS mAS3和mAS3opt50的比较
然后进行研究以比较补充不同浓度的超滤的酵母提取物与补充不同浓度的来自BD Biosciences (BD RECHARGE)的可商购“合成”酵母提取物。GBS血清型V被用作模型。表24中所示的数据表明，虽然20g/L酵母提取物（超滤的或合成的）赋予生长改善，但多糖滴度中没有相应的增加。补充合成酵母提取物改善了相对于GBS mAS3对照的生长，但不能赋予用超滤的酵母提取物实现的最大滴度。
表24. 超滤的酵母提取物和合成酵母提取物的不同浓度的比较
GBS mAS3补充 生长 (OD600) 多糖 (mg/L)
无 9.8 240
5 g/L AMBERFERM 5902 15.5 440
10 g/L AMBERFERM 5902 18.1 470
20 g/L AMBERFERM 5902 26.2 480
10 g/L BD REcharGE 18.0 320
20 g/L BD REcharGE 19.2 320
实施例14：恒定葡萄糖补料发酵的分析
使用各种GBS血清型作为模型，用mAS3opt50培养基检查恒定葡萄糖补料其在支持多糖滴度方面的作用。比较分批为50g/L葡萄糖和葡萄糖补料的发酵（10 g/L葡萄糖分批，并且剩余的40 g/L在EFT的3-4小时时开始的7个小时过程中以恒定速率补料）表明在所有血清型中实现可比较的生长和多糖滴度（参见表25）。在其他方面发酵控制参数为实施例2中所示的那些。
表25. 用mAS3opt50培养基的葡萄糖补料分批发酵
实施例15：用HPYE和GBS mAS3培养基的葡萄糖补料分批发酵
也使用GBS血清型V作为模型检查HPYE和GBS mAS3培养基的补料分批发酵。用10g/L葡萄糖分批开始发酵，然后在EFT 3-4小时后的5小时过程中补料70g/L葡萄糖。在其他方面如实施例2中配制发酵。表26中显示的数据表明相比于分批方法，补料分批方法为GBS mAS3提供了~等同的生产力。补料方法支持HPYE中的多糖生产，但生产力比分批略低。
实施例16：灌注发酵
对肺炎链球菌的13种血清型进行使用实施例1中描述的改良AS3培养基的灌注实验。将培养基接种并在2L生物反应器中以分批模式运行约4-10小时，直到OD600达到3-7。然后将培养物通过灌注***进行循环，其中除去用完的培养基和废物产物并通过引入新鲜培养基来维持培养体积。灌注以0.13 VVH的初始速率开始，并且在3-5小时的过程中逐渐升高至0.80VVH，此时灌注分批结束。下表27中显示的数据表明与实施例1中的分批发酵相比，生物质水平显著增加，且所产生的多糖相应增加。
表27. 灌注发酵相比于分批发酵的肺炎链球菌生长和多糖生产
实施例17：灌注和分批发酵方法在三种不同培养基中的比较
使用GBS mAS3或HPYE作为基础培养基进行灌注实验。接种1X培养基（含有0.5X葡萄糖）并以分批模式（5L工作体积）运行约3小时。当OD接近1-5 OD时，用0.5X培养基以0.13 VVH的初始速率开始灌注持续约1小时。在6-7小时的过程中，速率逐渐升至1.20 VVH，此时灌注分批结束。下表28中显示的GBS mAS3灌注数据表明，相对于分批模式，细胞密度增加约1.4-2倍，且伴随着多糖滴度的增加。
表28.
* ND =测试未进行。
基于HPYE复合培养基的灌注数据显示于下表29。一般而言，灌注导致相对于分批细胞密度提高2倍以上，且多糖滴度提高2至3.5倍。
表29.
* ND =测试未进行。
使用血清型IV作为模型同样进行基于mAS3opt50的培养基中的灌注。获得的收获OD600是16.7；多糖生产为667 mg/L。相比之下，实施例8中呈现的mAS3opt50分批发酵产生10.4的细胞密度和360 mg/L的多糖生产值，证明〜1.9倍的生产力改进。
总之，在所有使用的三种培养基中，灌注发酵导致比分批性能约2倍或更多的多糖生产力增加。
本发明的方面
以下条款描述了本发明的额外的实施方案。
C1. 产多糖细菌细胞培养基，其包含植物水解产物、酵母提取物和碳源。
C2. C1的培养基，其中所述植物水解产物为大豆水解产物。
C3. C2的培养基，其中所述大豆水解产物选自HYPEP 1510（Kerry GroupServices Ltd.）、HYPEP 4601（Kerry Group Services Ltd.）、HYPEP 5603（Kerry GroupServices Ltd.）、HY-SOY (Kerry Group Services Ltd.)、AMI-SOY (Kerry GroupServices Ltd.)、N-Z-SOY (Kerry Group Services Ltd.)、N-Z-SOY BL4 (Kerry GroupServices Ltd.)、N-Z-SOY BL7 (Kerry Group Services Ltd.)、SHEFTONE D (KerryGroup Services Ltd.)、SE50M、SE50MK、大豆蛋白胨、BACTO大豆胨(Difco LaboratoriesInc.)、NUTRISOY 2207 (ADM)、NUTRISOY (ADM)、NUTRISOY粉(ADM)和大豆粉。
C4. C3的培养基，其中所述大豆水解产物是HYPEP 1510 (Kerry Group ServicesLtd.)。
C5. C1-C4中任一项的培养基，其中所述植物水解产物的浓度为约5 g/L至约75g/L。
C6. C5的培养基，其中所述植物水解产物的浓度为约10g/L至约50g/L。
C7. C6的培养基，其中所述植物水解产物的浓度为约28g/L。
C8. C1-C7中任一项的培养基，其中所述酵母提取物为酵母自溶产物、超滤的酵母提取物或合成酵母提取物。
C9. C8的培养基，其中所述酵母提取物为超滤的酵母提取物。
C10. C9的培养基，其中所述超滤的酵母提取物是AMBERFERM 5902 (SensientTechnologies Corp.)、BD DIFCO (BD Biosciences)、HYPEP YE (Kerry Group ServicesLtd.)、ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 412 (Kerry GroupServices Ltd.)、HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 444 (KerryGroup Services Ltd.)、HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.)或HY-YEST 504(Kerry Group Services Ltd.)。
C11. C1-C10中任一项的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约1g/L至约50 g/L。
C12. C11的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约5g/L至约25g/L。
C13. C12的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约10g/L。
C14. C1-C13中任一项的培养基，其中所述碳源选自葡萄糖、右旋糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、棉子糖、木糖和甘露糖。
C15. C14的培养基，其中所述碳源是葡萄糖。
C16. C1-C15中任一项的培养基，其中所述碳源的浓度为约25g/L至约100g/L。
C17. C16的培养基，其中所述碳源的浓度为约50g/L至约90g/L。
C18. C17的培养基，其中所述碳源的浓度为约80g/L。
C19. C1-C18中任一项的培养基，其中所述培养基包含大豆水解产物、超滤的酵母提取物和葡萄糖。
C20. C1-C19中任一项的培养基，其中所述培养基还包含含磷酸盐成分。
C21. C20的培养基，其中所述含磷酸盐成分为Na2HPO4、K2HPO4或KH2PO4。
C22. C1-C21中任一项的培养基，其中所述培养基还包含至少一种氨基酸、维生素、核苷或无机盐。
C23. 产多糖细菌细胞培养基，其具有大于约50mM的总氨基酸浓度。
C24. C23的培养基，其中所述培养基包含约1.5mM至约60.0mM的总甘氨酸浓度。
C25. C24的培养基，其中所述总甘氨酸浓度为约5.0mM至约15.0mM。
C26. C25的培养基，其中所述总甘氨酸浓度为约7.5mM。
C27. C23-C26中任一项的培养基，其中所述培养基包含约1.0mM至约30.0mM的总精氨酸浓度。
C28. C27的培养基，其中所述总精氨酸浓度为约1.0mM至约20.0mM。
C29. C28的培养基，其中所述总精氨酸浓度为约4.0mM。
C30. C23-C29中任一项的培养基，其中所述培养基包含约0.1mM至约5.0mM的总半胱氨酸浓度。
C31. C30的培养基，其中所述总半胱氨酸浓度为约0.1 mM至约3.5 mM。
C32. C31的培养基，其中所述总半胱氨酸浓度为约0.4mM。
C33. C23-C32中任一项的培养基，其中所述培养基包含约5.0mM至约75.0mM的总丝氨酸浓度。
C34. C33的培养基，其中所述总丝氨酸浓度为约5.0mM至约15.0mM。
C35. C34的培养基，其中所述总丝氨酸浓度为约7.5mM或约10mM。
C36. C23-C35中任一项的培养基，其中所述培养基包含约1.0mM至约30.0mM的总谷氨酰胺浓度。
C37. C36的培养基，其中所述总谷氨酰胺浓度为约1.0mM至约20.0mM。
C38. C37的培养基，其中所述总谷氨酰胺浓度为约4.0mM。
C39. C23-C38中任一项的培养基，其中所述培养基包含约0.1mM至约5.0mM的总酪氨酸浓度。
C40. C39的培养基，其中所述总酪氨酸浓度为约1.0mM至约3.5mM。
C41. C40的培养基，其中所述总酪氨酸浓度为约2.9mM或约3.0mM。
C42. C23-C41中任一项的培养基，其中所述培养基包含约5.0mM至约50.0mM的总天冬酰胺浓度。
C43. C42的培养基，其中所述总天冬酰胺浓度为约10.0mM至约30.0mM。
C44. C43的培养基，其中所述总天冬酰胺浓度为约20.0mM。
C45. C23-C41中任一项的培养基，其中所述培养基不含有天冬酰胺。
C46. C23-C45中任一项的培养基，其中所述培养基还包含钾盐。
C47. C46的培养基，其中所述钾盐是氯化钾或硫酸钾。
C48. C46或C47的培养基，其中所述钾盐的总浓度为约0.1g/L至约25g/L。
C49. C48的培养基，其中所述总钾盐浓度为约0.2g/L至约1.25g/L。
C50. C49的培养基，其中所述总钾盐浓度为约0.9g/L。
C51. C23-C50中任一项的培养基，其中所述培养基还包含碳源。
C52. C51的培养基，其中所述碳源选自葡萄糖、右旋糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、棉子糖、木糖和甘露糖。
C53. C52的培养基，其中所述碳源是葡萄糖。
C54. C51-C53中任一项的培养基，其中所述培养基包含总浓度为约25g/L至约100g/L的碳源。
C55. C54的培养基，其中所述碳源的总浓度为约25g/L至约80g/L。
C56. C55的培养基，其中所述碳源的总浓度为约50g/L。
C57. C23-C56中任一项的培养基，其中所述培养基还包含碳酸氢钠。
C58. C57的培养基，其中所述培养基包含浓度为约0.1g/L至约20g/L的碳酸氢钠。
C59. C58的培养基，其中所述碳酸氢钠的浓度为约0.5g/L至约1.0g/L。
C60. C59的培养基，其中所述碳酸氢钠的浓度为约0.84g/L。
C61. C23-C60中任一项的培养基，其中所述培养基还包含酵母提取物。
C62. C61的培养基，其中所述酵母提取物选自酵母自溶产物、超滤的酵母提取物和合成酵母提取物。
C63. C62的培养基，其中所述酵母提取物为超滤的酵母提取物。
C64. C63的培养基，其中所述超滤的酵母提取物是AMBERFERM 5902 (SensientTechnologies Corp.)、BD DIFCO (BD Biosciences)、HYPEP YE (Kerry Group ServicesLtd.)、ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 412 (Kerry GroupServices Ltd.)、HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 444 (KerryGroup Services Ltd.)、HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.)或HY-YEST 504(Kerry Group Services Ltd.)。
C65. C61-C64中任一项的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约1g/L至约50g/L。
C66. C65的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约5g/L至约25g/L。
C67. C66的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约10g/L。
C68. C23-C67中任一项的培养基，其中所述培养基包含至少约50mM的氨基酸、钾盐、碳源和任选地，酵母提取物。
C69. C68的培养基，其中所述培养基包含至少约50mM的氨基酸、约5.0mM至约15.0mM的甘氨酸、约0.2 g/L至约1.25 g/L的钾盐、约25 g/L至约80 g/L的碳源和约5 g/L至约25 g/L的酵母提取物。
C70. C69的培养基，其中所述培养基包含至少约60mM的氨基酸、约7.5mM的甘氨酸、约0.9 g/L的氯化钾、50 g/L的葡萄糖和约10 g/L的超滤的酵母提取物。
C71. 培养产多糖细菌的方法，其包括a）将C1-C70中任一项的培养基添加到生物反应器中，b）用产多糖细菌接种培养基，和c）通过发酵培养细菌，其中所述培养包括以恒定速率向培养基中添加营养物。
C72. C71的培养方法，其中所述营养物是碳源。
C73. C72的培养方法，其中所述碳源是葡萄糖。
C74. C71-C73中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌具有至少9.0的细胞密度。
C75. C71-C74中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌具有至少约250mg/L的多糖浓度。
C76. C71-C75中任一项的培养方法，其中所述产多糖细菌选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
C77. 培养产多糖细菌的方法，其包括a）将C1-C70中任一项的培养基添加到生物反应器中，b）用产多糖细菌接种培养基，和c）通过灌注培养细菌，其中所述培养包括（i）从培养物中去除用完的培养基，（ii）添加新鲜培养基和（iii）保留细菌。
C78. C77的培养方法，其中灌注速率为约0.07VVH至约2.00VVH。
C79. C78的培养方法，其中所述灌注速率为约0.67VVH至约1.33VVH。
C80. C79的培养方法，其中所述灌注速率为约1.20VVH。
C81. C77的培养方法，其中所述灌注速率是改变的。
C82. C81的培养方法，其中所述灌注以第一速率开始并且速率增加至第二速率。
C83. C81的培养方法，其中所述灌注以第一速率开始并且速率降低至第二速率。
C84. C77-C83中任一项的培养方法，其中所述灌注的持续时间为约1小时至约15小时。
C85. C84的培养方法，其中所述灌注的持续时间为约1小时至约10小时。
C86. C85的培养方法，其中所述灌注的持续时间为约7小时。
C87. C77-C86中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌的细胞生长是分批发酵***中的细胞生长的至少2倍。
C88. C77-C87中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌已达到至少20.0的细胞密度。
C89. C77-C88中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌已达到至少约600 mg/L的多糖浓度。
C90. C77-C89中任一项的培养方法，其中所述产多糖细菌选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。

Claims (90)

1.产多糖细菌细胞培养基，其包含植物水解产物、酵母提取物和碳源。
2.权利要求1的培养基，其中所述植物水解产物为大豆水解产物。
3.权利要求2的培养基，其中所述大豆水解产物选自HYPEP 1510 (Kerry GroupServices Ltd.)、HYPEP 4601 (Kerry Group Services Ltd.)、HYPEP 5603 (Kerry GroupServices Ltd.)、HY-SOY (Kerry Group Services Ltd.)、AMI-SOY (Kerry GroupServices Ltd.)、N-Z-SOY (Kerry Group Services Ltd.)、N-Z-SOY BL4 (Kerry GroupServices Ltd.)、N-Z-SOY BL7 (Kerry Group Services Ltd.)、SHEFTONE D (KerryGroup Services Ltd.)、SE50M、SE50MK、大豆蛋白胨、BACTO大豆胨(Difco LaboratoriesInc.)、NUTRISOY 2207 (ADM)、NUTRISOY (ADM)、NUTRISOY粉(ADM)和大豆粉。
4.权利要求3的培养基，其中所述大豆水解产物是HYPEP 1510 (Kerry GroupServices Ltd.)。
5.权利要求1-4中任一项的培养基，其中所述植物水解产物的浓度为约5 g/L至约75g/L。
6.权利要求5的培养基，其中所述植物水解产物的浓度为约10 g/L至约50 g/L。
7.权利要求6的培养基，其中所述植物水解产物的浓度为约28 g/L。
8.权利要求1-7中任一项的培养基，其中所述酵母提取物为酵母自溶产物、超滤的酵母提取物或合成酵母提取物。
9.权利要求8的培养基，其中所述酵母提取物为超滤的酵母提取物。
10.权利要求9的培养基，其中所述超滤的酵母提取物是AMBERFERM 5902 (SensientTechnologies Corp.)、BD DIFCO (BD Biosciences)、HYPEP YE (Kerry Group ServicesLtd.)、ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 412 (Kerry GroupServices Ltd.)、HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 444 (KerryGroup Services Ltd.)、HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.)或HY-YEST 504(Kerry Group Services Ltd.)。
11.权利要求1-10中任一项的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约1 g/L至约50g/L。
12.权利要求11的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约5 g/L至约25 g/L。
13.权利要求12的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约10 g/L。
14.权利要求1-13中任一项的培养基，其中所述碳源选自葡萄糖、右旋糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、棉子糖、木糖和甘露糖。
15.权利要求14的培养基，其中所述碳源是葡萄糖。
16.权利要求1-15中任一项的培养基，其中所述碳源的浓度为约25 g/L至约100 g/L。
17.权利要求16的培养基，其中所述碳源的浓度为约50 g/L至约90 g/L。
18.权利要求17的培养基，其中所述碳源的浓度为约80 g/L。
19.权利要求1-18中任一项的培养基，其中所述培养基包含大豆水解产物、超滤的酵母提取物和葡萄糖。
20.权利要求1-19中任一项的培养基，其中所述培养基还包含含磷酸盐成分。
21.权利要求20的培养基，其中所述含磷酸盐成分为Na2HPO4、K2HPO4或KH2PO4。
22.权利要求1-21中任一项的培养基，其中所述培养基还包含至少一种氨基酸、维生素、核苷或无机盐。
23.产多糖细菌细胞培养基，其具有大于约50 mM的总氨基酸浓度。
24.权利要求23的培养基，其中所述培养基包含约1.5 mM至约60.0 mM的总甘氨酸浓度。
25.权利要求24的培养基，其中所述总甘氨酸浓度为约5.0 mM至约15.0 mM。
26.权利要求25的培养基，其中所述总甘氨酸浓度为约7.5 mM。
27.权利要求23-26中任一项的培养基，其中所述培养基包含约1.0 mM至约30.0 mM的总精氨酸浓度。
28.权利要求27的培养基，其中所述总精氨酸浓度为约1.0 mM至约20.0 mM。
29.权利要求28的培养基，其中所述总精氨酸浓度为约4.0 mM。
30.权利要求23-29中任一项的培养基，其中所述培养基包含约0.1 mM至约5.0 mM的总半胱氨酸浓度。
31.权利要求30的培养基，其中所述总半胱氨酸浓度为约0.1 mM至约3.5 mM。
32.权利要求31的培养基，其中所述总半胱氨酸浓度为约0.4 mM。
33.权利要求23-32中任一项的培养基，其中所述培养基包含约5.0 mM至约75.0 mM的总丝氨酸浓度。
34.权利要求33的培养基，其中所述总丝氨酸浓度为约5.0 mM至约15.0 mM。
35.权利要求34的培养基，其中所述总丝氨酸浓度为约7.5 mM或约10 mM。
36.权利要求23-35中任一项的培养基，其中所述培养基包含约1.0 mM至约30.0 mM的总谷氨酰胺浓度。
37.权利要求36的培养基，其中所述总谷氨酰胺浓度为约1.0 mM至约20.0 mM。
38.权利要求37的培养基，其中所述总谷氨酰胺浓度为约4.0 mM。
39.权利要求23-38中任一项的培养基，其中所述培养基包含约0.1 mM至约5.0 mM的总酪氨酸浓度。
40.权利要求39的培养基，其中所述总酪氨酸浓度为约1.0 mM至约3.5 mM。
41.权利要求40的培养基，其中所述总酪氨酸浓度为约2.9 mM或约3.0 mM。
42.权利要求23-41中任一项的培养基，其中所述培养基包含约5.0 mM至约50.0 mM的总天冬酰胺浓度。
43.权利要求42的培养基，其中所述总天冬酰胺浓度为约10.0 mM至约30.0 mM。
44.权利要求43的培养基，其中所述总天冬酰胺浓度为约20.0 mM。
45.权利要求23-41中任一项的培养基，其中所述培养基不含有天冬酰胺。
46.权利要求23-45中任一项的培养基，其中所述培养基还包含钾盐。
47.权利要求46的培养基，其中所述钾盐是氯化钾或硫酸钾。
48.权利要求46或权利要求47的培养基，其中所述钾盐的总浓度为约0.1 g/L至约25g/L。
49.权利要求48的培养基，其中所述总钾盐浓度为约0.2 g/L至约1.25 g/L。
50.权利要求49的培养基，其中所述总钾盐浓度为约0.9 g/L。
51.权利要求23-50中任一项的培养基，其中所述培养基还包含碳源。
52.权利要求51的培养基，其中所述碳源选自葡萄糖、右旋糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、棉子糖、木糖和甘露糖。
53.权利要求52的培养基，其中所述碳源是葡萄糖。
54.权利要求51-53中任一项的培养基，其中所述培养基包含总浓度为约25 g/L至约100 g/L的碳源。
55.权利要求54的培养基，其中所述碳源的总浓度为约25 g/L至约80 g/L。
56.权利要求55的培养基，其中所述碳源的总浓度为约50 g/L。
57.权利要求23-56中任一项的培养基，其中所述培养基还包含碳酸氢钠。
58.权利要求57的培养基，其中所述培养基包含浓度为约0.1 g/L至约20 g/L的碳酸氢钠。
59.权利要求58的培养基，其中所述碳酸氢钠的浓度为约0.5 g/L至约1.0 g/L。
60.权利要求59的培养基，其中所述碳酸氢钠的浓度为约0.84 g/L。
61.权利要求23-60中任一项的培养基，其中所述培养基还包含酵母提取物。
62.权利要求61的培养基，其中所述酵母提取物选自酵母自溶产物、超滤的酵母提取物和合成酵母提取物。
63.权利要求62的培养基，其中所述酵母提取物为超滤的酵母提取物。
64.权利要求63的培养基，其中所述超滤的酵母提取物是AMBERFERM 5902 (SensientTechnologies Corp.)、BD DIFCO (BD Biosciences)、HYPEP YE (Kerry Group ServicesLtd.)、ULTRAPEP YE (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 412 (Kerry GroupServices Ltd.)、HY-YEST 441 (Kerry Group Services Ltd.)、HY-YEST 444 (KerryGroup Services Ltd.)、HY-YEST 455 (Kerry Group Services Ltd.)或HY-YEST 504(Kerry Group Services Ltd.)。
65.权利要求61-64中任一项的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约1 g/L至约50g/L。
66.权利要求65的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约5 g/L至约25 g/L。
67.权利要求66的培养基，其中所述酵母提取物的浓度为约10 g/L。
68.权利要求23-67中任一项的培养基，其中所述培养基包含至少约50 mM的氨基酸、钾盐、碳源和任选地，酵母提取物。
69.权利要求68的培养基，其中所述培养基包含至少约50 mM的氨基酸、约5.0 mM至约15.0 mM的甘氨酸、约0.2 g/L至约1.25 g/L的钾盐、约25 g/L至约80 g/L的碳源和约5 g/L至约25 g/L的酵母提取物。
70.权利要求69的培养基，其中所述培养基包含至少约60 mM的氨基酸、约7.5 mM的甘氨酸、约0.9 g/L的氯化钾、50 g/L的葡萄糖和约10 g/L的超滤的酵母提取物。
71.培养产多糖细菌的方法，其包括a）将权利要求1-70中任一项的培养基添加到生物反应器中，b）用产多糖细菌接种培养基，和c）通过发酵培养细菌，其中所述培养包括以恒定速率向培养基中添加营养物。
72.权利要求71的培养方法，其中所述营养物是碳源。
73.权利要求72的培养方法，其中所述碳源是葡萄糖。
74.权利要求71-73中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌具有至少9.0的细胞密度。
75.权利要求71-74中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌具有至少约250 mg/L的多糖浓度。
76.权利要求71-75中任一项的培养方法，其中所述产多糖细菌选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
77.培养产多糖细菌的方法，其包括a）将权利要求1-70中任一项的培养基添加到生物反应器中，b）用产多糖细菌接种培养基，和c）通过灌注培养细菌，其中所述培养包括（i）从培养物中去除用完的培养基，（ii）添加新鲜培养基和（iii）保留细菌。
78.权利要求77的培养方法，其中所述灌注速率为约0.07 VVH至约2.00 VVH。
79.权利要求78的培养方法，其中所述灌注速率为约0.67 VVH至约1.33 VVH。
80.权利要求79的培养方法，其中所述灌注速率为约1.20 VVH。
81.权利要求77的培养方法，其中所述灌注速率是改变的。
82.权利要求81的培养方法，其中所述灌注以第一速率开始并且速率增加至第二速率。
83.权利要求81的培养方法，其中所述灌注以第一速率开始并且速率降低至第二速率。
84.权利要求77-83中任一项的培养方法，其中所述灌注的持续时间为约1小时至约15小时。
85.权利要求84的培养方法，其中所述灌注的持续时间为约1小时至约10小时。
86.权利要求85的培养方法，其中所述灌注的持续时间为约7小时。
87.权利要求77-86中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌的细胞生长是分批发酵***中的细胞生长的至少2倍。
88.权利要求77-87中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌已达到至少20.0的细胞密度。
89.权利要求77-88中任一项的培养方法，其中所述培养的细菌已达到至少约600 mg/L的多糖浓度。
90.权利要求77-89中任一项的培养方法，其中所述产多糖细菌选自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
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