CN110325199A

CN110325199A - 用于治疗苯丙酮尿症的基因疗法

Info

Publication number: CN110325199A
Application number: CN201780087369.2A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·M·威尔逊; 詹妮·艾格尼丝·西德兰; 斯科特·艾希莉
Original assignee: Pennsylvania State University
Current assignee: Pennsylvania State University
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-10-11
Also published as: KR20190100318A; JP7229161B2; BR112019013576A2; US20190336550A1; JP2020504619A; EP3562494A4; US11382941B2; EP3562494A1; US20220313760A1; MX2019007876A; CA3048038A1; WO2018126112A1

Abstract

提供了可用于治疗苯丙酮尿症的组合物和方案。所述组合物包含具有驱动人类苯丙氨酸羟化酶表达的转甲状腺素蛋白增强子和启动子的重组腺相关病毒(rAAV)。

Description

用于治疗苯丙酮尿症的基因疗法

以引用的方式并入以电子形式提交的材料

申请人在此将以引用的方式并入以电子形式提交的序列表材料。此文件标记为“UPN-16-7939PCT_ST25.txt”。

1.背景技术

本申请涉及可用于用以治疗苯丙酮尿症的基因疗法的实施方案。

2.背景技术

作为最常见的先天性代谢障碍之一，在美国苯丙酮尿症(PKU)发生在10,000至15,000之一的新生儿中。当前治疗方法要求受影响个体始终坚持难吃且昂贵的饮食限制和/或从出生开始持续一生用苯丙氨酸氨裂解酶进行酶替代。

PKU的最常见原因是由PAH基因中的隐性遗传突变而导致的苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏。PAH主要在肝脏中表达，催化苯丙氨酸不可逆羟基化为酪氨酸。因此，PAH的缺乏影响苯丙氨酸的分解代谢途径，从而导致苯丙氨酸积累。高血浆苯丙氨酸水平导致苯丙氨酸在大脑中积累，并且可能影响大脑发育和功能，从而造成智力残疾和癫痫发作。此外，通过饮食限制和酶替代降低血浆苯丙氨酸是昂贵的、不方便的并且与各种不良并发症诸如持续性轻度认知缺陷相关。

实现持续性PAH治疗水平的替代性方法是通过使用由细胞定向的腺相关病毒(AAV)或其他病毒或非病毒载体介导的基因转移在体内肝细胞中连续产生天然酶。已经在小鼠研究中初步测试了载体介导的PAH表达的若干种尝试。参见例如Harding等人，Complete correction of hyperphenylalaninemia following liver-directed,recombinant AAV2/8vector mediated gene therapy in murine phenylketonuria GeneTher.2006年3月；13(5):457-6以及Viecelli等人,Treatment of Phenylketonuria UsingMinicircle-Based Naked-DNA Gene Transfer to Murine Liver Hepatology.2014Sep；60(3):1035-1043，其以引用的方式并入本文。然而，对递送效率、免疫刺激、长期表达稳定性和安全性的评估是缺乏的或不是最佳的。因此，PKU治疗需要更高效的AAV.hPAH载体。

发明内容

本文所述的实施方案涉及一种AAV基因疗法载体，其用于在静脉内施用所述载体后将正常人类苯丙氨酸羟化酶(PAH)递送至有需要的受试者，从而产生对高苯丙氨酸血症的临床上有意义的长期校正，可能是10年或更长时间。受试患者群体是患有中度至重度高苯丙氨酸血症的患者，包括患有PKU、变体PKU或非PKU高苯丙氨酸血症的患者。与野生型相比，预期的载体剂量旨在递送约15％或更高的PAH血液水平，这是已针对“中度”PKU患者报道的水平。参见Kaufman,S.,PNAS,96:3160-4(1999)，其以引用的方式并入本文。在另一个实施方案中，预期的载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低25％或更多。在一个实施方案中，AAV载体治疗的目标是将重度PKU患者转化为中度或轻度PKU，从而减轻与严重受限的苯丙氨酸饮食相关的负担。

在一个方面，本申请提供了复制缺陷型腺相关病毒(AAV)将人类苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因递送至诊断患有PKU的患者(人类受试者)的肝细胞的用途。用于递送hPAH基因(“rAAV.hPAH”)的重组AAV载体(rAAV)应具有肝脏的趋向性(例如，携带AAV8衣壳的rAAV)，并且hPAH转基因应通过肝脏特异性表达控制元件来控制。在一个实施方案中，表达控制元件包括以下一种或多种：增强子；启动子；内含子；WPRE；以及polyA信号。这类元件在本文中进一步描述。

在一个实施方案中，hPAH编码序列示出于SEQ ID NO:1中。在一个实施方案中，PAH蛋白序列示出于SEQ ID NO:2中。在一个实施方案中，hPAH的编码序列被密码子优化以在人类中表达。此类序列可以与天然hPAH编码序列(SEQ ID NO:3)共有小于80％同一性。在一个实施方案中，hPAH编码序列是示出于SEQ ID NO:1中的序列。

另一方面，本文提供了适用于向PKU患者施用的水性悬浮液，其包含本文所述的rAAV。在一些实施方案中，悬浮液包含水性悬浮液体和约1x 10¹²至约l x 10¹⁴个rAAV基因组拷贝(GC)/mL。在一个实施方案中，悬浮液适用于静脉内注射。在其他实施方案中，悬浮液还包含溶解在水性悬浮液中的表面活性剂、防腐剂和/或缓冲液。

在另一个实施方案中，本文提供了一种用本文所述的rAAV治疗患有PKU的患者的方法。在一个实施方案中，将约1x 10¹¹至约3x10¹³个rAAV基因组拷贝(GC)/kg患者体重以水性悬浮液递送至患者。

3.附图说明

图1是pAAV.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH顺式质粒的示意图。

图2A是如实施例1中所述在PAH_KO_A小鼠模型(以白色示出)和野生型(以黑色示出)或杂合(以灰色示出)同窝仔中的血浆苯丙氨酸(Phe)水平的条形图。这些结果总结在图2D中。

图2B是PAH_KO_A小鼠(以白色示出)以及作为对照提供的杂合(以灰色示出)和野生型(以黑色示出)同窝小鼠中的血浆苯丙氨酸(Phe)水平的线表。如实施例3中所述，在自然病史研究的第56天向小鼠注射1x 10¹³GC/kg或1x 10¹²GC/kg的AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH。从自然病史研究开始对7只雄性和3只雌性PAH_KO_A小鼠进行实验。

图2C是如实施例3中所述在注射1x 10¹³GC/kg或1x 10¹²GC/kg的AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH的PAH_KO_A小鼠模型中的血浆苯丙氨酸(Phe)水平的线表。注射日为第0天。

图2D是示出图2A中研究的小鼠的平均Phe水平的线表。值表示为平均值+/-SEM。

图3A是如实施例1中所述在PAH_KO_B小鼠模型(以白色示出)和野生型(以黑色示出)或杂合(以灰色示出)同窝仔中的血浆苯丙氨酸(Phe)水平的条形图。这些结果总结在图3D中。

图3B是PAH_KO_B小鼠(以白色示出)以及作为对照提供的杂合(以灰色示出)和野生型(以黑色示出)同窝小鼠中的血浆苯丙氨酸(Phe)水平的线表。从自然病史研究开始对3只雌性PAH_KO_B小鼠进行实验。

图3C是如实施例3中所述在注射1x 10¹²GC/kg AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH的PAH_KO_B小鼠模型中的血浆苯丙氨酸(Phe)水平的线表。小鼠识别号1691、1695和1696是在第0天注射1x 10¹²GC/kg的雌性。

图3D是示出图3A中研究的小鼠的平均Phe水平的线表。值表示为平均值+/-SEM。

图4A是如实施例1中所述在PAHKOC小鼠模型(以白色示出)和野生型(以黑色示出)或杂合(以灰色示出)同窝仔中的血浆苯丙氨酸(Phe)水平的线表。这些结果总结在图4C中。

图4B是PAH_KO_C小鼠(以白色示出)以及作为对照提供的杂合(以灰色示出)和野生型(以黑色示出)同窝小鼠中的血浆苯丙氨酸(Phe)水平的线表。从自然病史研究开始对2只雄性PAH_KO_C小鼠进行实验。

图4C是示出图4A中研究的小鼠的平均Phe水平的线表。值表示为平均值+/-SEM。

图5是总结图2A、图3A和图4A的结果的条形图。通过LC/MS/MS检测血浆苯丙氨酸(Phe)水平并且得到来自从6-8周大开始抽血的PAH_KO_A、PAH_KO_B和PAH_KO_C小鼠的数据。分离血浆并分析Phe浓度。提供野生型同窝仔作为阴性对照。

图6A-6C证明AAV8.TBG.hPAHco拯救PKUKOB小鼠中的苯丙氨酸水平。在建立预处理苯丙氨酸水平之后，向17-22周大的PKU B小鼠给予10¹²GC/kg的AAV8.TBG.hPAHco.bGH(圆形)或AAV8.TBG.hPAHco.WPRE.bGH(正方形)。用三角形示出PBS处理。然后每周对小鼠抽血，分离血浆并测定苯丙氨酸浓度(A)。在研究结束时，收集肝脏并进行基因组拷贝分析(B)和免疫组织化学(C)。将数值表示为平均值±SEM。

图7是证明AAV基因疗法降低PKUKOA小鼠中的血浆Phe浓度的线表。在建立基线苯丙氨酸水平后，向WT(三角形)、杂合(圆形)和PKUKOA(KO)小鼠静脉内注射10¹¹GC/kg的AAV8.TBG.hPAHco。然后每周对小鼠抽血，分离血浆并分析Phe浓度。值表示为平均值+/-SEM。在静脉内注射AAV8.TBG.hPAHco之后，血浆中的Phe水平降低了71％。

图8A-8C证明高剂量AAV9.TBG.hPAHco拯救PKU KO B小鼠中的苯丙氨酸水平。在建立基线苯丙氨酸水平之后，向PKU KO B小鼠给予10¹²GC/kg、3x 10¹¹GC/kg、或10¹¹GC/kg的AAV8.TBG.hPAHco。然后每周对小鼠抽血，分离血浆并分析Phe浓度(A)。值表示为平均值+/-SEM。在研究结束时，收集肝脏并进行基因组拷贝分析(B)和免疫组织化学(C)。在10¹²GC/kg剂量下观察到蛋白质表达和Phe水平降低。

图9示出野生型(WT)(SEQ ID NO:26)、PAH_KO_A(品系A)(SEQ ID NO:27)、PAH_KO_B(品系B)(SEQ ID NO:28)、PAH_KO_C(品系C)(SEQ ID NO:29)、PAH_KO_D(品系D)(SEQ IDNO:30)和共有(SEQ ID NO:31)的PAH序列的一部分的比对。

4.发明内容

本申请中描述的实施方案涉及复制缺陷型腺相关病毒(AAV)将人类苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因递送至诊断患有苯丙酮尿症(PKU)的患者(人类受试者)的肝细胞的用途。用于递送hPAH基因(“rAAV.hPAH”)的重组AAV载体(rAAV)应具有肝脏的趋向性(例如，携带AAV8衣壳的rAAV)，并且hPAH转基因应通过肝脏特异性表达控制元件来控制。在一个实施方案中，表达控制元件包括以下一种或多种：增强子；启动子；内含子；WPRE；以及polyA信号。这类元件在本文中进一步描述。

如本文所用，“AAV8衣壳”是指具有以下GenBank登录号的氨基酸序列的AAV8衣壳：YP_077180.1，SEQ ID NO:19，其以引用的方式并入本文。允许与此编码序列的一些变异，所述变异可以包括与YP_077180.1和WO 2003/052051(其以引用的方式并入本文中)中的参考氨基酸序列具有约99％同一性的序列(即，与所述参考序列的变异小于约1％)。已经描述了产生衣壳、其编码序列的方法，以及产生rAAV病毒载体的方法。参见例如Gao等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10),6081-6086(2003)和US 2015/0315612。

如本文所用，术语“NAb滴度”是产生多少中和抗体(例如，抗AAV Nab)的量度，所述中和抗体中和其靶向表位(例如，AAV)的生理效应。可如以下所述测量抗-AAV NAb滴度：例如Calcedo,R.等人,Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses.Journal of Infectious Diseases,2009.199(3):第381-390页，其以引用的方式并入本文。

在氨基酸序列的上下文中，术语“百分比(％)同一性”、“序列同一性”、“百分比序列同一性”或“百分比相同”是指两个序列中的残基在一致地比对时相同。可以在蛋白质、多肽、约32个氨基酸、约330个氨基酸或其肽片段的全长或对应核酸序列编码测序仪上容易地确定氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段长度可以是至少约8个氨基酸，并且可以是至多约700个氨基酸。通常，当提及两个不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，参考“比对”序列确定“同一性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对”是指多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列，与参考序列相比，其通常含有缺失或额外地碱基或氨基酸的校正。使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序中的任一种执行比对。对于氨基酸序列，可利用序列比对程序，例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任何程序都在默认设置下使用，但是本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。或者，本领域的技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，所述算法或计算机程序至少提供由参考算法和程序提供的同一性或比对水平。参见例如J.D.Thomson等人,Nucl.Acids.Res.,“A comprehensive comparison ofmultiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指与所关注的基因邻接的表达控制序列和反式或远距离起作用以控制所关注的基因的表达控制序列。

“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指合成或人工病毒粒子，其中含有目标基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中，其中同样包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列是复制缺陷的；即，它们不能产生子代病毒体，但保留感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，病毒载体的基因组不包括编码复制所需酶的基因(基因组可以被工程化成“无肠的”-仅含有所关注的转基因，其侧翼是扩增和包装人工基因组所需的信号)，但这些基因可以在生产期间供应。因此，认为用于基因疗法是安全的，因为除了存在复制所需的病毒酶之外，不会发生由子代病毒体引起的复制和感染。

应注意，术语“一个/种(a/an)”是指一个/种或多个/种。因此，术语“一个/种(a/an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。

词语“包含(comprise/comprises/comprising)”应是包含在内而不是排他性地解释。单词“由...组成(consist/consisting)”及其变体应排他性地解释，而不是包含在内。虽然说明书中的各种实施方案是使用“包含”语言呈现的，但在其他情况下，相关实施方案也旨在使用“由...组成”或“基本上由......组成”语言来解释和描述。

除非另有说明，否则本文所用的术语“约”是指与给定参考值相差10％。

除非在本说明书中另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员并且参考公开的文本通常理解的含义相同的含义，其为本领域技术人员提供了对本申请中使用的许多术语的一般指导。

5.1基因疗法载体

在一方面，提供携带人类PAH基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体以用于基因疗法。rAAV.hPAH载体应具有肝脏的趋向性(例如，携带AAV8衣壳的rAAV)，并且hPAH转基因应通过肝脏特异性表达控制元件来控制。将载体在适用于输注在人类受试者中的缓冲液/载剂中配制。缓冲液/载剂应包含防止rAAV粘附到输注管但不干扰体内rAAV结合活性的组分。

5.1.1.rAAV.hPAH载体

5.1.1.1.hPAH序列

苯丙酮尿症是主要由苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的突变引起的遗传性代谢障碍。PAH基因的突变导致催化活性降低，从而影响苯丙氨酸(Phe)的分解代谢途径。PAH是需要辅助因子四氢生物蝶呤(BH₄)将Phe转化为酪氨酸(Tyr)的一种肝酶。PAH或其辅助因子BH₄的缺乏导致过量苯丙氨酸积累，在不治疗时，其毒性作用可导致严重且不可逆的智力残疾和其他疾病。参见Havid和Cristodoulou,Transl Pediatr,2015年10月,4(4):304-17，其以引用的方式并入本文。

已经描述了超过550个PAH基因突变，其中大部分导致酶活性缺乏。参见可在http://www.pahdb.megill.ca/处访问的苯丙氨酸羟化酶基因座知识库，其以引用的方式并入本文。由于大量已知PKU突变和所述疾病的常染色体隐性性质，观察到广泛的疾病严重程度。疾病严重程度通常按血液苯丙氨酸水平分类，有时被分类为经典PKU、中度或变体PKU、轻度PKU或高苯丙氨酸血症。基于诊断时的血液Phe水平，有4个PKU严重程度。

·高苯丙氨酸血症，其Phe水平略高于正常范围：120-600μmol/L(2-10mg/dL)

·轻度，其血液Phe水平最低：600-900μmol/L(10-15mg/dL)

·中度或变体，其血液Phe水平位于中间：900-1200μmol/L(15-20mg/dL)

·重度或“经典”PKU，其血液Phe水平极高：>1200μmol/L(20mg/dL)

本文所述疗法的目标是提供功能性PAH酶，使得Phe水平在120-600μmol/L范围内，例如血浆Phe水平降低25％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低25％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低30％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低35％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低40％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低45％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低50％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低60％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低70％或更多。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低75％或更多。

在一个实施方案中，“受试者”或“患者”是患有如上所述的PKU的哺乳动物受试者。希望患有任何严重程度的PKU的患者是预期受试者。

在一个实施方案中，hPAH基因编码SEQ ID NO:2中所示的h PAH蛋白。因此，在一个实施方案中，hPAH转基因可包括但不限于所附序列表中提供的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3提供的序列，它们以引用的方式并入本文。SEQ ID NO:3提供了天然人类PAH的cDNA。SEQ IDNO:1提供了人类PAH的工程化cDNA，其已被密码子优化以在人类中表达(本文有时称为hPAHco)。应理解，在一些实施方案中，本文对hPAH的提及可以指hPAH天然或密码子优化的序列。可替代地或另外地，基于网络或可商购获得的计算机程序以及基于服务的公司可以用于将氨基酸序列反向翻译成核酸编码序列，包括RNA和/或cDNA。参见例如EMBOSS的backtranseq，http://w ww.ebi.ac.uk/Tools/st/；Gene Infinity(http://www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html)；ExPasy(http://www.expasy.org/tools/)。希望涵盖编码所述hPAH多肽序列的所有核酸，包括已被优化用于在所需目标受试者中表达(例如，通过密码子优化)的核酸序列。

在一个实施方案中，编码hPAH的核酸序列与SEQ ID NO:3的天然hPAH编码序列共有至少95％的同一性。在另一个实施方案中，编码hPAH的核酸序列与SEQ ID NO:3的天然hPAH编码序列共有至少90％、85％、80％、75％、70％或65％的同一性。在一个实施方案中，编码hPAH的核酸序列与SEQ ID NO:3的天然hPAH编码序列共有约78％的同一性。在一个实施方案中，编码hPAH的核酸序列是SEQ ID NO:1。

在一个实施方案中，PAH编码序列被优化用于在目标受试者中表达。密码子优化的编码区可以通过各种不同的方法设计。此优化可以使用可在线获得的方法(例如，GeneArt)、公开的方法或提供密码子优化服务的公司例如作为DNA2.0(Menlo Park，CA)执行。例如，在国际专利公布WO 2015/012924中描述了一种密码子优化方法，所述专利以引用的方式并入本文。还参见例如美国专利公布2014/0032186和美国专利公布2006/0136184。适当地，改进产品的开放阅读框(ORF)的整个长度。然而，在一些实施方案中，可以仅改变ORF的片段。通过使用这些方法中的一种，可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并产生编码多肽的密码子优化的编码区的核酸片段。

许多选择可用于执行密码子的实际变化或用于合成如本文所述设计的密码子优化的编码区。可以使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规分子生物学操作执行这类修饰或合成。在一种方法中，通过标准方法合成一系列长度各自为80至90个核苷酸且跨越期望序列的长度的互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对，使得它们在退火时形成80至90个碱基对的含有粘性末端的双链片段，例如合成所述对中的每个寡核苷酸以延伸超出与所述对中的其他核苷酸互补的区域3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。设计每对寡核苷酸的单链末端以与另一对寡核苷酸的单链末端一起退火。使寡核苷酸对退火，然后使这些双链片段中的约五个至六个通过粘性单链末端一起退火，然后将它们接合在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可从Thermo Fisher Scientific Inc.购得的载体。然后通过标准方法对构建体进行测序。制备这些构建体中的若干种，其由接合在一起的80至90个碱基对片段的5至6个片段(即约500个碱基对的片段)组成，使得整个所需序列在一系列质粒构建体中表示。然后用适当的限制酶切割这些质粒的***物并将其接合在一起以形成最终的构建体。然后将最终构建体克隆到标准细菌克隆载体中，并测序。其他方法对于技术人员来说是显而易见的。此外，基因合成在商业上很容易获得。

5.1.1.2.rAAV载体

因为PAH在肝脏中天然表达，所以期望使用显示肝脏趋向性的AAV。在一个实施方案中，供应衣壳的AAV是AAV8。在另一个实施方案中，供应衣壳的AAV是AAVrh.10。在又一个实施方案中，供应衣壳的AAV是分化体E AAV。这种AAV包括rh.2；rh.10；rh.25；bb.l、bb.2、pi.1、pi.2、pi.3、rh.38、rh.40、rh.43、rh.49、rh.50、rh.51、rh.52、rh.53、rh.57、rh.58、rh.61、rh.64、hu.6、hu.17、hu.37、hu.39、hu.40、hu.41、hu.42、hu.66和hu.67。此分化体还包括修饰的rh.2；修饰的rh.58；和修饰的rh.64。参见WO 2005/033321，其以引用的方式并入本文。然而，可以使用许多具有肝脏趋向性的rAAV载体中的任何一种。

在下文实施例中描述的具体实施方案中，基因疗法载体是在称为AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH的甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子控制下表达hPAH转基因的AAV8载体。这种载体的载体基因组示出于SEQ ID NO:20中。在另一个实施方案中，省略了WPRE，即AAV8.TBG.PI.hPAHco.bGH。这种载体的载体基因组示出于SEQ ID NO:21中。外部AAV载体组分是血清型8，T＝1二十面体衣壳，由3种AAV病毒蛋白VP1、VP2和VP3以比率1:1:10的60个拷贝组成。衣壳含有单链DNA rAAV载体基因组。

在一个实施方案中，rAAV.hPAH基因组含有侧接两个AAV反向末端重复序列(ITR)的hPAH转基因。在一个实施方案中，hPAH转基因包含增强子、启动子、内含子、土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)(例如，SEQ ID NO:15)、hPAH编码序列和多腺苷酸化(polyA)信号中的一种或多种。在另一个实施方案中，hPAH转基因包含增强子、启动子、内含子、hPAH编码序列和多腺苷酸化(polyA)信号中的一种或多种。这些控制序列与hPAH基因序列“可操作地连接”。可以将包含这些序列的表达盒工程化到用于产生病毒载体的质粒上。

ITR是在载体生产期间负责基因组复制和包装的遗传元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。将表达盒包装到AAV病毒粒子中所需的最小序列是AAV 5'和3'ITR，其可以与衣壳具有相同的AAV来源，或者不同的AAV来源(以产生AAV假型)。在一个实施方案中，使用来自AAV2的ITR序列或其缺失版本(ΔITR)。然而，可以选择来自其他AAV来源的ITR。当ITR的来源是来自AAV2并且AAV衣壳是来自另一个AAV来源时，所得载体可以称为假型。通常，AAV载体的表达盒包含AAV 5'ITR、hPAH编码序列和任何调节序列以及AAV 3'ITR。然而，这些元件的其他构造可能是合适的。已经描述了缩短版本的5'ITR，称为ΔITR，其中缺失D-序列和终端分解位点(trs)。在其他实施方案中，使用全长AAV 5'和3'ITR。在一个实施方案中，5'ITR是示出于SEQ ID NO:16中的序列。在一个实施方案中，3'ITR是示出于SEQID NO:17中的序列。

在一个实施方案中，表达控制序列包括一种或多种增强子。在一个实施方案中，包括SEQ ID NO:4中所示的En34增强子(来自人类载脂蛋白肝脏控制区的34bp核心增强子)。在另一个实施方案中，包括EnTTR(来自甲状腺素运载蛋白的100bp增强子序列)。此类序列示出于SEQ ID NO:5。参见，Wu等人，Molecular Therapy,16(2):280-289，2008年2月，其以引用的方式并入本文。在又一实施方案中，包括α1-微球蛋白/尿抑胰酶素(bikunin)前体增强子。在另一个实施方案中，包括ABPS(来自α1-微球蛋白/双库尼茨前体[ABP]的100bp远端增强子缩短成42bp的版本)增强子。此类序列示出于SEQ ID NO:6。在又一个实施方案中，包括ApoE增强子。此类序列示出于SEQ ID NO:7。在另一个实施方案中，存在多于一种的增强子。此类组合可以包括本文所述的任何增强子的一个以上拷贝，和/或多于一种类型的增强子。

hPAH编码序列的表达由肝特异性启动子驱动。本文描述的示例性质粒和载体使用甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子(SEQ ID NO:9)或其修饰版本。TBG启动子的一个修饰版本是缩短版本，称为TBG-S1。修饰的甲状腺素结合球蛋白(TBG-S1)启动子序列示出于SEQID NO:8。或者，可以使用其他肝特异性启动子，例如甲状腺素运载蛋白启动子。另一种合适的启动子是α1抗胰蛋白酶(A1AT)启动子或其修饰版本(其序列所示在SEQ ID NO:10中)。另一种合适启动子是TTR启动子(SEQ ID NO:11)。其他合适的启动子包括人类白蛋白(Miyatake等人，J.Virol.,71:5124 32(1997))、humAlb；肝脏特异性启动子(LSP)和乙型肝炎病毒核心启动子(Sandig等人，Gene Ther.,3:1002 9(1996)。参见例如The LiverSpecific Gene Promoter Database,Cold Spring Harbor,http://rulai,schl,edu/ LSPD，其以引用的方式并入。尽管不太理想，但可以使用其他启动子，诸如病毒启动子、组成型启动子、可调节的启动子[参见例如WO 2011/126808和WO 2013/04943]或可对生理信号有应答的启动子可以用于本文所述的载体中。

除启动子外，表达盒和/或载体还可以含有其他适当的转录起始、终止、增强子序列和高效的RNA加工信号。这类序列包括剪接和多腺苷酸化(polyA)信号；增强表达的调节元件(即，WPRE(SEQ ID NO:15))；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时增强编码产物分泌的序列。在一个实施方案中，包括聚腺苷酸化(polyA)信号以介导hPAH mRNA转录物的终止。其他合适poly A序列的实例包括例如牛生长激素(SEQ ID NO:12)、SV40、兔β珠蛋白和TK poly A等。

在一个实施方案中，选择调节序列，使得总rAAV载体基因组的大小为约2.0千碱基至约5.5千碱基。在一个实施方案中，选择调节序列使得总rAAV载体基因组的大小为约3.4kb、约2.9kb、约3.3kb、约2.2kb或约2.5kb。在一个实施方案中，期望rAAV载体基因组接近天然AAV基因组的大小。因此，在一个实施方案中，选择调节序列，使得总rAAV载体基因组的大小为约4.7kb。在另一个实施方案中，总rAAV载体基因组的大小小于5.2kb。可以基于调节序列的大小来操纵载体基因组的大小，所述调节序列包括启动子、增强子、内含子、polyA等。参见Wu等人,Mol Ther,2010年1月18(l):80-6，其以引用的方式并入本文。

因此，在一个实施方案中，内含子包含在所述载体中。合适内含子包括人类β珠蛋白IVS2(SEQ ID NO:13)。参见Kelly等人,Nucleic Acids Research,43(9):4721-32(2015)，其以引用的方式并入本文。另一种合适启动子包括Promega嵌合内含子(SEQ IDNO:14)，有时也称为“PI”)。参见Almond,B.和Schenbom,E.T.A Comparison of pCI-neoVector and pcDNA4/HisMax Vector.[因特网]2000，其以引用的方式并入本文。可获自：www.promega.com/resources/pubhub/enotes/a-comparison-of-pcineo-vector-and-pcdna4hismax-vector/).另一种合适内含子包括hFIX内含子(SEQ ID NO:18)。本文中合适的各种内含子是本领域中已知的，并且包括但不限于在以下发现的那些：http://bpg.utoledo.edu/～afedorov/lab/eid.html，其以引用的方式并入本文。还参见ShepelevV.,Fedorov A.Advances in the Exon-Intron Database.Briefings in Bioinformatics2006,7:178-185，其以引用的方式并入本文。

在一个实施方案中，rAAV载体基因组包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。

5.1.2.组合物

在一个实施方案中，rAAV.hPAH病毒以药物组合物形式提供，所述药物组合物包含水性载剂、赋形剂、稀释剂或缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂为PBS。在一个具体的实施方案中，rAAV.hPAH制剂是含有有效量的rAAV.hPAH载体的悬浮液，所述载体悬浮于含有TMN200(200mM氯化钠、1mM氯化镁、20mM Tris，pH 8.0)中的0.001％Pluronic F-68的水溶液中。然而，已知各种合适的溶液，包括包含以下一种或多种的溶液：缓冲盐水、表面活性剂和调节至相当于约100mM氯化钠(NaCl)至约250mM氯化钠的离子强度的生理学相容的盐或盐的混合物或调节至等效离子浓度的生理学相容盐。

例如，本文提供的悬浮液可以含有NaCl和KCl。pH可以在6.5至8.5、或7至8.5、或7.5至8的范围内。合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可以选自泊洛沙姆，即由侧翼为两个聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链组成的非离子三嵌段共聚物；SOLUTOL HS 15(Macrogol-15羟基硬脂酸)；LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)；聚氧10油基醚；TWEEN(聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯)；乙醇和聚乙二醇。在一个实施方案中，制剂含有泊洛沙姆。这些共聚物通常用字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后面跟三个数字：前两个数字x 100给出聚氧丙烯芯的近似分子量，最后一个数字x 10给出聚氧乙烯含量百分比。在一个实施方案中，选择泊洛沙姆188。表面活性剂的含量可以高达悬浮液的约0.0005％至约0.001％。在另一个实施方案中，将载体悬浮在pH 7.3的含有180mM氯化钠、10mM磷酸钠、0.001％泊洛沙姆188的水溶液中。

在一个实施方案中，所述制剂适用于在人类受试者中使用并且静脉内施用。在一个实施方案中，制剂通过推注注射经外周静脉递送。在一个实施方案中，制剂通过输注在约10分钟(±5分钟)内经外周静脉递送。在一个实施方案中，制剂通过输注在约20分钟(±5分钟)内经外周静脉递送。在一个实施方案中，制剂通过输注在约30分钟(±5分钟)内经外周静脉递送。在一个实施方案中，制剂通过输注在约60分钟(±5分钟)内经外周静脉递送。在一个实施方案中，制剂通过输注在约90分钟(±10分钟)内经外周静脉递送。然而，可以根据需要或期望调节所述时间。可以使用任何合适的方法或途径来施用如本文所述的含有AAV的组合物，并且任选地，与本文所述的hPAH的AAV介导的递送结合共同施用其他活性药物或疗法。施用途径包括例如全身、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内和其他肠胃外施用途径。

在一个实施方案中，制剂可以含有例如约1.0x 10¹¹个基因组拷贝/千克患者体重(GC/kg)至约1x 10¹⁵GC/kg、约5x 10¹¹个基因组拷贝/千克患者体重(GC/kg)至约3x 10¹³GC/kg、或约1x 10¹²至约1x10¹⁴GC/kg，如通过例如M.Lock等人，Hum Gene Ther Methods.2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.电子版2014年2月14日中所述的oqPCR或数字液滴PCR(ddPCR)测量，所述文献以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，rAAV.hP AH制剂是含有至少1x 10¹³个基因组拷贝(GC)/mL或更高的悬浮液，如通过例如M.Lock等人，同上所述的oqPCR或数字液滴PCR(ddPCR)所测量。

为了确保从施用到患者的AAV.hPAH剂量中除去空衣壳，在载体纯化期间，例如使用本文讨论的方法，将空衣壳与载体粒子分离。在一个实施方案中，使用2016年4月13日提交且题为“Scalable Purification Method for AAV8”的美国专利申请号62/322,098所述的方法，从空衣壳中纯化含有包装基因组的载体粒子，所述专利以引用的方式并入本文中。简言之，描述了两步纯化方案，其从rAAV生产细胞培养物的澄清的浓缩上清液中选择性地捕获并分离含有基因组的rAAV载体粒子。所述方法利用在高盐浓度下执行的亲和捕获方法，然后在高pH下执行阴离子交换树脂方法，以提供基本上不含rAAV中间体的rAAV载体粒子。类似的纯化方法可用于具有其他衣壳的载体。

虽然可以使用任何常规的制造方法，但本文(以及美国专利申请号62/322,098)所述的方法产生载体制剂，其中50％至70％的粒子具有载体基因组，即50％至70％的全粒子。因此，对于1.6x 10¹²GC/kg的示例性剂量，总粒子剂量将为2.3x 10¹²至3x 10¹²个粒子。在另一个实施方案中，所提出的剂量高出半对数，或为5x 10¹²GC/kg，并且总粒子剂量将为7.6x10¹²个至1.1x 10¹³个粒子。在一个实施方案中，制剂的特征在于rAAV原液的“空”与“全”的比率为1或更小，优选小于0.75，更优选0.5，优选小于0.3。

当原液中的rAAV8粒子占原液或制剂中的rAAV8的至少约75％至约100％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少99％时，rAAV8粒子(包装的基因组)的原液或制剂“基本上不含”AAV空衣壳(和其他中间体)，并且“空衣壳”小于原液或制剂中的rAAV8的约1％、小于约5％、小于约10％、小于约15％。

通常，用于测定空衣壳和具有包装的基因组的AAV载体粒子的方法是本领域已知的。参见，例如Grimm等人，Gene Therapy(1999)6:1322-1330；Sommer等人，Molec.Ther.(2003)7:122-128。为了测试变性衣壳，所述方法包括使处理的AAV原液经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述电泳由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如含有缓冲液中的3-8％Tris-乙酸盐的梯度凝胶，然后运行凝胶直至样品材料分离，并将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜(优选尼龙)上。然后使用抗AAV衣壳抗体作为与变性衣壳蛋白结合的第一抗体，优选抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选B1抗AAV-2单克隆抗体(Wobus等人,J.Virol.(2000)74:9281-9293)。然后使用第二抗体，其结合第一抗体并含有用于检测与第一抗体的结合的手段，更优选地含有与其共价键合的检测分子的抗IgG抗体，最优选地与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。用于检测结合的方法用于半定量测定第一抗体与第二抗体之间的结合，优选地能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地化学发光检测试剂盒。例如，对于SDS-PAGE，可以从柱级分中取出样品并在含有还原剂(例如，DTT)的SDS-PAGE加载缓冲液中加热，并在预制梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，Novex)上解析衣壳蛋白。可以使用SilverXpress(Invitrogen，CA)根据制造商的说明书进行银染色。在一个实施方案中，可以通过定量实时PCR(Q-PCR)测量柱级分中AAV载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释并用DNA酶I(或另一种合适的核酸酶)消化以除去外源DNA。在灭活核酸酶后，将样品进一步稀释并使用引物和对引物之间的DNA序列具有特异性的TaqMan^TM荧光探针扩增。在Applied Biosystems Prism 7700序列检测***上测量每个样品达到确定荧光水平所需的循环数(阈值循环，Ct)。使用含有与AAV载体中所含序列相同的序列的质粒DNA以在Q-PCR反应中产生标准曲线。从样品获得的循环阈值(Ct)值用于通过将其标准化为质粒标准曲线的Ct值来确定载体基因组滴度。也可以使用基于数字PCR的终点测定。

在一个方面，本文提供了优化的q-PCR方法，其使用广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(诸如可从Qiagen商购获得)。更具体地讲，优化的qPCR基因组滴度测定与标准测定相似，除了在DNA酶I消化后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释并用蛋白酶K.处理，然后加热灭活。适当地用蛋白酶K缓冲液稀释样品，其量等于样品大小。蛋白酶K缓冲液可以浓缩至2倍或更高。通常，蛋白酶K处理为约0.2mg/mL，但可以在0.1mg/mL至约1mg/mL之间变化。处理步骤通常在约55℃下执行约15分钟，但可以在较低温度(例如，约37℃至约50℃)下执行较长时间(例如，约20分钟至约30分钟)，或在较高温度(例如，高达约60℃)下执行较短时间(例如，约5分钟至10分钟)。类似地，热灭活通常在约95℃下持续约15分钟，但温度可以降低(例如，约70℃至约90℃)并且时间可以延长(例如，约20分钟至约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)并如标准测定中所述进行TaqMan分析。

另外或替代地，可以使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已经描述了通过ddPCR确定单链和自身互补AAV载体基因组滴度的方法。参见例如M.Lock等人,Hu Gene TherapyMethods,Hum Gene Ther Methods.2014年4月；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131.电子版2014年2月14日。

5.2患者人群

如上文所讨论，患有任何严重程度的PKU的受试者是本文所述的组合物和方法的预期接受者。

可以允许受试者在其护理医师的判断下在基因疗法治疗之前和同时继续其标准护理治疗(例如，低Phe饮食；使用二盐酸沙丙蝶呤治疗)。在替代方案中，医师可能更喜欢在施用基因疗法治疗之前停止标准护理疗法，并且任选地，在施用基因疗法后作为共同疗法恢复标准护理疗法。

基因治疗方案的理想终点是PAH活性增加，使得Phe水平在120-360μmol/L之间。在另一个实施方案中，载体剂量旨在递送PAH以使得血浆苯丙氨酸水平降低25％或更多。在另一个实施方案中，理想终点是降低血浆Phe水平，使其从“重度”表型经受“中度”表型。用于测量苯丙氨酸水平的方法是本领域已知的，例如，如Gregory等人,Blood phenylalaninemonitoring for dietary compliance among patients with phenylketonuria:comparison of methods,Genetics in Medicine(2007年11月)9,761-765所述，所述文献以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，患者在用rAAV.hPAH单独治疗和/或与使用辅助治疗组合治疗后实现所需循环PAH水平。

5.3.施用的剂量和途径

在一个实施方案中，rAAV.hPAH载体对每位患者以单剂量递送。在一个实施方案中，向受试者递送最小有效剂量(MED)(通过本文实施例中描述的临床前研究确定)。如本文所用，MED是指实现PAH活性使得Phe水平在120-360μmol/L之间所需的rAAV.hPAH剂量。

通常，载体滴度是基于载体制剂的DNA含量确定的。在一个实施方案中，如实施例中所述的定量PCR或优化的定量PCR用于确定rAAV.hPAH载体制剂的DNA含量。在一个实施方案中，如实施例中所述的数字液滴PCR用于确定rAAV.hPAH载体制剂的DNA含量。在一个实施方案中，剂量为约1x 10¹¹个基因组拷贝(GC)/kg体重至约1x 10¹³GC/kg(包括端点)。在一个实施方案中，剂量为5x 10¹¹GC/kg。在另一个实施方案中，剂量为5x 10¹²GC/kg。在具体的实施方案中，向患者施用的rAAV.hPAH的剂量为至少5x 10¹¹GC/kg、1x 10¹²GC/kg、1.5x10¹²GC/kg、2.0x 10¹²GC/kg、2.5x 10¹²GC/kg、3.0x 10¹²GC/kg、3.5x 10¹²GC/kg、4.0x10¹²GC/kg、4.5x 10¹²GC/kg、5.0x 10¹²GC/kg、5.5x10¹²GC/kg、6.0x 10¹²GC/kg、6.5x 10¹²GC/kg、7.0x 10¹²GC/kg或7.5x 10¹²GC/kg。此外，复制缺陷型病毒组合物可以配制成剂量单位，以含有范围在约1.0x 10⁹GC至约1.0x 10¹⁵GC内的量的复制缺陷型病毒。如本文所用，术语“剂量”可以指在治疗过程中递送给受试者的总剂量，或者以单次(多次)施用递送的量。

在一个实施方案中，剂量足以将患者中的血浆Phe水平降低25％或更多。

在一些实施方案中，rAAV.hPAH与一种或多种用于治疗PKU的疗法(例如低Phe饮食或施用二盐酸沙丙蝶呤)组合施用。

5.4.测量临床目标

可以通过如由血浆Phe水平和/或PAH活性确定的转基因表达和活性来测量治疗功效的测量。可以通过临床评估膳食Phe耐受性来确定对功效的进一步评估。

如本文所用，当患者表达足够水平的PAH以实现PAH活性使得Phe水平在120-360μmol/L之间时，本文中的rAAV.hPAH载体用活性PAH“在功能上替换”或“功能性补充”患者的缺陷型PAH。

以下实施例仅是说明性的，并不意图限制本发明。

实施例

以下实施例仅是说明性的，并不意图限制本发明。

实施例1：苯丙酮尿症(PKU)的小鼠模型

PAH^-/-小鼠在Jackson Labs处通过CRISPR/Cas9技术产生。将Cas9mRNA和靶向PAH基因的第二编码外显子的两个指导RNA(sgRNA)直接注射到野生型C57BL/6小鼠的小鼠受精卵中。对由这些胚胎发育的小鼠进行测序以确定突变，并且然后使其与C57BL/6J小鼠一起繁殖以传递等位基因并确认种系传递。

产生四种不同的突变，并将小鼠品系命名为PAH_KO_A、PAH_KO_B、PAH_KO_C和PAH_KO_D。PAH_KO_A小鼠显示3-bp取代，随后为小家鼠(Mus musculus)PAH基因[NC_000076.6]的从6534nt至6600nt的64-bp缺失，PAH_KO_B和PAH_KO_C小鼠分别在6589nt和6539nt之后显示单碱基对***。PAH_KO_D显示从6535nt至6540nt的6bp缺失。图9示出野生型、PAH_KO_A、PAH_KO_B、PAHKOC、PAHKOD的PAH序列的一部分和共有序列的比对。对这些小鼠进行自然病史研究。通过眶后或下颌下抽血来收集血液样品。通过LC/MS/MS检测血浆苯丙氨酸(Phe)水平并且获得来自PAH_KO_A、PAH_KO_B和PAH_KO_C小鼠的数据并且分别呈现于图2A、3A和4A中，并总结于图5A中。提供杂合和野生型同窝仔作为阴性对照。与对照相比，PAH_KO_A、PAH_KO_B和PAH_KO_C小鼠中的血浆苯丙氨酸水平显着更高，表明这些小鼠中的PAH存在功能缺陷。还表明PAH_KO_A、PAH_KO_B和PAH_KO_C小鼠可以用作人类苯丙酮尿症(PKU)的小鼠模型。

然而，第四种敲除小鼠PAH_KO_D未表现出升高的血浆苯丙氨酸水平，因此被排除在进一步分析之外。

实施例2：含有hPAH的AAV载体-AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH

基因疗法载体AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH在杂合启动子TBG控制下基于人类甲状腺激素结合球蛋白启动子和微球蛋白/尿抑胰酶素增强子由携带密码子优化的人类PAH cDNA的AAV8载体构建(图1)。PAH表达盒侧接AAV2衍生的反向末端重复序列(ITR)，并且表达由TBG增强子/启动子和土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)的杂交体作为增强子驱动。转基因还包含Promega SV40misc内含子(PI)和牛生长激素多腺苷酸化信号(bGH)。载体基因组序列示出于SEQ ID NO:20中。

使用常规三重转染技术在293细胞中制备载体，如例如Mizukami、Hiroaki等人,AProtocol for AAV vector production and purification.Diss.Di-vision of GeneticTherapeutics,Center for MolecularMedicine,1998.，所述文献以引用的方式并入本文。所有载体均由宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)的载体中心(Vector Core)产生，如先前所述[Lock,M.等人,Hum Gene Ther,21:1259-1271(2010)]。

实施例3：PKU模型中的AAV8.hPAH载体

所有动物程序均根据宾夕法尼亚大学的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的方案进行。

产生20只PAH_KO_A小鼠。在自然病史研究中评估了七只雄性和三只雌性。在自然病史研究的第56天，通过尾静脉向具有识别号1531、1532和1533的三只雄性小鼠静脉内注射1x 10¹³GC/kg的AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH载体。向具有识别号1538、1539、1554和1564的四只雄性小鼠注射1x 10¹²GC/kg载体。向具有识别号1507、1536和1537的三只雌性小鼠注射1x 10¹²GC/kg载体。每周收集血液样品以评估血浆苯丙氨酸浓度(图2B)。与同窝仔对照相比，在注射前PAH_KO_A小鼠中检测到更高水平的苯丙氨酸，这表明PAH_KO_A小鼠中缺乏PAH。载体注射之后7天，PAH_KO_A小鼠的血浆苯丙氨酸水平降低，而对照保持稳定。此结果表明，向PAH_KO_A小鼠单次注射AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH可以挽救缺乏的PAH并减少血液中苯丙氨酸的病理积累。

在PAH_KO_A小鼠中进一步评估性别差异和两剂的AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH载体的影响(图2C)。每周观察血浆苯丙氨酸水平持续11周，例如，如Gregory等人,Bloodphenylalanine monitoring for dietary compliance among patients withphenylketonuria:comparison of methods,Genetics in Medicine(2007年11月)9,761-765所述，所述文献以引用的方式并入本文。三只雌性小鼠中的两只接受1x 10¹²GC/kg载体，并且使用1x 10¹²GC/kg和1x 10¹³GC/k两种剂量的所有七只雄性小鼠均显示血浆中苯丙氨酸浓度降低。七只雄性小鼠的苯丙氨酸持续11周观察期保持相对较低的水平，而所有三只雌性小鼠均显示血浆苯丙氨酸水平缓慢增加。

在自然病史研究中产生并处死(exanimated)三只雌性PAH_KO_B小鼠。进行苯丙氨酸水平的每周抽血，并且结果证实与健康的同窝仔对照相比苯丙氨酸在血液中异常积累。在静脉内注射1x 10¹²GC/kg的AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH后，在所有三只雌性中观察到苯丙氨酸水平降低，并且在注射后8周观察期内维持低水平。

为此研究产生两只雄性PAH_KO_C小鼠并用于自然病史研究。每周收集血液样品并且评估苯丙氨酸浓度。数据显示，在9周观察期间，PAH_KO_C小鼠和杂合/野生型同窝仔保持相对稳定的血浆苯丙氨酸浓度，而敲除小鼠显示出显着更高的水平。

在注射的PAH^-/-小鼠中进一步研究PAH的表达和酶活性。从仅注射载体或PBS的PAH_KO_A、PAH_KO_B和PAH_KO_C小鼠以及健康的同窝仔对照中收集肝脏。从肝脏提取mRNA，并通过RT-PCR评估人类PAH的表达。为了确定PAH的蛋白质表达，制备肝脏裂解物以用于通过蛋白质印迹进行检测，同时制备肝脏切片以用于免疫组织化学。还进行实验以评估用载体处理的PAH^-/-小鼠以及对照的PAH酶活性。

为了充分评估所有三种PAH^-/-小鼠的性别差异，繁殖PAH_KO_A、PAH_KO_B和PAH_KO_C小鼠以评估在AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH注射之前和之后的血浆苯丙氨酸浓度、在mRNA和蛋白质水平下的PAH表达以及PAH的酶活性。

为了确定AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH的剂量依赖性表达和最高剂量的潜在毒性，将各种剂量的AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPR E.bGH注射到PAH^-/-小鼠中并且进一步评估苯丙氨酸积累和PAH表达/活性。

使用AAV8.TBG.hPAHco.bGH进行类似实验。在建立预处理苯丙氨酸水平之后，向17-22周大的PKU B小鼠给予10¹²GC/kg的AAV8.TBG.hPAHco.bGH或AAV8.TBG.hPAHco.WPRE.bGH(或用于对照的PBS)。然后每周对小鼠抽血，分离血浆并测定苯丙氨酸浓度(图6A)。在研究结束时，收集肝脏并进行基因组拷贝分析(图6B)和免疫组织化学(图6C)。在AAV8.TBG.hPAHco.bGH和AAV8.TBG.hPAHco.WPRE.bGH处理的小鼠中苯丙氨酸水平均降低。

使用AAV8.TBG.hPAHco.bGH载体进行进一步研究。在建立基线苯丙氨酸水平后，向野生型、杂合(圆形)和PKU KO A(KO)小鼠静脉内注射10¹¹GC/kg的AAV8.TBG.hPAHco。然后每周对小鼠抽血，分离血浆并分析Phe浓度。在静脉内注射AAV8.TBG.hPAHco之后，血浆中的Phe水平降低了71％。图7。

在建立基线苯丙氨酸水平之后，向PKU_KO_B小鼠给予10¹²GC/kg、3x 10¹¹GC/kg、或10¹¹GC/kg的AAV8.TBG.hPAHco。然后每周对小鼠抽血，分离血浆并分析Phe浓度。在研究结束时，收集肝脏并进行基因组拷贝分析和免疫组织化学。在10¹²GC/kg剂量下观察到蛋白质表达和Phe水平降低。

同时，还施用10¹²GC/kg的以下每种载体并且将其用作比较：AAV8.TBG.PI.hPAHco.bGH、AAV8.LSP.IVS2.hPAHco.bGH、AAV8.AlAT.hPAHco.BGH、AAV8.TTR.hPAHco.BGH、AAV8.TBG.PI.hPAH天然序列.bGH、AAV8.ABPS.TBG.hFIX内含子.hPAHco.BGH、AAV8.ABPS.TBG-Sl.hFIX内含子.hPAHco.BGH、AAV8.ApoE.AlAT.hFIX内含子.hPAHco.BGH。

总之，当在三只PAH缺陷型小鼠中静脉内施用时，单次注射AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH载体导致显着血浆苯丙氨酸减少和伴随的功能校正。

实施例4：苯丙酮尿症的AAV基因疗法

苯丙酮尿症(PKU)是由苯丙氨酸-4-羟化酶(PAH)活性减弱从而导致苯丙氨酸在组织和血液中累积而引起的常染色体隐性遗传疾病。血流中的高水平苯丙氨酸被认为抑制其他大中性氨基酸穿过血脑屏障的转运，从而影响大脑发育并导致智力残疾和癫痫发作。PKU的治疗目前仅限于维持严格的苯丙氨酸限制性饮食和旨在稳定残余PAH的产品。本文描述的肝靶向AAV基因治疗方法是改进当前护理标准。

为了研究PKU的基因疗法的发展，通过如本文所述的CRISPR/Cas9技术通过在PAH基因的外显子1中诱导不同的突变来产生四种独特小鼠品系。对这些品系中的每一种进行自然病史研究以确定疾病的进展并鉴定最佳复制人类PKU表型的品系。命名为B和C的PKU群落在外显子1的不同位置处含有单碱基对(bp)缺失，并且与70μM正常水平相比，分别维持2049μM和1705μM的平均苯丙氨酸水平。PKU群落A尽管在PAH基因的外显子1中具有64bp缺失和3bp***，但其具有477μM的适度更高的平均苯丙氨酸水平。具有6bp缺失的PKU群落D具有与野生型同窝仔相当的苯丙氨酸水平。在以1x 10¹²GC/kg的剂量施用AAV8载体以向PKU B小鼠群落表达人类密码子优化形式的PAH之后，血浆苯丙氨酸水平降低87％至222μM。血浆苯丙氨酸水平的降低恢复了雄性产生后代的能力。这些结果代表了用于PKU的基于AAV的治疗剂的开发。

本说明书中引用的所有出版物以及美国临时专利申请号62/440,651、62/469,898和62/505,373都以引用的方式并入本文。类似地，本文引用并出现在所附序列表中的SEQID NO以引用的方式并入本文。虽然已经参考特定实施方案描述了本发明，但是应该理解，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。

序列表自由文本：

Seq ID

NO自由文本

序列表

<110> 宾夕法尼亚大学理事会(Trustees of the University of Pennsylvania)

<120> 用于治疗苯丙酮尿症的基因疗法

<130> UPN-16-7939PCT

<150> 62/440,651

<151> 2016-12-30

<150> 62/469,898

<151> 2017-03-10

<150> 62/505,373

<151> 2017-05-12

<160> 31

<170> PatentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 1

atgtctaccg ccgtgctgga aaatcccggc ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag 60

gaaaccagct acatcgagga caactgcaac cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc 120

ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag gtgctgcggc tgttcgaaga gaacgacgtg 180

aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc agactgaaga aggacgagta cgagttcttc 240

acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 300

gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 360

ttcccccgga ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgag ctacggcgcc 420

gagctggacg ccgatcaccc cggctttaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 480

tttgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tcccccgggt ggagtatatg 540

gaagaggaaa agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc 600

cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctgg aaaagtactg cggcttccac 660

gaggacaata tcccccagct ggaagacgtg tcccagttcc tgcagacctg caccggcttc 720

agactgaggc ctgtggccgg actgctgagc agcagagatt ttctgggcgg actggccttc 780

cgggtgttcc actgcaccca gtacatcaga cacggcagca agcccatgta cacccccgag 840

cccgatatct gccacgagct gctgggacac gtgcccctgt tcagcgacag aagcttcgcc 900

cagttcagcc aggaaatcgg cctggcctct ctgggagccc ccgacgagta tatcgagaag 960

ctggccacca tctactggtt caccgtggaa ttcggcctgt gcaagcaggg cgacagcatc 1020

aaggcctacg gcgctggcct gctgtccagc tttggcgagc tgcagtactg tctgagcgag 1080

aagcccaagc tgctgcccct ggaactggaa aagaccgcca tccagaacta caccgtgacc 1140

gagttccagc ccctgtacta cgtggccgag agcttcaacg acgccaaaga aaaagtgcgg 1200

aacttcgccg ccaccatccc cagaccattc tccgtcagat acgaccccta cacccagcgg 1260

atcgaggtgc tggacaacac acagcagctg aaaattctgg ccgactccat caacagcgag 1320

atcggcatcc tgtgcagcgc cctgcagaag atcaag 1356

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser

1 5 10 15

Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn

20 25 30

Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu

35 40 45

Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His

50 55 60

Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe

65 70 75 80

Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys

85 90 95

Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp

100 105 110

Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu

115 120 125

Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala

130 135 140

Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Pro Val Tyr Arg Ala Arg Arg Lys Gln

145 150 155 160

Phe Ala Asp Ile Ala Tyr Asn Tyr Arg His Gly Gln Pro Ile Pro Arg

165 170 175

Val Glu Tyr Met Glu Glu Glu Lys Lys Thr Trp Gly Thr Val Phe Lys

180 185 190

Thr Leu Lys Ser Leu Tyr Lys Thr His Ala Cys Tyr Glu Tyr Asn His

195 200 205

Ile Phe Pro Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Gly Phe His Glu Asp Asn Ile

210 215 220

Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Gln Phe Leu Gln Thr Cys Thr Gly Phe

225 230 235 240

Arg Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ser Arg Asp Phe Leu Gly

245 250 255

Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly

260 265 270

Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu

275 280 285

Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln

290 295 300

Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys

305 310 315 320

Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln

325 330 335

Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly

340 345 350

Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu

355 360 365

Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro

370 375 380

Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg

385 390 395 400

Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro

405 410 415

Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile

420 425 430

Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu

435 440 445

Gln Lys Ile Lys

450

<210> 3

<211> 1359

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

atgtccactg cggtcctgga aaacccaggc ttgggcagga aactctctga ctttggacag 60

gaaacaagct atattgaaga caactgcaat caaaatggtg ccatatcact gatcttctca 120

ctcaaagaag aagttggtgc attggccaaa gtattgcgct tatttgagga gaatgatgta 180

aacctgaccc acattgaatc tagaccttct cgtttaaaga aagatgagta tgaatttttc 240

acccatttgg ataaacgtag cctgcctgct ctgacaaaca tcatcaagat cttgaggcat 300

gacattggtg ccactgtcca tgagctttca cgagataaga agaaagacac agtgccctgg 360

ttcccaagaa ccattcaaga gctggacaga tttgccaatc agattctcag ctatggagcg 420

gaactggatg ctgaccaccc tggttttaaa gatcctgtgt accgtgcaag acggaagcag 480

tttgctgaca ttgcctacaa ctaccgccat gggcagccca tccctcgagt ggaatacatg 540

gaggaagaaa agaaaacatg gggcacagtg ttcaagactc tgaagtcctt gtataaaacc 600

catgcttgct atgagtacaa tcacattttt ccacttcttg aaaagtactg tggcttccat 660

gaagataaca ttccccagct ggaagacgtt tctcaattcc tgcagacttg cactggtttc 720

cgcctccgac ctgtggctgg cctgctttcc tctcgggatt tcttgggtgg cctggccttc 780

cgagtcttcc actgcacaca gtacatcaga catggatcca agcccatgta tacccccgaa 840

cctgacatct gccatgagct gttgggacat gtgcccttgt tttcagatcg cagctttgcc 900

cagttttccc aggaaattgg ccttgcctct ctgggtgcac ctgatgaata cattgaaaag 960

ctcgccacaa tttactggtt tactgtggag tttgggctct gcaaacaagg agactccata 1020

aaggcatatg gtgctgggct cctgtcatcc tttggtgaat tacagtactg cttatcagag 1080

aagccaaagc ttctccccct ggagctggag aagacagcca tccaaaatta cactgtcacg 1140

gagttccagc ccctgtatta cgtggcagag agttttaatg atgccaagga gaaagtaagg 1200

aactttgctg ccacaatacc tcggcccttc tcagttcgct acgacccata cacccaaagg 1260

attgaggtct tggacaatac ccagcagctt aagattttgg ctgattccat taacagtgaa 1320

attggaatcc tttgcagtgc cctccagaaa ataaagtaa 1359

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 4

tgtttgctgc ttgcaatgtt tgcccatttt aggg 34

<210> 5

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 5

ctacctcgtg atcgcccggc ccctgttcaa acatgtccta atactctgtc tctgcaaggg 60

tcatcagtag ttttccatct tactcaacat cctcccagtg 100

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 6

aggttaattt ttaaactgtt tgctctggtt aataatctca gg 42

<210> 7

<211> 322

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 7

aaggctcaga ggcacacagg agtttctggg ctcaccctgc ccccttccaa cccctcagtt 60

cccatcctcc agcagctgtt tgtgtgctgc ctctgaagtc cacactgaac aaacttcagc 120

ctactcatgt ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct 180

ccctgcctgc tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac 240

ctccaacatc cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg 300

tggtttaggt agtgtgagag gg 322

<210> 8

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 8

actcaaagtt caaaccttat cattttttgc tttgttcctc ttggccttgg ttttgtacat 60

cagctttgaa aataccatcc cagggttaat gctggggtta atttataact aagagtgctc 120

tagttttgca atacaggaca tgctataaaa atggaaagat gttgctttct gagaga 176

<210> 9

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 9

agggctggaa gctacctttg acatcatttc ctctgcgaat gcatgtataa tttctacaga 60

acctattaga aaggatcacc cagcctctgc ttttgtacaa ctttccctta aaaaactgcc 120

aattccactg ctgtttggcc caatagtgag aactttttcc tgctgcctct tggtgctttt 180

gcctatggcc cctattctgc ctgctgaaga cactcttgcc agcatggact taaacccctc 240

cagctctgac aatcctcttt ctcttttgtt ttacatgaag ggtctggcag ccaaagcaat 300

cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct cttggccttg gttttgtaca 360

tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt aatttataac taagagtgct 420

ctagttttgc aatacaggac atgctataaa aatggaaaga tgttgctttc tgagaga 477

<210> 10

<211> 218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 10

tggacacagg acgctgtggt ttctgagcca gggggcgact cagatcccag ccagtggact 60

tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 120

cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 180

cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaata 218

<210> 11

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 11

atttcataga acgaatgttc cgatgctcta atctctctag acaaggttca tatttgtatg 60

ggttacttat tctctctttg ttgactaagt caataatcag aatcagcagg tttgcagtca 120

gattggcagg gataagcagc ctagctcagg agaagtgagt ataaaagccc caggctggga 180

gcagccatca 190

<210> 12

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 12

gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 60

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 120

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 180

gaggattggg aagacaatag caggcatgct gggga 215

<210> 13

<211> 572

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 13

agcttacttg tggtaccgag ctcggatcct gagaacttca gggtgagtct atgggaccct 60

tgatgttttc tttccccttc ttttctatgg ttaagttcat gtcataggaa ggggagaagt 120

aacagggtac acatattgac caaatcaggg taattttgca tttgtaattt taaaaaatgc 180

tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta atactttccc taatctcttt 240

ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg caccattcta aagaataaca 300

gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca tataaatatt tctgcatata 360

aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca gctacaatcc agctaccatt 420

ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct gagtccaagc taggcccttt 480

tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct cctgggcaac gtgctggtct 540

gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat tg 572

<210> 14

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 14

atgtctaccg ccgtgctgga aaatcccggc ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag 60

gaaaccagct acatcgagga caactgcaac cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc 120

ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag gtgctgcggc tgttcgaaga gaacgacgtg 180

aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc agactgaaga aggacgagta cgagttcttc 240

acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 300

gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 360

ttcccccgga ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgag ctacggcgcc 420

gagctggacg ccgatcaccc cggctttaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 480

tttgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tcccccgggt ggagtatatg 540

gaagaggaaa agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc 600

cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctgg aaaagtactg cggcttccac 660

gaggacaata tcccccagct ggaagacgtg tcccagttcc tgcagacctg caccggcttc 720

agactgaggc ctgtggccgg actgctgagc agcagagatt ttctgggcgg actggccttc 780

cgggtgttcc actgcaccca gtacatcaga cacggcagca agcccatgta cacccccgag 840

cccgatatct gccacgagct gctgggacac gtgcccctgt tcagcgacag aagcttcgcc 900

cagttcagcc aggaaatcgg cctggcctct ctgggagccc ccgacgagta tatcgagaag 960

ctggccacca tctactggtt caccgtggaa ttcggcctgt gcaagcaggg cgacagcatc 1020

aaggcctacg gcgctggcct gctgtccagc tttggcgagc tgcagtactg tctgagcgag 1080

aagcccaagc tgctgcccct ggaactggaa aagaccgcca tccagaacta caccgtgacc 1140

gagttccagc ccctgtacta cgtggccgag agcttcaacg acgccaaaga aaaagtgcgg 1200

aacttcgccg ccaccatccc cagaccattc tccgtcagat acgaccccta cacccagcgg 1260

atcgaggtgc tggacaacac acagcagctg aaaattctgg ccgactccat caacagcgag 1320

atcggcatcc tgtgcagcgc cctgcagaag atcaag 1356

<210> 15

<211> 542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 15

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180

tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240

ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300

attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360

ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420

gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480

aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540

cg 542

<210> 16

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 16

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacg 168

<210> 17

<211> 168

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 17

cgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt 60

ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 120

acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 168

<210> 18

<211> 1421

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 18

gtttgtttcc ttttttaaaa tacattgagt atgcttgcct tttagatata gaaatatctg 60

atgctgtctt cttcactaaa ttttgattac atgatttgac agcaatattg aagagtctaa 120

cagccagcac gcaggttggt aagtactggt tctttgttag ctaggttttc ttcttcttca 180

tttttaaaac taaatagatc gacaatgctt atgatgcatt tatgtttaat aaacactgtt 240

cagttcatga tttggtcatg taattcctgt tagaaaacat tcatctcctt ggtttaaaaa 300

aattaaaagt gggaaaacaa agaaatagca gaatatagtg aaaaaaaata accacattat 360

ttttgtttgg acttaccact ttgaaatcaa aatgggaaac aaaagcacaa acaatggcct 420

tatttacaca aaaagtctga ttttaagata tatgacattt caaggtttca gaagtatgta 480

atgaggtgtg tctctaattt tttaaattat atatcttcaa tttaaagttt tagttaaaac 540

ataaagatta acctttcatt agcaagctgt tagttatcac caaagctttt catggattag 600

gaaaaaatca ttttgtctct atgtcaaaca tcttggagtt gatatttggg gaaacacaat 660

actcagttga gttccctagg ggagaaaagc aagcttaaga attgacataa agagtaggaa 720

gttagctaat gcaacatata tcactttgtt ttttcacaac tacagtgact ttatgtattt 780

cccagaggaa ggcatacagg gaagaaatta tcccatttgg acaaacagca tgttctcaca 840

ggaagcattt atcacactta cttgtcaact ttctagaatc aaatctagta gctgacagta 900

ccaggatcag gggtgccaac cctaagcacc cccagaaagc tgactggccc tgtggttccc 960

actccagaca tgatgtcagc tggaccataa ttaggcttct gttcttcagg agacatttgt 1020

tcaaagtcat ttgggcaacc atattctgaa aacagcccag ccagggtgat ggatcacttt 1080

gcaaagatcc tcaatgagct attttcaagt gatgacaaag tgtgaagtta accgctcatt 1140

tgagaacttt ctttttcatc caaagtaaat tcaaatatga ttagaaatct gaccttttat 1200

tactggaatt ctcttgacta aaagtaaaat tgaattttaa ttcctaaatc tccatgtgta 1260

tacagtactg tgggaacatc acagattttg gctccatgcc ctaaagagaa attggctttc 1320

agattatttg gattaaaaac aaagactttc ttaagagatg taaaattttc atgatgtttt 1380

cttttttgct aaaactaaag aattattctt ttacatttca g 1421

<210> 19

<211> 738

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<220>

<223> AAV8

<400> 19

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

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Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

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Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

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Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

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180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly

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Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His

245 250 255

Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp

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Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn

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325 330 335

Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln

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Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly

485 490 495

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530 535 540

Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val

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Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr

565 570 575

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580 585 590

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Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg

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Asn Leu

<210> 20

<211> 3445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 20

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<210> 21

<211> 2897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 21

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aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc 240

caagtggccc ttggcagcat ttactctctc tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca 300

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ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct cttggccttg 780

gttttgtaca tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt aatttataac 840

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gataggcacc tattggtctt actgacatcc actttgcctt tctctccaca ggtgtccagg 1080

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acttcggcca ggaaaccagc tacatcgagg acaactgcaa ccagaacggc gccatcagcc 1200

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gacggaagca gtttgccgat atcgcctaca actaccggca cggccagccc atcccccggg 1620

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<210> 22

<211> 3341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 22

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aacattcctt actagttcta ggagttaatt tttaaaaagc agtcaaaagt ccaagtgccc 360

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gatcacccag cctctgcttt tgtacaactt tcccttaaaa aactgccaat cccactgctg 600

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cctctttctc ttttgtttta catgaagggt ctggcagcca aagcaatcac tcaaagttca 780

aaccttatca ttttttgctt tgttcctctt ggccttggtt ttgtacatca gctttgaaaa 840

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cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca taggaagggg agaagtaaca gggtacacat 1080

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atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc attctaaaga ataacagtga taatttctgg 1260

gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata aatatttctg catataaatt gtaactgatg 1320

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atacctctta tcttcctccc acagctcctg ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat 1500

cactttggca aagaattgat ctcgaggccg ccaccatgtc taccgccgtg ctggaaaatc 1560

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tggaattcgg cctgtgcaag cagggcgaca gcatcaaggc ctacggcgct ggcctgctgt 2580

ccagctttgg cgagctgcag tactgtctga gcgagaagcc caagctgctg cccctggaac 2640

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cattctccgt cagatacgac ccctacaccc agcggatcga ggtgctggac aacacacagc 2820

agctgaaaat tctggccgac tccatcaaca gcgagatcgg catcctgtgc agcgccctgc 2880

agaagatcaa gtgataagca tgcggatctg cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 2940

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 3000

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 3060

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 3120

gggactcgag ttaagggcga attcccgata aggatcttcc tagagcatgg ctacgtagat 3180

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<210> 23

<211> 2203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 23

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactta agtgtttgct 180

gcttgcaatg tttgcccatt ttaggggaat tctggacaca ggacgctgtg gtttctgagc 240

cagggggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct gtttgctcct ccgataactg 300

gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct 360

taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg 420

acagtgaata gcggccgcca ccatgtctac cgccgtgctg gaaaatcccg gcctgggcag 480

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gaaggacgag tacgagttct tcacccacct ggacaagcgg agcctgcccg ccctgaccaa 720

catcatcaag atcctgcggc acgacatcgg cgccaccgtg cacgagctga gccgggacaa 780

gaaaaaggac accgtgccct ggttcccccg gaccatccag gaactggaca gattcgccaa 840

ccagatcctg agctacggcg ccgagctgga cgccgatcac cccggcttta aggaccccgt 900

gtaccgggcc agacggaagc agtttgccga tatcgcctac aactaccggc acggccagcc 960

catcccccgg gtggagtata tggaagagga aaagaaaacc tggggcaccg tgttcaagac 1020

cctgaagtcc ctgtacaaga cccacgcctg ctacgagtac aaccacatct tcccactgct 1080

ggaaaagtac tgcggcttcc acgaggacaa tatcccccag ctggaagacg tgtcccagtt 1140

cctgcagacc tgcaccggct tcagactgag gcctgtggcc ggactgctga gcagcagaga 1200

ttttctgggc ggactggcct tccgggtgtt ccactgcacc cagtacatca gacacggcag 1260

caagcccatg tacacccccg agcccgatat ctgccacgag ctgctgggac acgtgcccct 1320

gttcagcgac agaagcttcg cccagttcag ccaggaaatc ggcctggcct ctctgggagc 1380

ccccgacgag tatatcgaga agctggccac catctactgg ttcaccgtgg aattcggcct 1440

gtgcaagcag ggcgacagca tcaaggccta cggcgctggc ctgctgtcca gctttggcga 1500

gctgcagtac tgtctgagcg agaagcccaa gctgctgccc ctggaactgg aaaagaccgc 1560

catccagaac tacaccgtga ccgagttcca gcccctgtac tacgtggccg agagcttcaa 1620

cgacgccaaa gaaaaagtgc ggaacttcgc cgccaccatc cccagaccat tctccgtcag 1680

atacgacccc tacacccagc ggatcgaggt gctggacaac acacagcagc tgaaaattct 1740

ggccgactcc atcaacagcg agatcggcat cctgtgcagc gccctgcaga agatcaagtg 1800

ataagcatgc ggatctgcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 1860

ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 1920

tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 1980

gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg actcgagtag 2040

ataagtagca tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca 2100

ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc 2160

cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cag 2203

<210> 24

<211> 2496

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 24

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180

aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc ctacctcgtg atcgcccggc ccctgttcaa 240

acatgtccta atactctgtc tctgcaaggg tcatcagtag ttttccatct tactcaacat 300

cctcccagtg gaattcattt catagaacga atgttccgat gctctaatct ctctagacaa 360

ggttcatatt tgtatgggtt acttattctc tctttgttga ctaagtcaat aatcagaatc 420

agcaggtttg cagtcagatt ggcagggata agcagcctag ctcaggagaa gtgagtataa 480

aagccccagg ctgggagcag ccatcactgc agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta 540

agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga gaccaataga aactgggctt gtcgagacag 600

agaagactct tgcgtttctg ataggcacct attggtctta ctgacatcca ctttgccttt 660

ctctccacag gtgtccaggc ggccgccacc atgtctaccg ccgtgctgga aaatcccggc 720

ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag gaaaccagct acatcgagga caactgcaac 780

cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag 840

gtgctgcggc tgttcgaaga gaacgacgtg aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc 900

agactgaaga aggacgagta cgagttcttc acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc 960

ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc 1020

cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg ttcccccgga ccatccagga actggacaga 1080

ttcgccaacc agatcctgag ctacggcgcc gagctggacg ccgatcaccc cggctttaag 1140

gaccccgtgt accgggccag acggaagcag tttgccgata tcgcctacaa ctaccggcac 1200

ggccagccca tcccccgggt ggagtatatg gaagaggaaa agaaaacctg gggcaccgtg 1260

ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc 1320

ccactgctgg aaaagtactg cggcttccac gaggacaata tcccccagct ggaagacgtg 1380

tcccagttcc tgcagacctg caccggcttc agactgaggc ctgtggccgg actgctgagc 1440

agcagagatt ttctgggcgg actggccttc cgggtgttcc actgcaccca gtacatcaga 1500

cacggcagca agcccatgta cacccccgag cccgatatct gccacgagct gctgggacac 1560

gtgcccctgt tcagcgacag aagcttcgcc cagttcagcc aggaaatcgg cctggcctct 1620

ctgggagccc ccgacgagta tatcgagaag ctggccacca tctactggtt caccgtggaa 1680

ttcggcctgt gcaagcaggg cgacagcatc aaggcctacg gcgctggcct gctgtccagc 1740

tttggcgagc tgcagtactg tctgagcgag aagcccaagc tgctgcccct ggaactggaa 1800

aagaccgcca tccagaacta caccgtgacc gagttccagc ccctgtacta cgtggccgag 1860

agcttcaacg acgccaaaga aaaagtgcgg aacttcgccg ccaccatccc cagaccattc 1920

tccgtcagat acgaccccta cacccagcgg atcgaggtgc tggacaacac acagcagctg 1980

aaaattctgg ccgactccat caacagcgag atcggcatcc tgtgcagcgc cctgcagaag 2040

atcaagtgat aagcatgcgg atctgcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 2100

gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 2160

taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 2220

ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggac 2280

tcgagttaag ggcgaattcc cgattaggat cttcctagag catggctacg tagataagta 2340

gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 2400

tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 2460

tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcag 2496

<210> 25

<211> 2241

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 构建序列

<400> 25

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactta agctacctcg 180

tgatcgcccg gcccctgttc aaacatgtcc taatactctg tctctgcaag ggtcatcagt 240

agttttccat cttactcaac atcctcccag tggaattcat ttcatagaac gaatgttccg 300

atgctctaat ctctctagac aaggttcata tttgtatggg ttacttattc tctctttgtt 360

gactaagtca ataatcagaa tcagcaggtt tgcagtcaga ttggcaggga taagcagcct 420

agctcaggag aagtgagtat aaaagcccca ggctgggagc agccatcagc ggccgccacc 480

atgtctaccg ccgtgctgga aaatcccggc ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag 540

gaaaccagct acatcgagga caactgcaac cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc 600

ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag gtgctgcggc tgttcgaaga gaacgacgtg 660

aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc agactgaaga aggacgagta cgagttcttc 720

acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 780

gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 840

ttcccccgga ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgag ctacggcgcc 900

gagctggacg ccgatcaccc cggctttaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 960

tttgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tcccccgggt ggagtatatg 1020

gaagaggaaa agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc 1080

cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctgg aaaagtactg cggcttccac 1140

gaggacaata tcccccagct ggaagacgtg tcccagttcc tgcagacctg caccggcttc 1200

agactgaggc ctgtggccgg actgctgagc agcagagatt ttctgggcgg actggccttc 1260

cgggtgttcc actgcaccca gtacatcaga cacggcagca agcccatgta cacccccgag 1320

cccgatatct gccacgagct gctgggacac gtgcccctgt tcagcgacag aagcttcgcc 1380

cagttcagcc aggaaatcgg cctggcctct ctgggagccc ccgacgagta tatcgagaag 1440

ctggccacca tctactggtt caccgtggaa ttcggcctgt gcaagcaggg cgacagcatc 1500

aaggcctacg gcgctggcct gctgtccagc tttggcgagc tgcagtactg tctgagcgag 1560

aagcccaagc tgctgcccct ggaactggaa aagaccgcca tccagaacta caccgtgacc 1620

gagttccagc ccctgtacta cgtggccgag agcttcaacg acgccaaaga aaaagtgcgg 1680

aacttcgccg ccaccatccc cagaccattc tccgtcagat acgaccccta cacccagcgg 1740

atcgaggtgc tggacaacac acagcagctg aaaattctgg ccgactccat caacagcgag 1800

atcggcatcc tgtgcagcgc cctgcagaag atcaagtgat aagcatgcgg atctgcctcg 1860

actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 1920

ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 1980

ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 2040

tgggaagaca atagcaggca tgctggggac tcgagtagat aagtagcatg gcgggttaat 2100

cattaactac aaggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc 2160

gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 2220

agtgagcgag cgagcgcgca g 2241

<210> 26

<211> 108

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

gaaacaagtt acatcgaaga caactccaat caaaatggtg ctgtatctct gatattctca 60

ctcaaagagg aagttggtgc cctggccaag gtcctgcgct tatttgag 108

<210> 27

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化序列

<400> 27

gaaacaagtt acatcgaaga caactccaat caaaacctgc ttatttgag 49

<210> 28

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化序列

<400> 28

gaaacaagtt acatcgaaga caactccaat caaaatggtg ctgtatctct gatattctca 60

ctcaaagagg aagttggtgc cctggtccaa ggtcctgcgc ttatttgag 109

<210> 29

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化序列

<400> 29

gaaacaagtt acatcgaaga caactccaat caaaaatggt gctgtatctc tgatattctc 60

actcaaagag gaagttggtg ccctggccaa ggtcctgcgc ttatttgag 109

<210> 30

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 工程化序列

<400> 30

gaaacaagtt acatcgaaga caactccaat ggtgctgtat ctctgatatt ctcactcaaa 60

gaggaagttg gtgccctggc caaggtcctg cgcttatttg ag 102

<210> 31

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 共有序列

<400> 31

gaaacaagtt acatcgaaga caactccaat caaaatggtg ctgtatctct gatattctca 60

ctcaaagagg aagttggtgc cctggccaag gtcctgcgct tatttgag 108

Claims

1.一种可用作苯丙酮尿症(PKU)的肝脏定向治疗剂的重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包含AAV衣壳和包装在其中的载体基因组，所述载体基因组包含：

(a)AAV 5'反向末端重复(ITR)序列；

(b)启动子；

(c)编码人类苯丙氨酸羟化酶(PAH)的密码子优化序列；

(d)AAV 3'ITR。

2.根据权利要求1所述的rAAV，其中(c)的所述编码序列为SEQ ID NO:1。

3.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述rAAV衣壳为AAV8衣壳。

4.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述启动子是TBG启动子或TBG-S1启动子。

5.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述启动子是AlAT启动子。

6.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述启动子是LSP启动子。

7.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述启动子是TTR启动子。

8.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述AAV 5'ITR和/或AAV3'ITR是来自AAV2。

9.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述载体基因组还包含poly A。

10.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述polyA是来自bGH。

11.根据权利要求1所述的rAAV，还包含WPRE。

12.根据权利要求1所述的rAAV，还包含内含子。

13.根据权利要求12所述的rAAV，其中所述内含子是来自人类β珠蛋白IVS2或SV40。

14.根据权利要求1所述的rAAV，还包含增强子。

15.根据权利要求14所述的rAAV，其中所述增强子是APB增强子、ABPS增强子、αmic/bik增强子、TTR增强子、en34或ApoE增强子。

16.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述载体基因组的大小为约3千碱基至约5.5千碱基。

17.一种适用于向苯丙酮尿症患者施用的水性悬浮液，所述悬浮液包含水性悬浮液体和约1x 10¹²GC/mL至约1x 10¹⁴GC/mL的可用作苯丙酮尿症的肝脏定向治疗剂的重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV具有AAV衣壳并且具有包装在其中的载体基因组，所述载体基因组包含：

(a)AAV 5'反向末端重复(ITR)序列；

(b)启动子；

(c)编码人类苯丙氨酸羟化酶(PAH)的编码序列；以及

(d)AAV 3'ITR。

18.根据权利要求17所述的悬浮液，其中所述悬浮液适用于静脉内注射。

19.根据权利要求17所述的悬浮液，其中所述悬浮液还包含溶解在所述水性悬浮液体中的表面活性剂、防腐剂和/或缓冲液。

20.一种用根据权利要求1所述的rAAV治疗患有苯丙酮尿症的患者的方法，其中所述rAAV为以水性悬浮液递送约1x 10¹⁰至约1x10¹⁵个基因组拷贝(GC)/kg，其中所述GC如基于oqPCR或ddPCR所确定的那样计算。

21.根据权利要求1所述的rAAV，其中所述载体基因组包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。

22.根据权利要求17所述的悬浮液，其中所述rAAV衣壳为AAV8衣壳。

23.根据权利要求1至16中任一项所述的rAAV用于治疗有需要的受试者的PKU的用途。