KR20210042128A - 핵산 분자 및 비바이러스 유전자 치료를 위한 이의 용도 - Google Patents

핵산 분자 및 비바이러스 유전자 치료를 위한 이의 용도 Download PDF

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지아윤 리우
통야오 리우
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로버트 티. 피터스
알렉세이 세레긴
필립 자카스
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Abstract

본 발명은 제1 역방위 말단 반복부(ITR), 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 miRNA 및/또는 치료학적 단백질을 암호화한다. 소정의 구현예에서, 치료학적 단백질은 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노 연관된 바이러스(AAV)의 ITR이다. 본 발명은 또한 핵산 분자 또는 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 간의 대사 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

핵산 분자 및 비바이러스 유전자 치료를 위한 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2018년 8월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/716,826호에 대해 우선권을 주장하며, 그 전체 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
전자로 제출된 서열 목록에 대한 언급
ASCII 텍스트 파일의 전자로 제출된 서열 목록(파일명: SA9-465PC_SL_ST25.txt; 크기: 460,648 바이트; 및 생성일: 2019년 8월 8일)의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
유전자 치료는 다양한 질환을 치료하는 지속적인 수단에 대한 가능성을 제공한다. 과거에, 많은 유전자 요법 치료는 전형적으로 바이러스의 사용에 의존한다. 이 목적에 선택될 수 있는 많은 바이러스제가 있고, 각각은 이들이 유전자 치료에 다소 적합하게 하는 명확한 특성을 갖는다. Zhou et al., Adv Drug Deliv Rev. 106(Pt A):3-26, 2016. 그러나, 면역원성 프로필 또는 암을 야기하는 경향을 포함하는 일부 바이러스 벡터의 원치 않는 특성은 임상 안전성 우려를 초래하고, 최근까지 이의 임상 용도를 소정의 분야, 예를 들어 백신 및 종양세포붕괴성 전략으로 제한하였다. Cotter et al., Front Biosci. 10:1098-105 (2005).
아데노 연관된 바이러스(AAV: adeno-associated virus)는 가장 흔히 조사된 유전자 치료 벡터 중 하나이다. AAV는 대략 4.8 킬로염기(kb)의 작은 단일 가닥 DNA 게놈을 둘러싸고 보호하는 단백질 쉘이다. Naso et al., BioDrugs, 31(4): 317-334, 2017. AAV는 파르보바이러스 패밀리에 속하고, 복제하기 위해 다른 바이러스, 주로 아데노바이러스와의 동시감염에 의존한다. Id. 이의 단일 가닥 게놈은 Rep(복제), Cap(캡시드) 및 aap(어셈블리)의 3개의 유전자를 함유한다. Id. 이 암호화 서열은 게놈 복제 및 패키징에 필요한 역방위 말단 반복부(ITR)에 의해 측접된다. Id. 2개의 시스-작용 AAV ITR은 DNA 복제의 개시 동안 프라이머로서 작용하는 T 형상 헤어핀 구조로 폴딩할 수 있는 중단된 회문 서열을 갖는 대략 145개의 뉴클레오타이드 길이이다.
그러나, 유전자 전달 벡터로서의 종래의 AAV의 사용은 소정의 단점을 갖는다. 주요 단점 중 하나는 이종성 DNA의 약 4.5 kb의 AAV의 제한된 바이러스 패키징 역량과 연관된다. (Dong et al., Hum Gene Ther. 7(17): 2101-12, 1996). 부가적으로, AAV 벡터의 투여는 인간에서 면역 반응을 유도할 수 있다. AAV가 일부 다른 바이러스(즉, 아데노바이러스)보다 덜 면역원성인 것으로 나타났지만, 캡시드 단백질은 인간 면역계의 다양한 성분을 촉발시킬 수 있다. Naso 등의 2017 문헌 참조. AAV는 인간 집단에서 흔한 바이러스이고, 대부분의 사람은 AAV에 노출되고, 따라서 대부분의 사람은 이들이 이전에 노출된 특정 변이체에 대한 면역 반응을 이미 발생시켰다. 이의 기존의 적응 반응은 AAV에 의한 후속하는 재감염의 임상 효능 및/또는 형질도입된 세포의 제거를 감소시킬 수 있는 중화 항체(NAb: neutralizing antibody) 및 T 세포를 포함할 수 있고, 이는 AVV 기반 유전자 요법 치료에 대해 기존의 항-AAV 면역력을 갖는 환자를 탈락시킬 수 있다. 더 나아가, 증거는 AAV ITR의 T 형상 헤어핀 루프가 AAV ITR의 T 형상 헤어핀 구조에 결합하는 숙주 세포 단백질/단백질 복합체에 의해 억제가 되기 쉽다는 것을 제시한다. 예를 들어, 문헌[Zhou et al., Scientific Reports 7:5432 (July 14, 2017)] 참고.
따라서, 의도되지 않은 결과의 일부 및 기존의 AAV 벡터 기술의 제한을 피하면서 시험관내 및 생체내 환경에서 표적 서열, 예를 들어 치료학적 단백질 및/또는 miRNA를 효율적으로 그리고 지속적으로 발현시키기 위한 필요가 당업계에 있다.
소정의 양태에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자로서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 180에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 ITR은 서열 번호 181에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 183에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 ITR은 서열 번호 184에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 185에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 ITR은 서열 번호 186에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 187에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 ITR은 서열 번호 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 소정의 예시적인 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 서로의 역상 보체(reverse complement)이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 프로모터를 추가로 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 프로모터는 근육, 중추 신경계(CNS), 눈, 간, 심장, 신장, 췌장, 폐, 피부, 방광, 요로, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택되는 장기에서의 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 프로모터는 간세포, 내피 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 동양혈관 세포, 구심성 뉴런, 원심성 뉴런, 뉴런간, 신경교 세포, 성상세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 뇌실막 세포, 폐 상피 세포, 슈반 세포, 위성 세포, 광수용체 세포, 망막 신경절 세포, 또는 임의의 이들의 조합에서의 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 프로모터는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 5'에 위치한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 프로모터는 마우스 타이레틴 프로모터(mTTR: mouse thyretin promoter), 내인성 인간 VIII 인자 프로모터(F8), 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, α1-안티트립신(AAT), 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 데스민(DES), SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, tMCK 및 포스포글리세레이트 키나제(PGK: phosphoglycerate kinase) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 인트론 서열을 추가로 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 인트론 서열은 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 5'에 위치한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 인트론 서열은 프로모터의 3'에 위치한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 인트론 서열은 합성 인트론 서열을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 인트론 서열은 서열 번호 115 또는 192를 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 전사후 조절 요소는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 3'에 위치한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 전사후 조절 요소는 돌연변이된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE: woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element), 마이크로RNA 결합 부위, DNA 핵 표적화 서열, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 마이크로RNA 결합 부위는 miR142-3p에 대한 결합 부위를 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 추가로 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A), 액틴 폴리(A), 헤모글로빈 폴리(A), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 인핸서 서열을 추가로 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 인핸서 서열은 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 5'에서 3'로 제1 ITR, 유전적 카세트 및 제2 ITR을 포함하고; 여기서 유전적 카세트는 조직 특이적 프로모터 서열, 인트론 서열, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 전사후 조절 요소 및 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 5'에서 3'로 조직 특이적 프로모터 서열, 인트론 서열, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 전사후 조절 요소 및 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 조직 특이적 프로모터 서열은 TTT 프로모터를 포함하고; 인트론은 합성 인트론이고; 전사후 조절 요소는 WPRE를 포함하고; 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGHpA를 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 또는 임의의 이들의 조합을 암호화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 아드레노메둘린(AM: adrenomedullin), 안지오포이에틴(Ang: angiopoietin), 자가분비 운동 인자, 골 형태발생 단백질(BMP: bone morphogenetic protein)(예를 들어, BMP2, BMP4, BMP5, BMP7), 섬모 신경영양 인자 패밀리 구성원(예를 들어, 섬모 신경영양 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor), 백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor), 인터류킨-6(IL-6)), 콜로니 자극 인자(예를 들어, 대식세포 콜로니 자극 인자(m-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)), 표피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor), 에프린(예를 들어, 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3), 에리쓰로포이에틴(EPO: erythropoietin), 섬유아세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor)(예를 들어, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23), 소 태아 소마토트로핀(FBS: foetal bovine somatotrophin), GDNF 패밀리 구성원(예를 들어, 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factor), 뉴투린, 퍼세핀, 아르테민), 성장 분화 인자-9(GDF9: growth differentiation factor-9), 간세포 성장 인자(HGF: hepatocyte growth factor), 간세포암 유래 성장 인자(HDGF: hepatoma-derived growth factor), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(예를 들어, 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 또는 IGF-2, 인터류킨(IL)(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7), 각질세포 성장 인자(KGF: keratinocyte growth factor), 이동 자극 인자(MSF: migration-stimulating factor), 대식세포 자극 단백질(MSP: macrophage-stimulating protein 또는 간세포 성장 인자-유사 단백질(HGFLP: hepatocyte growth factor-like protein)), 마이오스타틴(GDF-8), 뉴레귤린(예를 들어, 뉴레귤린 1(NRG1), NRG2, NRG3, NRG4), 뉴트로트로핀(예를 들어, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF: brain-derived neurotrophic factor), 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor), 뉴트로트로핀-3(NT-3), NT-4, 태반 성장 인자(PGF: placental growth factor), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor), 레날라아제(RNLS: renalase), T-세포 성장 인자(TCGF: T-cell growth factor), 트롬보포이에틴(TPO: thrombopoietin), 형질전환 성장 인자(예를 들어, 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), TGF-β, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자를 암호화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 호르몬을 암호화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 사이토카인을 암호화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체 또는 이의 단편을 암호화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 디스트로핀 X-연관, MTM1(마이오튜불라린), 티로신 수산화효소, AADC, 사이클로하이드롤라아제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다아제), 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 유전자를 암호화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 마이크로RNA(miRNA)를 암호화한다. 소정의 예시적인 구현예에서, miRNA는 SOD1, HTT, RHO, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 표적 유전자의 발현을 하향조절한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 I 인자(FI), II 인자(FII), III 인자(FIII), IV 인자(FVI), V 인자(FV), VI 인자(FVI), VII 인자(FVII), VIII 인자(FVIII), IX 인자(FIX), X 인자(FX), XI 인자(FXI), XII 인자(FXII), XIII 인자(FVIII), 폰 빌레브란트 인자(VWF: Von Willebrand factor), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐, 피브로넥틴, 안티트롬빈 III, 헤파린 보인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제(ZPI: Z-related protease inhibitor), 플라스미노겐, 알파 2-안티플라스민, 조직 플라스미노겐 활성자(tPA: tissue plasminogen activator), 유로키나제, 플라스미노겐 활성자 억제제-1 (PAI-1), 플라스미노겐 활성자 억제제-2(PAI2), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 응고 인자를 암호화한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 응고 인자는 FVIII이다. 소정의 예시적인 구현예에서, FVIII은 전장 성숙 FVIII를 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, FVIII는 서열 번호 106을 갖는 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, FVIII는 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, 및 부분 또는 무 B 도메인을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, FVIII는 서열 번호 109의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 응고 인자는 이종성 모이어티를 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 모이어티는 알부민 또는 이의 단편, 면역글로불린 Fc 영역, 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 아단위의 C 말단 펩타이드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 모이어티는 FVIII의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나, FVIII에서 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 모이어티는 표 4에 기재된 삽입 부위로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 2개의 아미노산 사이에 삽입된다.
소정의 예시적인 구현예에서, FVIII는 A1 도메인, A2 도메인, C1 도메인, C2 도메인, 선택적인 B 도메인 및 이종성 모이어티를 추가로 포함하고, 여기서 이종성 모이어티는 성숙 FVIII(서열 번호 106)에 상응하는 아미노산 745의 바로 하류에 삽입된다.
소정의 예시적인 구현예에서, FVIII는 FcRn 결합 파트너를 추가로 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, FcRn 결합 파트너는 면역글로불린 불변 도메인의 Fc 영역을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, FVIII를 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된다. 소정의 예시적인 구현예에서, FVIII를 암호화하는 핵산 서열은 인간에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다.
소정의 예시적인 구현예에서, FVIII를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 107의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, FVIII를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 인간에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 전달제에 의해 제형화된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 전달제는 지질 나노입자를 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 전달제는 리포솜, 비지질 중합체성 분자 및 엔도솜, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내, 경피, 진피내, 피하, 폐 또는 경구 전달, 또는 임의의 이들의 조합을 위해 제형화된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내 전달을 위해 제형화된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 및 핵산 분자를 필요로 하는 대상체에게 핵산 분자를 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자의 제조를 위한 바큘로바이러스 시스템이 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자는 곤충 세포에서 생산된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 나노입자 전달 시스템이 제공된다.
소정의 양태에서, 적합한 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 제공된다.
소정의 양태에서, 적합한 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 응고 활성을 갖는 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 응고 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 방법이 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 응고 인자의 발현을 필요로 하는 대상체에서 응고 인자를 발현시키는 방법이 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 또는 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 응고 인자 결핍을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자, 본원에 기재된 바와 같은 벡터, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 응고 인자 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서 응고 인자 결핍을 치료하는 방법이 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내로, 경피로, 진피내로, 피하로, 경구로, 폐로, 또는 임의의 이들의 조합으로 투여된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내 투여된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 상기 방법은 대상체에게 제2 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 대상체는 인간이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 대상체에 대한 핵산 분자의 투여는 투여 전의 대상체에서의 FVIII 활성에 비해 FVIII 활성을 증가시키고, 여기서 FVIII 활성은 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배만큼 증가한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 대상체는 출혈 장애를 갖는다. 소정의 예시적인 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 출혈 장애는 A 혈우병이다.
소정의 양태에서, 출혈 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 장애를 치료하는 방법으로서, 응고 인자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법이 제공된다.
소정의 양태에서, A 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 A 혈우병을 치료하는 방법으로서, VIII 인자(FVIII)를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법이 제공된다.
소정의 양태에서, 간의 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간의 대사 장애를 치료하는 방법으로서, 대상체에서 결핍된 간 연관된 대사 효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR인 방법이 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
소정의 양태에서, 간의 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간의 대사 장애를 치료하는 방법으로서, 대상체에서 결핍된 간 연관된 대사 효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법이 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 간의 대사 장애는 페닐케톤뇨증(PKU: phenylketonuria), 우레아 사이클 질환, 리소좀 저장 장애 및 글리코겐 저장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 간의 대사 장애는 페닐케톤뇨증(PKU)이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내로, 경피로, 진피내로, 피하로, 경구로, 폐로, 또는 임의의 이들의 조합으로 투여된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 정맥내 투여된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 상기 방법은 대상체에게 제2 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 대상체는 인간이다.
소정의 양태에서, 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 방법으로서, 페닐알라닌 수산화효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법이 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산을 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 전달제에 의해 제형화된다. 소정의 예시적인 구현예에서, 전달제는 지질 나노입자를 포함한다.
소정의 양태에서, 복잡한 2차 구조가 가능한 핵산 분자를 적합한 벡터로 삽입하는 단계, 및 생성된 벡터를 SbcCD 복합체에서의 파괴를 포함하는 박테리아 숙주 균주로 도입하는 단계를 포함하는, 핵산 분자를 클로닝하는 방법이 제공된다.
소정의 예시적인 구현예에서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcC 유전자 및/또는 SbcD 유전자에서의 유전적 파괴를 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcC 유전자에서의 유전적 파괴를 포함한다. 소정의 예시적인 구현예에서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcD 유전자에서의 유전적 파괴를 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV) ITR이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 핵산 분자는 유전적 카세트를 추가로 포함하고, 여기서 유전적 카세트는 제1 ITR 및 제2 ITR에 의해 측접된다.
소정의 예시적인 구현예에서, 유전적 카세트는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
소정의 예시적인 구현예에서, 적합한 벡터는 저카피 벡터이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 적합한 벡터는 pBR322이다.
소정의 예시적인 구현예에서, 박테리아 숙주 균주는 십자형 DNA 구조를 풀 수 없다.
소정의 예시적인 구현예에서, 박테리아 숙주 균주는 유전자형 sbcC, recD, mcrA, ΔmcrBCF를 포함하는 PMC103이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 박테리아 숙주 균주는 유전자형 recBC, recJ, sbcBC, mcrA, ΔmcrBCF를 포함하는 PMC107이다. 소정의 예시적인 구현예에서, 박테리아 숙주 균주는 유전자형 recB, recJ, sbcC, mcrA, ΔmcrBCF, umuC, uvrC를 포함하는 SURE이다.
소정의 양태에서, 핵산 분자를 클로닝하는 방법으로서, 복잡한 2차 구조가 가능한 핵산 분자를 적합한 벡터로 삽입하는 단계 및 생성된 벡터를 SbcCD 복합체에서의 파괴를 포함하는 박테리아 숙주 균주로 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 핵산 분자는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법이 제공된다.
도 1a-1b는 단일 가닥 응고 인자(예를 들어, FVIII) 발현 카세트의 도식적 표시이다. 비-AAV(ssDNA 구조의 말단에서 헤어핀 루프를 가짐)로부터의 5' ITR, 비-AAV(헤어핀 루프를 가짐)로부터의 3' ITR, 프로모터 서열(예를 들어, TTPp 또는 CAGp), 및 전이유전자 서열, 예를 들어 XTEN144가 B 도메인 내에 삽입된 FVIIIco6XTEN 서열의 위치가 도시되어 있다. 예시적인 발현 카세트는 또한 추가의 가능한 요소, 예를 들어 인트론 서열, WPREmut 서열 및 bGHpA 서열을 보여준다.
도 1c-1f는 단일 가닥 응고 인자 발현 카세트, 예컨대 도 1a-1b에 도시된 카세트를 제조하기 위해 사용된 플라스미드의 도식적 표시이고, 여기서 카세트의 ITR은 AAV2(도 1c), B19 (도 1d), GPV(도 1e)로부터 유래되거나, 야생형 B19 ITR 서열(도 1f)이다. 본원에 도시된 바대로 ssFVIII 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 작제물은 ITR 및 발현 카세트를 포함하는 서열을 정확하게 방출시키도록 (PvuII 부위에서) PvuII(도 1C) 또는 (LguI 부위에서) LguI(도 1d-1f)로 분해되었다. 이중 가닥 DNA는 ssDNA를 제조하도록 95℃에서 열 변성되고, 이후 ITR 구조 형성을 허용하도록 4℃에서 항온처리되었다.
도 2a는 다양한 파르보바이러스 과 구성원 사이에 그 관계식을 예시하는 계통발생론적 나무이다. B19, AAV-2 및 GPV는 윤곽표시된 박스에 의해 표시된다.
도 2b는 헤어핀 구조를 포함하는 다양한 카세트의 도식적 도면이다.
도 3a 및 3b는 B19, GPV 및 AAV2(도 3a) 및 B19 및 GPV(도 3b)의 ITR의 정렬이다. 회색 음영은 상동성을 보여준다.
도 4a-4c는 Hem A 마우스에서 수력학적 주사(HDI: hydrodynamic injection)를 통한 단일 가닥 FVIII-AAV 네이키드 DNA(ssAAV-FVIII; 도 1c), ssDNA-B19 FVIII(도 1d) 또는 ssDNA-GPV FVIII (도 1e) 투여 후 FVIII 혈장 활성을 보여준다. FVIII 활성은 50 ㎍/마우스(도 4c), 20 ㎍/마우스(도 4a 및 도 4b), 10 ㎍/마우스(도 4a, 도 4b 및 도 4c), 또는 5 ㎍/마우스(도 4a)에서의 ssDNA의 단일 HDI에 의해 치료된 마우스에서 24시간, 3일, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 및 6개월에서 혈장 샘플에서 (인간에서의 정상 생리학적 수준의 백분율로서) 측정되었다. 5 ㎍/마우스의 플라스미드 DNA의 HDI는 대조군으로 주어졌다(도 4a, 도 4b 및 도 4c).
도 5는 등몰량의 단일 가닥 네이키드 DNA(ssAAV-FVIII, 도 1a), ITR 서열을 함유하는 단일 가닥 AAV-FVIII DNA(dsDNA), ITR 서열이 없는 이중 가닥 FVIII DNA(ITR 무 dsDNA), 또는 ITR 또는 박테리아 서열이 없는 원형화된 이중 가닥 FVIII DNA(미니서클)의 단일 수력학적 주사 후 A 혈우병 마우스 혈장에서의 FVIII 활성을 보여준다. dsDNA는 PvuII에 의한 AAV-FVIII 플라스미드(도 2c)의 효소 절단에 의해 생성되지만, 열 변성되지 않았다. ITR 무 dsDNA는 AflII에 의한 AAV-FVIII 플라스미드(도 2c)의 효소 절단에 의해 생성되고 후속하여 정제되었다. 미니서클 DNA는 AflII 부위에서 ITR 무 dsDNA DNA의 결찰에 의해 생성되었다. 마우스 혈장은 3개월 또는 4개월에 걸쳐 수집되고, FVIII는 색소생산성 활성 검정에 의해 결정되었다.
도 6은 30 ㎍의 단일 가닥 네이키드 FVIII-DNA의 수력학적 주사 후 A 혈우병 마우스 혈장에서의 FVIII 활성을 보여준다(도 1a, 도 1d-1f). 혈장은 7주 동안 주마다 수집되고, FVIII 활성은 색소생산성 검정에 의해 결정되었다. 35일 후(검정 화살표로 도시됨), FVIII-B19d135 및 FVIII-GPVd162 ssDNA를 받은 마우스는 수력학적 주사를 통해 30 ㎍이 재투여되었다.
도 7a는 단일 가닥 쥣과 페닐알라닌 수산화효소(예를 들어, PAH) 발현 카세트의 도식적 표시이다. 비-AAV(ssDNA 구조의 말단에서 헤어핀 루프를 가짐)로부터의 5' ITR, 비-AAV(헤어핀 루프를 가짐)로부터의 3' ITR, 프로모터 서열(예를 들어, CAGp), 및 전이유전자 서열, 예를 들어 3xFLAG_mPAH 서열의 위치가 도시되어 있다. 예시적인 발현 카세트는 또한 추가의 가능한 요소, 예를 들어 WPREmut 서열 및 bGHpA 서열을 보여준다.
도 7b-7d는 수력학적 주사를 통한 쥣과 PAH cDNA 및 비-AAV ITR B19d135 또는 GPVd162를 함유하는 단일 가닥 DNA의 단일 투여 전(0일) 및 후에 페닐케톤뇨증(PKU) 마우스에서의 페닐알라닌(Phe)의 혈장 농도를 보여준다. 혈장은 ssDNA 투여 후 3일, 7일, 14일, 28일, 42일 및 56일에 수집되었다. 잔류 페닐알라닌 수준은 ㎍/mL의 농도로(도 7b-7c) 또는 투여 전 퍼센트로(도 7d) 도시되어 있다. 수평 선은 투여 전 기준선 Phe 수준을 도시한다.
도 7e는 쥣과 PAH 전이유전자 및 B19d135 또는 GPVd165 ITR 중 어느 하나를 함유하는 ssDNA로 치료된 PKU 마우스로부터의 간 용해물의 웨스턴 면역블롯을 보여준다. 간을 치료 후 81일에 수집하고, 단백질 용해물을 추출하였다. 각각의 웰은 단일 동물을 나타낸다. FLAG-태그화된 쥣과 PAH 단백질은 M2 항-FLAG 항체를 사용하여 검출되고, GAPDH 로딩 대조군은 비교를 위해 포함되었다.
도 8a-8b는 FVIII-AAV DNA(도 1a-1c) 캡슐화된 지질 나노입자에 의한 형질도입 후 Huh7 세포 상청액에서의 FVIII 활성 수준을 보여준다. CAGp 프로모터 하의 플라스미드 FVIII-AAV(도 1b)는 3개의 아민-대-포스페이트(NP) 비로 캡슐화되고, 피코그린 검정에 의해 결정된 다양한 농도에서 Huh7 세포에 적용되었다(도 8a). TTPp 프로모터 하의 플라스미드, 이중 가닥 선형(ds) 및 단일 기닥(ss) AAV-FVIII(도 1a)는 또한 2의 NP 비로 지질 나노입자에서 캡슐화되고, 다양한 DNA 농도에서 Huh7 세포를 형질도입하도록 사용되었다(도 8b). FVIII는 인간 FACT 혈장 표준품과 비교하여 색소생산성 활성 검정에 의해 측정되었다.
본 발명은 제1 역방위 말단 반복부(ITR), 제2 ITR 및 예를 들어 표적 서열(본원에서 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열이라고도 칭함), 예를 들어 치료학적 단백질 또는 miRNA를 암호화하는 유전적 카세트를 포함하는 플라스미드-유사 핵산 분자를 기재하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스의 ITR이다(예를 들어, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-AAV 유래임). 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 치료학적 단백질을 암호화하고, 예를 들어 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 디스트로핀 X 연관, MTM1(마이오튜불라린), 티로신 수산화효소, AADC, 사이클로하이드롤라아제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다아제), 또는 임의의 이들의 조합을 암호화한다.
일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 응고 인자를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 치료학적 단백질은 FVIII 또는 FIX 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 miRNA를 암호화한다. 소정의 구현예에서, miRNA는 SOD1, HTT, RHO, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택되는 표적 유전자의 발현을 하향조절한다.
소정의 구현예에서, 비-AAV는 바이러스 과 파르보비리다에의 구성원 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명은 추가로 제1 역방위 말단 반복부(ITR), 제2 ITR 및 예를 들어 치료학적 단백질 또는 miRNA를 암호화하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 발현을 필요로 하는 대상체에서 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII를 발현시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR이다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 113 및 120으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 서열 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 기재한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 제공하고, 여기서 1 ITR 및/또는 제2 ITR은 파르보바이러스 B19 또는 거위 파르보바이러스(GPV: goose parvovirus)로부터 유래된다.
본 발명의 예시적 작제물은 첨부된 도면 및 서열 목록에 예시되어 있다. 본 명세서 및 청구범위에 대한 명확한 이해를 제공하기 위해, 다음 정의가 아래에 제공된다.
I. 정의
용어 "하나(a 또는 an)"의 집합체는 하나 이상의 이러한 집합체를 지칭하며, 예를 들어 "핵산 서열"은 하나 이상의 핵산 서열을 나타내는 것으로 이해됨을 주목해야 한다. 유사하게, "치료학적 단백질" 및 "miRNA"는 각각 하나 이상의 치료학적 단백질 및 하나 이상의 miRNA를 나타내도록 이해된다. 그러므로, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 "약"은 대략적으로, 거의, 가량 또는 ~한 정도를 의미하기 위해 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 관련하여 사용되는 경우, 이것은 기재된 수치의 위와 아래로 경계를 확장하여 그 범위를 수식한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 10% 위 또는 아래의(더 높거나 더 낮은) 변량만큼 언급된 값보다 높고 낮은 수치를 수식하도록 사용된다.
본원에 또한 사용된 바와 같이, "및/또는"은 대안("또는")으로 해석될 때 연관된 기재된 항목의 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 및 조합의 결여를 지칭하고 이를 포함한다.
"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드(들) 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 교환가능하게 사용되고, 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 사이티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시타이미딘 또는 데옥시사이티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체 형태, 또는 임의의 이의 포스포에스테르 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 및 티오에스테르(단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 나선)를 지칭한다. 단일 가닥 핵산 서열은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 또는 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 지칭한다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 오직 분자의 1차 및 2차 구조를 의미하고, 이것을 임의의 특정한 3차 형태로 제한하지 않는다. 따라서, 이 용어는 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편)로 특히 발견되는 이중 가닥 DNA, 플라스미드, 초나선형 DNA 및 염색체를 포함한다. 특정한 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 논의하는 데 있어서, 서열은 DNA의 비전사된 가닥(즉, mRNA에 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라 오직 5'에서 3' 방향으로의 서열을 주는 일반 관계에 따라 본원에 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 겪은 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 "핵산 조성물"은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "역방위 말단 반복부"(또는 "ITR")는 단일 가닥 핵산 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치한 핵산 하위서열을 지칭하는데, 이 핵산 서열은 뉴클레오타이드 세트(초기 서열), 이어서 하류에 이의 역상 보체, 즉 회문 서열을 포함한다. 초기 서열과 역상 보체 사이의 뉴클레오타이드의 개재 서열은 0을 포함하는 임의의 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 유용한 ITR은 하나 이상의 "회문 서열"을 포함한다. 임의의 ITR은 임의의 수의 기능을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ITR은 헤어핀 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, ITR은 T 형상 헤어핀 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, ITR은 비-T 형상 헤어핀 구조, 예를 들어 U 형상 헤어핀 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 장기간 생존을 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 (예를 들어, 세포의 전체 수명에 대해) 세포의 핵에서 핵산 분자의 영구적인 생존을 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 안정성을 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 보유를 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 지속성을 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 분해를 억제하거나 방지한다.
일 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 2~600개의 뉴클레오타이드, 약 2~550개의 뉴클레오타이드, 약 2~500개의 뉴클레오타이드, 약 2~450개의 뉴클레오타이드, 약 2~400개의 뉴클레오타이드, 약 2~350개의 뉴클레오타이드, 약 2~300개의 뉴클레오타이드, 또는 약 2~250개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 5~600개의 뉴클레오타이드, 약 10~600개의 뉴클레오타이드, 약 15~600개의 뉴클레오타이드, 약 20~600개의 뉴클레오타이드, 약 25~600개의 뉴클레오타이드, 약 30~600개의 뉴클레오타이드, 약 35~600개의 뉴클레오타이드, 약 40~600개의 뉴클레오타이드, 약 45~600개의 뉴클레오타이드, 약 50~600개의 뉴클레오타이드, 약 60~600개의 뉴클레오타이드, 약 70~600개의 뉴클레오타이드, 약 80~600개의 뉴클레오타이드, 약 90~600개의 뉴클레오타이드, 약 100~600개의 뉴클레오타이드, 약 150~600개의 뉴클레오타이드, 약 200~600개의 뉴클레오타이드, 약 300~600개의 뉴클레오타이드, 약 350~600개의 뉴클레오타이드, 약 400~600개의 뉴클레오타이드, 약 450~600개의 뉴클레오타이드, 약 500~600개의 뉴클레오타이드, 또는 약 550~600개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 5~550개의 뉴클레오타이드, 약 5~500개의 뉴클레오타이드, 약 5~450개의 뉴클레오타이드, 약 5~400개의 뉴클레오타이드, 약 5~350개의 뉴클레오타이드, 약 5~300개의 뉴클레오타이드, 또는 약 5~250개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 10~550개의 뉴클레오타이드, 약 15~500개의 뉴클레오타이드, 약 20~450개의 뉴클레오타이드, 약 25~400개의 뉴클레오타이드, 약 30~350개의 뉴클레오타이드, 약 35~300개의 뉴클레오타이드, 또는 약 40~250개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 225개의 뉴클레오타이드, 약 250개의 뉴클레오타이드, 약 275개의 뉴클레오타이드, 약 300개의 뉴클레오타이드, 약 325개의 뉴클레오타이드, 약 350개의 뉴클레오타이드, 약 375개의 뉴클레오타이드, 약 400개의 뉴클레오타이드, 약 425개의 뉴클레오타이드, 약 450개의 뉴클레오타이드, 약 475개의 뉴클레오타이드, 약 500개의 뉴클레오타이드, 약 525개의 뉴클레오타이드, 약 550개의 뉴클레오타이드, 약 575개의 뉴클레오타이드, 또는 약 600개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 400개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 2~200개의 뉴클레오타이드, 약 5~200개의 뉴클레오타이드, 약 10~200개의 뉴클레오타이드, 약 20~200개의 뉴클레오타이드, 약 30~200개의 뉴클레오타이드, 약 40~200개의 뉴클레오타이드, 약 50~200개의 뉴클레오타이드, 약 60~200개의 뉴클레오타이드, 약 70~200개의 뉴클레오타이드, 약 80~200개의 뉴클레오타이드, 약 90~200개의 뉴클레오타이드, 약 100~200개의 뉴클레오타이드, 약 125~200개의 뉴클레오타이드, 약 150~200개의 뉴클레오타이드, 또는 약 175~200개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 2~150개의 뉴클레오타이드, 약 5~150개의 뉴클레오타이드, 약 10~150개의 뉴클레오타이드, 약 20~150개의 뉴클레오타이드, 약 30~150개의 뉴클레오타이드, 약 40~150개의 뉴클레오타이드, 약 50~150개의 뉴클레오타이드, 약 75~150개의 뉴클레오타이드, 약 100~150개의 뉴클레오타이드, 또는 약 125~150개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 2~100개의 뉴클레오타이드, 약 5~100개의 뉴클레오타이드, 약 10~100개의 뉴클레오타이드, 약 20~100개의 뉴클레오타이드, 약 30~100개의 뉴클레오타이드, 약 40~100개의 뉴클레오타이드, 약 50~100개의 뉴클레오타이드, 또는 약 75~100개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 약 2~50개의 뉴클레오타이드, 약 10~50개의 뉴클레오타이드, 약 20~50개의 뉴클레오타이드, 약 30~50개의 뉴클레오타이드, 약 40~50개의 뉴클레오타이드, 약 3~30개의 뉴클레오타이드, 약 4~20개의 뉴클레오타이드, 또는 약 5~10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 초기 서열 및/또는 역상 보체는 2개의 뉴클레오타이드, 3개의 뉴클레오타이드, 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 6개의 뉴클레오타이드, 7개의 뉴클레오타이드, 8개의 뉴클레오타이드, 9개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 11개의 뉴클레오타이드, 12개의 뉴클레오타이드, 13개의 뉴클레오타이드, 14개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 16개의 뉴클레오타이드, 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 또는 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 다른 구현예에서, 초기 서열과 역상 보체 사이의 개재 뉴클레오타이드는 0개의 뉴클레오타이드, 1개의 뉴클레오타이드, 2개의 뉴클레오타이드, 3개의 뉴클레오타이드, 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 6개의 뉴클레오타이드, 7개의 뉴클레오타이드, 8개의 뉴클레오타이드, 9개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 11개의 뉴클레오타이드, 12개의 뉴클레오타이드, 13개의 뉴클레오타이드, 14개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 16개의 뉴클레오타이드, 17개의 뉴클레오타이드, 18개의 뉴클레오타이드, 19개의 뉴클레오타이드, 또는 20개의 뉴클레오타이드이다(예를 들어, 이들로 이루어진다).
따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "ITR"은 스스로 다시 폴딩하고 이중 가닥 분절을 형성할 수 있다. 예를 들어, 서열 GATCXXXXGATC는 폴딩하여 이중 나선을 형성할 때 GATC의 초기 서열 및 이의 보체(3'CTAG5')를 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 초기 서열과 역상 보체 사이에 연속 회문 서열(예를 들어, GATCGATC)을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 초기 서열과 역상 보체 사이에 중단된 회문 서열(예를 들어, GATCXXXXGATC)을 포함한다. 일부 구현예에서, 연속 또는 중단된 회문 서열의 상보성 분절은 서로 상호작용하여 "헤어핀 루프" 구조를 형성한다. 본원에 사용된 바와 같이 "헤어핀 루프" 구조는 단일 가닥 뉴클레오타이드 분자에서의 적어도 2개의 상보성 서열이 염기 쌍을 이루어 이중 가닥 분절을 형성할 때 생긴다. 일부 구현예에서, 오직 ITR의 일부가 헤어핀 루프를 형성한다. 다른 구현예에서, 전체 ITR은 헤어핀 루프를 형성한다.
본 발명에서, 적어도 하나의 ITR은 비아데노바이러스 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR이다. 소정의 구현예에서, ITR은 바이러스 과 파르보비리다에의 비-AAV 구성원의 ITR이다. 일부 구현예에서, ITR은 데펜도바이러스(Dependovirus) 속 또는 에리트로바이러스(Erythrovirus) 속의 비-AAV 구성원의 ITR이다. 특정 구현예에서, ITR은 거위 파르보바이러스(GPV: goose parvovirus), 머스코비 기러기 파르보바이러스(MDPV: Muscovy duck parvovirus) 또는 에리트로바이러스 파르보바이러스 B19(파르보바이러스 B19, 영장류 에리쓰로파르보바이러스 1, B19 바이러스 및 에리트로바이러스로도 공지됨)의 ITR이다. 소정의 구현예에서, 2개의 ITR의 1개의 ITR은 AAV의 ITR이다. 다른 구현예에서, 작제물에서의 2개의 ITR의 1개의 ITR은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 AAV 혈청형의 ITR이다. 하나의 특정 구현예에서, ITR은 AAV 혈청형 2로부터 유래되고, 예를 들어 AAV 혈청형 2의 ITR이다.
본 발명의 소정의 양태에서, 핵산 분자는 5' ITR 및 3' ITR인 2개의 ITR을 포함하고, 여기서 5' ITR은 핵산 분자의 5' 말단에 위치하고, 3' ITR은 핵산 분자의 3' 말단에 위치한다. 5' ITR 및 3' ITR은 동일한 바이러스 또는 상이한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 소정의 구현예에서, 5' ITR은 AAV로부터 유래되고, 3' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV). 일부 구현예에서, 3' ITR은 AAV로부터 유래되고, 5' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV). 다른 구현예에서, 5' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않고(예를 들어, 비-AAV), 3' ITR은 동일한 또는 상이한 비-AAV 바이러스로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "파르보바이러스"는 비제한적인 예로서 자율 복제 파르보바이러스 및 데펜도바이러스를 포함하는 파르보비리다에 과를 포함한다. 자율적 파르보바이러스는 예를 들어 속 보카바이러스(Bocavirus), 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스(Amdovirus), 파르보바이러스(Parvovirus), 덴소바이러스(Densovirus), 이테라바이러스(Iteravirus), 콘트라바이러스(Contravirus), 아베파르보바이러스(Aveparvovirus), 코피파르보바이러스(Copiparvovirus), 프로토파르보바이러스(Protoparvovirus), 테트라파르보바이러스(Tetraparvovirus), 암비덴소바이러스(Ambidensovirus), 브레비덴소바이러스(Brevidensovirus), 헤판덴소바이러스(Hepandensovirus) 및 펜스틸덴소바이러스(Penstyldensovirus)의 구성원을 포함한다.
예시적인 자율적 파르보바이러스는 돼지 파르보바이러스, 마우스 미세 바이러스, 개과 파르보바이러스, 밍크 장염 바이러스, 소과 파르보바이러스, 닭 파르보바이러스, 고양이과 범백혈구감소증 바이러스, 고양이과 파르보바이러스, 거위 파르보바이러스, H1 파르보바이러스, 머스코비 기러기 파르보바이러스, 뱀 파르보바이러스 및 B19 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 자율적 파르보바이러스는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)] 참고.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "비-AAV"는 파르보비리다에 과의 임의의 아데노 연관된 바이러스(AAV)를 배제하여 파르보비리다에 과로부터의 핵산, 단백질 및 바이러스를 포함한다. "비-AAV"는 속 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스 및 펜스틸덴소바이러스의 자율 복제 구성원을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "아데노 연관된 바이러스"(AAV)는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B를 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소과 AAV, 개과 AAV, 말과 AAV, 양과 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, Gao 등(Gao et al. (J. Virol. 78:6381 (2004)) 및 Moris et al. (Virol. 33:375 (2004))에 의해 개시된 AAV 혈청형 및 계통군, 및 현재 공지되어 있거나 나중에 발견되는 임의의 다른 AAV를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌[FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)] 참고.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유래된"은 규정된 분자 또는 유기체로부터 단리되거나 이를 사용하여 제조된 성분, 또는 규정된 분자 또는 유기체로부터의 정보(예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 제2 핵산 서열(예를 들어, ITR)로부터 유래된 핵산 서열(예를 들어, ITR)은 제2 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 경우에, 유래된 종은 예를 들어 천연 발생 돌연변이유발, 인공 지시 돌연변이유발 또는 인공 랜덤 돌연변이유발에 의해 얻어질 수 있다. 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 유래하도록 사용된 돌연변이유발은 의도적으로 지시되거나 의도적으로 랜덤이거나, 또는 각각의 혼합일 수 있다. 제1로부터 유래된 상이한 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 생성하기 위한 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 돌연변이유발은 랜덤 사건일 수 있고(예를 들어, 중합효소 부정에 의해 야기됨), 유래된 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 확인은 예를 들어 본원에 기술된 적절한 스크리닝 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩타이드의 돌연변이유발은 전형적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 조작을 수반한다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 각각 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, 여기서 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 다른 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 90% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 80% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 70% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 60% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 50% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다.
소정의 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 단편은 적어도 약 5개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 35개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 45개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 50개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 55개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 60개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 65개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 70개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 75개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 80개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 85개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 90개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 95개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 125개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 150개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 175개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 225개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 250개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 275개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 300개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 325개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 350개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 375개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 400개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 425개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 450개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 475개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 500개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 525개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 550개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 575개의 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 600개의 뉴클레오타이드를 포함하고; 여기서 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 소정의 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 단편은 적어도 약 129개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 소정의 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 단편은 적어도 약 102개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다.
일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 단편은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 길이의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%를 포함한다.
소정의 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 적절히 정렬될 때 각각 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 상동성 부분과 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, 여기서 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 다른 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 90% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 80% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 70% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 60% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 50% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다.
"캡시드 비함유" 또는 "캡시드가 적은" 벡터 또는 핵산 분자는 캡시드가 없는 벡터 작제물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 캡시드가 적은 벡터 또는 핵산 분자는 예를 들어 AAV Rep 단백질을 암호화하는 서열을 함유하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 "암호화 영역" 또는 "암호화 서열"은 아미노산으로 번역 가능한 코돈으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드의 부분이다. "종결 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)이 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않더라도, 이것은 암호화 영역의 부분인 것으로 여겨질 수 있지만, 임의의 플랭킹 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 암호화 영역의 부분이 아니다. 암호화 영역의 경계는 전형적으로 생성된 폴리펩타이드의 아미노 말단을 암호화하는 5' 말단에서의 출발 코돈 및 생성된 폴리펩타이드의 카르복실 말단을 암호화하는 3' 말단에서의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 2개 이상의 암호화 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 작제물에서 예를 들어 단일 벡터 상에 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 작제물에서 예를 들어 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 이후, 단일 벡터가 단지 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 암호화 영역을 포함하는 것이 된다.
조면 소포체에 걸쳐 성장하는 단백질 사슬의 배출이 개시되면 포유류 세포에 의해 분비된 소정의 단백질은 성숙 단백질로부터 절단되는 분비 신호 펩타이드와 회합된다. 당업자는 신호 펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N 말단에 융합되고, 완전한 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 절단되어서 폴리펩타이드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성한다는 것을 알고 있다. 소정의 구현예에서, 천연 신호 펩타이드 또는 그 서열의 기능성 유도체는 이것과 작동가능하게 회합된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유한다. 대안적으로, 이종성 포유류 신호 펩타이드, 예를 들어 인간 조직 플라스미노겐 활성자(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제 신호 펩타이드, 또는 이의 기능성 유도체를 사용할 수 있다.
용어 "하류"는 기준 뉴클레오타이드 서열의 3'에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 하류 뉴클레오타이드 서열은 전사의 출발점 뒤의 서열과 관련된다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 하류에 위치한다.
용어 "상류"는 기준 뉴클레오타이드 서열의 5'에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 상류 뉴클레오타이드 서열은 암호화 영역의 5'측 또는 전사의 출발점에 위치한 서열과 관련된다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사의 시작 부위의 상류에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유전자 조절 영역" 또는 "조절 영역"은 암호화 영역의 상류(5' 비암호화 서열)에, 그 영역 내에 또는 그 영역의 하류(3' 비암호화 서열)에 위치하고, 회합된 암호화 영역의 전사, RNA 프로세싱, 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위 또는 줄기-루프 구조를 포함할 수 있다. 암호화 영역이 진핵 세포에서의 발현을 위해 의도되는 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 보통 암호화 서열의 3'에 위치할 것이다.
miRNA 또는 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩타이드, 예컨대 치료학적 단백질)과 같은 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 암호화 영역과 작동가능하게 회합된 프로모터 및/또는 다른 발현(예를 들어, 전사 또는 번역) 제어 요소를 포함할 수 있다. 작동가능한 회합에서, 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩타이드에 대한 암호화 영역은 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 두는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 회합된다. 예를 들어, 암호화 영역 및 프로모터는, 프로모터 기능의 유도가 암호화 영역에 의해 암호화된 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 일으키는 경우, 및 프로모터와 암호화 영역 사이의 연결의 성질이 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하거나 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 회합"된 것이다. 프로모터 외에 다른 발현 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 또한 유전자 산물 발현을 지시하도록 암호화 영역과 작동가능하게 회합될 수 있다.
"전사 제어 서열"은 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서, 종결자 등과 같은 DNA 조절 서열을 지칭한다. 다양한 전사 제어 영역은 당업자에게 공지되어 있다. 이것은, 제한 없이, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 함께인 극초기 프로모터), 시미안 바이러스 40(초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예컨대, 라우스 육종 바이러스)(이에 한정되지 않음)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편을 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 액틴, 열 쇼크 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유래된 것, 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서, 및 림포카인 유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소는 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 이들은, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코나바이러스에서 유래된 요소(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, 또는 IRES))를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생산하는 과정을 지칭한다. 이것은 제한 없이 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA(tRNA), 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 소형 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 폴리뉴클레오타이드의 전사, 및 폴리펩타이드로의 mRNA의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에 사용된 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생산된 메신저 RNA 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 기술된 유전자 산물은 전사 후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산 또는 번역 후 변형, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 아단위와의 회합 또는 단백질분해 절단을 갖는 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "수율"은 유전자의 발현에 의해 생성된 폴리펩타이드의 양을 지칭한다.
"벡터"는 숙주 세포로의 핵산의 운반 및/또는 클로닝을 위한 임의의 비히클을 지칭한다. 벡터는 부착된 분절의 복제를 발생시키도록 다른 핵산 분절이 부착될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체내 복제의 자율 단위로서 기능을 하는, 즉 그 자체의 제어 하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관내, 세포외 또는 생체내 세포로 핵산을 도입하기 위한 비히클을 포함한다. 많은 수의 벡터는 당업계에서 공지되고 사용되며, 이는 예를 들어 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함한다. 적합한 벡터로의 폴리뉴클레오타이드의 삽입은 상보성 응착성 말단을 갖는 선택된 벡터로 적절한 폴리뉴클레오타이드 단편을 결찰하여 달성될 수 있다.
벡터는 벡터가 혼입된 세포의 선택 또는 확인을 제공하는 선별 마커 또는 리포터를 암호화하도록 조작될 수 있다. 선별 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 함유된 다른 암호화 영역이 혼입되고 이를 발현하는 숙주 세포의 확인 및/또는 선택을 허용한다. 당업계에 공지되고 사용된 선별 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙타비딘, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라아제 유전자 등을 포함한다. 당업계에 공지되고 사용된 리포터의 예는 루시퍼라아제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-갈락토시다아제(LacZ), β-글루쿠로니다아제(Gus) 등을 포함한다. 선별 마커는 또한 리포터인 것으로 생각될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "숙주 세포"는 예를 들어 ssDNA 또는 벡터일 수 있거나 이었거나 이의 수혜자로 사용되는 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 지칭한다. 상기 용어는 형질도입된 원래의 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질도입된 세포를 나타낸다. 단일 모 세포의 자손이 자연적, 우연한 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 부모에 대한 게놈 또는 총 DNA 보체에서 또는 형태에서 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다고 이해된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 시험관내 숙주 세포일 수 있다.
용어 "선별 마커"는 확인 인자, 보통 마커 유전자의 효과(즉 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성)에 기초하여 선택될 수 있는 항생제 또는 화학물질 내성 유전자, 비색 마커, 효소, 형광 마커 등을 의미하고, 여기서 효과는 관심 핵산의 유전성을 추적하고/하거나, 관심 핵산이 유전된 세포 또는 유기체를 확인하도록 사용된다. 당업계에 공지되고 사용된 선별 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙타비딘, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라아제 유전자 등을 포함한다.
용어 "리포터 유전자"는 리포터 유전자의 효과에 기초하여 확인될 수 있는 확인 인자를 암호화하는 핵산을 지칭하고, 여기서 효과는 관심 핵산의 유전성을 추적하고/하거나, 관심 핵산이 유전된 세포 또는 유기체를 확인하고/하거나, 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하도록 사용된다. 당업계에 공지되고 사용된 리포터 유전자의 예는 루시퍼라아제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-갈락토시다아제(LacZ), β-글루쿠로니다아제(Gus) 등을 포함한다. 선별 마커 유전자는 또한 리포터 유전자인 것으로 생각될 수 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 상호교환가능하게 사용되고, 암호화 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 암호화 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 분절을 포함할 수 있다. 당업계의 숙련자에 의해 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경학적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다고 이해된다. 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 대부분의 때에 "구성적 프로모터"라 흔히 칭해진다. 특이적 세포 유형에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 "세포 특이적 프로모터" 또는 "조직 특이적 프로모터"라 흔히 칭해진다. 특정한 발생 또는 세포 분화 단계에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 "발생적 특이적 프로모터" 또는 "세포 분화 특이적 프로모터"라 흔히 칭해진다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 광 등에 의한 세포의 노출 또는 처리 후 유전자가 발현되게 하거나 유도되는 프로모터는 "유도성 프로모터" 또는 "조절 가능한 프로모터"라 흔히 칭해진다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 한정되지 않으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 추가로 인식된다.
프로모터 서열은 전형적으로 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 결합되고, 배경 위의 검출 가능한 수준에서 전사를 개시시키기 위해 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함하도록 상류(5' 방향)로 연장한다. (편리하게는 예를 들어 뉴클레아제 S1에 의한 맵핑에 의해 한정된) 전사 개시 부위, 및 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(공통 서열)이 프로모터 서열 내에서 발견될 것이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 소정의 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 간, 예를 들어 간세포 및/또는 내피 세포에서 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자의 발현을 유도한다. 특정 구현예에서, 프로모터는 마우스 타이레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 VIII 인자 프로모터(F8), 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간 특이적 프로모터(예를 들어, α1-안티트립신(AAT)), 근육 특이적 프로모터(예를 들어, 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB) 및 데스민(DES)), 합성 프로모터(예를 들어, SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK 및 tMCK) 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된다. 하나의 특정 구현예에서, 프로모터는 TTP 프로모터를 포함한다.
용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 상호교환가능하게 사용되고, 이중 가닥 DNA 내의 특이적 뉴클레오타이드 서열에 결합하여 그 내부를 절단하는 효소를 지칭한다.
용어 "플라스미드"는 보통 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태의 세포의 중추 대사의 부분이 아닌 유전자를 흔히 운반하는 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원로부터 유래된, 선형, 원형 또는 초나선형, 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오타이드 서열일 수 있는데, 여기서 세포로 적절한 3' 비번역된 서열을 따라 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열 및 프로모터 단편을 도입할 수 있는 독특한 작제물로 다수의 뉴클레오타이드 서열이 연결되거나 재조합된다.
사용될 수 있는 진핵 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노 관련된 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터, 예를 들어 우두 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 또는 헤르페스바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비바이러스성 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질(시토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 바이폴리머(bipolymer)를 포함한다.
"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제하는 핵산의 단위 길이이고, 부착된 분절의 복제를 발생시키도록 다른 핵산 분절이 부착할 수 있는 복제 기점, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 포함하는 "레플리콘"을 지칭한다. 소정의 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형, 예를 들어 박테리아에서의 복제 및 다른, 예를 들어 진핵 세포에서의 발현을 할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터를 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 관심 핵산 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 다수의 클로닝 부위를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포로의 삽입 후 삽입된 핵산 서열의 발현을 허용하도록 설계된 비히클을 지칭한다. 삽입된 핵산 서열은 상기 기술된 바와 같은 조절 영역과 회합되어 작동가능하게 위치한다.
벡터는 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 형질감염, 전기천공, 미량주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 운반체에 의해 숙주 세포로 도입된다. 본원에 사용된 바와 같이 "배양", "에 대한 배양" 및 "배양하는"은 세포 성장 또는 분열을 허용하는 시험관내 조건 하에 세포를 배양하거나, 세포를 살아 있는 상태로 유지시키는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이 "배양된 세포"는 시험관내 증식되는 세포를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리펩타이드"는 단일 "폴리펩타이드", 및 복수의 "폴리펩타이드들"을 포함하도록 의도되고, 아미드 결합(펩타이드 결합으로도 공지됨)에 의해 직선으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 의미한다. 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 의미하고, 그 산물의 특정한 길이를 의미하지 않는다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 의미하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 이것과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 제한 없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 천연 비발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 산물을 의미하는 것으로 또한 의도된다. 폴리펩타이드는 천연의 생물학적 공급원 또는 제조된 재조합 기술로부터 유래될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되지는 않는다. 이것은 화학 합성을 포함하는 임의의 방식에 의해 생성될 수 있다.
용어 "아미노산"은 알라닌(Ala 또는 A); 아르기닌(Arg 또는 R); 아스파라긴(Asn 또는 N); 아스파르트산(Asp 또는 D); 시스테인(Cys 또는 C); 글루타민(Gln 또는 Q); 글루탐산(Glu 또는 E); 글리신(Gly 또는 G); 히스티딘(His 또는 H); 이소류신(Ile 또는 I): 류신(Leu 또는 L); 리신(Lys 또는 K); 메티오닌(Met 또는 M); 페닐알라닌(Phe 또는 F); 프롤린(Pro 또는 P); 세린(Ser 또는 S); 트레오닌(Thr 또는 T); 트립토판(Trp 또는 W); 티로신(Tyr 또는 Y); 및 발린(Val 또는 V)을 포함한다. 비전통적인 아미노산은 또한 본 발명의 범위 내에 있고, 노르류신, 오미틴, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 문헌[Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기술된 것을 포함한다. 이러한 천연 비발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌[Noren et al. Science 244:182 (1989)] 및 상기 Ellman 등의 문헌의 절차를 이용할 수 있다. 간단히 말하면, 이 절차는 천연 비발생 아미노산 잔기에 의한 억제자 tRNA의 화학 활성화, 이어서 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다. 비전통적인 아미노산의 도입은 당업계에 공지된 펩타이드 화학을 이용하여 또한 달성될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "극성 아미노산"은 0의 순 전하를 갖지만 이의 측쇄의 상이한 부분에서 0이 아닌 부분 전하를 갖는 아미노산(예를 들어, M, F, W, S, Y, N, Q, C)을 포함한다. 이 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기 상호작용에 참여할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "하전된 아미노산"은 이의 측쇄에서 0이 아닌 순 전하를 가질 수 있는 아미노산(예를 들어, R, K, H, E, D)을 포함한다. 이 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기 상호작용에 참여할 수 있다.
폴리펩타이드의 단편 또는 변이체, 및 임의의 이들의 조합이 본 발명에 또한 포함된다. 용어 "단편" 또는 "변이체"는, 본 발명의 폴리펩타이드 결합 도메인 또는 결합 분자를 지칭할 때, 기준 폴리펩타이드의 적어도 약간의 특성(예를 들어, FcRn 결합 도메인 또는 Fc 변이체에 대한 FcRn 결합 친화도, FVIII 변이체에 대한 응고 활성 또는 VWF 단편에 대한 FVIII 결합 활성)을 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드의 단편은 본원에서 어딘가에 기술된 특이적 항체 단편 이외에 단백질분해 단편, 및 결실 단편을 포함하지만, 천연 발생 전장 폴리펩타이드(또는 성숙 폴리펩타이드)를 포함하지 않는다. 본 발명의 폴리펩타이드 결합 도메인 또는 결합 분자의 변이체는 상기 기술된 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체는 천연 또는 천연 비발생일 수 있다. 천연 비발생 변이체는 분야 공지된 돌연변이유발 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판)을 포함하여 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군이 당업계에 정의되었다. 따라서, 폴리펩타이드에서의 아미노산이 동일한 측쇄 군 유래의 다른 아미노산으로 대체되는 경우, 이 치환은 보존적인 것으로 여겨진다. 다른 구현예에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 군 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로는 유사한 스트링으로 보존적으로 대체될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이 용어 "동일성 백분율"은, 서열을 비교하여 결정된 바와 같은, 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한, 이러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된 바와 같이, 그 경우에서처럼, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 비제한적인 예로서 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기술된 것을 포함하는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 최고의 일치를 주도록 설계된다. 동일성을 결정하기 위한 방법은 공공으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산은 서열 분석 소프트웨어, 예컨대 LASERGENE bioinformaticscomputing suite의 Megalign 프로그램(DNASTAR Inc.(위스콘신주 매디슨)), 프로그램의 GCG 스위트(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group(GCG)(위스콘신주 매디슨)), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)) 및 DNASTAR(DNASTAR, Inc.(미국 위스콘신주 53715 매디슨 스트리트 에스. 파크 1228))을 이용하여 수행될 수 있다. 본 출원의 맥락 내에, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 분석의 이 결과가, 달리 기술되지 않는 한, 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초한다고 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 "디폴트 값"은 처음에 초기설정될 때 소프트웨어에 의해 원래 로딩하는 값 또는 매개변수의 임의의 세트를 의미할 것이다. 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 본 발명의 서열과 기준 서열 사이의 동일성(%)을 결정할 목적을 위해, 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 본 발명의 서열에서 뉴클레오타이드에 상응하는 기준 서열에서 뉴클레오타이드만이 동일성(%)을 계산하도록 사용된다. 예를 들어, B 도메인을 함유하는 전장 FVIII 뉴클레오타이드 서열을 본 발명의 최적화된 B 도메인 결실된(BDD) FVIII 뉴클레오타이드 서열과 비교할 때, A1, A2, A3, C1 및 C2 도메인을 포함하는 정렬의 부분은 동일성(%)을 계산하도록 사용될 것이다. (정렬에서의 큰 "갭"을 생성시키는) B 도메인을 암호화하는 전장 FVIII 서열의 부분에서의 뉴클레오타이드는 미스매치로서 계산되지 않을 것이다. 부가적으로, 본 발명의 최적화된 BDD FVIII 서열, 또는 이의 지정된 부분(예를 들어, 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374)과 기준 서열 사이의 동일성(%)을 결정하는 데 있어서, 동일성(%)은 본원에 언급된 바와 같은 최적화된 BDD-FVIII 서열, 또는 이의 지정된 부분의 완전한 서열에서의 뉴클레오타이드의 전체 수로 일치된 뉴클레오타이드의 수를 나눈 것을 정렬하여 계산될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 특정 서열에서의 뉴클레오타이드에 상응하는 뉴클레오타이드는 기준 서열과의 동일성을 최대화하기 위해 본 발명의 서열의 정렬에 의해 확인된다. 기준 서열에서의 동등한 아미노산을 확인하기 위해 사용된 수는 본 발명의 서열에서의 상응하는 아미노산을 확인하기 위해 사용된 수에 기초한다.
"융합" 또는 "키메라" 단백질은 성질상 자연에서 연결되지 않는 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 의미한다. 별개의 단백질에 보통 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩타이드에 함께 놓일 수 있거나, 동일한 단백질에 보통 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩타이드에서의 새로운 배열에, 예를 들어 Ig Fc 도메인에 의한 본 발명의 VIII 인자 도메인의 융합에 위치할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어 화학 합성에 의해 또는 펩타이드 영역이 원하는 관계에서 암호화된 폴리뉴클레오타이드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 키메라 단백질은 공유, 비펩타이드 결합 또는 비공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "삽입 부위"는 이종성 모이어티가 삽입될 수 있는 위치의 바로 상류인 폴리펩타이드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에서의 위치를 의미한다. "삽입 부위"는 수로 규정되는데, 그 수는 기준 서열에서의 아미노산의 수이다. 예를 들어, FVIII에서의 "삽입 부위"는 삽입의 위치에 바로 N 말단인, 삽입 부위가 상응하는, 성숙 천연 FVIII(서열 번호 15)에서의 아미노산 서열의 수를 지칭한다. 예를 들어, 구절 "a3은 서열 번호 15의 1656번 아미노산에 상응하는 삽입 부위에서 이종성 모이어티를 포함한다"는 이종성 모이어티가 서열 번호 15의 1656번 아미노산 및 1657번 아미노산에 상응하는 2개의 아미노산 사이에 위치한다는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 구절 "아미노산의 바로 하류"는 아미노산의 말단 카복실기의 바로 옆의 위치를 지칭한다. 유사하게, 구절 "아미노산의 바로 상류"는 아미노산의 말단 아민기의 바로 옆의 위치를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "삽입된", "삽입된다", "로 삽입된" 또는 문법적으로 관련된 용어는 모 폴리펩타이드에서 유사한 위치에 대해 폴리펩타이드, 예를 들어 응고 인자에서 이종성 모이어티의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, "삽입된" 및 기타는 천연 성숙 인간 FVIII에서의 유사한 위치에 대한 재조합 FVIII 폴리펩타이드에서의 이종성 모이어티의 위치를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 이들 용어는 폴리펩타이드의 특성을 지칭하며, 폴리펩타이드가 만들어지는 임의의 방법 또는 단계를 나타내거나, 암시하거나, 추론하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "반감기"는 생체내 특정 폴리펩타이드의 생물학적 반감기를 지칭한다. 반감기는 순환에서 청소되는 대상체 및/또는 동물에서의 다른 조직에 투여되는 분량의 절반에 필요한 시간으로 표시될 수 있다. 소정의 폴리펩타이드의 청소율 곡선이 시간의 함수로서 작도될 때, 곡선은 보통 신속한 α-상 및 더 긴 β-상에 의해 이상성이다. α-상은 전형적으로 혈관내 공간과 혈관외 공간 사이의 투여된 Fc 폴리펩타이드의 평형을 나타내고, 부분적으로 폴리펩타이드의 크기에 의해 결정된다. β-상은 전형적으로 혈관내 공간에서의 폴리펩타이드의 이화작용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 및 이를 포함하는 키메라 단백질은 단상성이고, 이에 따라 알파 상을 갖지 않고, 단지 단일 베타 상을 갖는다. 따라서, 소정의 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같이 용어 반감기는 β-상에서의 폴리펩타이드의 반감기를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "연결된"은 각각 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 공유로 또는 비공유로 연결된 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 제2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에 직접적으로 연결되거나 병치될 수 있거나, 대안적으로 개재 서열은 제1 서열을 제2 서열에 공유로 연결할 수 있다. 용어 "연결된"은 C 말단 또는 N 말단에서의 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 융합을 의미할 뿐만 아니라, 제2 아미노산 서열(또는 각각 제1 아미노산 서열)에서의 임의의 2개의 아미노산으로의 전체 제1 아미노산 서열(또는 제2 아미노산 서열)의 삽입을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 아미노산 서열은 펩타이드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 제1 뉴클레오타이드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(폴리펩타이드 사슬의 경우) 또는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 사슬(뉴클레오타이드 사슬의 경우) 또는 임의의 화학 모이어티(폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 사슬 둘 다의 경우)일 수 있다. 용어 "연결된"은 또한 하이폰(-)으로 표시된다.
본원에 사용된 바와 같이 지혈은 출혈 또는 대출혈의 중지 또는 느려짐; 또는 혈관 또는 신체 부분을 통한 혈류의 중지 또는 느려짐을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 지혈 장애는 자발적으로 또는 외상의 결과로서, 피브린 혈전을 형성하는 것의 손상된 능력 또는 불능으로 인해 대출혈에 대한 경향을 특징으로 하는 유전적인 선천적 또는 후천적 병태를 의미한다. 이러한 장애의 예는 혈우병을 포함한다. 3개의 주요 형태는 A 혈우병(VIII 인자 결핍증), B 혈우병(인자 IX 결핍증 또는 "크리스마스병(Christmas disease)") 및 C 혈우병(XI 인자 결핍증, 경증 출혈 경향)이다. 다른 지혈 장애는 예를 들어 폰 빌레브란트 질환, XI 인자 결핍증(PTA 결핍증), XII 인자 결핍증, 피브리노겐, 프로트롬빈, V 인자, VII 인자, X 인자 또는 XIII 인자에서의 결핍증 또는 구조적 비정상, GPIb에서의 결함 또는 결핍증인 베르나르-술리에(Bernard-Soulier) 증후군을 포함한다. vWF에 대한 수용체인 GPIb는 결함성일 수 있고, 1차 혈전 형성(1차 지혈)의 부족 및 증가한 출혈 경향, 및 글랜즈먼(Glanzman) 및 네젤리(Naegeli)의 혈소판기능저하증(글랜즈먼 혈소판기능저하증)을 발생시켰다. 간부전(급성 및 만성 형태)에서, 간에 의해 응고 인자가 불충분하게 생성되고; 이는 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.
단리된 핵산 분자, 단리된 폴리펩타이드 또는 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터가 예방적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "예방적 치료"는 출혈 에피소드 전의 분자의 투여를 지칭한다. 일 구현예에서, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 수술을 받고 있거나 곧 받을 예정이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 벡터는 예방적으로 수술 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 벡터는 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제, 치과 시술 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 단리된 핵산 분자, 단리된 폴리펩타이드 또는 벡터는 대증적 치료에 또한 사용된다. 용어 "대증적 치료"는 출혈 에피소드의 증상에 반응한 또는 출혈을 야기할 수 있는 활동 전의 단리된 핵산 분자, 단리된 폴리펩타이드 또는 벡터의 투여를 지칭한다. 일 양태에서, 대증적 치료는 출혈이 시작할 때, 예컨대 손상 후 또는 출혈이 예상될 때, 예컨대 수술 전 대상체에게 주어질 수 있다. 다른 양태에서, 대증적 치료는 접촉 스포츠와 같은 출혈의 위험을 증가시키는 활동 전에 주어질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "급성 출혈"은 기초 원인과 무관하게 출혈 에피소드를 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 외상, 요독증, 유전성 출혈 장애(예를 들어, VII 인자 결핍증) 혈소판 장애 또는 응고 인자에 대한 항체의 발생으로 인한 내성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 치료한다, 치료, 치료하는 것은 예를 들어 질환 또는 병태의 중증도의 감소; 질환 과정의 기간의 감소; 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 경감; 질환 또는 병태를 반드시 치유할 필요 없이 질환 또는 병태를 갖는 대상체에 대한 유리한 효과의 제공; 또는 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 예방책을 의미한다. 일 구현예에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 본 발명의 단리된 핵산 분자, 단리된 폴리펩타이드 또는 벡터를 투여하여 대상체에서 예를 들어 적어도 약 1 IU/㎗, 2 IU/㎗, 3 IU/㎗, 4 IU/㎗, 5 IU/㎗, 6 IU/㎗, 7 IU/㎗, 8 IU/㎗, 9 IU/㎗, 10 IU/㎗, 11 IU/㎗, 12 IU/㎗, 13 IU/㎗, 14 IU/㎗, 15 IU/㎗, 16 IU/㎗, 17 IU/㎗, 18 IU/㎗, 19 IU/㎗, 20 IU/㎗, 25 IU/㎗, 30 IU/㎗, 35 IU/㎗, 40 IU/㎗, 45 IU/㎗, 50 IU/㎗, 55 IU/㎗, 60 IU/㎗, 65 IU/㎗, 70 IU/㎗, 75 IU/㎗, 80 IU/㎗, 85 IU/㎗, 90 IU/㎗, 95 IU/㎗, 100 IU/㎗, 105 IU/㎗, 110 IU/㎗, 115 IU/㎗, 120 IU/㎗, 125 IU/㎗, 130 IU/㎗, 135 IU/㎗, 140 IU/㎗, 145 IU/㎗, 또는 150 IU/㎗의 FVIII 트로프 수준을 유지시키는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, 치료하는 또는 치료는 약 1 내지 약 150 IU/㎗, 약 1 내지 약 125 IU/㎗, 약 1 내지 약 100 IU/㎗, 약 1 내지 약 90 IU/㎗, 약 1 내지 약 85 IU/㎗, 약 1 내지 약 80 IU/㎗, 약 1 내지 약 75 IU/㎗, 약 1 내지 약 70 IU/㎗, 약 1 내지 약 65 IU/㎗, 약 1 내지 약 60 IU/㎗, 약 1 내지 약 55 IU/㎗, 약 1 내지 약 50 IU/㎗, 약 1 내지 약 45 IU/㎗, 약 1 내지 약 40 IU/㎗, 약 1 내지 약 35 IU/㎗, 약 1 내지 약 30 IU/㎗, 약 1 내지 약 25 IU/㎗, 약 25 내지 약 125 IU/㎗, 약 50 내지 약 100 IU/㎗, 약 50 내지 약 75 IU/㎗, 약 75 내지 약 100 IU/㎗, 약 1 내지 약 20 IU/㎗, 약 2 내지 약 20 IU/㎗, 약 3 내지 약 20 IU/㎗, 약 4 내지 약 20 IU/㎗, 약 5 내지 약 20 IU/㎗, 약 6 내지 약 20 IU/㎗, 약 7 내지 약 20 IU/㎗, 약 8 내지 약 20 IU/㎗, 약 9 내지 약 20 IU/㎗, 또는 약 10 내지 약 20 IU/㎗의 FVIII 트로프 수준을 유지시키는 것을 의미한다. 질환 또는 병태의 치료 또는 치료하는 것은 또한 대상체에서의 FVIII 활성을 비혈우병 대상체에서의 FVIII 활성의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145% 또는 150%에 필적하는 수준으로 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 치료에 필요한 최소 트로프 수준은 하나 이상의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있고, 각각의 사람에 대해 조정(증가 또는 감소)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "투여하는"은 약제학적으로 허용 가능한 경로를 통해 대상체에게 약제학적으로 허용 가능한 핵산 분자, 이로부터 발현된 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 주는 것을 의미한다. 투여 경로는 정맥내, 예를 들어 정맥내 주사 및 정맥내 점적주사일 수 있다. 추가의 투여 경로는 예를 들어 피하, 근육내, 경구, 비강 및 폐 투여를 포함한다. 핵산 분자, 폴리펩타이드 및 벡터는 적어도 하나의 부형제를 포함하는 제약 조성물의 부분으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 인간에게 투여될 때 생리학적으로 관용성이고 소화불량, 현기증 등과 같은 독성 또는 알레르기 또는 유사한 뜻밖의 반응을 전형적으로 생성하지 않는 분자 집합체 및 조성물을 지칭한다. 선택적으로, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "약학적으로 허용되는"은 연방정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되어 있거나 미국 약전(U.S. Pharmacopeia), 또는 동물에서의, 그리고 더 상세하게는 인간에서의 사용에 대한 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거되어 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 구절 "이를 필요로 하는 대상체"는, 예를 들어 지혈을 개선하도록, 본 발명의 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 벡터의 투여로부터 이익일 수 있는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다. 일 구현예에서, 대상체는 혈우병을 갖는 개체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 구현예에서, 대상체는 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII에 대한 억제제를 개발하고, 이에 따라 우회 치료를 필요로 하는 개체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 대상체는 성인 또는 미성년자(예를 들어, 12세 미만)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "치료학적 단백질"은 대상체에게 투여될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 응고 인자, 성장 인자, 항체, 이의 기능적 단편, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "응고 인자"는 대상체에서의 출혈 에피소드를 예방하거나 이의 기간을 감소시키는, 천연 발생 또는 재조합으로 생산된, 분자 또는 이의 유사체를 지칭한다. 바꾸어 말하면, 이것은 응고촉진 활성을 갖는 분자를 의미하고, 즉 혈액이 응고되거나 혈전형성하도록 불용성 피브린의 그물망으로의 피브리노겐의 전환을 담당한다. 본원에 사용된 바와 같이 "응고 인자"는 활성화된 응고 인자, 이의 지모겐, 또는 활성화 가능한 응고 인자를 포함한다. "활성화 가능한 응고 인자"는 활성 형태로 전환될 수 있는 불활성 형태(예를 들어, 이의 지모겐 형태)의 응고 인자이다. 용어 "응고 인자"는 I 인자(FI), II 인자(FII), V 인자(FV), FVII, FVIII, FIX, X 인자(FX), XI 인자(FXI), XII 인자(FXII), XIII 인자(FXIII), 폰 빌레브란트 인자(VWF), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐, 피브로넥틴, 안티트롬빈 III, 헤파린 보인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제(ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-안티플라스민, 조직 플라스미노겐 활성자(tPA), 유로키나제, 플라스미노겐 활성자 억제제-1 (PAI-1), 플라스미노겐 활성자 억제제-2(PAI2), 이의 지모겐, 이의 활성화 형태, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 응고 활성은 피브린 혈전의 형성에서 절정을 이루고/이루거나, 대출혈 또는 출혈 에피소드의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키는 생화학적 반응의 캐스케이드에 참여하는 능력을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 "성장 인자"는 사이토카인 및 호르몬을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 성장 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 아드레노메둘린(AM), 안지오포이에틴(Ang), 자가분비 운동 인자, 골 형태발생 단백질(BMP)(예를 들어, BMP2, BMP4, BMP5, BMP7), 섬모 신경영양 인자 패밀리 구성원(예를 들어, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터류킨-6(IL-6)), 콜로니 자극 인자(예를 들어, 대식세포 콜로니 자극 인자(m-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)), 표피 성장 인자(EGF), 에프린(예를 들어, 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3), 에리쓰로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자(FGF)(예를 들어, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23), 소 태아 소마토트로핀(FBS), GDNF 패밀리 구성원(예를 들어, 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 퍼세핀, 아르테민), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간세포암 유래 성장 인자(HDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(예를 들어, 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 또는 IGF-2, 인터류킨(IL)(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7), 각질세포 성장 인자(KGF), 이동 자극 인자(MSF), 대식세포 자극 단백질(MSP 또는 간세포 성장 인자-유사 단백질(HGFLP)), 마이오스타틴(GDF-8), 뉴레귤린(예를 들어, 뉴레귤린 1(NRG1), NRG2, NRG3, NRG4), 뉴트로트로핀(예를 들어, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴트로트로핀-3(NT-3), NT-4, 태반 성장 인자(PGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 레날라아제(RNLS), T-세포 성장 인자(TCGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자(예를 들어, 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), TGF-β, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 디스트로핀 X 연관, MTM1(마이오튜불라린), 티로신 수산화효소, AADC, 사이클로하이드롤라아제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다아제), 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 유전자에 의해 암호화된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "이종성" 또는 "외인성"은 주어진 환경, 예를 들어 세포 또는 폴리펩타이드에서 보통 발견되지 않는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 외인성 또는 이종성 분자는 세포로 도입될 수 있고, 예를 들어 형질감염 또는 유전자 조작의 다른 형태에 의해 세포의 조작 후 오직 존재하거나, 이종성 아미노산 서열은 이것이 자연에서 발견되지 않는 단백질에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "이종성 뉴클레오타이드 서열"은 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 자연에서 발생하지 않는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII의 반감기를 연장할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 구현예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII의 유체역학 반경을 증가시키는 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 구현예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열은 이의 생물학적 활성 또는 기능(예를 들어, 응혈 활성)에 유의미하게 영향을 미치지 않으면서 치료학적 단백질의 하나 이상의 약동역학 특성을 개선하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 링커에 의해 이종성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 결합되거나 연결된다. 이종성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드 모이어티의 비제한적인 예는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분, 알부민 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, 트랜스페린, 미국 특허 출원 20100292130호의 PAS 폴리펩타이드, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 아단위의 C 말단 펩타이드(CTP), 알부민 결합 소분자, XTEN 서열, FcRn 결합 모이어티(예를 들어, FcRn에 결합하는 완전한 Fc 영역 또는 이의 부분), 단쇄 Fc 영역(예를 들어, US 2008/0260738호, WO 2008/012543호 또는 WO 2008/1439545호에 기술된 바와 같은 ScFc 영역), 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 펩타이드 및 무엇보다도 50% 미만 내지 50% 초과의 다양한 정도의 2차 구조를 갖는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택된 아미노산의 2개의 유형의 6개 내지 40개의 아미노산의 짧은 폴리펩타이드, 또는 2개 이상의 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 비폴리펩타이드 모이어티에 연결된다. 비폴리펩타이드 모이어티의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 알부민 결합 소분자, 폴리시알산, 하이드록시에틸 전분(HES), 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "Fc 영역"은 천연 Ig의 Fc 영역에 상응하는 폴리펩타이드의 부분, 즉 이의 2개의 중쇄의 각각의 Fc 도메인의 이량체 회합에 의해 형성된 것으로 정의된다. 천연 Fc 영역은 다른 Fc 영역과 동종이량체를 형성한다. 반대로, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "유전자 융합된 Fc 영역" 또는 "단쇄 Fc 영역"(scFc 영역)은 단일 폴리펩타이드 사슬 내의 유전자 연결된(즉, 단일 연접 유전자 서열 형태로 코딩된) Fc 도메인들로 이루어진 합성 이량체 Fc 영역을 지칭한다.
일 구현예에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG 내의 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기가 114인 것으로 함)의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하여 항체의 C 말단에서 종료되는 단일 Ig 중쇄의 일부를 지칭한다. 따라서, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
Ig 불변 영역의 Fc 영역은, Ig 아이소타입에 따라, CH2, CH3 및 CH4 도메인, 및 힌지 영역을 포함할 수 있다. Ig의 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은 증가한 안정성, 증가한 혈청 반감기(문헌[Capon et al., 1989, Nature 337:525] 참조), 및 Fc 수용체, 예컨대 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합(미국 특허 6,086,875호, 6,485,726호, 6,030,613호; WO 03/077834호; US2003-0235536A1호)(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)을 포함하는 키메라 단백질에 대한 여러 원하는 특성을 부여한다.
“기준 뉴클레오타이드 서열"은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 대한 비교로서 본원에 사용될 때, 서열이 최적화되지 않는다는 것을 제외하고는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 본질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 예를 들어, 서열 번호 1의 코돈 최적화된 BDD FVIII 및 이의 3' 말단에서 서열 번호 1에 연결된 단일 가닥 Fc 영역을 암호화하는 이종성 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자에 대한 기준 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16의 원래의(또는 "모") BDD FVIII 및 이의 3' 말단에서 서열 번호 16에 연결된 단일 가닥 Fc 영역을 암호화하는 동일한 이종성 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자이다.
본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 서열과 관련하여, 용어 "최적화된"은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭하고, 여기서 폴리뉴클레오타이드 서열은 그 폴리뉴클레오타이드 서열의 특성을 증대시키도록 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 최적화는 전사 수준을 증가시키거나, 번역 수준을 증가시키거나, 정상 상태 mRNA 수준을 증가시키거나, 조절 단백질, 예컨대 일반적인 전사 인자의 결합을 증가시키거나 감소시키거나, 스플라이싱을 증가시키거나 감소시키거나, 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 생성된 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기 위해 수행된다. 폴리뉴클레오타이드 서열을 최적화하기 위해 이것에 이루어질 수 있는 변경의 예는 코돈 최적화, G/C 함량 최적화, 반복 서열의 제거, AT 풍부 요소의 제거, 은성(cryptic) 스플라이스 부위의 제거, 전사 또는 번역을 억제하는 시스 작용성 요소의 제거, 폴리-T 또는 폴리-A 서열의 부가 또는 제거, 전사를 향상시키는 전사 시작 부위 주의의 서열, 예컨대 Kozak 공통 서열의 부가, 줄기 루프 구조를 형성하는 서열의 제거, 불안정화 서열의 제거, 및 2개 이상의 이들의 조합을 포함한다.
II. 핵산 분자
본 발명은 표적 서열을 암호화하는 플라스미드 유사, 캡시드 비함유, 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질 또는 miRNA와 같은 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 유전자를 암호화한다. 바이러스의 단백질 외피인 캡시드는 바이러스의 유전 재료를 둘러싼다. 캡시드는 바이러스 게놈을 보호하고, 게놈을 숙주에 전달하고, 숙주와 상호작용하여 비리온의 기능을 돕는 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 바이러스 캡시드는 특히 유전자 치료에 사용될 때 벡터의 패키징 능력을 제한하고/하거나 면역 반응을 유도하는 것에서의 요인일 수 있다.
AAV 벡터는 유전자 치료 벡터의 보다 흔한 종류 중 하나로 생겼다. 그러나, 캡시드의 존재는 유전자 치료에서의 AAV 벡터의 이용성을 제한한다. 특히, 캡시드 자체는 4.5 kb 미만만큼 낮도록 벡터에 포함된 전이유전자의 크기를 제한할 수 있다. 유전자 치료에 유용할 수 있는 다양한 치료학적 단백질은 조절 요소가 부가되기 전에도 이 크기를 쉽게 초과할 수 있다.
더 나아가, 캡시드를 구성하는 단백질은 대상체의 면역계에 의해 표적화될 수 있는 항원으로서 작용할 수 있다. AAV는 일반 집단에서 매우 흔하고, 대부분의 사람은 이의 생에 걸쳐 AAV에 노출되었다. 그 결과, 대부분의 잠재적인 유전자 치료 수혜자는 아마도 AAV에 대한 면역 반응을 이미 발생시켰고, 이에 따라 치료를 아마 더욱 거부한다.
본 발명의 소정의 양태는 AAV 벡터의 이의 결핍을 극복하는 것을 목표로 한다. 구체적으로는, 본 발명의 소정의 양태는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 예를 들어 치료학적 단백질 및/또는 miRNA를 암호화하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시킨다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 캡시드 단백질, 복제 단백질, 및/또는 어셈블리 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 치료학적 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 응고 인자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 miRNA를 암호화한다. 소정의 구현예에서, 유전적 카세트는 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 비암호화 영역을 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 하나 이상의 비암호화 영역은 프로모터 서열, 인트론, 전사후 조절 요소, 3' UTR 폴리(A) 서열, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산이다. 다른 구현예에서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산이다.
일 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 파르보비리다에(예를 들어, B19 또는 GPV ITR)의 비-AAV 과 구성원의 ITR인 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) miRNA 또는 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA;
(g) 파르보비리다에(예를 들어, B19 또는 GPV ITR)의 비-AAV 과 구성원의 ITR인 제2 ITR을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 파르보비리다에의 비-AAV 과 구성원의 ITR인 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) miRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드이되, miRNA는 SOD1, HTT, RHO, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 표적 유전자의 발현을 하향조절하는, 뉴클레오타이드;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA;
(g) 파르보비리다에의 비-AAV 과 구성원의 ITR인 제2 ITR을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 파르보비리다에의 비-AAV 과 구성원의 ITR인 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) 디스트로핀 X-연관, MTM1(마이오튜불라린), 티로신 수산화효소, AADC, 사이클로하이드롤라아제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다아제), 또는 임의의 이들의 조합을 암호화하는 뉴클레오타이드;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA;
(g) 파르보비리다에의 비-AAV 과 구성원의 ITR인 제2 ITR을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는
(a) AAV, 예를 들어 AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(D) FVIII를 암호화하는 뉴클레오타이드이되; 뉴클레오타이드는 서열 번호 1-14 또는 서열 번호 71로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고, 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 FVIII는 FVIII 활성을 보유하는, 뉴클레오타이드;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및
(g) AAV, 예를 들어 AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인 제2 ITR을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는
(a) AAV, 예를 들어 AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) miRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드이되, miRNA는 표적 유전자, 예를 들어 SOD1, HTT, RHO, 및 임의의 이들의 조합의 발현을 하향조절하는, 뉴클레오타이드;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및
(g) AAV, 예를 들어 AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인 제2 ITR을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 분자는
(a) AAV, 예를 들어 AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) 디스트로핀 X-연관, MTM1(마이오튜불라린), 티로신 수산화효소, AADC, 사이클로하이드롤라아제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다아제), 또는 임의의 이들의 조합을 암호화하는 뉴클레오타이드;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및
(g) AAV, 예를 들어 AAV 혈청형 2 게놈의 ITR인 제2 ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) miRNA 또는 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및
(g) 제2 ITR을 포함하고,
제1 ITR 또는 제2 ITR 중 하나는 파르보비리다에의 비-AAV 과 구성원의 ITR이고, 다른 ITR은 AAV, 예를 들어 AAV 혈청형 2 게놈의 ITR이다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 111에 기재된 AAV2 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) FVIII를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 FVIIIco6XTEN;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 124에 기재된 AAV2 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 111에 기재된 AAV2 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 CAG 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) FVIII를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 FVIIIco6XTEN;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 193에 기재된 AAV2 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) miRNA 또는 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자를 암호화하는 뉴클레오타이드;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및
(g) 제2 ITR을 포함하고,
제1 ITR은 합성 ITR이거나, 제2 ITR은 합성 ITR이거나, 또는 제1 ITR 및 제2 ITR 둘 다는 합성 ITR이다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 B19 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료학적 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 제2 B19 ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 GPV ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료학적 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 제2 GPV ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 B19 ITR;
(b) 유비쿼터스 프로모터 서열, 예를 들어 CAG 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료학적 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 제2 B19 ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 GPV ITR;
(b) 유비쿼터스 프로모터 서열, 예를 들어 CAG 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료학적 단백질을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 제2 GPV ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 B19 ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) 페닐알라닌 수산화효소(PAH)를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 제2 B19 ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 제1 GPV ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) 페닐알라닌 수산화효소(PAH)를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 제2 GPV ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 180에 기재된 B19d135 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) FVIII를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 FVIIIco6XTEN;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 181에 기재된 B19d135 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 183에 기재된 GPVd162 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) FVIII를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 FVIIIco6XTEN;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 184에 기재된 GPVd162 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 185에 기재된 전장 B19 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) FVIII를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 FVIIIco6XTEN;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 186에 기재된 전장 B19 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 187에 기재된 전장 GPV 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 TTP 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) FVIII를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 FVIIIco6XTEN;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 188에 기재된 전장 GPV 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 180에 기재된 B19d135 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 CAG 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) PAH를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 181에 기재된 B19d135 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 183에 기재된 GPVd162 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 CAG 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) PAH를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 184에 기재된 GPVd162 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 185에 기재된 전장 B19 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 CAG 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) PAH를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 186에 기재된 전장 B19 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
다른 구현예에서, 핵산 분자는
(a) 서열 번호 187에 기재된 전장 GPV 5' ITR 서열을 보유하는 5' ITR;
(b) 조직 특이적 프로모터 서열, 예를 들어 CAG 프로모터;
(c) 인트론, 예를 들어 합성 인트론;
(d) PAH를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE;
(f) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열, 예를 들어 bGHpA; 및/또는
(g) 서열 번호 188에 기재된 전장 GPV 3' ITR 서열을 보유하는 3' ITR을 포함한다.
A. 역방위 말단 반복부
본 발명의 소정의 양태는 제1 ITR, 예를 들어 5' ITR, 및 제2 ITR, 예를 들어 3' ITR을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 전형적으로, ITR은 원핵 플라스미드로부터 파르보바이러스(예를 들어, AAV) DNA 복제 및 구제, 또는 절제에 관여된다(Samulski et al., 1983, 1987; Senapathy et al., 1984; Gottlieb and Muzyczka, 1988). 부가적으로, ITR은 AAV 프로바이러스 통합 및 비리온으로의 AAV DNA의 패키징에 필요한 최소 서열인 것으로 보인다(McLaughlin et al., 1988; Samulski et al., 1989). 이 요소는 파르보바이러스 게놈의 효율적인 증식에 필수적이다. ITR 기능에 필수적인 최소 한정 요소가 헤어핀 형성을 허용하는 Rep-결합 부위(예를 들어, RBS; AAV2에 대한 GCGCGCTCGCTCGCTC(서열 번호 104)) 및 말단 분해 부위(예를 들어, TRS; AAV2에 대한 AGTTGG(서열 번호 105))와 가변 회문 서열이라는 것이 가설제기된다. 회문 뉴클레오타이드 영역은 DNA 복제 기원으로서 시스에서 및 바이러스에 대한 패키징 신호로서 보통 함께 작용한다. ITR에서의 상보성 서열은 DNA 복제 동안 헤어핀 구조로 폴딩한다. 일부 구현예에서, ITR은 헤어핀 T 형상 구조로 폴딩한다. 다른 구현예에서, ITR은 비-T 형상 헤어핀 구조, 예를 들어 U 형상 헤어핀 구조로 폴딩한다. 데이터는 AAV ITR의 T 형상 헤어핀 구조가 ITR에 의해 측접된 전이유전자의 발현을 억제할 수 있다는 것을 제시한다. 예를 들어, 문헌[Zhou et al., Scientific Reports 7:5432 (July 14, 2017)] 참고. T 형상 헤어핀 구조를 형성하지 않는 ITR을 이용하여, 억제의 이 형태가 회피될 수 있다. 따라서, 소정의 양태에서, 비-AAV ITR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 T 형상 헤어핀을 형성하는 AAV ITR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 개선된 전이유전자 발현을 가졌다.
일부 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR을 포함하고, 예를 들어 ITR은 파르보바이러스 ITR의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 합성 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR은 합성 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR의 각각은 합성 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR은 천연 발생 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR의 각각은 천연 발생 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 부분, 예를 들어 절두된 ITR을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일부 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 단편은 적어도 약 5개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 25개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 35개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 45개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 50개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 55개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 60개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 65개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 70개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 75개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 80개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 85개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 90개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 95개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 125개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 150개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 175개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 225개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 250개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 275개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 300개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 325개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 350개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 375개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 400개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 425개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 450개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 475개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 500개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 525개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 550개의 뉴클레오타이드, 적어도 약 575개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 약 600개의 뉴클레오타이드를 포함하고; 여기서 ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 소정의 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 단편은 적어도 약 129개의 뉴클레오타이드를 포함하고; ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 소정의 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 단편은 적어도 약 102개의 뉴클레오타이드를 포함하고; ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다.
일부 구현예에서, ITR은 천연 발생 ITR의 부분을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 단편은 천연 발생 ITR의 길이의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%를 포함하고; 단편은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다.
소정의 구현예에서, ITR은 적절히 정렬될 때 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 다른 구현예에서, ITR은 적절히 정렬될 때 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, ITR은 적절히 정렬될 때 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, ITR은 적절히 정렬될 때 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, ITR은 적절히 정렬될 때 천연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 60%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 ITR은 천연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, ITR은 적절히 정렬될 때 자연 발생 ITR의 상동성 부분과 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 여기서 ITR은 자연 발생 ITR의 기능적 특성을 보유한다.
일부 구현예에서, ITR은 AAV 게놈으로부터의 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 AAV 게놈의 ITR이다. 특정 구현예에서, ITR은 AAV2 게놈의 ITR이다. 다른 구현예에서, ITR은 5′ 및 3′ 말단에서 AAV 게놈의 하나 이상으로부터 유래된 ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 서열이다.
일부 구현예에서, ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, ITR은 비-AAV의 ITR이다. 일부 구현예에서, ITR은 비제한적인 예로서 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 과 파르보비리다에로부터의 비-AAV 게놈의 ITR이다. 소정의 구현예에서, ITR은 에리트로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)로부터 유래된다. 다른 구현예에서, ITR은 머스코비 기러기 파르보바이러스(MDPV) 균주로부터 유래된다. 소정의 구현예에서, MDPV 균주는 MDPV 균주 FZ91-30과 같이 약독화된다. 다른 구현예에서, MDPV 균주는 예를 들어 MDPV 균주 YY와 같이 병원성이다. 일부 구현예에서, ITR은 돼지과 파르보바이러스, 예를 들어 돼지과 파르보바이러스 U44978로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 마우스 미세 바이러스, 예를 들어 마우스 미세 바이러스 U34256으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 개과 파르보바이러스, 예를 들어 개과 파르보바이러스 M19296으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 밍크 장염 바이러스, 예를 들어 밍크 장염 바이러스 D00765로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 데펜도파르보바이러스로부터 유래된다. 일 구현예에서, 데펜도파르보바이러스는 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(GPV) 균주이다. 구체적인 구현예에서, GPV 균주는 GPV 균주 82-0321V와 같이 약독화된다. 다른 구체적인 구현예에서, GPV 균주는 GPV 균주 B와 같이 병원성이다.
핵산 분자의 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일한 게놈, 예를 들어 동일한 바이러스의 게놈, 또는 상이한 게놈, 예를 들어 2개 이상의 상이한 바이러스 게놈의 게놈으로부터 유래될 수 있다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일한 AAV 게놈으로부터 유래된다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에 존재하는 2개의 ITR은 동일하고, 특히 AAV2 ITR일 수 있다. 다른 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV 게놈). 다른 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않고(예를 들어, 비-AAV 게놈), 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR 둘 다는 AAV 게놈으로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV 게놈). 하나의 특정 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래되고, 여기서 제1 ITR 및 제2 ITR은 동일한 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파르보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파르보바이러스, 코피파르보바이러스, 프로토파르보바이러스, 테트라파르보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래되고, 여기서 제1 ITR 및 제2 ITR은 상이한 게놈으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 에리트로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 에리트로바이러스 파르보바이러스 B19(인간 바이러스)로부터 유래된다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 B19로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 167, 168, 169, 170 및 171로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 이것이 유래된 B19 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 167, 168, 169, 170 및 171로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 헤어핀 구조는 T 형상 헤어핀을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 167, 168, 169, 170 및 171으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 167에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 168에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 169에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 170에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 171에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
Figure pct00001
Figure pct00002
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 167에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 167로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 168에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 168로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 169에 기재된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드서열은 서열 번호 167에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일하고, 이것이 유래된 B19 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 169에 기재된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드서열은 서열 번호 167에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 헤어핀 구조는 T 형상 헤어핀을 포함하지 않는다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 B19로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 제1 ITR의 역상 보체이다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 제2 ITR의 역상 보체이다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 185 및 186으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 기능적 유도체는 이것이 유래된 B19 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 185 및 186으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 기능적 유도체는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 헤어핀 구조는 T 형상 헤어핀을 포함하지 않는다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180으로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 181에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 181로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 185에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 185로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 186에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 186으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 185 및 186으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 180에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 181에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 185에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 186에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 서열 번호 180에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 서열 번호 181에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 서열 번호 185에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 서열 번호 186에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 180에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 제2 ITR은 서열 번호 181에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 181에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 제2 ITR은 서열 번호 180에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 185에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 제2 ITR은 서열 번호 186에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 186에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 제2 ITR은 서열 번호 185에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 GPV로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 GPV로부터 유래된다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 172에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 172로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 173에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 173으로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 GPV로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 172, 173, 174, 175 및 176으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 이것이 유래된 GPV ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 GPV로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 172, 173, 174, 175 및 176으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 헤어핀 구조는 T 형상 헤어핀을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 172, 173, 174, 175 및 176으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 172에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 173에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 174에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 175에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 176에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 174에 기재된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드서열은 서열 번호 172에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 이것이 유래된 GPV ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 174에 기재된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드서열은 서열 번호 172에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 헤어핀 구조는 T 형상 헤어핀을 포함하지 않는다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 176에 기재된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드서열은 서열 번호 172에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 이것이 유래된 GPV ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 176에 기재된 최소 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드서열은 서열 번호 172에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 헤어핀 구조는 T 형상 헤어핀을 포함하지 않는다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 GPV로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 제1 ITR의 역상 보체이다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 제2 ITR의 역상 보체이다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 183, 184, 187 및 188로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 기능적 유도체는 이것이 유래된 GPV ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 183, 184, 187 및 188로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 기능적 유도체는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 헤어핀 구조는 T 형상 헤어핀을 포함하지 않는다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 183에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 183으로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 184에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 184로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 187에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 187로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 188로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 183, 184, 187 및 188로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 183에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 184에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 187에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 서열 번호 183에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 서열 번호 184에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 서열 번호 187에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 서열 번호 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 183에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 제2 ITR은 서열 번호 184에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 184에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 제2 ITR은 서열 번호 183에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 187에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 제2 ITR은 서열 번호 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 서열 번호 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 제2 ITR은 서열 번호 187에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR 중 하나는 AAV2로부터 유래된 ITR의 전부 또는 일부를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR은 서열 번호 177 또는 178에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 이것이 유래된 AAV2 ITR의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 또는 제2 ITR은 서열 번호 177 또는 178에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어지고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 헤어핀 구조는 T 형상 헤어핀을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 177 또는 178에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 177에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 178에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 머스코비 기러기 파르보바이러스(MDPV) 균주로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 머스코비 기러기 파르보바이러스(MDPV) 균주로부터 유래된다. 소정의 구현예에서, MDPV 균주는 MDPV 균주 FZ91-30과 같이 약독화된다. 다른 구현예에서, MDPV 균주는 예를 들어 MDPV 균주 YY와 같이 병원성이다.
일부 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 데펜도파르보바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 데펜도파르보바이러스로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(GPV) 균주로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 데펜도바이러스 GPV 균주로부터 유래된다. 소정의 구현예에서, GPV 균주는 GPV 균주 82-0321V와 같이 약독화된다. 다른 구현예에서, GPV 균주 GPV 균주 B와 같이 병원성이다.
소정의 구현예에서, 제1 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제2 ITR은 돼지과 파르보바이러스, 예를 들어 돼지과 파르보바이러스 균주 U44978; 마우스 미세 바이러스, 예를 들어 마우스 미세 바이러스 균주 U34256; 개과 파르보바이러스, 예를 들어 개과 파르보바이러스 균주 M19296; 밍크 장염 바이러스, 예를 들어 밍크 장염 바이러스 균주 D00765; 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 제1 ITR은 돼지과 파르보바이러스, 예를 들어 돼지과 파르보바이러스 균주 U44978; 마우스 미세 바이러스, 예를 들어 마우스 미세 바이러스 균주 U34256; 개과 파르보바이러스, 예를 들어 개과 파르보바이러스 균주 M19296; 밍크 장염 바이러스, 예를 들어 밍크 장염 바이러스 균주 D00765; 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 게놈으로부터 유래된다.
다른 특정 구현예에서, ITR은 5′ 및 3′ 말단에서 AAV 게놈으로부터 유래되지 않은 ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 서열이다. 다른 특정 구현예에서, ITR은 5′ 및 3′ 말단에서 비-AAV 게놈의 하나 이상으로부터 유래된 ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 서열이다. 본 발명의 핵산 분자에 존재하는 2개의 ITR은 동일하거나 상이한 비-AAV 게놈일 수 있다. 특히, ITR은 동일한 비-AAV 게놈으로부터 유래될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에 존재하는 2개의 ITR은 동일하고, 특히 AAV2 ITR일 수 있다.
일부 구현예에서, ITR 서열은 하나 이상의 회문 서열을 포함한다. 본원에 개시된 ITR의 회문 서열은 자연적 회문 서열(즉, 자연에서 발견된 서열), 합성 서열(즉, 자연에서 발견되지 않은 서열), 예컨대 슈도 회문 서열, 및 이의 조합 또는 변형된 형태를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. "슈도 회문 서열"은 2차 구조를 형성하는 천연 AAV 또는 비-AAV 회문 서열에서의 서열과 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만 또는 0을 포함하는 80% 미만의 핵산 서열 동일성을 공유하는 불완전 회문 서열을 포함하는 회문 DNA 서열이다. 천연 회문 서열은 본원에 개시된 임의의 게놈에서 얻어지거나 유래될 수 있다. 합성 회문 서열은 본원에 개시된 임의의 게놈에 기초할 수 있다.
회문 서열은 연속이거나 중단될 수 있다. 일부 구현예에서, 회문 서열은 중단되고, 여기서 회문 서열은 제2 서열의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 서열은 프로모터, 인핸서, 인테그레이즈에 대한 통합 부위(예를 들어, Cre 또는 Flp 재조합효소에 대한 부위), 유전자 산물에 대한 오픈 리딩 프레임, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, ITR은 헤어핀 루프 구조를 형성한다. 일 구현예에서, 제1 ITR은 헤어핀 구조를 형성한다. 다른 구현예에서, 제2 ITR은 헤어핀 구조를 형성한다. 또 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR 둘 다는 헤어핀 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 T 형상 헤어핀 구조를 형성하지 않는다. 소정의 구현예에서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-T 형상 헤어핀 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 비-T 형상 헤어핀 구조는 U 형상 헤어핀 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 분자에서의 ITR은 전사로 활성화된 ITR일 수 있다. 전사로 활성화된 ITR은 적어도 하나의 전사 활성 요소의 포함에 의해 전사로 활성화된 야생형 ITR의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 다양한 유형의 전사 활성 요소는 이 맥락에서의 사용에 적합하다. 일부 구현예에서, 전사 활성 요소는 구성적인 전사 활성 요소이다. 구성적인 전사 활성 요소는 유전자 전사의 지속적 수준을 제공하고, 전이유전자가 지속적 기준으로 표현되는 것이 원해질 때 바람직하다. 다른 구현예에서, 전사 활성 요소는 유도성 전사 활성 요소이다. 유도성 전사 활성 요소는 일반적으로 유도제(또는 유도 조건)의 부재 하에 낮은 활성을 나타내고, 유도제(또는 유도 조건으로 전환)의 존재 하에 상향조절된다. 오직 소정의 시간에 또는 소정의 위치에서 발현을 원할 때, 또는 유도제를 사용한 발현의 수준을 적정하기를 원할 때 유도성 전사 활성 요소가 바람직할 수 있다. 전사 활성 요소는 또한 조직 특이적일 수 있고; 즉, 이들은 오직 소정의 조직 또는 세포 유형에서 활성을 나타낸다.
전사 활성 요소는 다양한 방식으로 ITR로 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 활성 요소는 ITR의 임의의 부분의 5′ 또는 ITR의 임의의 부분의 3′에 혼입된다. 다른 구현예에서, 전사로 활성화된 ITR의 전사 활성 요소는 2개의 ITR 서열 사이에 있다. 전사 활성 요소가 멀리 이격되어야 하는 2개 이상의 요소를 포함하면, 이들 요소는 ITR의 부분과 교대할 수 있다. 일부 구현예에서, ITR의 헤어핀 구조는 결실되고, 전사 요소의 역방위 반복부로 대체된다. 이 후자의 배열은 구조에서 결실된 부분을 모방하는 헤어핀을 생성할 것이다. 다중 탠덤 전사 활성 효소는 전사로 활성화된 ITR에 또한 존재할 수 있고, 이들은 인접하거나 멀리 이격될 수 있다. 부가적으로, 단백질 결합 부위(예를 들어, Rep 결합 부위)는 전사로 활성화된 ITR의 전사 활성 요소로 도입될 수 있다. 전사 활성 요소는 RNA를 형성하도록 RNA 중합효소에 의해 제어된 DNA 전사가 가능하게 하는 임의의 서열을 포함할 수 있고, 하기 기재된 바대로 예를 들어 전사 활성 요소를 포함할 수 있다.
전사로 활성화된 ITR은 핵산 분자로부터 운반되고 발현될 수 있는 전이유전자의 길이를 효과적으로 최대화하는 비교적 제한된 뉴클레오타이드 서열 길이에서 핵산 분자에 전사 활성화 및 ITR 기능 둘 다를 제공한다. ITR로의 전사 활성 요소의 도입은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. ITR 서열의 비교 및 전사 활성 요소의 서열 요건은 ITR 내의 요소를 암호화하는 방식에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 예를 들어, 전사 활성은 전사 활성 요소의 기능적 요소를 복제하는 ITR 서열에서 특정 변화의 도입을 통해 ITR에 부가될 수 있다. 다수의 기법은 특정 부위에서 특정 뉴클레오타이드 서열을 효율적으로 부가, 결실 및/또는 변화시키도록 존재한다(예를 들어, 문헌[Deng and Nickoloff (1992) Anal. Biochem. 200:81-88] 참조). 전사로 활성화된 ITR을 생성하는 다른 방식은 ITR에서의 원하는 위치에서 제합 부위의 도입을 수반한다. 부가적으로, 다중 전사 활성 요소는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 전사로 활성화된 ITR로 도입될 수 있다.
예에 의해, 전사로 활성화된 ITR은 하나 이상의 전사 활성 요소, 예컨대 TATA 박스, GC 박스, CCAAT 박스, Sp1 부위, Inr 영역, CRE(cAMP 조절 요소) 부위, ATF-1/CRE 부위, APBβ 박스, APBα 박스, CArG 박스, CCAC 박스, 또는 당업계에 공지된 바와 같이 전사에 포함된 임의의 다른 요소의 포함에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 양태는 복잡한 2차 구조가 가능한 핵산 분자를 적합한 벡터로 삽입하는 단계 및 생성된 벡터를 적합한 박테리아 숙주 균주로 도입하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 핵산 분자를 클로닝하는 방법을 제공한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 핵산의 복잡한 2차 구조(예를 들어, 긴 회문 영역)는 불안정하고 박테리아 숙주 균주에서 클로닝하기 어려울 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제1 ITR 및 제2 ITR(예를 들어, 비-AAV 파르보바이러스 ITR, 예를 들어 B19 또는 GPV ITR)을 포함하는 핵산 분자는 종래의 방법론을 이용하여 클로닝하기에 어려울 수 있다. 긴 DNA 회문은 DNA 복제를 억제하고, 이. 콜라이, 바실루스, 스트렙토코커스, 스트렙토마이세스, S. 세레비시아에, 마우스, 및 인간의 게놈에서 불안정하다. 가닥내 염기 페어링에 의해 헤어핀 또는 십자형 구조의 형성으로부터 이 효과가 생긴다. 이 콜라이에서 DNA 복제의 억제는 SbcC 또는 SbcD 돌연변이체에서 상당히 극복할 수 있다. SbcD는 뉴클레아제 아단위이고, SbcC는 SbcCD 복합체의 ATPase 아단위이다. 이 콜라이 SbcCD 복합체는 긴 회문의 복제의 방지를 담당하는 엑소뉴클레아제 복합체이다. SbcCD 복합체는 ATP 의존적 이중 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성 및 ATP 독립적 단일 가닥 DNA 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 핵이다. SbcCD는 DNA 회문을 인식하고, 생기는 헤어핀 구조를 공격하여 복제 포크를 붕괴시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 적합한 박테리아 숙주 균주는 십자형 DNA 구조를 풀 수 없다. 소정의 구현예에서, 적합한 박테리아 숙주 균주는 SbcCD 복합체에서의 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcC 유전자 및/또는 SbcD 유전자에서의 유전적 파괴를 포함한다. 소정의 구현예에서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcC 유전자에서의 유전적 파괴를 포함한다. SbcC 유전자에서의 유전적 파괴를 포함하는 다양한 박테리아 숙주 균주는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 제한 없이, 박테리아 숙주 균주 PMC103은 유전자형 sbcC, recD, mcrA, ΔmcrBCF를 포함하고; 박테리아 숙주 균주 PMC107은 유전자형 recBC, recJ, sbcBC, mcrA, ΔmcrBCF를 포함하고; 박테리아 숙주 균주 SURE는 유전자형 recB, recJ, sbcC, mcrA, ΔmcrBCF, umuC, uvrC를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 분자를 클로닝하는 방법은 복잡한 2차 구조가 가능한 핵산 분자를 적합한 벡터로 삽입하는 단계 및 생성된 벡터를 숙주 균주 PMC103, PMC107 또는 SURE로 도입하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 분자를 클로닝하는 방법은 복잡한 2차 구조가 가능한 핵산 분자를 적합한 벡터로 삽입하는 단계 및 생성된 벡터를 숙주 균주 PMC103으로 도입하는 단계를 포함한다.
적합한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 본원에서 어딘가에 기재되어 있다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 클로닝 방법론에서 사용하기 위한 적합한 벡터는 저카피 벡터이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 클로닝 방법론에서 사용하기 위한 적합한 벡터는 pBR322이다.
따라서, 본 발명은 복잡한 2차 구조가 가능한 핵산 분자를 적합한 벡터로 삽입하는 단계 및 생성된 벡터를 SbcCD 복합체에서의 파괴를 포함하는 박테리아 숙주 균주로 도입하는 단계를 포함하는 핵산 분자를 클로닝하는 방법을 제공하고, 여기서 핵산 분자는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
B. 치료학적 단백질
본 발명의 소정의 양태는 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 하나의 치료학적 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 하나 초과의 치료학적 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 동일한 치료학적 단백질의 2개 이상의 카피를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 동일한 치료학적 단백질의 2개 이상의 변이체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 2개 이상의 상이한 치료학적 단백질을 암호화한다.
본 발명의 소정의 구현예는 제1 ITR, 제2 ITR 및 치료학적 단백질을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 치료학적 단백질은 응고 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 응고 인자는 FI, FII, FIII, FIV, FV, FVI, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII), VWF, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐, 피브로넥틴, 안티트롬빈 III, 헤파린 보인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제(ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-안티플라스민, 조직 플라스미노겐 활성자(tPA), 유로키나제, 플라스미노겐 활성자 억제제-1(PAI-1), 플라스미노겐 활성자 억제제-2(PAI2), 이의 임의의 지모겐, 이의 임의의 활성 형태, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 응고 인자는 FVIII 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 응고 인자는 FIX 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 응고 인자는 FVII 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 응고 인자는 VWF 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.
1. 응고 인자
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화하고, 치료학적 단백질은 VIII 인자 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "FVIII"로 본 출원에 걸쳐 약칭된 "VIII 인자"는, 달리 명시되지 않는 한, 응고에서 정상 역할을 하는 기능적 FVIII 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 용어 FVIII는 기능적인 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. "FVIII 단백질"은 FVIII 폴리펩타이드(또는 단백질) 또는 FVIII와 상호교환적으로 사용된다. FVIII 기능의 예는 응고를 활성화하는 능력, 인자 IX에 대한 보인자로서 작용하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재 하에 IX 인자와 테나아제(tenase) 복합체를 형성하고, 이어서 X 인자를 활성화된 형태인 Xa로 전환시키는 능력을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. FVIII 단백질은 인간, 돼지과, 개과, 래트 또는 쥣과 FVIII 단백질일 수 있다. 부가적으로, 인간과 다른 종의 FVIII를 비교하여 기능에 필요할 것 같은 보존된 잔기를 확인하였다(Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632호). 전장 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 많은 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형된 형태로서 알려져 있다. 다양한 FVIII 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 미국 공개 2015/0158929 A1호, 2014/0308280 A1호, 및 2014/0370035 A1호 및 국제 공보 WO 2015/106052 A1호에 개시되어 있다. FVIII 폴리펩타이드는 예를 들어 전장 FVIII, N 말단에서 Met가 결실된 전장 FVIII, 성숙 FVIII(신호 서열이 결실됨), N 말단에서 추가 Met를 갖는 성숙 FVIII, 및/또는 B 도메인이 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 FVIII를 포함한다. FVIII 변이체는 부분적 결실 또는 전체적 결실이든 B 도메인의 결실을 포함한다.
a. FVIII 및 FVIII 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화하고, 치료학적 단백질은 VIII 인자 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "FVIII"로 본 출원에 걸쳐 약칭된 "VIII 인자"는, 달리 명시되지 않는 한, 응고에서 정상 역할을 하는 기능적 FVIII 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 용어 FVIII는 기능적인 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. "FVIII 단백질"은 FVIII 폴리펩타이드(또는 단백질) 또는 FVIII와 상호교환적으로 사용된다. FVIII 기능의 예는 응고를 활성화하는 능력, 인자 IX에 대한 보인자로서 작용하는 능력, 또는 Ca2+ 및 인지질의 존재 하에 IX 인자와 테나아제(tenase) 복합체를 형성하고, 이어서 X 인자를 활성화된 형태인 Xa로 전환시키는 능력을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. FVIII 단백질은 인간, 돼지과, 개과, 래트 또는 쥣과 FVIII 단백질일 수 있다. 부가적으로, 인간과 다른 종의 FVIII를 비교하여 기능에 필요할 것 같은 보존된 잔기를 확인하였다(Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632호). 전장 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 많은 기능적 단편, 돌연변이체 및 변형된 형태로서 알려져 있다. 다양한 FVIII 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 미국 공개 2015/0158929 A1호, 2014/0308280 A1호, 및 2014/0370035 A1호 및 국제 공보 WO 2015/106052 A1호에 개시되어 있다. FVIII 폴리펩타이드는 예를 들어 전장 FVIII, N 말단에서 Met가 결실된 전장 FVIII, 성숙 FVIII(신호 서열이 결실됨), N 말단에서 추가 Met를 갖는 성숙 FVIII, 및/또는 B 도메인이 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 FVIII를 포함한다. FVIII 변이체는 부분적 결실 또는 전체적 결실이든 B 도메인의 결실을 포함한다.
본원에 사용된 키메라 단백질에서의 FVIII 부분은 FVIII 활성을 갖는다. FVIII 활성은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 응고 시스템의 기능을 평가하기 위한 다수의 시험이 이용 가능하다: 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time; aPTT) 시험, 발색성 분석, ROTEM 분석, 프로트롬빈 시간(prothrombin time; PT) 시험(INR 결정에도 사용됨), (종종 클라우스 방법에 의한) 피브리노겐 시험, 혈소판 계수, (종종 PFA-100에 의한) 혈소판 기능 시험, TCT, 출혈 시간, 혼합 시험(환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합되면 이상성이 교정되는지 여부), 응고 인자 분석, 항인지질 항체, D-이량체, 유전자 시험(예를 들어, V 인자 라이덴, 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀 사독 시간(dilute Russell's viper venom time; dRVVT), 기타 혈소판 기능 시험, 트롬보엘라스토그래피(thromboelastography; TEG 또는 소노클롯(Sonoclot)), 트롬보엘라스토메트리(thromboelastometry; TEM®, 예를 들어, ROTEM®), 또는 유글로불린 용해 시간(euglobulin lysis time; ELT).
aPTT 시험은 "고유" 응고 경로(접촉 활성화 경로로도 지칭됨) 및 공통 응고 경로 둘 다의 효능을 측정하는 성능 지표이다. 이러한 시험은 FVIII와 같은 상업적으로 이용 가능한 재조합 응고 인자의 응고 활성을 측정하도록 흔히 사용된다. 이는 외인성 경로를 측정하는 프로트롬빈 시간(PT)과 함께 사용된다.
ROTEM 분석은 응고 시간, 응고물질 형성, 응고물질 안정성 및 용해성과 같은 지혈의 전체 동특성(whole kinetics)에 대한 정보를 제공한다. 트롬보엘라스토메트리에서의 상이한 매개변수는 혈장 응고 시스템, 혈소판 기능, 섬유소용해, 또는 이러한 상호작용에 영향을 미치는 많은 요인의 활성에 따라 달라진다. 이러한 분석은 2차 지혈에 대한 완전한 관점을 제공할 수 있다.
발색성 분석 메커니즘은 활성화된 IX 인자, 인지질 및 칼슘 이온의 존재 하에 활성화된 FVIII가 X 인자의 Xa 인자로의 전환을 가속화시키는 혈액 응고 캐스케이드의 원리에 기초한다. Xa 인자의 활성은 Xa 인자에 특이적인 p-니트로아닐라이드(pNA) 기질의 가수분해에 의해 평가된다. 405 nM에서 측정된 p-니트로아닐라이드의 초기 방출 속도는 Xa 인자의 활성에 정비례하고, 이에 따라 샘플에서 FVIII의 활성에도 정비례한다.
발색성 분석은 국제 혈전 지혈 학회(International Society on Thrombosis and Hemostatsis; ISTH)의 과학 및 표준화 위원회(Scientific and Standardization Committee; SSC) 산하 FVIII 및 IX 인자 소위원회(FVIII and Factor IX Subcommittee)에 의해 권고된다. 1994년 이후, 발색성 분석은 FVIII 농축물 효능을 할당하기 위한 유럽 약전의 기준 방법이기도 하다. 따라서, 일 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO® 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드와 비슷한 FVIII 활성을 갖는다.
다른 구현예에서, 본 발명의 FVIII를 포함하는 키메라 단백질은 성숙 FVIII 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO® 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 단백질과 비슷한 Xa 인자 생성 속도를 갖는다.
X 인자를 Xa 인자로 활성화시키기 위해, 활성화된 IX 인자(IXa 인자)는 X 인자 내의 하나의 아르기닌-이소류신 결합을 가수분해하여 Ca2+, 막 인지질 및 FVIII 보인자의 존재 하에 Xa 인자를 형성한다. 따라서, 응고 경로에 있어서는 FVIII와 IX 인자의 상호작용이 중요하다. 소정의 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO® 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드와 비슷한 속도로 IXa 인자와 상호작용할 수 있다.
또한, FVIII는 순환 중 비활성일 때 폰 빌레브란트 인자에 결합된다. FVIII는 VWF에 결합되지 않으면 급속히 분해되고, 트롬빈의 작용에 의해 VWF로부터 방출된다. 일부 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO® 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드와 비슷한 수준으로 폰 빌레브란트 인자에 결합한다.
FVIII는 칼슘 및 인지질의 존재 하에 활성화된 단백질 C에 의해 비활성화될 수 있다. 활성화된 단백질 C는 A1 도메인에서의 아르기닌 336 이후의 FVIII 중쇄를 절단하여 X 인자의 기질 상호작용 부위를 파괴하고, A2 도메인에서의 아르기닌 562 이후를 절단하여 A2 도메인의 해리를 향상시킬 뿐만 아니라 IXa 인자와의 상호작용 부위도 파괴한다. 또한, 이러한 절단은 A2 도메인(43 kDa)을 양분하여 A2-N(18 kDa) 및 A2-C(25 kDa) 도메인을 생성한다. 따라서, 활성화된 단백질 C는 중쇄에서의 다중 절단 부위를 촉매할 수 있다. 일 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO® 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드와 비슷한 수준으로 활성화된 단백질 C에 의해 비활성화된다.
다른 구현예에서, FVIII를 포함하는 키메라 단백질은 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO® 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드와 비슷한 생체내 FVIII 활성을 갖는다. 특정 구현예에서, HemA 마우스 꼬리 정맥 가로 절단 모델에서, FVIII를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 성숙 FVIII 서열 또는 BDD FVIII(예를 들어, ADVATE®, REFACTO® 또는 ELOCTATE®)를 포함하는 키메라 폴리펩타이드와 비슷한 수준으로 HemA 마우스를 보호할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 FVIII의 "B 도메인"은 내부 아미노산의 서열 동일성 및 트롬빈에 의한 단백질분해 절단 부위, 예를 들어, 성숙 인간 FVIII의 잔기 Ser741/Arg1648에 의해 정의되는 당업계에 알려진 B 도메인과 동일하다. 다른 인간 FVIII 도메인은 성숙 인간 FVIII에 비해 하기 아미노산 잔기에 의해 정의된다: 성숙 FVIII의, A1, 잔기 Ala1-Arg372; A2, 잔기 Ser373-Arg740; A3, 잔기 Ser1690-Ile2032; C1, 잔기 Arg2033-Asn2172; C2, 잔기 Ser2173-Tyr2332. 달리 명시되지 않는 한, 임의의 서열 번호를 지칭하지 않고 본원에 사용된 서열 잔기 번호는 신호 펩타이드 서열(19개의 아미노산)이 없는 FVIII 서열에 상응한다. FVIII 중쇄로도 알려진 A3-C1-C2 서열은 잔기 Ser1690/Tyr2332를 포함한다. 잔여 서열인 잔기 Glu1649/Arg1689는 일반적으로 FVIII 경쇄 활성화 펩타이드라 지칭된다. 돼지과, 마우스 및 개과 FVIII에 대한 B 도메인을 포함하여, 모든 도메인에 대한 경계의 위치도 당업계에 알려져 있다. 일 구현예에서, FVIII의 B 도메인이 결실된다("B-도메인-결실된 FVIII" 또는 "BDD FVIII"). BDD FVIII의 일 예는 REFACTO® (재조합 BDD FVIII)이다. 하나의 특정 구현예에서, B 도메인이 결실된 FVIII 변이체는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 746 내지 1648의 결실을 포함한다.
"B-도메인-결실된 FVIII"는 미국 특허 6,316,226호, 6,346,513호, 7,041,635호, 5,789,203호, 6,060,447호, 5,595,886호, 6,228,620호, 5,972,885호, 6,048,720호, 5,543,502호, 5,610,278호, 5,171,844호, 5,112,950호, 4,868,112호 및 6,458,563호 및 국제 공보 WO 2015106052 A1호(PCT/US2015/010738호)에 개시된 완전 또는 부분 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 B-도메인-결실된 FVIII 서열은 미국 특허 6,316,226호의 4란 4행 내지 5란 28행, 및 실시예 1 내지 5(또한 미국 특허 6,346,513호)에 개시된 결실 중 어느 하나를 포함한다. 다른 구현예에서, B-도메인 결실된 VIII 인자는 S743/Q1638 B-도메인 결실된 VIII 인자(SQ BBB FVIII)(예를 들어, 아미노산 744에서 아미노산 1637까지 결실된 VIII 인자, 예를 들어, 성숙 FVIII의 아미노산 1~743 및 아미노산 1638~2332를 갖는 VIII 인자)이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 B-도메인-결실된 FVIII는 미국 특허 5,789,203호의 2란 26 내지 51행 및 실시예 5 내지 8(또한 미국 특허 6,060,447호, 5,595,886호 및 6,228,620호)에 개시된 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실된 VIII 인자는 미국 특허 5,972,885호의 1란 25행 내지 2란 40행; 미국 특허 6,048,720호의 6란 1~22행, 및 실시예 1; 미국 특허 5,543,502호의 2란 17~46행; 미국 특허 5,171,844호의 4란 22행 내지 5란 36행; 미국 특허 5,112,950호의 2란 55~68행, 도 2, 및 실시예 1; 미국 특허 4,868,112호의 2란 2행 내지 19란 21행 및 표 2; 미국 특허 7,041,635호의 2란 1행 내지 3란 19행, 3란 40행 내지 4란 67행, 7란 43행 내지 8란 26행, 및 11란 5행 내지 13란 39행; 또는 미국 특허 6,458,563호의 4란 25~53행에 기재된 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실된 FVIII는 WO 91/09122에 개시된 바와 같이 대부분의 B 도메인의 결실을 갖지만, 일차 번역 산물을 2개의 폴리펩타이드 사슬로 생체내 단백질분해 처리하는 데 필수적인 B 도메인의 아미노 말단 서열을 여전히 포함한다. 일부 구현예에서, B-도메인-결실된 FVIII는 아미노산 747~1638이 결실되어, 즉 B 도메인이 사실상 완전한 결실되어 작제된다. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). B-도메인-결실된 VIII 인자는 또한 아미노산 771~1666 또는 아미노산 868~1562의 결실을 포함할 수 있다. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). 본 발명의 일부인 추가의 B 도메인 결실은 아미노산 982~1562 또는 760~1639(Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797~1562(Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741~1646(Kaufman(PCT 공개 출원 WO 87/04187호)), 747~1560(Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), 741~1648(Pasek(PCT 출원 88/00831호)), 또는 816~1598 또는 741~1648(Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597))의 결실을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, B-도메인-결실된 FVIII는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 746~1648의 결실을 포함한다. 다른 구현예에서, B-도메인-결실된 FVIII는 성숙 FVIII의 아미노산 잔기 745~1648의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, BDD FVIII는 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 765~1652의 결실을 함유하는 단쇄 FVIII(rVIII-SingleChain 및 AFSTYLA®로도 알려짐)를 포함한다. 미국 특허 7,041,635호 참조.
다른 구현예에서, BDD FVIII는 전장 FVIII 서열의 아미노산 서열에 상응하는 하나 이상의 N-연결된 글리코실화 부위, 예를 들어, 잔기 757, 784, 828, 900, 963, 또는 선택적으로는 943을 보유하는 B-도메인의 단편을 함유하는 FVIII 폴리펩타이드를 포함한다. B-도메인 단편의 예는 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008), 및 Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)]에 개시된 바와 같은 B-도메인의 226 아미노산 또는 163 아미노산을 포함한다(즉, B 도메인의 제1 226 아미노산 또는 163 아미노산이 보유됨). 여전히 다른 구현예에서, BDD FVIII는 BDD FVIII 단백질의 발현을 개선하기 위한 (Phe에서 Ser로의) 잔기 309에서의 점 돌연변이를 추가로 포함한다. 문헌[Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004)] 참고. 여전히 다른 구현예에서, BDD FVIII는 B-도메인의 일부를 함유하지만 하나 이상의 퓨린 절단 부위(예를 들어, Arg 1313 및 Arg 1648)를 함유하지 않는 FVIII 폴리펩타이드를 포함한다. 문헌[Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011)] 참고. 일부 구현예에서, BDD FVIII는 성숙 전장 FVIII에 상응하는 아미노산 765~1652의 결실을 함유하는 단쇄 FVIII(rVIII-SingleChain 및 AFSTYLA®로도 알려짐)를 포함한다. 미국 특허 7,041,635호 참조. 전술한 결실의 각각은 임의의 FVIII 서열에서 이루어질 수 있다.
상기 및 하기에 논의되는 바와 같이, 상당히 많은 기능적 FVIII 변이체가 알려져 있다. 부가적으로, FVIII에서의 수 백 가지의 비기능적 돌연변이가 혈우병 환자에서 확인되었는데, 돌연변이가 FVIII의 기능에 미치는 효과는 치환의 성질에 기인하기 보다는 이들이 FVIII의 3차원 구조 내에 존재하는 것에 더 기인하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Cutler et al., Hum. Mutat. 19:274-8 (2002)], 본원에 그 전체가 참고로 포함됨). 부가적으로, 인간과 다른 종의 FVIII를 비교하여 기능에 필요할 것 같은 보존된 잔기를 확인하였다(문헌[Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998)]; US 6,251,632호, 본원에 그 전체가 참고로 포함됨).
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드는 FVIII 변이체 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 FVIII 변이체 또는 이의 단편은 FVIII 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 전장 FVIII 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII의 B 도메인의 전부 또는 일부가 결실된 B 도메인-결실된(BDD) FVIII 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 특정 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 106, 107, 109, 110, 111 또는 112와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 17의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 106의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 107과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 109의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 16과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 109와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 유전적 카세트는 신호 펩타이드 또는 이의 단편을 포함하는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 구현예에서, 유전적 카세트는 신호 펩타이드가 결여된 FVIII 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 17의 아미노산 1~19를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된다. 소정의 구현예에서, 유전적 카세트는 국제 출원 PCT/US2017/015879호(그 전체가 참고로 포함됨)에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된다. 소정의 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 1~14로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 71과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 서열 번호 19와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
i. FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화하고, 제1 ITR 및 제2 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되고, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 전장 FVIII 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII의 B 도메인의 전부 또는 일부가 결실된 B 도메인-결실된(BDD) FVIII 폴리펩타이드를 암호화한다. 하나의 특정 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 17 또는 이의 단편과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 일 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 17 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드 또는 이의 단편을 포함하는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드가 결여된 FVIII 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드는 서열 번호 17의 아미노산 1~19를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791, 또는 (ii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 제1 핵산 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제1 핵산 서열은 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791 또는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791을 포함한다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791, 또는 (ii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791 또는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1792~4374 또는 서열 번호 4의 1792~4374와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1792~4374 또는 서열 번호 4의 1792~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374 또는 서열 번호 4의 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1792~4374 또는 서열 번호 4의 1792~4374)와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374 또는 서열 번호 4의 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1792~4374 또는 서열 번호 4의 1792~4374)를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374, 또는 (ii) 서열 번호 6의 1792~4374와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 소정의 구현예에서, 제2 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 제2 핵산 서열은 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 제2 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374 또는 서열 번호 6의 1792~4374를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기에 열거된 제2 핵산 서열에 연결된 제1 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 58~1791 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 58~1791과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기에 열거된 제2 핵산 서열에 연결된 제1 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1~1791 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374) 또는 (ii) 서열 번호 6의 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 소정의 구현예에서, 제2 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드를 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 제2 핵산 서열은 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 제2 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374 또는 서열 번호 6의 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374 또는 서열 번호 6의 1792~4374)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기에 열거된 제2 핵산 서열에 연결된 제1 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 58~1791 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 58~1791과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기에 열거된 제2 핵산 서열에 연결된 제1 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1~1791 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 58~1791, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 58~1791, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 58~1791, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 58~1791과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 58~1791, 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 58~1791, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 58~1791, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 58~1791을 포함한다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1~1791, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1~1791, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1~1791, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1~1791, 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1~1791, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1~1791, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1~1791을 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열에 연결된 제2 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~4374, 서열 번호 2의 1792~4374, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~4374, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~4374와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열에 연결된 제2 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~4374, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~4374, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~4374, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~4374를 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열에 연결된 제2 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구현예에서, 제2 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374를 포함한다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~4374, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~4374, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~4374, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~4374와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~4374, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~4374, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~4374, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~4374를 포함한다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~4374, 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~4374, 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~4374, 또는 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, (iii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, 또는 (iv) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1792~4374, 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1792~4374, 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1792~4374, 또는 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1792~4374)를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 58~4374와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호 1과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 58~4374) 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 58~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1~4374) 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1~4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 58~4374와 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374와 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호 2와 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 58~4374) 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 58~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1~4374) 또는 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1~4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 58~4374와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호 70과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 58~4374) 또는 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 58~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1~4374) 또는 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1~4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 58~4374와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호 71과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 58~4374) 또는 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 58~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1~4374) 또는 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1~4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~4374와 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호 3과 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~4374) 또는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~4374) 또는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~4374와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호 4와 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~4374) 또는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~4374) 또는 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 58~4374와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호 5와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 58~4374) 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 58~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1~4374) 또는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1~4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 58~4374와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 핵산 서열은 서열 번호 6과 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 58~4374) 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 58~4374를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1~4374) 또는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1~4374를 포함한다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 신호 펩타이드는 FVIII 신호 펩타이드이다. 일부 구현예에서, 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된다. 하나의 특정 구현예에서, 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 1~57; (ii) 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 1~57; (iii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~57; (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~57; (v) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1~57; (vi) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1~57; (vii) 서열 번호 70의 뉴클레오타이드 1~57; (viii) 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 1~57; 또는 (ix) 서열 번호 68의 뉴클레오타이드 1~57과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다.
서열 번호 1~6, 70 및 71은 서열 번호 16의 최적화된 버전, 출발 또는 "모" 또는 "야생형" FVIII 뉴클레오타이드 서열이다. 서열 번호 16은 B 도메인 결실된 인간 FVIII를 암호화한다. 서열 번호 1~6, 70 및 71이 FVIII(서열 번호 16)의 특이적 B 도메인 결실된 형태로부터 유래되지만, 본 발명이 FVIII의 다른 버전을 암호화하는 핵산의 최적화된 버전을 또한 포함한다고 이해되어야 한다. 예를 들어, FVIII의 다른 버전은 전장 FVIII, (본원에 기재된) FVIII의 다른 B 도메인 결실, 또는 FVIII 활성을 함유하는 FVIII의 다른 단편을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 2A-2F에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 2A에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 2B에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 2C에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 2D에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 2E에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 2F에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 FVIII 작제물을 포함한다
소정의 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 179, 182, 189 또는 194의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 179의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 182의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 189의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 194의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 기능적 FVIII 단백질을 발현하는 능력을 보유한다.
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일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 10A 및 표 10B에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 페닐알라닌 수산화효소(PAH) 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 10A에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PAH 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 유전적 카세트는 표 10B에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 PAH 작제물을 포함한다.
소정의 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 197 또는 198의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 197의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 198의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 기능적 페닐알라닌 수산화효소를 발현하는 능력을 보유한다.
A. 코돈 적응 지수
일 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열의 인간 코돈 적응 지수는 서열 번호 16에 비해 증가한다. 예를 들어, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75(75%), 적어도 약 0.76(76%), 적어도 약 0.77(77%), 적어도 약 0.78(78%), 적어도 약 0.79(79%), 적어도 약 0.80(80%), 적어도 약 0.81(81%), 적어도 약 0.82(82%), 적어도 약 0.83(83%), 적어도 약 0.84(84%), 적어도 약 0.85(85%), 적어도 약 0.86(86%), 적어도 약 0.87(87%), 적어도 약 0.88(88%), 적어도 약 0.89(89%), 적어도 약 0.90(90%), 적어도 약 0.91(91%), 적어도 약 0.92(92%), 적어도 약 0.93(93%), 적어도 약 0.94(94%), 적어도 약 0.95(95%), 적어도 약 0.96(96%), 적어도 약 0.97(97%), 적어도 약 0.98(98%), 또는 적어도 약 0.99(99%)인 인간 코돈 적응 지수를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약.88(88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약.91(91%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약.91 (97%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
하나의 특정 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 가지며; 뉴클레오타이드 서열의 인간 코돈 적응 지수는 서열 번호 16에 비해 증가한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75(75%), 적어도 약 0.76(76%), 적어도 약 0.77(77%), 적어도 약 0.78(78%), 적어도 약 0.79(79%), 적어도 약 0.80(80%), 적어도 약 0.81(81%), 적어도 약 0.82(82%), 적어도 약 0.83(83%), 적어도 약 0.84(84%), 적어도 약 0.85(85%), 적어도 약 0.86(86%), 적어도 약 0.87(87%), 적어도 약 0.88(88%), 적어도 약 0.89(89%), 적어도 약 0.90(90%), 또는 적어도 약 0.91(91%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약.88(88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약.91(91%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374, 또는 (ii) 서열 번호 6의 1792~2277 및 2320~4374와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 가지며; 뉴클레오타이드 서열의 인간 코돈 적응 지수는 서열 번호 16에 비해 증가한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75(75%), 적어도 약 0.76(76%), 적어도 약 0.77(77%), 적어도 약 0.78(78%), 적어도 약 0.79(79%), 적어도 약 0.80(80%), 적어도 약 0.81(81%), 적어도 약 0.82(82%), 적어도 약 0.83(83%), 적어도 약 0.84(84%), 적어도 약 0.85(85%), 적어도 약 0.86(86%), 적어도 약 0.87(87%), 또는 적어도 약 0.88(88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약.83(83%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약.88(88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택되는 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열의 인간 코돈 적응 지수는 서열 번호 16에 비해 증가한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75(75%), 적어도 약 0.76(76%), 적어도 약 0.77(77%), 적어도 약 0.78(78%), 적어도 약 0.79(79%), 적어도 약 0.80(80%), 적어도 약 0.81(81%), 적어도 약 0.82(82%), 적어도 약 0.83(83%), 적어도 약 0.84(84%), 적어도 약 0.85(85%), 적어도 약 0.86(86%), 적어도 약 0.87(87%), 또는 적어도 약 0.88(88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.75 (75%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.83 (83%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.88 (88%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.91 (91%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다. 다른 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 0.97 (97%)인 인간 코돈 적응 지수를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 최적 코돈의 빈도(FOP: frequency of optimal codon)가 증가한다. 소정의 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열의 FOP는 적어도 약 40, 적어도 약 45, 적어도 약 50, 적어도 약 55, 적어도 약 60, 적어도 약 64, 적어도 약 65, 적어도 약 70, 적어도 약 75, 적어도 약 79, 적어도 약 80, 적어도 약 85, 또는 적어도 약 90이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 상대 동의 코돈 용법(RCSU: relative synonymous codon usage)이 증가한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자의 RCSU는 1.5 초과이다. 다른 구현예에서, 단리된 핵산 분자의 RCSU는 2.0 초과이다. 소정의 구현예에서, 단리된 핵산 분자의 RCSU는 적어도 약 1.5, 적어도 약 1.6, 적어도 약 1.7, 적어도 약 1.8, 적어도 약 1.9, 적어도 약 2.0, 적어도 약 2.1, 적어도 약 2.2, 적어도 약 2.3, 적어도 약 2.4, 적어도 약 2.5, 적어도 약 2.6, 또는 적어도 약 2.7이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 유효 코돈 수가 감소한다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 약 50 미만, 약 45 미만, 약 40 미만, 약 35 미만, 약 30 미만, 또는 약 25 미만의 유효 코돈 수를 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 약 40, 약 35, 약 30, 약 25, 또는 약 20의 유효 코돈 수를 갖는다.
B. G/C 함량 최적화
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에서의 G/C 뉴클레오타이드의 백분율과 비교하여 더 높은 백분율의 G/C 뉴클레오타이드를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59% 또는 적어도 약 60%인 G/C 함량을 갖는다.
하나의 특정 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖고; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 가지며; 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에서의 G/C 뉴클레오타이드의 백분율과 비교하여 더 높은 백분율의 G/C 뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57% 또는 적어도 약 58%인 G/C 함량을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 58%인 G/C 함량을 갖는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374; (ii) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374; (iii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374), 또는 (iv) 서열 번호 6의 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에서의 G/C 뉴클레오타이드의 백분율과 비교하여 더 높은 백분율의 G/C 뉴클레오타이드를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 45%, 적어도 약 46%, 적어도 약 47%, 적어도 약 48%, 적어도 약 49%, 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56% 또는 적어도 약 57%인 G/C 함량을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 52%인 G/C 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 55%인 G/C 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 57%인 G/C 함량을 갖는다.
다른 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택되는 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에서의 G/C 뉴클레오타이드의 백분율과 비교하여 더 높은 백분율의 G/C 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 45%인 G/C 함량을 갖는다. 하나의 특정 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 52%인 G/C 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 55%인 G/C 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 57%인 G/C 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 58%인 G/C 함량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 적어도 약 60%인 G/C 함량을 갖는다.
"G/C 함량"(또는 구아닌-시토신 함량) 또는 "G/C 뉴클레오타이드의 백분율"은 구아닌 또는 시토신 중 어느 하나인 DNA 분자에서의 질소성 염기의 백분율을 지칭한다. G/C 함량은 하기 식을 이용하여 계산될 수 있다:
Figure pct00026
인간 유전자는 이의 G/C 함량이 매우 불균일하고, 여러 유전자는 20%만큼 낮은 G/C 함량을 갖고, 다른 유전자는 95%만큼 높은 G/C 함량을 갖는다. 일반적으로, G/C 풍부 유전자가 더 고도로 발현된다. 사실상, 유전자의 G/C 함량의 증가는, 주로 전사의 증가 및 더 높은 정상 상태 mRNA 수준으로 인해, 유전자 발현의 증가를 초래할 수 있음이 입증되었다. 문헌[Kudla et al., PLoS Biol., 4(6): e180 (2006)] 참조.
C. 매트릭스 부착 영역-유사 서열
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 또는 최대 2개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 1개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 MARS/ARS 서열을 함유하지 않는다.
하나의 특정한 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 또는 최대 2개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 1개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 MARS/ARS 서열을 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374; (ii) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374; (iii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374); 또는 (iv) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 또는 최대 2개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 1개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 MARS/ARS 서열을 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 또는 최대 2개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 1개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 MARS/ARS 서열을 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 또는 최대 2개의 MARS/ARS 서열을 함유한다. (Fallux et al., Mol. Cell. Biol. 16:4264-4272 (1996). 이들 요소 중 하나는 시험관내 핵 인자에 결합하고 클로람페니콜 아세틸전환효소(CAT) 리포터 유전자의 발현을 억제하는 것으로 입증되었다. Id. 이들 서열이 인간 FVIII 유전자의 전사 억제에 기여할 수 있다고 가설제기되었다. 따라서, 일 구현예에서, 모든 MAR/ARS 서열을 본 발명의 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열에서 없앤다. 모 FVIII 서열(서열 번호 16)에서 4개의 MAR/ARS ATATTT 서열(서열 번호 21) 및 3개의 MAR/ARS AAATAT 서열(서열 번호 22)이 있다. 이들 부위의 전부는 최적화된 FVIII 서열(서열 번호 1~6)에서 MAR/ARS 서열을 파괴하도록 돌연변이되었다. 이들 요소 각각의 위치, 및 최적화된 서열에서의 상응하는 뉴클레오타이드의 서열이 하기 표 3에 기재되어 있다.
Figure pct00027
Figure pct00028
D. 불안정화 서열
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 탈안정화 요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 또는 최대 5개의 탈안정화 요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 탈안정화 요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 탈안정화 요소를 함유하지 않는다.
하나의 특정 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 탈안정화 요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 또는 최대 5개의 불안정화 요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 탈안정화 요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 탈안정화 요소를 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374; (ii) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374; (iii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374); 또는 (iv) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 탈안정화 요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 또는 최대 5개의 불안정화 요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 탈안정화 요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 탈안정화 요소를 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 탈안정화 요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 또는 최대 5개의 탈안정화 요소를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 탈안정화 요소를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 탈안정화 요소를 함유하지 않는다.
모 FVIII 서열(서열 번호 16)에서 6개의 ATTTA 서열(서열 번호 23) 및 4개의 TAAAT 서열(서열 번호 24)인 10개의 탈안정화 요소가 있다. 일 구현예에서, 이들 부위의 서열은 최적화된 FVIII 서열 번호 1~6, 70 및 71에서의 불안정화 요소를 파괴하도록 돌연변이되었다. 이들 요소 각각의 위치, 및 최적화된 서열에서의 상응하는 뉴클레오타이드의 서열이 표 3에 기재되어 있다.
E. 잠재적 프로모터 결합 부위
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 또는 최대 5개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유하지 않는다.
하나의 특정 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 또는 최대 5개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374; (ii) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374; (iii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374); 또는 (iv) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 또는 최대 5개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 16에 비해 더 적은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 또는 최대 5개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 최대 4개, 최대 3개, 최대 4개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유한다. 또 다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 잠재적 프로모터 결합 부위를 함유하지 않는다.
TATA 박스는 진핵생물의 프로모터 영역에서 종종 발견되는 조절 서열이다. 이것은 일반 전사 인자인 TATA 결합 단백질(TBP)의 결합 부위로서 역할을 한다. TATA 박스는 보통 서열 TATAA(서열 번호 28) 또는 이와 밀접한 변이체를 포함한다. 그러나, 암호화 서열 내의 TATA 박스는 전장 단백질의 번역을 억제할 수 있다. 5개의 TATAA 서열(서열 번호 28) 및 5개의 TTATA 서열(서열 번호 29)인 야생형 BDD FVIII 서열(서열 번호 16)에서의 10개의 잠재적 프로모터 결합 서열이 있다. 일부 구현예에서, 프로모터 결합 부위 중 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개를 본 발명의 FVIII 유전자에서 없앤다. 일부 구현예에서, 프로모터 결합 부위 중 적어도 5개를 본 발명의 FVIII 유전자에서 없앤다. 다른 구현예에서, 프로모터 결합 부위 중 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개를 본 발명의 FVIII 유전자에서 없앤다. 일부 구현예에서, 프로모터 결합 부위 중 적어도 9개를 본 발명의 FVIII 유전자에서 없앤다. 하나의 특정 구현예에서, 모든 프로모터 결합 부위를 본 발명의 FVIII 유전자에서 없앤다. 각각의 잠재적 프로모터 결합 부위의 위치, 및 최적화된 서열에서의 상응하는 뉴클레오타이드의 서열이 표 3에 기재되어 있다.
F. 다른 시스 작용성 음성 조절 요소
상기 기재된 MAR/ARS 서열, 불안정화 요소 및 잠재적 프로모터 부위에 더하여, 여러 추가의 잠재적 억제 서열이 야생형 BDD FVIII 서열(서열 번호 16)에서 확인될 수 있다. 2개의 AU 풍부 서열 요소(ARE)는 비최적화된 BDD FVIII 서열에서 폴리-A 부위(AAAAAAA; 서열 번호 26), 폴리-T 부위(TTTTTT; 서열 번호 25) 및 스플라이스 부위(GGTGAT; 서열 번호 27)와 함께 확인될 수 있다(ATTTTATT(서열 번호 30); 및 ATTTTTAA(서열 번호 31)). 이들 요소 중 하나 이상이 최적화된 FVIII 서열로부터 제거될 수 있다. 이들 부위 각각의 위치, 및 최적화된 서열에서의 상응하는 뉴클레오타이드의 서열이 표 3에 기재되어 있다.
소정의 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 시스-작용성 음성 조절 요소, 예를 들어 스플라이스 부위, 폴리-T 서열, 폴리-A 서열, ARE 서열, 또는 임의의 이들의 조합을 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제2 핵산 서열은 (i) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374; (ii) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374; (iii) 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 1792~4374); 또는 (iv) 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 6의 뉴클레오타이드 1792~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 시스-작용성 음성 조절 요소, 예를 들어 스플라이스 부위, 폴리-T 서열, 폴리-A 서열, ARE 서열, 또는 임의의 이들의 조합을 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 시스-작용성 음성 조절 요소, 예를 들어 스플라이스 부위, 폴리-T 서열, 폴리-A 서열, ARE 서열, 또는 임의의 이들의 조합을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 스플라이스 부위 GGTGAT(서열 번호 27)를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 폴리-T 서열(서열 번호 25)를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 폴리-A 서열(서열 번호 26)를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 FVIII 폴리펩타이드의 N 말단 부분을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 FVIII 폴리펩타이드의 C 말단 부분을 암호화하는 제2 핵산 서열을 포함하고; 여기서, 제1 핵산 서열은 (i) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 58~1791; (ii) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 1~1791; (iii) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 58~1791; 또는 (iv) 서열 번호 4의 뉴클레오타이드 1~1791과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가지며; N 말단 부분 및 C 말단 부분은 함께 FVIII 폴리펩타이드 활성을 갖고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 ARE 요소(서열 번호 또는 서열 번호 31)를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 스플라이스 부위 GGTGAT(서열 번호 27)을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 폴리-T 서열(서열 번호 25)을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 폴리-A 서열(서열 번호 26)을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (i) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~4374 또는 (ii) 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 및 71로부터 선택된 아미노산 서열의 뉴클레오타이드 58~2277 및 2320~4374(즉, B 도메인 또는 B 도메인 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드가 없는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 70 또는 71의 뉴클레오타이드 58~4374)와 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 ARE 요소(서열 번호 30 또는 서열 번호 31))을 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명의 최적화된 FVIII 서열은 항바이러스 모티프, 스템-루프 구조 및 반복 서열 중 하나 이상을 포함하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 전사 개시 부위를 둘러싸고 있는 뉴클레오타이드는 코작 공통 서열(GCCGCCACCATGC(서열 번호 32), 여기서 밑줄이 그어진 뉴클레오타이드는 개시 코돈임)로 변경된다. 다른 구현예에서, 제한효소 부위를 부가하거나 제거하여 클로닝 과정을 용이하게 할 수 있다.
b. FIX 및 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화하고, 치료학적 단백질은 FIX 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 FIX 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 여기서 FIX 또는 이의 변이체 또는 단편은 FIX 활성을 갖는다.
인간 FIX는 혈액 응고 캐스케이드의 내재 경로의 중요 성분인 세린 프로테아제이다. 본원에 사용된 바와 같이 "IX 인자" 또는 "FIX"는 응고 인자 단백질 및 이의 종 및 서열 변이체를 지칭하며, 인간 FIX 전구체 폴리펩타이드("prepro")의 461 단쇄 아미노산 서열, 성숙 인간 FIX(서열 번호 125)의 415 단쇄 아미노산 서열, 및 R338 FIX(파두아) 변이체(서열 번호 126)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. FIX는 혈액 응고 FIX의 전형적인 특징을 갖는 임의의 형태의 FIX 분자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "IX 인자" 및 "FIX"는 도메인 Gla(γ-카복시글루탐산 잔기를 함유하는 영역), EGF1 및 EGF2(인간 상피 성장 인자에 상동성인 서열을 함유하는 영역), 활성화 펩타이드(성숙 FIX의 잔기 R136~R180에 의해 형성된 "AP"), 및 C 말단 프로테아제 도메인("Pro"), 또는 당업계에 알려진 이들 도메인의 동의어를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하도록 의도되거나, 천연 단백질의 생물학적 활성 중 적어도 일부를 보유한 절두된 단편 또는 서열 변이체일 수 있다. FIX 또는 서열 변이체는 미국 특허 4,770,999호 및 7,700,734호에 기재된 바와 같이 클로닝되었고, 인간 FIX를 암호화하는 cDNA는 발현 벡터 내로 단리되고 규명되고 클로닝되었다(예를 들어, 문헌[Choo et al., Nature 299:178-180 (1982); Fair et al., Blood 64:194-204 (1984); 및 Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461-6464 (1982)] 참조). Simioni 등(2009)에 의해 규명된 FIX 중 하나의 특정 변이체인 R338L FIX(파두아) 변이체(서열 번호 2)는 천연 FIX에 비해 파두아 변이체의 활성을 거의 8배 증가시키는 것과 상관되는 기능 획득 돌연변이(gain-of-function mutation)를 포함한다(표 4). FIX 변이체는 또한 FIX 폴리펩타이드의 FIX 활성에 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 임의의 FIX 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, FIX 변이체는 절단성 링커, 예를 들어 IDELVION®에 의해 융합된 rFIX-알부민을 포함한다. US 7,939,632호를 참조하고, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
FIX 폴리펩타이드는 3개의 영역으로 이루어진 프리프로폴리펩타이드 사슬(서열 번호 125)로 합성된 55 kDa이다: 28개의 아미노산(서열 번호 127의 아미노산 1 내지 28)의 단일 펩타이드, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화에 필요한 18개의 아미노산(아미노산 29 내지 46)의 프로펩타이드 및 415개의 아미노산(서열 번호 125 또는 126)의 성숙 IX 인자. 프로펩타이드는 감마-카복시글루탐산염 도메인에 대해 N 말단에 있는 18-아미노산 잔기 서열이다. 프로펩타이드는 비타민 K-의존성 감마 카복실라아제에 결합한 다음, 내인성 프로테아제에 의해, 거의 대부분은 PACE(쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소(paired basic amino acid cleaving enzyme); 퓨린 또는 PCSK3으로도 알려져 있음)에 의해 FIX의 전구체 폴리펩타이드로부터 절단된다. 감마 카복실화가 없으면, Gla 도메인은 음으로 하전된 인지질 표면에 단백질을 고정시키는 데 필요한 정확한 구조를 취하기 위해 칼슘에 결합할 수가 없어서, IX 인자를 비기능적으로 만든다. 비록 카복실화된다고 하더라도, 보유된 프로펩타이드가 칼슘과 인지질에 대한 최적 결합에 필요한 Gla 도메인의 구조 변화를 방해하므로, Gla 도메인은 또한 적절한 기능을 위해 프로펩타이드의 절단에 의존한다. 인간의 경우, 생성된 성숙 IX 인자는 약 17 중량%의 탄수화물을 함유하는 415개의 아미노산 잔기의 단쇄 단백질인 비활성 지모겐으로서 간 세포에 의해 혈류로 분비된다(Schmidt, A. E., et al. (2003) Trends Cardiovasc Med, 13: 39).
성숙 FIX는 N 말단에서 C 말단으로의 구성에 있어서의 여러 개의 도메인, 즉 GLA 도메인, EGR1 도메인, EFG2 도메인, 활성화 펩타이드(AP) 도메인 및 프로테아제(또는 촉매) 도메인으로 이루어진다. 짧은 링커는 EGF2 도메인을 AP 도메인과 연결시킨다. FIX는 R145-A146 및 R180-V181에 의해 각각 형성된 2개의 활성화 펩타이드를 함유한다. 활성화에 이어서, 단쇄 FIX는 2개의 사슬이 이황화 결합에 의해 연결된 2-사슬 분자가 된다. 응고 인자는 이들의 활성화 펩타이드를 대체하여 활성화 특이성을 변경하여 조작될 수 있다. 포유류의 경우, IXa 인자를 생성하기 위해서는 성숙 FIX가 활성화된 XI 인자에 의해 활성화되어야 한다. FIX가 활성화되어 FIXa가 되면, 프로테아제 도메인은 FIX의 촉매 활성을 제공한다. 활성화된 VIII 인자(FVIIIa)는 FIXa 활성의 완전 발현을 위한 특이적 보인자이다.
소정의 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 혈장 유래 FIX의 Thr148 대립유전자 형태를 포함하고, 내인성 FIX와 유사한 구조적 및 기능적 특징을 갖는다.
많은 기능적 FIX 변이체는 당업계에 공지되어 있다. 국제 공개 WO 02/040544 A3호는 4쪽 9~30행 및 15쪽 6~31행에서 헤파린에 의한 억제에 대해 내성 증가를 나타내는 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 WO 03/020764 A2호는 표 2와 3(14~24쪽) 및 12쪽 1~17행에서 T 세포 면역원성이 감소된 FIX 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 WO 2007/149406 A2호는 4쪽 1행 내지 19쪽 11행에서 단백질 안정성 증가, 생체내 및 시험관내 반감기 증가, 및 프로테아제에 대한 내성 증가를 나타내는 기능적 돌연변이 FIX 분자를 개시한다. WO 2007/149406 A2호는 또한 19쪽 12행 내지 20쪽 9행에서 키메라 및 다른 변이체 FIX 분자를 개시한다. 국제 공개 WO 08/118507 A3호는 5쪽 14행 및 6쪽 5행에서 내성 증가를 나타내는 FIX 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 WO 09/051717 A2호는 9쪽 11행 내지 20쪽 2행에서 N 연결 및/또는 O 연결 글리코실화 부위의 수가 증가하여 반감기 및/또는 회수가 증가된 FIX 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 WO 09/137254 A2호는 또한 2쪽 [006]단락 내지 5쪽 [011] 단락 및 16쪽 [044] 단락 내지 24쪽 [057] 단락에서 글리코실화 부위의 수가 증가된 IX 인자 돌연변이체를 개시한다. 국제 공개 WO 09/130198 A6호는 4쪽 26행 내지 12쪽 6행에서 글리코실화 부위의 수가 증가하여 반감기가 증가된 기능적 돌연변이 FIX 분자를 개시한다. 국제 공개 WO 09/140015 A2호는 11쪽 [0043] 단락 내지 13쪽 [0053] 단락에서 중합체(예: PEG) 접합에 사용될 수 있는 Cys 잔기의 수가 증가된 기능적 FIX 돌연변이체를 개시한다. 2011년 7월 11일에 출원되고, 2012년 1월 12일에는 WO 2012/006624호로 공개된 국제 공제 PCT/US2011/043569호에 기재된 FIX 폴리펩타이드도 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 알부민, 예를 들어 FIX-알부민에 융합된 FIX 폴리펩타이드를 포함한다. 소정의 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 IDELVION® 또는 rIX-FP이다.
또한, FIX에서의 수 백 개의 비기능적 돌연변이체가 혈우병 대상체에서 확인되었으며, 이 중 많은 부분이 국제 공개 WO 09/137254 A2호의 11~14쪽에 있는 표 6에 개시되어 있다. 이러한 비기능적 돌연변이체는 본 발명에 포함되어 있지 않지만, 어떤 돌연변이체가 기능적 FIX 폴리펩타이드를 생성할 다소의 가능성이 있는지에 대한 추가적인 지침을 제공한다.
일 구현예에서, FIX 폴리펩타이드(또는 융합 폴리펩타이드의 IX 인자 부분)는 서열 번호 1 또는 2에 기재된 서열(서열 번호 125 또는 126의 아미노산 1~415), 또는 대안적으로, 프로펩타이드 서열과, 또는 프로펩타이드 및 신호 서열(전장 FIX)과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, FIX 폴리펩타이드는 서열 번호 2에 기재된 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
FIX의 응고 활성은 국제 단위(IU)로서 표현된다. FIX 활성의 1 IU는 1 mL의 정상 인간 혈장 중 FIX의 양에 대략 상응한다. 일단계 응고 분석(활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간; PTT), 트롬빈 생성 시간(TGA) 및 회전식 트롬보 탄성측정(ROTEM®)을 포함하는 여러 가지 분석법이 FIX 활성의 측정에 사용될 수 있다. 본 발명은 FIX 서열에 상동성인 서열; 인간, 비인간 영장류, 포유류(가축을 포함함)와 같은 천연인 서열 단편; 및 FIX의 생물학적 활성 또는 생물학적 기능의 적어도 일부를 보유하고/하거나 응고 인자 관련 질환, 결핍, 장애 또는 병태(예를 들어, 응고 인자의 결핍으로 인한, 외상이나 수술과 관련된 출혈 사례)의 예방하거나 치료하거나 매개하거나 개선하는 데 유용한 비천연 서열 변이체를 고려한다. FIX 인간에 상동성인 서열은 NCBI BLAST와 같은 표준 상동성 검색 기술에 의해 발견될 수 있다.
소정의 구현예에서, FIX 서열은 코돈 최적화된다. 코돈 최적화된 FIX 서열의 예는 국제 공보 WO 2016/004113 A1호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)의 서열 번호 1 및 54~58을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
c. FVII 및 FVII 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열
일부 구현예에서, 핵산 분자 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화하고, 치료학적 단백질은 VII 인자 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, FVII 폴리펩타이드는 FVII 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하고, 여기서 이의 변이체 또는 단편은 FVII 활성을 갖는다.
"VII 인자"("FVII" 또는 "F7"; 7 인자, 응고 VII 인자, 혈청 VII 인자, 혈청 프로트롬빈 전환 활성자, SPCA, 프로콘베르틴 및 엡타코그 알파라고도 칭함)는 응고 캐스케이드의 일부인 세린 프로테아제이다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 핵산에서의 응고 인자는 FVII이다. 재조합 활성화된 VII 인자("FVII")는 A 또는 B 혈우병, 응고 XI 인자의 결핍, FVII, 결함성 혈소판 기능, 혈소판감소증, 또는 폰빌레브란트병을 갖는 환자에서 발생하는 것과 같은 주요 출혈의 치료에 널리 사용되고 있다.
재조합 활성화된 FVII(rFVIIa; Novoseven®)는 (i) FVIII 또는 FIX(억제제)에 대한 중화 항체를 갖는 혈우병 환자, (ii) FVII 결핍을 갖는 환자, 또는 (iii) 수술 절차를 겪은 억제제에 의한 A 또는 B 혈우병을 갖는 환자에서 출혈 에피소드를 치료하기 위해 사용된다. 그러나, Novoseven®은 불량한 효능을 나타낸다. 높은 농도에서의 FVIIa의 반복 용량은 대개 조직 인자의 부재에서 활성화된 혈소판에 대한 이의 낮은 친화도, 짧은 반감기 및 불량한 효소 활성으로 인해 출혈을 조절하는데 필요하다. 따라서, FVIII 및 FIX 억제제 및/또는 FVII 결핍을 갖는 혈우병 환자에 대한 더 양호한 치료 및 예방 옵션을 위한 충족되지 않은 의학 필요가 있다.
일 구현예에서, 유전적 카세트는 FVII의 성숙 형태 또는 이의 변이체를 암호화한다. FVII는 Gla 도메인, 2개의 EGF 도메인(EGF-1 및 EGF-2), 및 예를 들어 키모트립신에 의한 것과 같은 세린 펩티다아제의 펩티다아제 S1 패밀리의 모든 구성원 중에서 고도로 보존된 세린 프로테아제 도메인(또는 펩티다아제 S1 도메인)을 포함한다. FVII는 단일 사슬 지모겐(즉, 활성화 가능한 FVII) 및 전부 활성화된 2-사슬 형태로 발생하다.
C. 성장 인자
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화하고, 치료학적 단백질은 성장 인자를 포함한다. 성장 인자는 당업계에 공지된 임의의 성장 인자로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 호르몬이다. 다른 구현예에서, 성장 인자는 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 케모카인이다.
일부 구현예에서, 성장 인자는 아드레노메둘린(AM)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 안지오포이에틴(Ang)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 자가분비 운동 인자이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 골 형태발생 단백질(BMP)이다. 일부 구현예에서, BMP는 BMP2, BMP4, BMP5 및 BMP7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 섬모 신경영양 인자 패밀리 구성원이다. 일부 구현예에서, 섬모 신경영양 인자 패밀리 구성원은 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터류킨-6(IL-6)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 콜로니 자극 인자이다. 일부 구현예에서, 콜로니 자극 인자는 대식세포 콜로니 자극 인자(m-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 표피 성장 인자(EGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 에프린이다. 일부 구현예에서, 에프린은 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2 및 에프린 B3으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 에리쓰로포이에틴(EPO)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(FGF)이다. 일부 구현예에서, FGF는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 및 FGF23으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 소 태아 소마토트로핀(FBS)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 GDNF 패밀리 구성원이다. 일부 구현예에서, GDNF 패밀리 구성원은 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 페르세핀 및 아르테민으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 성장 분화 인자-9(GDF9)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 간세포 성장 인자(HGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 간세포암 유래 성장 인자(HDGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인슐린이다. 일부 구현예에서, 성장 인자느 인슐린-유사 성장 인자이다. 일부 구현예에서, 인슐린-유사 성장 인자는 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 또는 IGF-2이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인터류킨(IL)이다. 일부 구현예에서, IL은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및 Il-7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 각질세포 성장 인자(KGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 이동 자극 인자(MSF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 대식세포 자극 단백질(MSP 또는 간세포 성장 인자-유사 단백질(HGFLP))이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 마이오스타틴(GDF-8)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 뉴레귤린이다. 일부 구현예에서, 뉴레귤린은 뉴레귤린 1(NRG1), NRG2, NRG3 및 NRG4로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 뉴트로트로핀이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 신경 성장 인자(NGF)이다. 일부 구현예에서, NGF는 뉴트로트로핀-3(NT-3) 또는 NT-4이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 태반 성장 인자(PGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 레날라아제(RNLS)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 T-세포 성장 인자(TCGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 트롬보포이에틴(TPO)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 형질전환 성장 인자이다. 일부 구현예에서, 형질전환 성장 인자는 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α) 또는 TGF-β이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)이다.
D. 마이크로 RNA(miRNA)
마이크로RNA(miRNA)는 번역을 억제하거나 메신저 RNA(mRNA) 분해를 유도하여 유전자 발현을 부정적으로 조절하는 소형 비암호화 RNA 분자(약 18-22개의 뉴클레오타이드)이다. 이의 발견 이후로, miRNA는 아폽토시스, 분화 및 세포 증식을 포함하는 다양한 세포 과정에 연루되고, 이들은 발암에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 유전자 발현을 조절하는 miRNA의 능력은 생체내 miRNA의 발현을 유전자 치료에서 귀중한 도구로 만든다.
본 발명의 소정의 양태는 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하는 플라스미드-유사 핵산 분자에 관한 것이고, 여기서 표적 서열은 miRNA를 암호화하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스의 ITR이다(예를 들어, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-AAV 유래임). miRNA는 당업계에 공지된 임의의 miRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 표적 유전자의 발현을 하향조절한다. 소정의 구현예에서, 표적 유전자는 SOD1, HTT, RHO, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 하나의 miRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 하나 초과의 miRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 2개 이상의 상이한 miRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 동일한 miRNA의 2개 이상의 카피를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 동일한 치료학적 단백질의 2개 이상의 변이체를 암호화한다. 소정의 구현예에서, 유전적 카세트는 하나 이상의 miRNA 및 하나 이상의 치료학적 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, miRNA는 천연 발생 miRNA이다. 일부 구현예에서, miRNA는 조작된 miRNA이다. 일부 구현예에서, miRNA는 인공 miRNA이다. 소정의 구현예에서, miRNA는 문헌[Evers et al., Molecular Therapy 26(9):1-15 (epub ahead of print June 2018).]에 의해 개시된 miHTT 조작된 miRNA를 포함한다. 소정의 구현예에서, miRNA는 문헌[Dirren et al., Annals of Clinical and Translational Neurology 2(2):167-84 (February 2015)]에 의해 개시된 miR SOD1 인공 miRNA를 포함한다. 소정의 구현예에서, miRNA는 RHO를 표적화하는 miR-708을 포함한다(문헌[Behrman et al., JCB 192(6):919-27 (2011)] 참조).
일부 구현예에서, miRNA는 유전자의 억제제의 발현을 하향조절하여 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 구현예에서, 억제제는 자연, 예를 들어 야생형, 억제제이다. 일부 구현예에서, 억제제는 돌연변이된, 이종성, 및/또는 잘못 발현된 유전자로부터 생긴다.
E. 이종성 모이어티
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR 및 표적 서열을 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화하고, 치료학적 단백질은 적어도 하나의 이종성 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 치료학적 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 치료학적 단백질 내에 2개의 아미노산 사이에 삽입된다.
일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 및 FVIII 폴리펩타이드 내에 2개의 아미노산 사이에 삽입된 이종성 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 표 5로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 FVIII 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 국제 공개 WO 2013/123457 A1호, WO 2015/106052 A1호 또는 미국 공보 2015/0158929 A1호(이들은 본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시된 임의의 부위에서 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 응고 인자 폴리펩타이드 내에 삽입될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 치료학적 단백질은 FVIII 및 이종성 모이어티를 포함하고, 여기서 이종성 모이어티는 성숙 FVIII에 대해 아미노산 745의 바로 하류에 FVIII 내에 삽입된다. 하나의 특정 구현예에서, 치료학적 단백질은 FVIII 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 성숙 FVIII에 대해 아미노산 745의 바로 하류에 FVIII 내에 삽입된다. 하나의 특정 구현예에서, FVIII는 성숙 인간 FVIII(서열 번호 15)에 상응하는 아미노산 746~1646의 결실을 포함하고, 이종성 모이어티는 성숙 인간 FVIII(서열 번호 15)에 상응하는 아미노산 745의 바로 하류에 삽입된다.
Figure pct00032
일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 FIX 폴리펩타이드 내에 2개의 아미노산 사이에 삽입된 이종성 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 표 5로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 일부 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 국제 출원 PCT/US2017/015879호(이는 본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시된 임의의 부위에서 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 응고 인자 폴리펩타이드 내에 삽입될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 치료학적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 이종성 모이어티를 포함하고, 여기서 이종성 모이어티는 성숙 FIX에 대해 아미노산 166의 바로 하류에 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다. 하나의 특정 구현예에서, 치료학적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 성숙 FVIII에 대해 아미노산 166의 바로 하류에 FIX 내에 삽입된다.
Figure pct00033
다른 구현예에서, 본 발명의 치료학적 단백질은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 이종성 모이어티는 동일하다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 이종성 모이어티는 다른 이종성 모이어티와 다르다. 일부 구현예에서, 본 발명은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 초과의 탠덤으로 된 이종성 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 치료학적 단백질의 반감기를 증가시킨다("반감기 연장제"임).
일부 구현예에서, 이종성 이어티는, 본 발명의 단백질에 혼입되는 경우, 생체내 반감기의 연장과 연관된 비구조화된 또는 구조화된 특징을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 비제한적인 예는 알부민, 알부민 단편, 면역글로불린의 Fc 단편, 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 아단위의 C 말단 펩타이드(CTP), HAP 서열, XTEN 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, PAS 폴리펩타이드, 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 알부민 결합 모이어티, 또는 이들 폴리펩타이드의 임의의 단편, 유도체, 변이체, 또는 조합을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 이종성 아미노산 서열은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부, 트랜스페린, 알부민 또는 PAS 서열이다. 일부 양태에서, 이종성 모이어티는 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 관련된 양태에서, 이종성 모이어티는 비폴리펩타이드 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 요소의 임의의 유도체, 변이체, 또는 조합에 대한 부착 부위(예를 들어, 시스테인 아미노산)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 이종성 모이어티는 비폴리펩타이드 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 요소의 임의의 유도체, 변이체, 또는 조합에 대한 부착 부위로서 기능을 하는 시스테인 아미노산을 포함한다.
하나의 구체적인 구현예에서, 제1 이종성 모이어티는 당업계에 공지된 반감기 연장 분자이고, 제2 이종성 모이어티는 당업계에 공지된 반감기 연장 분자이다. 소정의 구현예에서, 제1 이종성 모이어티(예를 들어, 제1 Fc 모이어티) 및 제2 이종성 모이어티(예를 들어, 제2 Fc 모이어티)는 이량체를 형성하도록 서로 회합된다. 일 구현예에서, 제2 이종성 모이어티는 제2 Fc 모이어티이고, 여기서 제2 Fc 모이어티는 제1 이종성 모이어티, 예를 들어 제1 Fc 모이어티에 연결되거나 이것과 회합된다. 예를 들어, 제2 이종성 모이어티(예를 들어, 제2 Fc 모이어티)는 링커에 의해 제1 이종성 모이어티(예를 들어, 제1 Fc 모이어티)에 연결되거나 공유 또는 비공유 결합에 의해 제1 이종성 모이어티와 회합될 수 있다.
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 적어도 약 10개, 적어도 약 100개, 적어도 약 200개, 적어도 약 300개, 적어도 약 400개, 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 700개, 적어도 약 800개, 적어도 약 900개, 적어도 약 1000개, 적어도 약 1100개, 적어도 약 1200개, 적어도 약 1300개, 적어도 약 1400개, 적어도 약 1500개, 적어도 약 1600개, 적어도 약 1700개, 적어도 약 1800개, 적어도 약 1900개, 적어도 약 2000개, 적 어도 약 2500개, 적어도 약 3000개 또는 적어도 약 4000개의 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 폴리펩타이드이다. 다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 약 100개 내지 약 200개의 아미노산, 약 200개 내지 약 300개의 아미노산, 약 300개 내지 약 400개의 아미노산, 약 400개 내지 약 500개의 아미노산, 약 500개 내지 약 600개의 아미노산, 약 600개 내지 약 700개의 아미노산, 약 700개 내지 약 800개의 아미노산, 약 800개 내지 약 900개의 아미노산, 또는 약 900개 내지 약 1000개의 아미노산을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 폴리펩타이드이다.
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 이의 생물학적 활성 또는 기능에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 치료학적 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 개선한다.
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 본 발명의 치료학적 단백질의 생체내 및/또는 시험관내 반감기를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 본 발명의 치료학적 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, FVIII 단백질의 단백질분해 절단 후의 이종성 모이어티를 포함하는 단편)의 가시화 또는 국재화를 용이하게 한다. 본 발명의 치료학적 단백질 또는 이의 단편의 가시화 및/또는 국재화는 생체내, 시험관내, 생체외, 또는 이들의 조합일 수 있다.
다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 본 발명의 치료학적 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 치료학적 단백질, 예를 들어 응고 인자의 단백질분해 절단 후의 이종성 모이어티를 포함하는 단편)의 안정성을 증가시킨다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "안정성"은 환경 조건(예를 들어, 상승되거나 저하된 온도)에 반응하여 치료학적 단백질의 하나 이상의 물리적 특성을 유지하는 것에 대한 당업계에 인정된 척도를 지칭한다. 소정의 양태에서, 물리적 특성은 치료학적 단백질의 공유적 구조의 유지(예를 들어, 단백질분해 절단, 원하지 않는 산화 또는 탈아미드화의 부재)일 수 있다. 다른 양태에서, 물리적 특성은 또한 적절히 폴딩된 상태의 치료학적 단백질의 존재(예를 들어, 가용성 또는 불용성 응집물 또는 침전물의 부재)일 수 있다. 일 양태에서, 치료학적 단백질의 안정성은 치료학적 단백질의 생물물리학적 특성, 예를 들어 열 안정성, pH 비폴딩 프로파일, 글리코실화의 안정한 제거, 용해도, 생화학적 기능(예를 들어, 단백질, 수용체 또는 리간드에 결합하는 능력) 등, 및/또는 이들의 조합을 평가하여 측정된다. 다른 양태에서, 생화학적 기능은 상호작용의 결합 친화도에 의해 입증된다. 일 양태에서, 단백질 안정성의 척도는 열 안정성, 즉 열 자극에 대한 저항성이다. 안정성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), SEC(크기 배제 크로마토그래피), DLS(동적 광 산란) 등을 이용하여 측정될 수 있다. 열 안정성을 측정하는 방법은 시차 주사 열량계(DSC), 시차 주사 형광측정법(DSF), 원편광 이색성(CD) 및 열 자극 분석법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
소정의 양태에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 치료학적 단백질은 적어도 하나의 반감기 연장제, 즉 이종성 모이어티가 결여된 상응하는 치료학적 단백질의 생체내 반감기와 관련하여 치료학적 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 이종성 모이어티를 포함한다. 치료학적 단백질의 생체내 반감기는 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 활성 분석법(예를 들어, 색소생산성 분석법 또는 1단계 응고 aPTT 분석법, 여기서 치료학적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드를 포함함), ELISA, ROTEM® 등에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 반감기 연장제의 존재는 이러한 하나 이상의 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 반감기와 비교하여 치료학적 단백질의 반감기가 증가되게 한다. 반감기 연장제를 포함하는 치료학적 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 치료학적 단백질의 생체내 반감기보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배 또는 적어도 약 12배 더 길다.
일 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료학적 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 생체내 반감기보다 약 1.5배 내지 약 20배, 약 1.5배 내지 약 15배 또는 약 1.5배 내지 약 10배 더 길다. 다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료학적 단백질의 반감기는 이러한 반감기 연장제가 결여된 상응하는 단백질의 생체내 반감기와 비교하여 약 2배 내지 약 10배, 약 2배 내지 약 9배, 약 2배 내지 약 8배, 약 2배 내지 약 7배, 약 2배 내지 약 6배, 약 2배 내지 약 5배, 약 2배 내지 약 4배, 약 2배 내지 약 3배, 약 2.5배 내지 약 10배, 약 2.5배 내지 약 9배, 약 2.5배 내지 약 8배, 약 2.5배 내지 약 7배, 약 2.5배 내지 약 6배, 약 2.5배 내지 약 5배, 약 2.5배 내지 약 4배, 약 2.5배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 10배, 약 3배 내지 약 9배, 약 3배 내지 약 8배, 약 3배 내지 약 7배, 약 3배 내지 약 6배, 약 3배 내지 약 5배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 6배, 약 5배 내지 약 7배, 또는 약 6배 내지 약 8배 연장된다.
다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료학적 단백질의 반감기는 적어도 약 17시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 19시간, 적어도 약 20시간, 적어도 약 21시간, 적어도 약 22시간, 적어도 약 23시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 25시간, 적어도 약 26시간, 적어도 약 27시간, 적어도 약 28시간, 적어도 약 29시간, 적어도 약30시간, 적어도 약 31시간, 적어도 약 32시간, 적어도 약 33시간, 적어도 약 34시간, 적어도 약 35시간, 적어도 약 36시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 60시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 84시간, 적어도 약 96시간 또는 적어도 약 108시간이다.
또 다른 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료학적 단백질의 반감기는 약 15시간 내지 약 2주, 약 16시간 내지 약 1주, 약 17시간 내지 약 1주, 약 18시간 내지 약 1주, 약 19시간 내지 약 1주, 약 20시간 내지 약 1주, 약 21시간 내지 약 1주, 약 22시간 내지 약 1주, 약 23시간 내지 약 1주, 약 24시간 내지 약 1주, 약 36시간 내지 약 1주, 약 48시간 내지 약 1주, 약 60시간 내지 약 1주, 약 24시간 내지 약 6일, 약 24시간 내지 약 5일, 약 24시간 내지 약 4일, 약 24시간 내지 약 3일 또는 약 24시간 내지 약 2일이다.
일부 구현예에서, 반감기 연장제를 포함하는 치료학적 단백질의 대상체당 평균 반감기는 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간(1일), 약 25시간, 약 26시간, 약 27시간, 약 28시간, 약 29시간, 약 30시간, 약 31시간, 약 32시간, 약 33시간, 약 34시간, 약 35시간, 약 36시간, 약 40시간, 약 44시간, 약 48시간(2일), 약 54시간, 약 60시간, 약 72시간(3일), 약 84시간, 약 96시간(4일), 약 108시간, 약 120시간(5일), 약 6일, 약 7일(1주), 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일 또는 약 14일이다.
하나 이상의 반감기 연장제는 치료학적 단백질의 C 말단 또는 N 말단에 융합되거나 치료학적 단백질 내에 삽입될 수 있다.
1. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부
다른 양태에서, 이종성 모이어티는 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 영역)를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부를 암호화하는 이종성 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 Fc 영역이다.
면역글로불린 불변 영역은 CH(불변 중쇄) 도메인(CH1, CH2 등)으로 칭해지는 도메인으로 이루어진다. 아아이소타입(즉, IgG, IgM, IgA IgD 또는 IgE)에 따라, 불변 영역은 3개 또는 4개의 CH 도메인으로 이루어질 수 있다. 몇몇 아아이소타입(예를 들어, IgG) 불변 영역은 또한 힌지 영역을 함유한다. 문헌[Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.] 참조.
본 발명의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 그러나, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부가 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그) 또는 비인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있음이 이해된다. 더욱이, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 면역글로불린 아아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 인간 아아이소타입 IgG1을 사용한다.
다양한 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열(예를 들어, 인간 불변 영역 유전자 서열)은 공개적으로 접근가능한 기탁의 형태로 이용가능하다. 면역원성을 감소시키기 위해 특정한 변형을 갖거나 특정한 이펙터 기능을 갖는(또는 특정한 이펙터 기능이 결여된) 불변 영역 도메인 서열이 선택될 수 있다. 항체 및 항체 암호화 유전자의 많은 서열은 공개되어 있고, 적합한 Ig 불변 영역 서열(예를 들어, 힌지, CH2, 및/또는 CH3 서열, 또는 이의 일부)은 당업계에서 인지된 기술을 이용하여 이들 서열로부터 유래될 수 있다. 그후, 임의의 전술한 방법을 이용하여 얻은 유전 물질은 본 발명의 폴리펩타이드를 얻도록 변경되거나 합성될 수 있다. 본 발명의 범주가 불변 영역 DNA 서열의 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포함한다는 것이 추가로 인식될 것이다.
예를 들어, 관심 도메인을 증폭시키도록 선택되는 프라이머 및 폴리머라아제 연쇄 반응을 사용하여 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부의 서열이 클로닝될 수 있다. 항체로부터의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부의 서열의 클로닝을 위해, mRNA가 하이브리도마, 비장 또는 림프 세포로부터 단리되고, DNA로 역전사되고, 항체 유전자가 PCR에 의해 증폭될 수 있다. PCR 증폭 방법은 미국 특허 4,683,195호; 미국 특허 4,683,202호; 미국 특허 4,800,159호; 미국 특허 4,965,188호; 및 예를 들어 문헌["PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270]에 상세하게 기술되어 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열에 기초하여 공통 불변 영역 프라이머 또는 더 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 클론을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 이 경우에, 라이브러리는 공통 프라이머 또는 더 큰 상동성 프로브, 예컨대 마우스 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자의 증폭에 적합한 많은 프라이머 세트가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 정제된 항체의 N 말단 서열에 기초한 5' 프라이머(문헌[Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509]); cDNA 말단의 신속한 증폭(문헌[Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33]); 항체 리더 서열(문헌[Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250])에 상세하게 기술되어 있다. 항체 서열의 클로닝은 1995년 1월 25일자로 출원된 Newman 등의 미국 특허 5,658,570호(본원에 참고로 포함됨)에 추가로 기술되어 있다.
본원에 사용되는 면역글로불린 불변 영역은 모든 도메인 및 힌지 영역 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 CH2 도메인, CH3 도메인 및 힌지 영역, 즉 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "Fc 영역"은 천연 Ig의 Fc 영역에 상응하는 폴리펩타이드의 일부, 즉 이의 2개의 중쇄의 각각의 Fc 도메인의 이량체 회합에 의해 형성된 것으로 정의된다. 천연 Fc 영역은 다른 Fc 영역과 동종이량체를 형성한다. 반대로, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "유전자 융합된 Fc 영역" 또는 "단쇄 Fc 영역"(scFc 영역)은 단일 폴리펩타이드 사슬 내의 유전자 연결된(즉, 단일 인접 유전자 서열 형태로 암호화된) Fc 도메인으로 이루어진 합성 이량체 Fc 영역을 지칭한다. 국제 공개 2012/006635호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨) 참고.
일 구현예에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG 내의 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 첫 번째 잔기가 114인 것으로 함)의 바로 상류의 힌지 영역에서 시작하여 항체의 C 말단에서 종료되는 단일 Ig 중쇄의 일부를 지칭한다. 따라서, 완전한 Fc 영역은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 FcRn 결합 파트너일 수 있다. FcRn은 성인 상피 조직에서 활성이고, 장의 내강, 폐 기도, 코 표면, 질 표면, 결장 및 직장 표면에서 발현된다(미국 특허 6,485,726호). FcRn 결합 파트너는 FcRn에 결합하는 면역글로불린의 일부이다.
FcRn 수용체는 인간을 포함하는 몇몇 포유류 종으로부터 단리되었다. 인간 FcRn, 원숭이 FcRn, 래트 FcRn 및 마우스 FcRn의 서열은 공지되어 있다(문헌[Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377]). FcRn 수용체는 비교적 낮은 pH에서 IgG에 결합하고(그러나 다른 면역글로불린 클래스, 예컨대 IgA, IgM, IgD 및 IgE에는 결합하지 않음), 내강에서 장막 방향으로 세포경유로 IgG를 능동적으로 수송하고, 그후 간질액에서 발견되는 비교적 더 높은 pH에서 IgG를 방출한다. 이것은 폐 및 장 상피(문헌[Israel et al. 1997, Immunology 92:69]), 신장 근위 세뇨관 상피(문헌[Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358]), 및 코 상피, 질 표면 및 담도계 표면을 포함하는, 성인 상피 조직(미국 특허 6,485,726호, 6,030,613호, 6,086,875호; WO 03/077834호; US2003-0235536A1호)에서 발현된다.
본 발명에서 유용한 FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn 수용체의 완전한 결합 영역을 포함하는 다른 단편을 포함하여 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 포함한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X선 결정학에 기초하여 기술되었다(문헌[Burmeister et al. 1994, Nature 372:379]). Fc와 FcRn의 주요 접촉 부위는 CH2 도메인과 CH3 도메인의 접합부에 가깝게 있다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 파트너는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn의 완전한 결합 영역을 포함하는 IgG의 다른 단편을 포함한다. 주요 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 잔기 248, 250~257, 272, 285, 288, 290~291, 308~311 및 314 및 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385~387, 428 및 433~436을 포함한다. 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편 또는 영역의 아미노산 넘버링에 대하여 이루어진 언급은 모두 문헌[Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.]에 기초한다.
FcRn에 결합된 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너는 FcRn에 의해 상피 장벽을 가로질러 효과적으로 셔틀링될 수 있어서, 원하는 치료학적 분자를 전신으로 투여하기 위한 비침습적인 수단을 제공한다. 추가로, Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너를 포함하는 융합 단백질은 FcRn을 발현하는 세포에 의해 내포작용된다. 그러나 분해에 대해 표시되는 것 대신에, 이 융합 단백질은 다시 순환계로 재순환되어서, 이 단백질의 생체내 반감기가 증가된다. 소정의 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역의 일부는 전형적으로 이황화 결합 및 다른 비특이적 상호작용을 통해 다른 Fc 영역 또는 다른 FcRn 결합 파트너와 회합하여 이량체 및 더 높은 차수의 다량체를 형성하는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너이다.
2개의 FcRn 수용체는 단일 Fc 분자에 결합될 수 있다. 결정학적 데이터는 각각의 FcRn 분자가 Fc 동종이량체의 단일 폴리펩타이드에 결합됨을 제시한다. 일 구현예에서, 생물학적 활성 분자에 FcRn 결합 파트너, 예를 들어 IgG의 Fc 단편을 연결하는 것은 경구로, 협측으로, 설하로, 직장으로, 질로, 비강 투여되는 에어로졸로서 또는 폐 경로를 통해, 또는 안구 경로를 통해 생물학적 활성 분자를 전달하는 수단을 제공한다. 다른 구현예에서, 응고 인자 단백질은 침습적으로, 예를 들어 피하로, 정맥내로 투여될 수 있다.
FcRn 결합 파트너 영역은 FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있어 그 결과 Fc 영역의 FcRn 수용체에 의해 능동적으로 수송되는 분자 또는 이의 일부이다. 특이적으로 결합된이라는 것은 2개의 분자가 생리학적 조건 하에 비교적 안정한 복합체를 형성함을 지칭한다. 특이적 결합은 보통 내지는 높은 능력과 함께 저 친화도를 보통 갖는 비특이적 결합과 구별되는 바와 같이 높은 친화도 및 낮은 내지는 보통의 능력을 특징으로 한다. 전형적으로, 결합은 친화도 상수 KA가 106 M-1 초과 또는 108 M-1 초과인 경우 특이적인 것으로 여겨진다. 필요한 경우, 결합 조건을 변화시킴으로써 특이적 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않고도 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 적절한 결합 조건, 예컨대 분자의 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합에 허용된 시간, 차단제(예를 들어, 혈청 알부민, 밀크 카세인)의 농도 등은 일상적인 기술을 이용하여 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 치료학적 단백질은 하나 이상의 절두된 Fc 영역(이는 그럼에도 불구하고 Fc 수용체(FcR) 결합 특성을 Fc 영역에 부여하기에 충분함)을 포함한다. 예를 들어, FcRn에 결합하는 Fc 영역의 일부(즉, FcRn 결합 부분)는 IgG1의 대략 아미노산 282~438(EU 넘버링(1차 접촉 부위는 CH2 도메인의 아미노산 248, 250~257, 272, 285, 288, 290~291, 308~311 및 314 및 CH3 도메인의 아미노산 잔기 385~387, 428 및 433~436임))을 포함한다. 따라서, 본 발명의 Fc 영역은 FcRn 결합 부분을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. FcRn 결합 부분은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 아이소타입의 중쇄로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 인간 아이소타입 IgG1의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다. 다른 구현예에서, 인간 아이소타입 IgG4의 항체로부터의 FcRn 결합 부분이 사용된다.
Fc 영역은 다수의 상이한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩타이드의 Fc 영역은 인간 면역글로불린으로부터 유래된다. 그러나, Fc 모이어티가 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그) 또는 비인간 영장류(예를 들어, 침팬지, 마카크) 종을 포함하는 다른 포유류 종의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있음이 이해된다. 더욱이, Fc 도메인의 폴리펩타이드 또는 이의 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 이소형 IgG1이 사용된다.
소정의 구현예에서, Fc 변이체는 상기 야생형 Fc 도메인을 포함하는 Fc 모이어티에 의해 부여된 적어도 하나의 이펙터 기능의 변경(예를 들어, Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII) 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q)에 결합하거나, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 식세포작용 또는 보체 의존성 세포독성(CDCC)을 촉발하기 위한 Fc 영역의 능력의 개선 또는 감소)을 부여한다. 다른 구현예에서, Fc 변이체는 조작된 시스테인 잔기를 제공한다.
본 발명의 Fc 영역은 이펙터 기능 및/또는 FcR 또는 FcRn 결합의 변경(예를 들어, 향상 또는 감소)을 부여하는 것으로 공지된 당업계에서 인정된 Fc 변이체를 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 Fc 영역은 국제 PCT 공보 WO88/07089A1호, WO96/14339A1호, WO98/05787A1호, WO98/23289A1호, WO99/51642A1호, WO99/58572A1호, WO00/09560A2호, WO00/32767A1호, WO00/42072A2호, WO02/44215A2호, WO02/060919A2호, WO03/074569A2호, WO04/016750A2호, WO04/029207A2호, WO04/035752A2호, WO04/063351A2호, WO04/074455A2호, WO04/099249A2호, WO05/040217A2호, WO04/044859호, WO05/070963A1호, WO05/077981A2호, WO05/092925A2호, WO05/123780A2호, WO06/019447A1호, WO06/047350A2호, 및 WO06/085967A2호; 미국 특허 공보 US2007/0231329호, US2007/0231329호, US2007/0237765호, US2007/0237766호, US2007/0237767호, US2007/0243188호, US20070248603호, US20070286859호, US20080057056호; 또는 미국 특허 5,648,260호; 5,739,277호; 5,834,250호; 5,869,046호; 6,096,871호; 6,121,022호; 6,194,551호; 6,242,195호; 6,277,375호; 6,528,624호; 6,538,124호; 6,737,056호; 6,821,505호; 6,998,253호; 7,083,784호; 7,404,956호, 및 7,317,091호(이들의 각각은 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 아미노산 위치 중 하나 이상에서의, 예를 들어, 변화(예를 들어, 치환)를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 특정한 변경(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산의 특정한 치환)이 하나 이상의 개시된 아미노산 위치에서 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 개시된 아미노산 위치에서의 상이한 변경(예를 들어, 당업계에 개시된 하나 이상의 아미노산 위치의 상이한 치환)이 이루어질 수 있다.
IgG의 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너는 FcRn에 의해 결합되는 변형된 IgG 또는 Fc 단편 또는 이의 일부를 생성하도록 잘 인정된 절차, 예컨대 부위 지정 돌연변이유발 등에 따라 변형될 수 있다. 이러한 변형은 FcRn 접촉 부위로부터 먼 변형, 및 FcRn에 대한 결합성을 보존하거나 심지어 향상시키는 접촉 부위 내의 변형을 포함한다. 예를 들어, 인간 IgG1 Fc(Fc1)에서의 하기 단일 아미노산 잔기는 FcRn에 대한 Fc 결합 친화도의 유의미한 손실 없이 치환될 수 있다: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, and K447A(여기서, 예를 들어 P238A는 238번 위치에서 야생형 프롤린이 알라닌에 의해 치환된 것을 나타냄). 예로서, 구체적인 구현예는 N297A 돌연변이를 혼입하여 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거한다. 알라닌에 더하여, 다른 아미노산이 상기 특정된 위치에서 야생형 아미노산을 치환할 수 있다. 돌연변이는 Fc 내로 단독으로 도입되어서, 천연 Fc와 구별되는 100개 초과의 Fc 영역을 생성할 수 있다. 추가로, 이들 개별 돌연변이의 2개, 3개 또는 그 이상의 조합이 함께 도입되어서, 수 백개가 넘는 Fc 영역을 생성할 수 있다.
소정의 상기 돌연변이는 Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너 상에 새로운 기능성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예는 N297A를 혼입하여 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 제거한다. 이 돌연변이의 효과는 면역원성을 감소시켜서, Fc 영역의 순환 반감기를 향상시키고, Fc 영역이 FcRn에 대한 친화도를 손상시키지 않으면서 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIIA에 결합할 수 없게 하는 것이다(문헌[Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591]). 상기 기술된 돌연변이로부터 생긴 새로운 기능성의 추가의 예로서, FcRn에 대한 친화도가 일부 경우에 야생형의 것을 넘어 증가될 수 있다. 이러한 친화도의 증가는 "온(on)" 속도의 증가, "오프(off)" 속도의 감소 또는 "온" 속도의 증가 및 "오프" 속도의 감소 둘 다를 반영할 수 있다. FcRn에 대한 친화도의 증가를 부여하는 것으로 생각되는 돌연변이의 예는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다(문헌[Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591]).
추가로, 적어도 3개의 인간 Fc 감마 수용체가 하부 힌지 영역, 일반적으로 아미노산 234~237 내에서 IgG 상의 결합 부위를 인식하는 것으로 보인다. 따라서, 새로운 기능성 및 잠재적인 감소된 면역원성의 다른 예는 예를 들어 인간 IgG1 "ELLG"(서열 번호 45)의 아미노산 233~236을 IgG2 "PVA"(1개의 아미노산 결실을 가짐)로부터의 상응하는 서열로 대체하여 이 영역의 돌연변이로부터 생길 수 있다. 이러한 돌연변이가 도입되었을 때 다양한 이펙터 기능을 매개하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII이 IgG1에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 및 Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
다른 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 제2 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부와 하나 이상의 이황화 결합을 형성하는 힌지 영역 또는 이의 일부에서의 아미노산 서열을 포함한다. 제2 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 제2 폴리펩타이드에 연결되어서, 치료학적 단백질과 제2 폴리펩타이드가 함께 있게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 인핸서 모이어티이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "인핸서 모이어티"는 치료학적 단백질의 활성을 향상시킬 수 있는 폴리펩타이드의 구성요소, 분자 또는 이의 단편을 지칭한다. 인핸서 모이어티는 예컨대 보인자일 수 있고, 여기서 치료학적 단백질은 응고 인자, 가용성 조직 인자(sTF) 또는 전응고 펩타이드이다. 따라서, 응고 인자의 활성화 시, 인핸서 모이어티는 응고 인자 활성을 향상시키도록 이용 가능하다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 치료학적 단백질은 Ig 불변 영역의 항원 독립적 이펙터 기능, 특히 단백질의 순환 반감기를 변경시키는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부에 대한 아미노산 치환(예를 들어, Fc 변이체)을 포함한다.
2. scFc 영역
다른 양태에서, 이종성 모이어티는 scFc(단쇄 Fc) 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 scFc 영역을 암호화하는 이종성 핵산 서열을 추가로 포함한다. scFc 영역은 Fc 펩타이드 링커에 의해 연결된 하나의 기능성 scFc 영역을 형성하기 위해 폴딩할(예를 들어, 분자내 또는 분자간 폴딩할) 수 있는 적어도 2개의 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 모이어티 또는 도메인(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상의 Fc 모이어티 또는 도메인))를 동일 선형 폴리펩타이드 사슬 내에 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 반감기를 개선하거나 면역 이펙터 기능(예를 들어, 항체 의존성 세포독성(ADCC), 식세포작용 또는 보체 의존성 세포독성(CDCC))을 촉발하고/하거나, 제조가능성을 개선하기 위해, 이의 scFc 영역을 통해, 적어도 하나의 Fc 수용체(예를 들어, FcRn, FcγR 수용체(예를 들어, FcγRIII) 또는 보체 단백질(예를 들어, C1q))에 결합될 수 있다.
3. CTP
다른 양태에서, 이종성 모이어티는 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 아단위의 1개의 C 말단 펩타이드(CTP) 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 재조합 단백질 내로 삽입된 하나 이상의 CTP 펩타이드는 이 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,712,122호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨) 참고.
예시적인 CTP 펩타이드는 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(서열 번호 33) 또는 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(서열 번호 34)를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 2009/0087411 A1호(참고로 포함됨) 참고.
4. XTEN 서열
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 하나 이상의 XTEN 서열, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "XTEN 서열"은 주로 작은 친수성 아미노산으로 구성된 천연 비발생, 실질적 비반복적 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩타이드를 지칭하고, 상기 서열은 생리학적 조건 하에 적은 정도의 2차 또는 3차 구조를 갖거나 2차 또는 3차 구조를 갖지 않는다. 이종성 모이어티로서, XTEN은 반감기 연장 모이어티로서 역할을 할 수 있다. 부가적으로, XTEN은 비제한적인 예로서 향상된 약동학 매개변수 및 용해도 특징을 포함하는 원하는 특성을 제공할 수 있다.
본 발명의 단백질로의 XTEN 서열을 포함하는 이종성 모이어티의 혼입은 다음의 유리한 특성 중 하나 이상을 단백질에 부여할 수 있다: 입체배좌 가요성, 향상된 수용해도, 높은 정도의 프로테아제 내성, 낮은 면역원성, 포유류 수용체에 대한 낮은 결합성 또는 증가된 유체역학(또는 스토크스(Stokes)) 반경.
소정의 양태에서, XTEN 서열은 더 긴 생체내 반감기 또는 증가된 곡선 하 면적(AUC)과 같이 약동학적 특성을 증가시킬 수 있어서, 본 발명의 단백질은 생체내 머물고, XTEN 이종성 모이어티가 없는 것을 제외하고는 동일한 단백질과 비교하여 증가된 시간 기간 동안 전응고 활성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 유용한 XTEN 서열은 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1200개, 1400개, 1600개, 1800개, 또는 2000개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 소정의 구현예에서, XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개의 아미노산 잔기, 30개 초과 내지 약 2500개의 잔기, 40개 초과 내지 약 2000개의 잔기, 50개 초과 내지 약 1500개의 잔기, 60개 초과 내지 약 1000개의 잔기, 70개 초과 내지 약 900개의 잔기, 80개 초과 내지 약 800개의 잔기, 90개 초과 내지 약 700개의 잔기, 100개 초과 내지 약 600개의 잔기, 110개 초과 내지 약 500개의 잔기 또는 120개 초과 내지 약 400개의 잔기를 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 하나의 특정 구현예에서, XTEN은 42개보다 긴 아미노산 및 144개보다 짧은 아미노산의 길이의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 XTEN 서열은 서열 모티프와 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 5개 내지 14개(예를 들어, 9개 내지 14개)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열의 하나 이상의 서열 모티프를 포함할 수 있고, 여기서 모티프는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 내지 6개 유형의 아미노산(예를 들어, 5개의 아미노산)을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. US 2010-0239554 A1호 참고.
일부 구현예에서, XTEN은 비중첩 서열 모티프를 포함하고, 여기서 서열의 약 80% 또는 적어도 약 85% 또는 적어도 약 90% 또는 약 91% 또는 약 92% 또는 약 93% 또는 약 94% 또는 약 95% 또는 약 96% 또는 약 97% 또는 약 98% 또는 약 99% 또는 약 100%는 표 7로부터 선택된 단일 모티프 패밀리로부터 선택된 비중첩 서열의 다수의 단위로 이루어져서 패밀리 서열을 생성한다. 본원에 사용된 바와 같이 "패밀리"는 XTEN이 단지 표 7로부터의 단일 모티프 카테고리로부터 선택된 모티프; 즉 AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC, 또는 BD XTEN을 갖고, 패밀리 모티프로부터의 것이 아닌 XTEN에서의 임의의 다른 아미노산이 필요한 특성을 달성하도록, 예컨대 암호화 뉴클레오타이드에 의한 제한효소 부위의 혼입, 절단 서열의 혼입을 허용하거나 치료학적 단백질에 대한 더 양호한 연결을 달성하도록 선택된다는 것을 의미한다. XTEN 패밀리의 일부 구현예에서, XTEN 서열은 AD 모티프 패밀리 또는 AE 모티프 패밀리 또는 AF 모티프 패밀리 또는 AG 모티프 패밀리 또는 AM 모티프 패밀리 또는 AQ 모티프 패밀리 또는 BC 패밀리 또는 BD 패밀리의 비중첩 서열 모티프의 다수의 단위를 포함하고, 생성된 XTEN은 상기 기술된 범위의 상동성을 나타낸다. 다른 구현예에서, XTEN은 표 7의 2개 이상의 모티프 패밀리로부터의 모티프 서열의 다중 단위를 포함한다. 이들 서열은, 하기에 더 충분히 기술된, 모티프의 아미노산 조성에 의해 부여된 순 전하, 친수화도, 2차 구조의 결여 또는 반복성의 결여와 같은 특성을 포함하는 원하는 물리적/화학적 특징을 달성하도록 선택될 수 있다. 이 단락에 기술된 상기에서의 구현예에서, XTEN 내로 혼입되는 모티프는 약 36개 내지 약 3000개의 아미노산 잔기의 XTEN을 달성하도록 본원에 기술된 방법을 이용하여 선택되고 조립될 수 있다.
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본 발명의 치료학적 단백질에서 이종성 모이어티로서 사용될 수 있는 XTEN 서열의 예는 예를 들어 미국 특허 공보 2010/0239554 A1호, 2010/0323956 A1호, 2011/0046060 A1호, 2011/0046061 A1호, 2011/0077199 A1호, 또는 2011/0172146 A1호, 또는 국제 출원 공보 WO 2010091122 A1호, WO 2010144502 A2호, WO 2010144508 A1호, WO 2011028228 A1호, WO 2011028229 A1호, 또는 WO 2011028344 A2호에 개시되어 있으며, 이들의 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
XTEN은 치료학적 단백질 내로의 삽입 또는 이에 대한 연결을 위해 다양한 길이를 가질 수 있다. 일 구현예에서, XTEN 서열(들)의 길이는 융합 단백질에서 달성되는 특성 또는 기능에 기초하여 선택된다. 의도된 특성 또는 기능에 따라, XTEN은 캐리어로서 역할을 할 수 있는 짧은 길이 또는 중간 길이의 서열 또는 더 긴 서열일 수 있다. 소정의 구현예에서, XTEN은 약 6개 내지 약 99개의 아미노산 잔기의 짧은 분절, 약 100개 내지 약 399개의 아미노산 잔기의 중간 길이 및 약 400개 내지 약 1000개 및 최대 약 3000개의 아미노산 잔기의 더 긴 길이를 포함한다. 따라서, 치료학적 단백질 내로 삽입되거나 이에 연결된 XTEN은 약 6개, 약 12개, 약 36개, 약 40개, 약 42개, 약 72개, 약 96개, 약 144개, 약 288개, 약 400개, 약 500개, 약 576개, 약 600개, 약 700개, 약 800개, 약 864개, 약 900개, 약 1000개, 약 1500개, 약 2000개, 약 2500개 또는 최대 약 3000개의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, XTEN 서열은 약 6개 내지 약 50개, 약 50개 내지 약 100개, 약 100개 내지 150개, 약 150개 내지 250개, 약 250개 내지 400개, 약 400개 내지 약 500개, 약 500개 내지 약 900개, 약 900개 내지 1500개, 약 1500개 내지 2000개 또는 약 2000개 내지 약 3000개의 아미노산 잔기의 길이이다. 치료학적 단백질 내로 삽입되거나 이에 연결된 XTEN의 정확한 길이는 치료학적 단백질의 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 변할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 사용되는 XTEN 중 하나 이상은 42개의 아미노산, 72개의 아미노산, 144개의 아미노산, 288개의 아미노산, 576개의 아미노산 또는 864개의 아미노산의 길이를 갖고, 하나 이상의 XTEN 패밀리 서열; 즉, AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC 또는 BD로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 288개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 치료학적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 288개의 아미노산을 포함하고, XTEN은 FVIII 폴리펩타이드의 B 도메인 내에 삽입된다. 하나의 특정 구현예에서, 치료학적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 및 서열 번호 109를 포함하는 XTEN을 포함하고, XTEN은 FVIII 폴리펩타이드의 B 도메인 내에 삽입된다. 하나의 특정 구현예에서, 치료학적 단백질은 FVIII 폴리펩타이드 및 서열 번호 109를 포함하는 XTEN을 포함하고, XTEN은 성숙 FVIII의 아미노산 745의 바로 하류에 FVIII 폴리펩타이드 내에 삽입된다.
일부 구현예에서, 치료학적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 72개의 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 치료학적 단백질은 FIX 폴리펩타이드 및 XTEN을 포함하고, 여기서 XTEN은 72개의 아미노산을 포함하고, XTEN은 성숙 FIX의 아미노산 166의 바로 하류에 FIX 폴리펩타이드 내에 삽입된다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용된 XTEN 서열은 AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908, AG2004, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. US 2010-0239554 A1호 참고. 하나의 특정 구현예에서, XTEN은 AE42, AE72, AE144, AE288, AE576, AE864, AG 42, AG72, AG144, AG288, AG576, AG864, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 치료학적 단백질에서 이종성 모이어티로서 사용될 수 있는 예시적인 XTEN 서열은 XTEN AE42-4(서열 번호 47에 의해 암호화된 서열 번호 46), XTEN AE144-2A(서열 번호 49에 의해 암호화된 서열 번호 48), XTEN AE144-3B(서열 번호 51에 의해 암호화된 서열 번호 50), XTEN AE144-4A(서열 번호 53에 의해 암호화된 서열 번호 52), XTEN AE144-5A(서열 번호 55에 의해 암호화된 서열 번호 54), XTEN AE144-6B(서열 번호 57에 의해 암호화된 서열 번호 56), XTEN AG144-1(서열 번호 59에 의해 암호화된 서열 번호 58), XTEN AG144-A(서열 번호 61에 의해 암호화된 서열 번호 60), XTEN AG144-B(서열 번호 63에 의해 암호화된 서열 번호 62), XTEN AG144-C(서열 번호 65에 의해 암호화된 서열 번호 64), 및 XTEN AG144-F(서열 번호 67에 의해 암호화된 서열 번호 66)를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, XTEN은 서열 번호 18에 의해 암호화된다.
다른 구현예에서, XTEN 서열은 AE36(서열 번호 130), AE42(서열 번호 131), AE72(서열 번호 132), AE78(서열 번호 133), AE144(서열 번호 134), AE144_2A(서열 번호 48), AE144_3B(서열 번호 50), AE144_4A(서열 번호 52), AE144_5A(서열 번호 54), AE144_6B(서열 번호 135), AG144(서열 번호 136), AG144_A(서열 번호 137), AG144_B(서열 번호 62), AG144_C(서열 번호 64), AG144_F(서열 번호 66), AE288(서열 번호 138), AE288_2(서열 번호 139), AG288(서열 번호 140), AE576(서열 번호 141), AG576(서열 번호 142), AE864(서열 번호 143), AG864(서열 번호 144), XTEN_AE72_2A_1(서열 번호 145), XTEN_AE72_2A_2(서열 번호 146), XTEN_AE72_3B_1(서열 번호 147), XTEN_AE72_3B_2(서열 번호 148), XTEN_AE72_4A_2(서열 번호 149), XTEN_AE72_5A_2(서열 번호 150), XTEN_AE72_6B_1(서열 번호 151), XTEN_AE72_6B_2(서열 번호 152), XTEN_AE72_1A_1(서열 번호 153), XTEN_AE72_1A_2(서열 번호 154), XTEN_AE144_1A(서열 번호 155), AE150(서열 번호 156), AG150(서열 번호 157), AE294(서열 번호 158), AG294(서열 번호 159), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구체적인 구현예에서, XTEN 서열은 AE72, AE144 및 AE288로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 소정의 XTEN 서열에 대한 아미노산 서열은 표 8에 기재되어 있다.
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
일부 구현예에서, XTEN의 아미노산의 100% 미만은 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택되거나, 서열의 100% 미만은 본원에 제공된 XTEN 서열 또는 표 7로부터의 서열 모티프로 이루어진다. 이러한 구현예에서, XTEN의 나머지 아미노산 잔기는 임의의 다른 14개의 천연 L-아미노산으로부터 선택되지만, 친수성 아미노산으로부터 우선적으로 선택될 수 있어서, XTEN 서열은 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 약 99%의 친수성 아미노산을 함유한다. 접합 작제물에서 사용된 XTEN에서의 소수성 아미노산의 함량은 5% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만의 소수성 아미노산 함량일 수 있다. XTEN의 작축에 덜 선호되는 소수성 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 류신, 이소류신, 발린 및 메티오닌을 포함한다. 추가로, XTEN 서열은 하기 아미노산을 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만으로 함유하거나 함유할 수 있다: 메티오닌(예를 들어, 산화를 피하기 위해), 또는 아스파라긴 및 글루타민(탈아미드화를 피하기 위해).
하나 이상의 XTEN 서열은 치료학적 단백질의 C 말단 또는 N 말단에 삽입되거나 치료학적 단백질의 아미노산 서열에서의 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 치료학적 단백질이 FVIII 폴리펩타이드를 포함하는 경우, XTEN은 표 5로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 치료학적 단백질이 FIX 폴리펩타이드를 포함하는 경우, XTEN은 표 5로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 2개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 XTEN 서열의 추가적인 예는 미국 특허 공보 2010/0239554 A1호, 2010/0323956 A1호, 2011/0046060 A1호, 2011/0046061 A1호, 2011/0077199 A1호, 또는 2011/0172146 A1호, 또는 국제 특허 공보 WO 2010091122 A1호, WO 2010144502 A2호, WO 2010144508 A1호, WO 2011028228 A1호, WO 2011028229 A1호, WO 2011028344 A2호, WO 2014/011819 A2호, 또는 WO 2015/023891호에 개시되어 있다.
5. 알부민, 또는 이의 단편, 유도체 또는 변이체
일부 구현예에서, 이종성 모이어티는 알부민 또는 이의 기능성 단편을 포함한다. 전장 형태의 609개의 아미노산의 단백질인 인간 혈청 알부민(HSA, 또는 HA)은 혈청의 삼투압의 유의한 비율을 담당하고, 또한 내인성 및 외인성 리간드의 캐리어로서 역할을 한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "알부민"은 전장 알부민, 또는 이의 기능적 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체의 예는 미국 특허 공보 2008/0194481A1호, 2008/0004206 A1호, 2008/0161243 A1호, 2008/0261877 A1호, 또는 2008/0153751 A1호 또는 PCT 출원 공보 2008/033413 A2호, 2009/058322 A1호, 또는 2007/021494 A2호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 치료학적 단백질은 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부(예를 들어, Fc 영역), PAS 서열, HES, PEG 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 이종성 모이어티에 추가로 연결된 알부민, 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
6. 알부민 결합 모이어티
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 알부민 결합 펩타이드, 박테리아 알부민 결합 도메인, 알부민 결합 항체 단편, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 알부민 결합 모이어티이다.
예를 들어, 알부민 결합 단백질은 박테리아 알부민 결합 단백질, 항체 또는 항체 단편(도메인 항체를 포함함)일 수 있다(미국 특허 6,696,245호 참조). 알부민 결합 단백질은 예를 들어 박테리아 알부민 결합 도메인, 예컨대 스트렙토코커스 단백질 G의 것일 수 있다(문헌[Konig, T. and Skerra, A. (1998)　J. Immunol. Methods　218, 73-83]). 접합 파트너로서 사용될 수 있는 알부민 결합 펩타이드의 다른 예는 예를 들어 미국 특허 출원 2003/0069395호 또는 Dennis 등의 문헌[Dennis et al. (2002)　J. Biol. Chem.　277, 35035-35043]에 기술된 바와 같이 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 콘센서스 서열(여기서, Xaa1은 Asp, Asn, Ser, Thr 또는 Trp이며; Xaa2는 Asn, Gln, His, Ile, Leu 또는 Lys이며; Xaa3은 Ala, Asp, Phe, Trp 또는 Tyr이며; Xaa4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser 또는 Thr임)을 갖는 것이 있다.
문헌[Kraulis et al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996) and Linhult et al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)]에 개시된 바와 같은 스트렙토코커스 단백질 G로부터의 도메인 3은 박테리아 알부민 결합 도메인의 예이다. 알부민 결합 펩타이드의 예는 코어 서열 DICLPRWGCLW(서열 번호 35)를 갖는 일련의 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)] 참고. 알부민 결합 항체 단편의 예는 문헌[Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007); Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007), 및 Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)](본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시되어 있다. 이러한 알부민 결합 모이어티의 예는 문헌[Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20:2286-2292 (2009)]에 개시된 바와 같은 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-요오도페닐)부탄아미도) 헥사노에이트("Albu" 태그)이다.
지방산, 특히 장쇄 지방산(LCFA) 및 장쇄 지방산 유사 알부민 결합 화합물이 본 발명의 응고 인자 단백질의 생체내 반감기를 연장시키기 위해 사용될 수 있다. LCFA 유사 알부민 결합 화합물의 예는 16-(1-(3-(9-(((2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시)카보닐옥시)-메틸)-7-술포-9H-플루오렌-2-일아미노)-3-옥소프로필)-2,5-디옥소피롤리딘-3-일티오) 헥사데칸산이 있다(예를 들어, WO 2010/140148호 참조).
7. PAS 서열
다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 PAS 서열이다. 본원에 사용된 바와 같이 PAS 서열은 알라닌 및 세린 잔기를 주로 포함하거나 알라닌, 세린 및 프롤린 잔기를 주로 포함하는 아미노산 서열을 의미하고, 상기 아미노산 서열은 생리학적 조건 하에 랜덤 코일 배좌를 형성한다. 따라서, PAS 서열은 키메라 단백질에서 이종성 모이어티의 부분으로 사용될 수 있는 알라닌, 세린 및 프롤린을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 빌딩 블록, 아미노산 중합체 또는 서열 카세트이다. 그러나, 당업자는 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 잔기가 PAS 서열에서 부차적 구성성분으로서 부가되는 경우 아미노산 중합체가 또한 랜덤 코일 배좌를 형성할 수 있다는 것을 알고 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "부차적 구성성분"은 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 아미노산이 소정의 정도로, 예를 들어 최대 약 12%, 즉 PAS 서열의 100개 중 약 12개의 아미노산, 최대 약 10%, 즉 PAS 서열의 100개 중 약 10개의 아미노산, 최대 약 9%, 즉 100개 중 약 9개의 아미노산, 최대 약 8%, 즉 100개 중 약 8개의 아미노산, 약 6%, 즉 100개 중 약 6개의 아미노산, 약 5%, 즉 100개 중 약 5개의 아미노산, 약 4%, 즉 100개 중 약 4개의 아미노산, 약 3%, 즉 100개 중 약 3개의 아미노산, 약 2%, 즉 100개 중 약 2개의 아미노산, 약 1%, 즉 100개 중 약 1개의 아미노산까지 PAS 서열에서 부가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린 및 프롤린과는 다른 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
생리학적 조건 하에, PAS 서열 스트레치는 랜덤 코일 배좌를 형성하고 이에 의해 응고 인자 단백질에 대한 증가된 생체내 및/또는 시험관내 안정성을 매개할 수 있다. 랜덤 코일 도메인이 스스로 안정한 구조 또는 기능을 채택하지 않으므로, 응고 인자 단백질에 의해 매개된 생물학적 활성은 본질적으로 보존된다. 다른 구현예에서, 랜덤 코일 도메인을 형성하는 PAS 서열은 특히 혈장에서의 단백질분해, 면역원성, 등전점/정전기 거동, 세포 표면 수용체에 대한 결합 또는 내재화와 관련하여 생물학적으로 불활성이지만, 여전히 생분해성이고, 이는 합성 중합체, 예컨대 PEG에 비해 명확한 장점을 제공한다.
랜덤 코일 구성을 형성하는 PAS 서열의 비제한적인 예는 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(서열 번호 36), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(서열 번호 37), APSSPSPSAPSSPSPASPSS(서열 번호 38), APSSPSPSAPSSPSPASPS(서열 번호 39), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(서열 번호 40), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(서열 번호 41), ASAAAPAAASAAASAPSAAA(서열 번호 42) 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. PAS 서열의 추가의 예는 예를 들어 미국 특허 공보 2010/0292130 A1호 및 PCT 출원 공보 WO 2008/155134 A1호에 공지되어 있다.
8. HAP 서열
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 글리신 풍부 호모-아미노산 중합체(HAP)이다. HAP 서열은 적어도 50개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 120개의 아미노산, 140개의 아미노산, 160개의 아미노산, 180개의 아미노산, 200개의 아미노산, 250개의 아미노산, 300개의 아미노산, 350개의 아미노산, 400개의 아미노산, 450개의 아미노산 또는 500개의 아미노산의 길이를 갖는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, HAP 서열은 HAP 서열에 융합되거나 연결된 모이어티의 반감기를 연장시킬 수 있다. HAP 서열의 비제한적인 예는 (Gly)n, (Gly4Ser)n 또는 S(Gly4Ser)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20임)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 구현예에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40이다. 다른 구현예에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200이다.
9. 트랜스페린 또는 이의 단편
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 트랜스페린 또는 이의 단편이다. 임의의 트랜스페린이 본 발명의 응고 인자 단백질을 만들기 위해 사용될 수 있다. 예로서, 야생형 인간 TF(TF)는, 유전자 중복으로부터 기원하는 것으로 보이는, 2개의 주요 도메인, N(약 330개의 아미노산) 및 C(약 340개의 아미노산)를 갖는 대략 75 KDa(글리코실화를 설명하는 것이 아님)의 679개의 아미노산 단백질이다. GenBank 등록 번호 NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 및 S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov/)(이들은 모두 본원에 그 전체가 참고로 포함됨)을 참조한다. 트랜스페린은 2개의 도메인, N 도메인 및 C 도메인을 포함한다. N 도메인은 2개의 하위도메인, N1 도메인 및 N2 도메인을 포함하고, C 도메인은 2개의 하위도메인, C1 도메인 및 C2 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 트랜스페린 이종성 모이어티는 트랜스페린 스플라이스 변이체를 포함한다. 일 예에서, 트랜스페린 스플라이스 변이체는 인간 트랜스페린의 스플라이스 변이체, 예를 들어 Genbank 등록 번호 AAA61140일 수 있다. 다른 구현예에서, 키메라 단백질의 트랜스페린 부분은 트랜스페린 서열의 하나 이상의 도메인, 예를 들어 N 도메인, C 도메인, N1 도메인, N2 도메인, C1 도메인, C2 도메인 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
10. 클리어런스 수용체(clearance receptor)
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 클리어런스 수용체, 이의 단편, 변이체 또는 유도체이다. LRP1은 X 인자와 같은 다양한 단백질의 수용체 매개된 클리어런스에 관여된 600 kDa 내재성 막 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Narita et al., Blood 91:555-560 (1998)] 참조.
11. 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 단편
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 폰 빌레브란트 인자(VWF) 또는 하나 이상의 이의 단편이다.
VWF(F8VWF로도 알려짐)는 혈장에 존재하고 내피에서(바이벨-팔라드 소체에서), 거핵구(혈소판의 α-과립)에서 그리고 내피하 결합 조직에서 구성적으로 생성된 거대한 다량체 당단백질이다. 염기성 VWF 단량체는 2813개의 아미노산 단백질이다. 모든 단량체는 특이적 기능을 갖는 다수의 특이적 도메인, D' 및 D3 도메인(이들은 함께 VIII 인자에 결합됨), A1 도메인(이는 혈소판 GPIb-수용체, 헤파린, 및/또는 가능하게는 콜라겐에 결합됨), A3 도메인(이는 콜라겐에 결합됨), C1 도메인(여기서, RGD 도메인은 이것이 활성화되는 경우 혈소판 인테그린 αIIbβ3에 결합됨) 및 단백질의 C 말단에서의 "시스테인 노트(knot)" 도메인(VWF가 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자-β(TGFβ) 및 β-인간 융모성 생식선 자극호르몬(βHCG)과 공유함)을 함유한다.
인간 VWF에 대한 2813개의 단량체 아미노산 서열은 Genbank에서 등록 번호 NP000543.2로 보고된다. 인간 VWF를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 Genbank에서 등록 번호 NM000552.3으로 보고된다. 서열 번호 129는 서열 번호 128에 의해 암호화된 아미노산 서열이다. D' 도메인은 서열 번호 129의 아미노산 764~866을 포함한다. D3 도메인은 서열 번호 44의 아미노산 867~1240을 포함한다.
혈장에서, FVIII의 95~98%는 전장 VWF와 단단한 비공유 복합체로 순환한다. 이 복합체의 형성은 생체내 FVIIII의 적절한 혈장 수준의 유지에 중요하다. nting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). FVIII가 중쇄에서의 위치 372 및 740 및 경쇄에서의 위치 1689에서의 단백질분해로 인해 활성화될 때, FVIII에 결합된 VWF는 활성화된 FVIII으로부터 제거된다.
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 전장 폰 빌레브란트 인자이다. 다른 구현예에서, 이종성 모이어티는 폰 빌레브란트 인자 단편이다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "VWF 단편(들)"은 FVIII와 상호작용하고, 전장 VWF에 의해 FVIII에 보통 제공되는 적어도 하나 이상의 특성을 보유하여, 예를 들어 FVIIIa로의 조기 활성화를 방지하고/하거나, 조기 단백질분해를 방지하고/하거나, 조기 청소를 초래할 수 있는 인지질 막과의 회합을 방지하고/하거나, VWF 결합된 FVIII가 아니라 네이키드 FVIII에 결합될 수 있는 FVIII 클리어런스 수용체에 대한 결합을 방지하고/하거나, FVIII 중쇄 및 경쇄 상호작용을 안정화시키는 임의의 VWF 단편을 의미한다. 구체적인 구현예에서, 이종성 모이어티는 VWF의 D3 도메인 및 D' 도메인을 포함하는 (VWF) 단편이다. D' 도메인 및 D3 도메인을 포함하는 VWF 단편은 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, D1 도메인, D2 도메인, D4 도메인, B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, CK 도메인, 하나 이상의 이의 단편, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VWF 도메인을 추가로 포함할 수 있다. VWF 단편에 융합된 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드의 추가의 예는 미국 가특허 출원 61/667,901호(2012년 7월 3일 출원) 및 미국 공보 2015/0023959 A1호(이들 둘 다 본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
12. 링커 모이어티
소정의 구현예에서, 이종성 모이어티는 펩타이드 링커이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "펩타이드 링커" 또는 "링커 모이어티"는 폴리펩타이드 사슬의 선형 아미노산 서열에서 2개의 도메인을 연결하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 합성 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열)을 지칭한다.
일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 본 발명의 치료학적 단백질과 상기 기재된 이종성 모이어티, 예컨대 알부민 사이에 삽입될 수 있다. 펩타이드 링커는 키메라 폴리펩타이드 분자에 유연성을 제공할 수 있다. 링커는 전형적으로 절단되지 않지만, 이러한 절단이 바람직할 수 있다. 일 구현예에서, 이 링커는 프로세싱 동안 제거되지 않는다.
본 발명의 키메라 단백질에 존재할 수 있는 링커의 유형은 절단성 부위(즉, 프로테아제 절단 부위 기질, 예를 들어 Xia 인자, Xa 또는 트롬빈 절단 부위)를 포함하고, N 말단 또는 C 말단 또는 절단 부위의 양측에서 추가의 링커를 포함할 수 있는 프로테아제 절단성 링커이다. 이 절단성 링커는 본 발명의 작제물로 혼입되는 경우 이종성 절단 부위를 갖는 키메라 분자를 생성한다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 치료학적 단백질은 단일 폴리펩타이드 사슬에 포함된 Fc 영역을 형성하도록 cscFc 링커를 통해 연결된 2개 이상의 Fc 도메인 또는 모이어티를 포함한다. cscFc 링커는 적어도 하나의 세포내 프로세싱 부위, 즉 세포내 효소에 의해 절단되는 부위가 측접된다. 적어도 하나의 세포내 프로세싱 부위에서의 폴리펩타이드의 절단은 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 폴리펩타이드를 생성한다.
다른 펩타이드 링커는 예를 들어 응고 인자 단백질을 Fc 영역에 연결하기 위해 본 발명의 작제물에서 선택적으로 사용될 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 일부 예시적인 링커는 예를 들어 하기에 더 상세하게 기술된 GlySer 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 펩타이드 링커는 합성, 즉 천연 비발생이다. 일 구현예에서, 펩타이드 링커는 아미노산의 제1 선형 서열을 자연에서는 천연적으로는 연결되지 않거나 유전자 융합되지 않는 아미노산의 제2 선형 서열에 연결시키거나 유전자 융합시키는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(또는 폴리펩타이드)(천연 발생일 수 있거나 아닐 수 있음)를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서 펩타이드 링커는 천연 발생 폴리펩타이드의 변형된 형태(예를 들어, 돌연변이, 예컨대 부가, 치환 또는 결실을 포함)인 천연 비발생 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 천연 비발생 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 자연에서는 발생하지 않는 선형 서열에서 발생하는 천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 천연 발생 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 소정의 구현예에서, 펩타이드 링커는 동일한 Fc 모이어티를 융합시켜서, 동종이량체성 scFc 영역을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 상이한 Fc 모이어티들(예를 들어, 야생형 Fc 모이어티 및 Fc 모이어티 변이체)를 융합시켜서, 이종이량체성 scFc 영역을 형성하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 gly-ser 링커를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 일 구현예에서, scFc 또는 cscFc 링커는 면역글로불린 힌지의 적어도 일부 및 gly-ser 링커를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "gly-ser 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 이루어진 펩타이드를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 상기 gly-ser 링커는 펩타이드 링커의 2개의 다른 서열 사이에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, gly-ser 링커는 펩타이드 링커의 다른 서열의 일 말단 또는 양 말단에 부착된다. 또 다른 구현예에서, 2개 이상의 gly-ser 링커는 펩타이드 링커에서 시리즈로 혼입된다. 일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 상부 힌지 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유래)의 적어도 일부, 중간 힌지 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유래)의 적어도 일부 및 일련의 gly/ser 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 펩타이드 링커는 적어도 하나의 아미노산의 길이이고, 다양한 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 약 1개 내지 약 50개의 아미노산의 길이이다. 이 문맥에서 사용된 바와 같이 용어 "약"은 +/- 2개의 아미노산 잔기를 나타낸다. 링커 길이가 양의 정수이어야 하므로, 약 1개 내지 약 50개 아미노산 길이의 길이는 1개~3개로부터 48개~52개까지의 아미노산의 길이를 의미한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 약 10개 내지 약 20개의 아미노산의 길이이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 약 15개 내지 약 50개의 아미노산의 길이이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 약 20개 내지 약 45개의 아미노산의 길이이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 약 15개 내지 약 35개 또는 약 20개 내지 약 30개의 아미노산의 길이이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 500개, 1000개 또는 2000개의 아미노산의 길이이다. 일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 링커는 20개 또는 30개의 아미노산의 길이이다.
일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개의 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 펩타이드 링커는 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개 또는 적어도 1,000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 1600개, 1700개, 1800개, 1900개 또는 2000개의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 링커는 1개 내지 5개의 아미노산, 1개 내지 10개의 아미노산, 1개 내지 20개의 아미노산, 10개 내지 50개의 아미노산, 50개 내지 100개의 아미노산, 100개 내지 200개의 아미노산, 200개 내지 300개의 아미노산, 300개 내지 400개의 아미노산, 400개 내지 500개의 아미노산, 500개 내지 600개의 아미노산, 600개 내지 700개의 아미노산, 700개 내지 800개의 아미노산, 800개 내지 900개의 아미노산 또는 900개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있다.
펩타이드 링커는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 폴리펩타이드 서열로 도입될 수 있다. 변형은 DNA 서열 분석에 의해 확인될 수 있다. 생성되는 폴리펩타이드의 안정한 생성을 위해 숙주 세포를 형질전환하기 위해 플라스미드 DNA가 사용될 수 있다.
13. 단량체-이량체 하이브리드
일부 구현예에서, 본 발명의 치료학적 단백질은 응고 인자를 포함하는 단량체-이량체 하이브리드 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단량체-이량체 하이브리드"는 이황화 결합에 의해 서로 회합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 키메라 단백질을 의미하고, 제1 사슬은 응고 인자, 예를 들어 FVIII 및 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 사슬은 응고 인자가 없는 제2 Fc 영역을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 단량체-이량체 하이브리드 작제물은 따라서 적어도 하나의 응고 인자를 갖는 단량체 양태 및 2개의 Fc 영역을 갖는 이량체 양태를 포함하는 하이브리드이다.
14. 발현 제어 서열
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 적어도 하나의 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 발현 제어 서열은 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합과 같은 임의의 조절 뉴클레오타이드 서열인데, 이들이 작동가능하게 연결되는 암호화 핵산의 효율적인 전사 및 번역을 수월하게 한다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자는 적어도 하나의 전사 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 유전자 발현 제어 서열은 예를 들어 포유류 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다.
구성적 포유류 프로모터는 히포크산틴 포스포리보실 전달효소(HPRT), 아데노신 디아미나아제, 피루브산 키나아제, 베타-액틴 프로모터 및 기타 구성적 프로모터의 유전자를 위한 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus), 시미안 바이러스(예를 들어, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복체(LTR), 및 기타 레트로바이러스 유래의 프로모터, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나아제 프로모터를 포함한다. 다른 구성적 프로모터가 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 또한 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에 발현된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 소정의 금속 이온의 존재 하에 전사 및 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터가 당업자에게 공지되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 조직 특이적 프로모터 및/또는 인핸서의 제어 하에서의 전이유전자의 발현을 포함한다. 다른 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 선택적으로 간 세포에서의 전이유전자의 발현을 향상시킨다. 소정의 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 선택적으로 간세포, 동양혈관 세포, 및/또는 내피 세포에서의 전이유전자의 발현을 향상시킨다. 하나의 특정 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 선택적으로 내피 세포에서의 전이유전자의 발현을 향상시킨다. 소정의 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 선택적으로 근육 세포, 중추 신경계, 눈, 간, 심장, 또는 임의의 이들의 조합에서의 전이유전자의 발현을 향상시킨다. 간 특이적 프로모터의 예는 마우스 타이레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 VIII 인자 프로모터(F8), 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터 및 마우스 알부민 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 프로모터는 mTTR 프로모터를 포함한다. mTTR 프로모터는 문헌[R. H. Costa et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4697]에 기재되어 있다. F8 프로모터는 문헌[Figueiredo and Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간 특이적 프로모터(예를 들어, α1-안티트립신 (AAT)), 근육 특이적 프로모터(예를 들어, 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB) 및 데스민(DES)), 합성 프로모터(예를 들어, SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK 및 tMCK) 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 프로모터는 마우스 타이레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 VIII 인자 프로모터(F8), 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, TTPp, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, α1-안티트립신(AAT), 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 데스민(DES), SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK 및 tMCK, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
발현 수준은 하나 이상의 인핸서를 사용하여 치료학적 효능을 달성하도록 추가로 향상될 수 있다. 하나 이상의 인핸서는 단독으로 또는 하나 이상의 프로모터 요소와 함께 제공될 수 있다. 전형적으로, 발현 제어 서열은 복수의 인핸서 요소 및 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일 구현예에서, 인핸서는 α-1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서의 하나 이상의 카피를 포함한다(문헌[Rouet et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773; Rouet et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404; Rouet et al., 1998, Biochem. J. 334:577-584; Ill et al., 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30]). 다른 구현예에서, 인핸서는 EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6과 같은 간 특이적 전사 인자의 결합 부위로부터 유래되며, Enh1은 HNF1, (센스)-HNF3, (센스)-HNF4, (안티센스)-HNF1, (안티센스)-HNF6, (센스)-EBP, (안티센스)-HNF4(안티센스)를 포함한다.
특정 예에서, 본 발명에 유용한 프로모터는 GenBank Ay661265호로도 공지된 서열 번호 69(즉, ET 프로모터)를 포함한다. 또한, 문헌[Vigna et al., Molecular Therapy 11(5):763 (2005)] 참고. 다른 적합한 벡터 및 유전자 조절 요소의 예는 WO 02/092134호, EP1395293호, 또는 미국 특허 6,808,905호, 7,745,179호, 또는 7,179,903호(이들은 본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 인트론 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 FVIII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 천연 발생 인트론 서열이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 합성 서열이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 천연 발생 인트론 서열로부터 유래된다. 소정의 구현예에서, 인트론 서열은 SV40 작은 T 인트론을 포함한다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 서열 번호 115를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 전사후 조절 요소를 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 전사후 조절 요소는 돌연변이된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 전사후 조절 요소는 서열 번호 120을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 마이크로RNA(miRNA) 결합 부위를 포함한다. 일 구현예에서, miRNA 결합 부위는 miR-142-3p에 대한 miRNA 결합 부위이다. 다른 구현예에서, miRNA 결합 부위는 본원에 그 전체가 참고로 포함된 문헌[Rennie et al., RNA Biol. 13(6):554-560 (2016)] 및 http://sfold.wadsworth.org/starmirDB.php에서 이용 가능한 STarMirDB에 의해 개시된 miRNA 결합 부위로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 DNA 핵 표적화 서열(DTS)을 포함한다. DTS는 핵으로의 이러한 서열을 함유하는 DNA 분자의 전좌를 촉진한다. 소정의 구현예에서, DTS는 SV40 인핸서 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, DTS는 c-Myc 인핸서 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DTS는 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 있다. 일부 구현예에서, DTS는 제1 ITR에 3'이고, 치료학적 단백질에 5'이다. 다른 구현예에서, DTS는 치료학적 단백질에 3'이고, 제2 ITR에 5'이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함한다. 일 구현예에서, 3' UTR 폴리(A) 꼬리는 액틴 폴리(A) 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 3' UTR 폴리(A) 꼬리는 헤모글로빈 폴리(A) 부위를 포함한다.
하나의 특정 구현예에서, 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 서열 번호 122를 포함한다.
III. 조직 특이적 발현
소정의 구현예에서, 예를 들어 응고 인자 전이유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 벡터 내에 포함시키는 것이 유용할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 응고 인자 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되거나 또는 달리 벡터 내에 삽입된 적어도 하나의 miRNA 서열 표적을 제공한다. 벡터에 포함된 miRNA 표적 서열의 하나 초과의 카피는 시스템의 효율성을 증가시킬 수 있다. 상이한 miRNA 표적 서열도 또한 포함된다. 예를 들어, 하나 초과의 전이유전자을 발현하는 벡터는 동일하거나 상이할 수 있는 하나 초과의 miRNA 표적 서열의 제어 하의 전이유전자를 가질 수 있다. miRNA 표적 서열은 탠덤으로 있을 수 있지만, 다른 배열도 포함된다. miRNA 표적 서열을 함유하는 전이유전자 발현 카세트는 또한 안티센스 배향으로 벡터 내에 삽입될 수 있다. 안티센스 배향은 생산자 세포에 독성이 있을 수 있는 유전자 산물의 발현을 피하기 위한 바이러스 입자의 생산에 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 동일하거나 상이한 miRNA 표적 서열의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개 카피를 포함한다. 그러나, 소정의 다른 구현예에서, 벡터는 어떠한 miRNA 표적 서열도 포함하지 않을 것이다. miRNA 표적 서열을 포함할지 여부(및 몇 개를 포함할지 여부)의 선택은 의도된 조직 표적, 필요한 발현 수준 등과 같은 공지된 매개변수에 의해 지도될 것이다.
일 구현예에서, 표적 서열은 골수성 수임 전구세포에서 가장 효과적으로 발현을 차단하고 더 원시적인 HSPC에서 적어도 부분적으로 발현을 차단하는 것으로 보고된 miR-223 표적이다. miR-223 표적은 과립구, 단핵구, 대식세포, 골수성 수지상 세포를 포함하는 분화된 골수성 세포에서 발현을 차단할 수 있다. miR-223 표적은 또한 림프계 또는 적혈구 계통에서 강력한 전이유전자 발현에 의존하는 유전자 치료 분야에 적합할 수 있다. miR-223 표적은 또한 인간 HSC에서 매우 효과적으로 발현을 차단할 수 있다.
다른 구현예에서, 표적 서열은 miR142 표적(tccataaagt aggaaacact aca(서열 번호 43))이다. 일 구현예에서, 벡터는 miR-142 표적 서열의 4개의 카피를 포함한다. 소정의 구현예에서, miR-142(142T)와 같은 조혈-특이적 마이크로RNA의 상보성 서열은 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터(LV)의 3' 비번역 영역 내로 혼입되어, 전이유전자-암호화 전사체가 miRNA 매개된 하향조절에 민감해지게 만든다. 이 방법에 의해, 조혈 계통 항원 제시 세포(APC)에서는 전이유전자 발현이 방지될 수 있는 한편, 비조혈 세포에서는 유지될 수 있다(문헌[Brown et al., Nat Med 2006]). 이 전략은 전이유전자 발현에 엄격한 전사후 제어를 부과할 수 있고 따라서 전이유전자의 안정적인 전달 및 장기간 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, miR-142 조절은 형질도입된 세포의 면역 매개된 청소를 방지하고/하거나 항원-특이적 조절 T 세포(T reg)를 유도하고 전이유전자-암호화된 항원에 대한 강력한 면역학적 내용성을 매개한다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 miR181 표적이다. 문헌[Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165]에는 마우스 골수 내에서 B 세포에서 특이적으로 발현되는 miRNA인 miR-181이 개시되어 있다(문헌[Chen and Lodish, 2005]). 이것에는 또한 일부 인간 miRNA가 백혈병과 관련됨이 개시되어 있다.
표적 서열은 miRNA에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보성일 수 있다. 용어 "완전히 상보성인"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 대해 100% 상보성인 핵산 서열을 가짐을 의미한다. 용어 "부분적으로 상보성인"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 대해 단지 부분적으로 상보성이며, 이에 의해 부분적 상보성 서열이 여전히 miRNA에 의해 인식된다는 것을 의미한다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 맥락에서 부분적 상보성 표적 서열은 상응하는 miRNA를 인식하고 그 miRNA를 발현하는 세포에서 전이유전자 발현의 방지 또는 감소를 수행하는 데 효과적이다. miRNA 표적 서열의 예는 WO2007/000668호, WO2004/094642호, WO2010/055413호, 또는 WO2010/125471호에 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 간에 표적화된다. 소정의 구현예에서, 전이유전자 발현은 간세포에 표적화된다. 다른 구현예에서, 전이유전자 발현은 내피 세포에 표적화된다. 하나의 특정 구현예에서, 전이유전자 발현은 내인성 FVIII를 자연적으로 발현하는 임의의 조직에 표적화된다.
일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 중추 신경계에 표적화된다. 소정의 구현예에서, 전이유전자 발현은 뉴런에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 구심성 뉴런에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 원심성 뉴런에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 뉴런간에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 신경교 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 성상뉴런에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 희소돌기아교세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 미세아교세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 상의 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 슈반 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 위성 세포에 표적화된다.
일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 근육 조직에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 평활근에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 심근육에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 골격근에 표적화된다.
일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 눈에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 광수용체 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 전이유전자 발현은 망막 신경절 세포에 표적화된다.
IV. 숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 "형질전환"은 유전형을 바꾸고 결과적으로 수여 세포의 변화를 야기하는 수여 숙주 세포로의 DNA의 도입을 지칭하는 넒은 의미로 사용되어야 한다.
"숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 암호화하는 벡터로 형질전환된 세포를 지칭한다. 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게는 포유류 기원; 가장 바람직하게는 인간 또는 마우스 기원이다. 당업자는 이의 목적에 맞는 특정 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력이 있는 것으로 여겨진다. 예시적인 숙주 세포는 CHO, DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소주, DHFR 음성), HELA(인간 경부암종), CVI(원숭이 신장주), COS(SV40 T 항원을 가지는 CVI 의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3(마우스 섬유아세포), HAK(햄스터 신장주), SP2/O(마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), PER.C6®, NS0, CAP, BHK21 및 HEK 293을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 하나의 특정 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6® 세포, NS0 세포, CAP 세포 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 곤충 기원이다. 하나의 특정 구현예에서, 숙주 세포는 SF9 세포이다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스인 아메리칸 티슈 컬쳐 컬렉션(American Tissue Culture Collection) 또는 공개된 문헌으로부터 이용가능하다.
숙주 세포로의 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터의 도입은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 이것은 형질감염(전기영동 및 전기천공을 포함함), 원형질 융합, 인산칼슘 침전법, 세포와 엔벨로핑된(enveloped) DNA의 융합, 미세주입, 및 온전한 바이러스를 이용한 감염을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 문헌[Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)] 참고. 가장 바람직하게는, 숙주로의 플라스미드 도입은 전기천공을 통한다. 형질전환된 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적절한 조건 하에 생장하고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 평가된다. 예시적인 분석 기술은 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA), 방사면역검정법(RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류 분석법(FACS), 면역조직화학법 등을 포함한다.
본 발명의 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포는 적절한 성장 배지에서 성장한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지를 의미한다. 세포 성장에 필요한 영양소는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 미네랄 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 배지는 하나 이상의 선택 인자를 함유할 수 있다. 선택적으로, 배지는 소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청(FCS)을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 배지는 실질적으로 IgG를 함유하지 않는다. 성장 배지는 일반적으로 예를 들어 약물 선택 또는 DNA 작제물 상의 선별 마커에 의해 보완되거나 DNA 작제물로 동시형질주입된 필수 영양소의 결핍에 의해 DNA 작제물을 함유하는 세포를 선택할 것이다. 배양된 포유류 세포는 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 혈청 함유 또는 혈청 비함유 배지(예를 들어, MEM, DMEM, DMEM/F12)에서 성장한다. 일 구현예에서, 배지는 CDoptiCHO(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드)이다. 다른 구현예에서, 배지는 CD17(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드)이다. 사용된 특정 세포주에 적절한 배지의 선택은 당업자의 수준 내에 있다.
V. 폴리펩타이드의 제조
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 암호화된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 의해 생산된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 또한 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드가 제조되는 조건 하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현은 기준 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 서열 번호 16, 모 FVIII 유전자 서열)을 포함함을 제외하고는 동일한 조건 하에 배양된 숙주 세포에 비해 증가한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드가 핵산 분자에 의해 발현되는 조건 하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 방법을 제공하고, 여기서 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 발현은 기준 핵산 분자(예를 들어, 서열 번호 16, 모 FVIII 유전자 서열)를 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 숙주 세포에 비해 증가한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드가 본원에 개시된 핵산 분자에 의해 생성되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 수율을 개선하는 방법을 제공하고, 여기서 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드의 수율은 기준 핵산 서열(예를 들어, 서열 번호 16, 모 FVIII 유전자 서열)을 포함하는 동일한 조건 하에 배양된 숙주 세포에 비해 증가한다.
본 발명의 응고 인자와 같은 치료학적 단백질은 설치류, 염소, 양, 돼지 또는 소와 같은 형질전환 동물에서 합성될 수 있다. 용어 "형질전환 동물"은 외래 유전자가 게놈으로 혼입된 비인간 동물을 지칭한다. 이 유전자가 생식선 조직에 존재하므로, 이것은 부모에서 자손으로 전달된다. 외인성 유전자는 단일 세포 배아로 도입된다(Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82:4438). 형질전환 동물을 제조하는 방법은 면역글로불린 분자를 생산하는 형질전환체를 포함하여 당업계에 공지되어 있다(Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al. 1983, Cell 34 : 335; Brinster et al. 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al. 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59 : 831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267).
VII. 약제학적 조성물
본 발명의 핵산 분자, 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 벡터, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물은 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 이들은 활성 화합물을 작용 부위에 대한 전달용으로 설계된 제제로 가공하는 것을 수월하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 핵산 분자, 벡터, 폴리펩타이드 또는 숙주 세포; 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 전달제를 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 전달제는 지질 나노입자(LNP)를 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 리포솜, 다른 중합체성 분자 및 엑소좀을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "지질 나노입자"는 분자간 힘에 의해 서로와 물리적으로 회합된 복수의 지질 분자를 포함하는 나노입자를 지칭한다. 지질 나노입자는 예를 들어 마이크로구(단층 및 다층 소포, 예를 들어 리포솜 포함), 에멀션 중의 분산된 상, 현탁액 중의 마이셀 또는 내부 상일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 캡슐화하는 지질 나노입자 숙주를 포함할 수 있는 캡슐화된 핵산 분자 조성물을 제공한다. 지질 나노입자는 하나 이상의 지질(예를 들어, 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 PEG 변형된 지질)을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 지질 나노입자는 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자를 하나 이상의 표적 세포에 전달하도록 제형화된다. 적합한 지질의 예는 제한 없이 포스파티딜 화합물(예를 들어, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 강글리오사이드 및 세레브로사이드)을 포함한다. "양이온성 지질"은 소정의 pH(예를 들어, 생리학적 pH)에서 순 양전하를 보유하는 임의의 지질 종을 지칭한다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 지질 나노입자는 소정의 N/P 비를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이 "N/P 비" 또는 "NP 비"는 음으로 하전된 핵산 포스페이트기에 대한 양으로 하전 가능한 중합체 아민기의 비를 지칭한다. 지질 나노입자/핵산 분자 복합체의 N/P 특징은 순 표면 전하, 안정성 및 크기와 같은 특성에 영향을 미칠 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 지질 나노입자의 NP 비는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 및 이들 사이의 임의의 비일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 지질 나노입자의 NP 비는 약 18, 약 36, 또는 약 72일 수 있다.
따라서, 소정의 구현예에서, 약제학적 조성물은 지질 나노입자에 캡슐화된 본 발명의 핵산 분자, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.
약제학적 조성물은 볼루스 주사에 의한 비경구 투여(즉, 정맥내, 피하 또는 근육내)를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들어 보존제가 첨가된 앰플 또는 다용량 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어 발열원 비함유 물을 이용한 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 또한 수용성 형태, 예를 들어 수용성 염 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서의 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세라이드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 및 덱스트란을 포함하여 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 리포솜은 또한 세포 또는 간질성 공간 내로의 전달을 위해 본 발명의 분자를 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리학적으로 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 일부 구현예에서, 조성물은 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 활성 성분의 저장 수명 또는 유효성을 향상시키는 약제학적으로 허용 가능한 물질, 예컨대 습윤제 또는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 포함한다.
본 발명의 조성물은 예를 들어 액체(예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산액, 현탁액, 반고체 및 고체 투여 형태를 포함하여 다양한 형태일 수 있다. 바람직한 형태는 투여 방식 및 치료학적 분야에 따라 달라진다.
조성물은 용액, 마이크로 에멀젼, 분산액, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙화된 구조물로 제형화될 수 있다. 살균 주사용 용액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합을 포함하는 적절한 용매 중에, 필요한 양의 활성 성분을 혼입하고, 이어서 필요한 경우, 여과 살균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질, 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 살균 비히클 내로 활성 성분을 혼입하여 제조된다. 살균 주사용 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이전에 살균 여과된 용액으로부터 임의의 원하는 추가 성분과 활성 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 발생할 수 있다.
활성 성분은 방출 제어형 제형 또는 장치에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 제형 및 장치의 예는 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형 및 장치의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.
주사용 데포 제형은 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드 중의 약물의 마이크로캡슐화된 매트릭스의 형성에 의해 제조될 수 있다. 약물 대 중합체의 비 및 사용된 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 예시적인 생분해성 중합체는 폴리오르토에스테르 및 폴리언하이드라이드이다. 데포 주사용 제형은 또한 리포솜 또는 마이크로에멀젼 중에 약물을 포획하여 제조될 수 있다.
보충적 활성 화합물이 조성물 내로 혼입될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는 응고 인자, 또는 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체에 의해 제형화된다. 예를 들어, 응고 인자는 V 인자, VII 인자, VIII 인자, IX 인자, X 인자, XI 인자, XII 인자, XIII 인자, 프로트롬빈, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자 또는 재조합 가용성 조직 인자(rsTF) 또는 임의의 전술한 것의 활성화 형태를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 지혈제의 응고 인자는 또한 항섬유소용해 약물, 예를 들어 엡실론-아미노-카프르산, 트라넥삼산을 포함할 수 있다.
투여 섭생은 원하는 최적의 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료학적 상황의 응급성에 의해 표시된 바대로 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약 단위 형태의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)] 참조.
활성 화합물에 더하여, 액체 투여 형태는 불활성 성분, 예컨대 물, 에틸 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르를 함유할 수 있다.
적합한 약제학적 담체의 비제한적인 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 또한 기술되어 있다. 부형제의 여러 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 또한 pH 완충 시약, 및 습윤제 또는 유화제를 함유할 수 있다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 또한 액체, 예를 들어 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 액체는 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방), 유화제(레시틴 또는 아카시아), 비수성 비히클(예를 들어, 아몬드유, 오일 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별화된 식물성 오일) 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 포함할 수 있다. 제제는 또한 착향제, 착색제 및 감미제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 물 또는 또 다른 적합한 비히클을 이용한 구성을 위한 건조 생성물로서 제시될 수 있다.
협측 투여를 위해, 조성물은 통상적인 프로토콜에 따라 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 편리하게는 부형제를 포함하거나 포함하지 않는 분무 에어로졸의 형태로 또는 분사제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 선택적으로 갖는 가압 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있으며, 이는 화합물 및 적합한 분말 기제, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유한다.
또한 약제학적 조성물은 예를 들어 통상적인 좌제 기제, 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 함유하는 좌제 또는 정체 관장으로서 직장 투여하기 위한 것으로 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 국소 투여, 안구내 투여, 비경구 투여, 척추강내 투여, 경막하 투여 및 경구 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의해 투여된다. 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다.
VIII. 치료 방법
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 핵산 분자, 벡터, 폴리펩타이드 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR 및 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 유전적 카세트는 표적 서열을 암호화하고, 표적 서열은 치료학적 단백질을 암호화하고, 핵산 분자는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 근육, 중추 신경계(CNS), 눈, 간, 심장, 신장, 췌장, 폐, 피부, 방광, 요로, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 장기에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 대상체는 DMD(듀시엔형 근이영양증), XLMTM(X 연관 근세관성 근병증), 파킨슨병, SMA(척수성 근위축), 프레드릭 실조증, GUCY2D-LCA(레베르 선천성 흑암시), XLRS(X 연관 망막층간분리증), AMD(연령 관련 황반병성), ACHM(완전색맹), RPF65 매개된 IRD, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태를 갖는다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 유전적 카세트는 표적 서열을 암호화하고, 표적 서열은 miRNA를 암호화하고, 핵산 분자는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 근위축성 축삭경화증(ALS), 헌팅턴병, 및/또는 상염색체 우성 색소성 망막염을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 유전적 카세트를 포함하고, 여기서 유전적 카세트는 표적 서열을 암호화하고, 표적 서열은 응고 인자를 암호화하고, 핵산 분자는 이를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 출혈 질환 또는 병태는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈, 장요근초에서의 출혈 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 수술을 받을 예정이다. 또 다른 구현예에서, 치료는 예방적 치료 또는 대증적 치료이다.
본 발명은 본 발명의 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 출혈 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 출혈 장애는 응고 인자, 예를 들어 FVIII에서의 결핍을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 출혈 장애는 혈우병이다. 일부 구현예에서, 출혈 장애는 A 혈우병이다. 출혈 장애의 치료 방법의 일부 구현예에서, 투여 후 24시간에 응고 인자, 예를 들어 FVIII의 혈장 활성은 기준 핵산 분자(예를 들어, 서열 번호 16, 모 FVIII 유전자 서열), 기준 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 기준 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 투여된 대상체에 비해 증가한다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 본 발명의 단리된 핵산 분자 또는 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 응고 인자, 예를 들어 FVIII, 활성을 갖는 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 지혈 장애를 치료하거나 개선하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 단리된 핵산 분자 또는 암호화된 폴리펩타이드에 의한 치료, 개선 및 예방은 우회 치료일 수 있다. 우회 치료를 받는 대상체는 이미 응고 인자, 예를 들어 FVIII에 대한 억제제가 생겼거나 응고 인자 억제제가 생기게 한다.
본 발명의 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 섬유소 응고의 형성을 촉진하여 지혈 장애를 치료 또는 예방한다. 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 응고 인자, 예를 들어 FVIII 활성을 갖는 폴리펩타이드는 응고 캐스케이드의 구성원을 활성화할 수 있다. 응고 인자는 외인성 경로, 내인성 경로 또는 이들 둘 다에 참여할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 응고 인자에 의해 치료 가능한 것으로 알려진 지혈 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 지혈 장애는 A 혈우병, B 혈우병, 폰 빌레브란트병, XI 인자 결핍(PTA 결핍), XII 인자 결핍과, 피브리노겐, 프로트롬빈, V 인자, VII 인자, X 인자 또는 XIII 인자의 결핍 또는 구조적 이상, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈 및 장요근초에서의 출혈을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 지혈 장애는 유전성 장애이다. 일 구현예에서, 대상체는 A 혈우병을 갖는다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 응고 인자 결핍의 결과이다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 FVIII의 결핍의 결과이다. 다른 구현예에서, 지혈 장애는 결함성 FVIII 응고 인자의 결과일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 지혈 장애는 후천성 장애일 수 있다. 후천성 장애는 기저 속발성 질환 또는 병태로 인해 발생할 수 있다. 비관련된 병태는 한정하지 않고서 예를 들어 암, 자가 면역 질환 또는 임신일 수 있다. 후천성 장애는 노령이나 기저 속발성 장애를 치료하기 위한 약물(예를 들어, 암 화학 요법)로 인해 발생할 수 있다.
본 발명은 또한 지혈 장애 또는 지혈 장애의 획득을 초래하는 속발성 질환 또는 병태를 갖지 않는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 받고 있거나 곧 받을 예정이다. 본 발명의 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 예방제로서 수술 전 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 지혈 장애가 없는 급성 출혈 에피소드를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 급성 출혈 에피소드는 중증 외상, 예를 들어 수술, 자동차 사고, 상처, 열상 총상 또는 제어되지 않는 출혈을 초래하는 기타 외상성 사건으로 인해 발생할 수 있다.
단리된 핵산 분자, 벡터 또는 단백질은 지혈 장애를 갖는 대상체를 예방적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다. 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 단백질은 또한 지혈 장애를 갖는 대상체에서 급성 출혈 에피소드를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 투여하여 응고 인자 단백질의 발현은 대상체에서 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 응고 인자에 대한 항체의 발생을 포함한다. 일 구현예에서, 면역 반응은 FVIII에 대한 항체의 발생을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 사이토카인 분비를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 B 세포, T 세포, 또는 B 세포와 T 세포 둘 다의 활성화를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 억제성 면역 반응이고, 여기서 대상체에서의 면역 반응은 면역 반응이 발생하지 않은 대상체에서의 응고 인자의 활성에 비해 응고 인자 단백질의 활성을 감소시킨다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 투여하여 응고 인자 단백질의 발현은 응고 인자 단백질 또는 단리된 핵산 분자 또는 벡터로부터 발현된 응고 인자 단백질에 대한 억제성 면역 반응을 방지한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 단백질 조성물은 지혈을 촉진하는 적어도 하나의 다른 약제와 조합되어 투여된다. 지혈을 촉진하는 상기 다른 제제는 응고 활성이 입증된 치료제이다. 제한이 아니라, 예로서, 지혈제는 FV, FVII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, 프로트롬빈, 또는 피브리노겐 또는 임의의 이전의 활성화된 형태를 포함할 수 있다. 응고 인자 또는 지혈제는 또한 항섬유소 용해제, 예를 들어 엡실론-아미노-카프르산, 트라넥삼산을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물(예를 들어, 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드)은 응고 인자가 대상체에게 투여될 때 활성화 가능한 형태로 존재하는 것이다. 이러한 활성화 가능한 분자는 대상체에게 투여한 후 응고 부위에서 생체내 활성화될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 출혈 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 응고 인자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 출혈 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 응고 인자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 출혈 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 응고 인자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 A 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 A 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 VIII 인자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 A 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 A 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 VIII 인자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 A 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 A 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 VIII 인자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 간의 대사 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 간의 대사 장애는 페닐케톤뇨증(도 7e는 쥣과 PAH 전이유전자 및 B19d135 또는 GPCd165 ITR 중 어느 하나를 함유하는 ssDNA로 치료된 PKU 마우스로부터의 간 용해물의 웨스턴 면역블롯을 보여준다.
간을 치료 후 81일에 수집하고, 단백질 용해물을 추출하였다. 각각의 웰은 단일 동물을 나타낸다. FLAG-태그화된 쥣과 PAH 단백질은 M2 항-FLAG 항체를 사용하여 검출되고, GAPDH 로딩 대조군은 비교에 포함된다.
), 요소 회로 질환(예를 들어, 트랜스카바밀라제(OTC), 또는 아르기니노숙시네이트 합성효소(ASS)의 결핍), 리소좀 저장 장애(예를 들어, 뮤코다당증) 및 글리코겐 저장 질환(예를 들어, 유형 I, II, III, IV 글리코겐 저장 질환)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 간의 다른 대사 장애는 제한 없이 윌슨병, 알파-1 안티트립신 결핍증, 임신성 동종면역 간 질환(GALD: gestational alloimmune liver disease), 지방산 산화 결함, 갈락토스혈증, 지질 저장 질환, 타이로신혈증 및 과산화소체 장애를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 결핍된 간 연관된 대사 효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간의 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간의 대사 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR이 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 치료학적 단백질(예를 들어, 간의 적절한 대사 기능에 필요한 단백질)을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간의 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간의 대사 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 치료학적 단백질(예를 들어, 간의 적절한 대사 기능에 필요한 단백질)을 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 간의 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간의 대사 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 페닐알라닌 수산화효소(PAH)를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 페닐알라닌 수산화효소(PAH)를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 페닐알라닌 수산화효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 정맥내, 피하, 근육내 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어 경구, 설하, 협측, 설하, 비강, 직장, 질 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 응고 인자 단백질은 원하는 부위로의 키메라 단백질의 느린 방출을 허용하는 바이오폴리머 고체 지지체 내에 임플란트될 수 있거나 상기 고체 지지체에 연결될 수 있다.
경구 투여를 위해, 약제학적 조성물은 통상적인 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 또한 액체, 예를 들어 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 액체는 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방), 유화제(레시틴 또는 아카시아), 비수성 비히클(예를 들어, 아몬드유, 오일 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별화된 식물성 오일) 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)를 포함할 수 있다. 제제는 또한 착향제, 착색제 및 감미제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 물 또는 또 다른 적합한 비히클을 이용한 구성을 위한 건조 생성물로서 제시될 수 있다.
협측 및 설하 투여를 위해, 조성물은 종래의 프로토콜에 따라 정제, 로젠지 또는 신속 용해 필름의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 응고 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드는 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스를 갖는 가압 팩 또는 분무기(예를 들어, PBS 중의)로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있으며, 이는 화합물 및 적합한 분말 기제, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유한다.
일 구현예에서, 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드의 투여 경로는 비경구이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 비경구는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 정맥내 형태의 경구 투여가 바람직하다. 모든 이들 형태의 투여가 본 발명의 범주 내인 것으로 명백히 고려되나, 투여를 위한 형태는 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적주입을 위한 주사용수일 것이다. 보통, 주사를 위한 적합한 약제학적 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시내용과 상용되는 다른 방법에서, 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 유해한 세포 집단 부위에 직접 전달됨으로써 치료제에 대한 이환된 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 살균 수용액 또는 비수용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르이다. 수용성 담체는, 염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 본 발명에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 0.01 내지 0.1 M, 그리고 바람직하게는 0.05 M 인산 완충액 또는 0.8% 염수를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 흔한 비경구 비히클은 인산 나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산화 링거액 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 링거 덱스트로스에 기반한 것 등과 같은 전해질 보충물, 유체 및 영양 보충물 등을 포함한다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성화 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
더 구체적으로, 주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 살균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 살균 분말을 포함한다. 이러한 경우에, 조성물은 반드시 살균되어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도의 유체여야 한다. 조성물은 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고, 바람직하게는 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존될 것이다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용, 분산액의 경우에서 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 기제를 함유하는 좌약 또는 정체 관장으로서 직장 투여용으로 제형화될 수 있다.
병태의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간이거나 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방학적 치료이거나 치료학적 치료인지의 여부를 포함하는 많은 다양한 요인에 따라 달라진다. 대개, 환자는 인간이지만, 형질전환 포유류를 포함하는 비인간 포유류도 또한 치료될 수 있다. 안전성 및 효능을 최적화하기 위해, 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 치료 투여량이 적정될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 선택적으로 (예를 들어, 예방학적 또는 치료학적) 치료를 필요로 하는 장애 또는 병태를 치료하는 데 효과적인 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 보조 요법과 함께 또는 보조 요법과 조합하여 본 발명의 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드를 투여하는 것은 요법 및 개시된 폴리펩타이드의 순차적 투여, 동시 투여, 동일 시공간 투여, 동반 투여, 공존 또는 동시발생적 투여 또는 적용을 의미한다. 당업자는 병용 치료 요법의 다양한 구성요소의 투여 또는 적용이 치료의 전체 효과를 향상시키기 위해 시간 지정될 수 있음을 인지할 것이다. 당업자(예를 들어, 의사)는 선택된 보조 요법 및 본 발명의 명세서의 교시내용을 기초로 하여 과도한 실험 없이 효과적인 병용 치료 요법을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.
본 발명의 단리된 핵산 분자, 벡터 또는 폴리펩타이드는 (예를 들어, 병용 치료 요법을 제공하기 위한) 제제 또는 제제들과 함께 또는 조합하여 사용될 수 있다는 것이 또한 인식될 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 조합될 수 있는 예시적인 제제는 치료되는 특정 장애에 대한 현행 관리 표준을 대표하는 제제를 포함한다. 이러한 제제는 사실상 화학적 또는 생물학적인 것일 수 있다. 용어 "생물학적" 또는 "생물학적 제제"는 치료제로서 사용하기 위한 살아있는 유기체 및/또는 이들의 제품으로 제조된 임의의 약제학적 활성제를 지칭한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 조합하여 사용되는 제제의 양은 대상체에 의해 변화될 수 있거나 당업계에 공지된 것에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996)] 참조. 다른 구현예에서, 관리의 표준과 일치하는 양의 그러한 제제가 투여된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 분자 및 이를 필요로 하는 대상체에게 핵산 분자를 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본원에 또한 개시된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 핵산 분자의 제조를 위한 바큘로바이러스 시스템이 본원에 개시되어 있다. 핵산 분자는 곤충 세포에서 제조된다. 다른 구현예에서, 발현 작제물에 대한 나노입자 전달 시스템이 제공된다. 발현 작제물은 본원에 개시된 핵산 분자를 포함한다.
IX. 유전자 치료
본 발명의 소정의 양태는 본 발명의 단리된 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 유전적 작제물을 발현시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 핵산 분자, 예를 들어 miRNA를 포함하는 핵산 서열을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 핵산 분자, 예를 들어 miRNA를 포함하는 핵산 서열을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 하향조절하는 방법을 제공한다.
체세포 유전자 치료는 비제한적인 예로서 A 혈우병을 포함하는 다양한 병태에 대한 가능한 치료로서 탐구된다. 유전자 치료는 벡터의 단일 투여 후 응고 인자, 예를 들어 FVIII의 지속적인 내인성 생성을 통해 질환을 치유하는 가능성 때문에 혈우병에 특히 매력적인 치료법이다. A 혈우병은 임상 증상이 전적으로 혈장에서 소량(200 ng/mL)으로 순환하는 단일 유전자 산물(예를 들어, FVIII)의 결여에 기인하기 때문에 유전자 대체 접근법에 적합하다.
종래의 바이러스 기반 유전자 전달의 사용은 인간에서 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 바이러스 캡시드 단백질은 인간 면역계의 다양한 성분을 촉발할 수 있다. AAV가 인간 집단에서 흔한 바이러스이고, 대부분의 사람이 AAV에 노출되고, AAV가 예를 들어 아데노바이러스보다 덜 면역원성인 것으로 나타났으므로 AAV 기반 유전자 전달은 매력적이다. 따라서, 대부분의 사람은 이들이 이전에 노출된 특정 변이체에 대한 면역 반응을 이전에 발생시켰다. 이의 기존의 적응 반응은 AAV에 의한 후속하는 재감염의 임상 효능 및/또는 형질도입된 세포의 제거를 감소시킬 수 있는 NAb 및 T 세포를 포함할 수 있고, 이는 AVV 기반 유전자 요법 치료법에 대해 기존의 항-AAV 면역력을 갖는 환자를 탈락시킬 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 비바이러스 기반 유전자 치료에 사용된다. 바이러스 캡시드가 본 발명의 핵산 분자를 사용한 유전자 전달에 필요하지 않으므로, 면역력이 바이러스 성분에 개발되지 않아 대상체의 후속하는 재투여(또는 재투약)를 막는다. 그러므로, 본 발명의 핵산 분자는 장기간 유전자 전달 전략에 대해 재투약을 허용한다.
부가적으로, 본원에 기재된 바대로, 본 발명의 핵산 분자는 투여 시 안정한 전이유전자 발현을 유도하도록 유전적 카세트를 측접시키는 비-AAV 파르보바이러스 ITR을 포함한다. ITR의 존재는 도 5에 도시된 바와 같은 안정한 전이유전자 발현에 필요하고, 여기서 ITR이 없는 핵산은 안정한 전이유전자 발현을 가져올 수 없었다("ITR 무 dsDNA" 및 "미니서클" 참조).
본 발명의 응고 인자 단백질은 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈 및 장요근초에서의 출혈로 이루어진 군으로부터 선택되는 출혈 질환 또는 장애의 치료에 대한 유전자 요법 접근법을 이용하여 포유류, 예를 들어 인간 환자에서 생체내 제조될 수 있고, 치료학적으로 유리할 것이다. 일 구현예에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병이다. 또 다른 구현예에서, 출혈 질환 또는 장애는 A 혈우병이다.
다른 병태는 본원에 개시된 핵산 분자를 사용하여 치료에 또한 적합하다. 소정의 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 근육, 중추 신경계(CNS), 눈, 간, 심장, 신장, 췌장, 폐, 피부, 방광, 요로, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 표적 장기에 영향을 미치는 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 소정의 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 DMD(듀시엔형 근이영양증), XLMTM(X 연관 근세관성 근병증), 파킨슨병, SMA(척수성 근위축), 프레드릭 실조증, GUCY2D-LCA(레베르 선천성 흑암시), XLRS(X 연관 망막층간분리증), AMD (연령 관련 황반병성), ACHM(완전색맹), RPF65 매개된 IRD로부터 선택된 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다(표 9).
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일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 리소좀 저장 장애를 치료하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 리소좀 저장 장애는 MLD(이염성 백질디스트로피), MPS(뮤코다당증), PKU(페닐케톤뇨증), 폼페 글리코겐 저장 질환 유형 II, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 마이크로RNA(miRNA) 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, miRNA는 유전자 또는 단백질의 과발현에 의해 야기된 병태를 치료한다. 일부 구현예에서, miRNA는 단백질의 축적에 의해 야기된 병태를 치료한다. 일부 구현예에서, miRNA는 유전자 또는 단백질의 오류발현에 의해 야기된 병태를 치료한다. 일부 구현예에서, miRNA는 돌연변이체 유전자의 발현에 의해 야기된 병태를 치료한다. 일부 구현예에서, miRNA는 이종성 유전자의 발현에 의해 야기된 병태를 치료한다. 소정의 구현예에서, miRNA 치료는 ALS(근위축성 축삭경화증), 헌팅턴병, AdRP(상염색체 우성 망막색소변성증), 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 병태를 치료한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 개시된 핵산 분자를 투여하여 ALS를 표적화 치료하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 miRNA를 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, miRNA는 SOD1의 발현을 표적화한다. 소정의 구현예에서, miRNA는 문헌[Dirren et al., Annals of Clinical and Translational Neurology 2(2):167-84 (February 2015)]에 의해 개시된 miR SOD1 인공 miRNA를 포함한다. SOD1 유전자의 돌연변이는 유전된 ALS 사례의 20%를 차지한다. 야생형 SOD1은 신경 배양물에서 항아폽토시스 특성을 나타냈지만, 돌연변이체 SOD1이 간 미토콘드리아에서가 아니라 척수 미토콘드리아에서 아폽토시스를 촉진하는 것(둘 다에서 동등하게 발현되지만)으로 관찰되었다. 돌연변이된 SOD1 발현의 하향조절은 ALS에서 운동 뉴런 변성을 억제할 수 있었다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 개시된 핵산 분자를 투여하여 헌팅턴병을 표적화 치료하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 miRNA를 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, miRNA는 HTT의 발현을 표적화한다. 소정의 구현예에서, miRNA는 문헌[Evers et al., Molecular Therapy 26(9):1-15 (epub ahead of print June 2018)]에 의해 개시된 miHTT 조작된 miRNA를 포함한다. 헌팅턴병은 정상 범위를 초과하는 유전자의 반복된 분절의 길이에 의해 생긴 여러 트리뉴클레오타이드 반복부 장애 중 하나이다. HTT는 트리뉴클레오타이드 반복부로 공지된 3개의 DNA 염기-시토신-아데닌-구아닌(CAG)-다회 반복(즉,　... CAGCAGCAG　...)의 서열을 함유한다. CAG는 아미노산 글루타민에 대한 3-문자 유전적 코드(코돈)여서, 일련의 이들 반복부는 폴리글루타민 트랙(또는 폴리Q 트랙)으로 공지된 글루타민의 사슬, 및 유전자의 반복된 부분, 폴리Q 영역을 생성시킨다. 일반적으로, 사람들은 폴리Q 영역에서 36개보다 적은 반복된 글루타민을 가져서, 이는 세포질 단백질 헌팅틴을 생성시킨다. 그러나, 36개 이상의 글루타민의 서열은 상이한 특징을 갖는 단백질을 생성시킨다. 돌연변이체 헝팅틴(mHTT)이라 불리는 이 변경된 형태는 소정의 유형의 뉴런의 붕괴 속도를 증가시킨다. 일반적으로, CAG 반복부의 수는 얼마나 많은 이 과정이 영향을 받는지와 관련되고, 증상의 발생의 연령의 변화의 약 60%를 차지한다. 남은 변화는 헌팅턴병의 기전을 변경하는 환경 및 다른 유전자에 기인한다. 36-39개의 반복부는 질환의 침투 형태를 감소시키며 발생이 훨씬 더 늦고 증상 진행이 더 느리다. 일부 경우에, 증상이 결코 의식되지 않도록 발생은 너무 늦을 수 있다. 매우 높은 반복부 수에 의해, 헌팅턴병은 이후 연소성 헌팅턴병, 무동성-경질 또는 Westphal 변이체 헌팅턴병이라 불릴 때 완전 침투를 갖고, 20세 아래에서 생길 수 있다. 이는 헌팅턴병 보균자의 약 7%를 차지한다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 개시된 핵산 분자를 투여하여 상염색체 우성 망막색소변성증(AdRP)을 표적화 치료하는 것을 포함하고, 여기서 핵산 분자는 miRNA를 암호화하는 유전적 카세트를 포함하고, miRNA는 RHO(로돕신)의 발현을 표적화한다. 소정의 구현예에서, miRNA는 miR-708을 포함한다(문헌[Behrman et al., JCB 192(6):919-27 (2011)] 참조). 망막색소변성증의 원인인 대부분의 RHO 유전자 돌연변이는 로돕신 단백질의 폴딩 또는 수송을 변경한다. 약간의 돌연변이는 광에 반응하여 활성화되는 대신에 로돕신이 항시적으로 활성화되게 한다. 연구는 변경된 로돕신 버전이 필수 세포 기능을 방해하여 간상세포가 자기-파괴하게 한다(아폽토시스를 겪음)는 것을 제시한다. 간상세포가 저광 조건 하에 시력에 필수적이므로, 이들 세포의 소실은 망막색소변성증을 갖는 사람에서 진행성 야맹증으로 이어진다.
본원에 기술된 모든 다양한 양태, 구현예 및 옵션은 임의의 및 모든 변형으로 조합될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명이 일반적으로 기술되어 있지만, 추가의 이해가 본원에 제공된 실시예를 참조하여 얻어질 수 있다. 이 실시예는 단지 예시의 목적을 위한 것이고 제한인 것으로 의도되지 않는다.
실시예:
실시예 1. AAV 및 비-AAV 파르보바이러스 ITR을 보유하는 FVIII 발현 작제물의 생성.
실시예 1a. AAV로부터의 유전적 카세트로의 코돈 최적화된 FVIII 유전자 및 역방위 말단 반복부(ITR) 영역의 클로닝.
FVIII 유전적 카세트는 AAV 혈청형 2의 게놈에 기초하여 생성되었다. 그러나, 임의의 혈청형(합성 포함)에서 기원한 ITR 영역은 이 접근법에 사용될 수 있다(도 1a).
AAV(AAV-FVIII)로부터의 역방위 말단 반복부(ITR) 영역에 의해 측접된 간 특이적 프로모터(TTPp) 또는 유비쿼터스 프로모터(CAGp, 도 1a 및 도 1b)의 조절 하에 코돈 최적화된 FVIII 암호화 서열을 암호화하는 발현 플라스미드 AAV2-FVIIIco6XTEN은 도 1c에 도시된 바대로 시험관내 및 생체내 발현에 설계되었다. 유전적 카세트는 또한 전이유전자의 최적 발현을 위해 WPRE 및 bGHpA 요소를 함유한다(도 1a-1c). ITR 측접된 코돈 최적화된 FVIII 서열은 베타-락타마아제에 대해 ColE1 복제 기원 및 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 골격으로 클로닝되고, 이는 암피실린 내성을 부여한다(도 1c). 발현 카세트를 측접시키는 제한 엔도뉴클레아제 PvuII에 대한 인식 부위는 PvuII 분해 시 AAV-FVIII 작제물의 정확한 절제를 허용하도록 조작되었다(도 1c).
실시예 1b. 비-AAV 파르보바이러스로부터의 유전적 카세트로의 코돈 최적화된 FVIII 유전자 및 역방위 말단 반복부(ITR) 영역의 클로닝.
AAV가 속하는 바이러스 과 파르보비리다에의 구성원 사이의 계통발생 관계에 기초하여(도 2a), 속 데펜도바이러스의 다른 비-AAV 구성원 및 속 에리트로바이러스의 구성원이 바이러스 생활 주기의 유지 및 지속적인 잠복 감염의 확립을 위해 유사한 세포 기전을 이용한다고 가설제기되었다. 따라서, 이들 바이러스의 게놈에서 기원한 ITR 영역은 AAV-유사(AAV 기반이 아님) 유전적 발현 카세트를 개발하도록 사용될 수 있었다. 하기 파르보바이러스는 유전자 치료 분야에 대해 유전적 작제물의 개발을 위해 이의 ITR 영역의 적합성에 대해 시험되었다: 데펜도바이러스 거위 파르보바이러스(GPV) 균주 B 및 에리트로바이러스 B19 파르보바이러스(도 2a).
박테리아 세포에서의 플라스미드 벡터의 전파 동안 파르보바이러스 ITR 영역의 불안정성은 유전적 작제물의 생성 및 조작에 대한 도전을 제시하다. 전장 AAV2 ITR(145 nt)을 함유하는 일부 유전적 작제물은 성공적으로 생성되었지만, 이 작제물은 고도로 불안정하고, 대부분의 AAV2 ITR 기반 플라스미드는 (표 1에 예시된) ITR 영역의 절두된 130 nt 버전을 함유한다. 유사하게, 생성된 B19 및 GPV ITR 둘 다의 전장 서열을 보유하는 플라스미드 작제물은 박테리아 숙주에서 높은 정도의 불안정성을 나타냈고(데이터 비기재), 이는 유전자 치료 분야에 대해 유전적 벡터의 개발을 위한 이 ITR의 이용성을 상당히 제한한다.
이전에, ITR의 절두된 버전을 보유하는, 재조합 B19 바이러스의 구제를 위한 리버스 유전학 시스템이 개발되었다(Manaresi, et al.　Virology 508 (2017): 54-62)(표 2B, ITR ID: B19d135). 따라서, B19d135 ITR은 유전적으로 안정한 FVIII 발현 플라스미드 B19-FVIIIco6XTEN을 생성하도록 이용되었다(도 1d). GPV ITR 기반 작제물의 합성을 위한 이 접근법을 추가로 이용하기 위해, B19, GPV 및 AAV2 ITR의 전장 야생형 서열이 비교되었다(도 3a). ITR 기능에 불필요한 각각 B19 및 AVV2 ITR 서열의 제1 135개 및 15개의 뉴클레오타이드와의 상동성에 기초하여, 완전히 기능적인 ITR을 갖는 안정한 유전적 작제물을 합성하기 위해 GPV ITR의 제1 162개의 뉴클레오타이드가 제거될 수 있었다고 가설제기되었다(도 3a, 박스의 서열). 따라서, 이의 상응하는 ITR의 절두된 버전을 보유하는 작제물 AAV2-FVIIIco6XTEN 및 B19-FVIIIco6XTEN과 유사하게, 안정한 FVIII 발현 플라스미드 작제물 GPV-FVIIIco6XTEN(도 1e)을 생성하도록 GPVd162를 사용하였다(표 2C). 특히, 전장 B19 및 GPV ITR 둘 다는 전장 AAV2 ITR보다 훨씬 더 길고(표 1), AAV ITR의 독특한 T 형상의 헤어핀 구조를 형성하지 않는다(도 2b).
오직 3' ITR을 함유하는 FVIIIco6XTEN 발현 작제물이 생성되므로, 전장 B19 ITR 서열을 함유하는 플라스미드는 박테리아 숙주 세포에서 높은 정도의 불안정성을 나타냈다. 표준 분자 클로닝 기법을 이용하여, 5' 및 3' 전장 B19 ITR 둘 다를 함유하는 양성 클론이 얻어질 수 없었다. 전장 B19 ITR에 의해 측접된 B19wt-FVIIIco6XTEN인 FVIIIco6XTEN 발현 작제물을 생성하기 위해(도 1f), 특이적 숙주 이. 콜라이 균주 PMC103이 사용되었다. PMC103은 십자형 DNA 구조를 인식하고 제거하는 엑소뉴클레아제를 암호화하는 유전자 sbcC에서의 결실을 함유한다. 이론에 의해 구속됨이 없이, sbcC가 결여된 균주 PMC103의 사용이 긴 회문(즉, 복잡한 2차 구조를 함유하는 서열) 및 B19wt-FVIIIco6XTEN 및 GPVwt-FVIIIco6XTEN의 성공적인 클로닝의 복제를 허용할 수 있다고 생각되었다. 생성된 플라스미드는 383개의 염기 쌍 야생형 B19 5' 및 3' ITR 서열(표 2D)을 암호화하고, 다른 플라스미드는 444개의 염기 쌍 야생형 GPV 5' 및 3' ITR 서열(표 2F)을 암호화한다.
비-AAV 파르보바이러스 ITR에 의해 측접된 FVIII-발현 카세트를 함유하는 플라스미드 B19-FVIIIco6XTEN(도 1d; 표 2B), GPV-FVIIIco6XTEN(도 1e; 표 2C) 및 B19wt-FVIIIco6XTEN(도 1f, Table 2D)(B19d135, GPVd162 및 B19wt)은 실시예 1a에 기재된 바대로 생성되었다. 제한 엔도뉴클레아제 LguI에 대한 인식 부위는 모든 FVIII 발현 카세트를 측접시키도록 사용되었다(도 1d-1f).
실시예 1c. AAV 및 비-AAV 파르보바이러스 ITR과 측접된 FVIII 발현 카세트를 함유하는 단일 가닥 DNA 단편의 제조.
FVIII 발현 카세트를 측접시키는 ITR 영역 내의 헤어핀 구조의 형성이 표적 세포의 지속적인 형질도입을 유도할 것이라고 가설제기되었다. 개념 증명 연구를 위해, AAV ITR 기반 플라스미드 AAV2-FVIIIco6XTEN 및 비-AAV ITR 기반 플라스미드 B19-FVIIIco6XTEN 및 GPV-FVIIIco6XTEN은 각각 PvuII 및 LguI에 의해 분해되었다. 단일 가닥(ss) AAV-FVIII, B19-FVIII, 또는 형성된 헤어핀 ITR 구조를 갖는 GPV-FVIII 단편은 95℃에서의 PvuII 또는 LguI 분해의 이중 가닥 DNA 단편 산물(FVIII 발현 카세트 및 플라스미드 골격)을 변성하고 이후 회문 ITR 서열이 폴딩하도록 4℃ 아래로 냉각시켜 생성되었다(도 1a-1b). 생성된 ssAAV-FVIII, ssB19-FVIII, 또는 ssGPV-FVIII는 간세포의 지속적인 형질도입을 확립하는 능력에 대해 HemA(A 혈우병) 마우스 모델에서 시험되었다.
실시예 1d. FVIII 발현 작제물을 생성하는 바큘로바이러스 발현 시스템의 용도
곤충 세포에서의 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자의 형태의 AAV-FVIII, B19-FVIII 및 GPV-FVIII 작제물의 제조를 위한 문헌[Li et al., PLoS ONE 8(8): e69879 (2013)]에 기재된 바큘로바이러스 발현 시스템이 사용될 것이다. ceDNA 발현 카세트의 전신 전달은 간세포의 지속적인 형질도입을 확립하고 간에서 안정한 장기간 전이유전자 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
실시예 2. AAV 및 비-AAV 파르보바이러스 ITR에 의해 측접된 FVIII 발현 카세트를 포함하는 유전적 작제물의 전신 주사는 HemA 마우스에서 장기간 FVIII 발현을 일으켰다.
실시예 2a. ssAAV-FVIII-매개된 FVIII 발현의 생체내 평가.
생체내 지속적인 전이유전자 발현을 매개하는 AAV ITR 영역을 보유하는 ssAAV-FVIII의 능력을 검?G하기 위해, 유전적 발현 카세트는 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍의 ssDNA 유전적 발현 카세트(ssAAV-FVIII)에서 5-12주령 A 혈우병(HemA) 마우스(4마리의 동물/그룹)에서 수력학적 주사(HDI)를 통해 전신으로 전달되었다(도 4a). HDI는 실험 동물의 간에 주사된 물질이 1차 전달되게 한다. ssAAV-FVIII의 단일 수력학적 주사 후 18시간, 3일, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월 및 4개월에 실험 동물로부터 혈장 샘플을 수집하였다. 색소생산성 FVIII 활성 검정에 의해 혈액에서의 FVIII 혈장 활성을 분석하였다. 5 ㎍/마우스의 모 발현 플라스미드가 주사된 대조군 동물은 투여 직후 FVIII 혈장 활성의 높은 수준을 나타냈다. 그러나, 순환 FVIII의 수준은 주사후(p.i.) 15일에 신속히 감소하고 검출 불가능하게 되었다. 이와 반대로, 5, 10 및 20 ㎍/마우스의 ssAAV-FVIII가 주사된 실험 동물은 각각 정상 FVIII 수준의 순환 FVIII 약 8, 16 및 32%의 안정한 수준을 갖는 전이유전자의 장기간 발현을 발생시켰다(도 4a). 강한 용량 반응이 관찰되어 주사된 용량과 치료 결과 사이의 높은 정도의 상관관계를 제시한다.
실시예 2b. ssB19-FVIII- 및 ssGPV-FVIII-매개된 FVIII 발현의 생체내 평가.
각각 비-AAV 파르보바이러스 ITR 영역 B19d135 및 GPVd162를 보유하는 ssB19-FVIII 및 ssGPV-FVIII로부터의 FVIII의 생체내 발현을 평가하기 위해, 10 또는 20 ㎍/마우스의 ssB19-FVIII, 및 10 또는 50 ㎍/마우스의 ssGPV-FVIII 유전적 발현 카세트는 5-12주령 A 혈우병(HemA) 마우스에서 HDI를 통해 전신으로 전달되었다. p.i. 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 42일, 56일, 84일, 112일, 140일 및 168일에 혈액 샘플을 수집하고, 색소생산성 FVIII 활성 검정에 의해 혈액에서의 FVIII 활성을 분석하였다. AAV-FVIII 작제물에 의해 관찰된 것처럼, 5 ㎍/마우스의 모 FVIII 발현 플라스미드가 주사된 대조군 동물은 p.i. 24시간에 FVIII 혈장 활성의 높은 수준을 나타냈고, 이는 p.i. 14일에 신속히 감소하고 검출 불가능하게 되었다. ssB19-FVIII가 주사된 실험 동물은 p.i. 3일에 피크 FVIII 혈장 활성을 나타냈고, 이는 이후 21일의 기간에 걸쳐 점진적으로 감소하고 p.i. 대략 28일에 안정화되었다(도 4b). 다른 한편, ssGPV-FVIII가 주사된 HemA 마우스는 112일에 FVIII 혈장 활성의 안정한 수준을 발생시켰고, 이는 남은 관찰 기간 동안 유지되었다(도 4c). 특히, 10 ㎍/마우스의 ssAAV-FVIII(도 4a) 또는 ssGPV-FVIII(도 4c)가 주사된 동물은 FVIII 혈장 활성의 고도로 유사한 안정한 수준을 발생시켜서, AAV2 및 GPV ITR 영역 둘 다가 표적 세포의 지속적인 형질도입의 효율적인 확립에 필요한 유전적 인자를 포함한다는 것을 제시한다.
실시예 2c. hemA 마우스에서 FVIII의 안정한 장기간 발현에 대한 ITR의 생체내 평가 및 헤어핀 요건.
대안적인 핵산 치료제에 대한 단일 가닥 DNA 카세트의 안정성 및 장기간 발현을 비교하기 위해, FVIIIco6XTEN 플라스미드 작제물(도 1a)은 AAV ITR 서열을 갖거나 갖지 않는 이중 가닥 선형 DNA를 생성하기 위해 PvuII 또는 AflII로 분해되었다. ITR이 없는 선형 이중 가닥 DNA는 ‘ITR 무 dsDNA' 작제물을 생성하도록 정제되었다. 마지막으로, 중첩하는 AflII 인식 부위를 통한 ITR이 없는 정제된 dsDNA의 결찰은 미니서클 DNA를 형성시켰다. 이 작은, 원형, 플라스미드-유사 DNA 작제물은 임의의 박테리아 서열 및/또는 ITR 서열이 없다. HemA 마우스는 수력학적 주사를 통해 등몰 농도의 DNA 작제물이 주사되고, FVIII 활성 수준은 2-4개월에 걸쳐 혈장 수집으로부터 결정되었다. 모든 DNA 작제물은 30-60% 정상 범위에서 FVIII의 초기 치료학적 수준을 생성하였지만, 오직 단일 가닥 DNA는 주사 후 4개월 동안 32%에서 전이유전자 발현의 안정한 지속성을 입증하였다(도 5). 모든 이중 가닥 DNA 및 미니서클 DNA는 14-42일에 정상의 6-10%에서 안정한 발현 수준에 도달하였지만, 이 플래토는 관찰된 초기 FVIII 활성의 불과 10%를 나타낸다. FVIII 발현의 일시적인 및 상승된 수준이 중화 항약물 항체를 형성할 수 있으므로, 안정한 발현은 A 혈우병 환경에서 면역 관용성에 필요하다.
실시예 2d. 야생형 및 유도체 B19 ITR의 생체내 비교.
B19 유도체 ITR(B19d135, 도 1d, 표 2C)과 전장 B19 ITR(표 2C)의 효과를 비교하기 위해, 248개의 염기 쌍 ITR에 의해 측접된 FVIIIco6XTEN 발현 카세트(도 1f)가 생성되었다. A 혈우병 마우스는 B19d135(도 1d), GPVd165(도 1e) 또는 야생형 B19 ITR(도 1f)에 의해 측접된 30 ㎍의 단일 가닥 FVIII-DNA가 수력학적으로 주사되었다. 혈장은 모든 코호트에 대해 주사 후 3일, 7일, 14일, 21일, 28일 및 35일에 수집되고, 추가의 샘플은 B19d135 및 GPVd165 작제물에 대해 42일, 55일 및 84일에 취해지고, 색소생산성 검정에 의해 FVIII 활성에 대해 분석되었다(도 6). 유도체 B19 ITR과 비교하여, 전장 ITR은 FVIII 발현을 거의 2.5배 증가시켰다. 더 나아가, 야생형 ITR로부터의 FVIII의 발현은 발생 시 안정하였다.
실시예 2e. 생체내 단일 가닥 네이키드 DNA의 재투여의 평가.
현재의 유전자 치료 양상에서 중요한 제한은 유전자 치료 벡터의 바이러스 캡시드에 대해 항약물 항체의 형성으로 인해 치료제를 재투여할 수 없음이다. 그러나, 면역원성 단백질에 부재하는 유전자 치료 시스템은 원하는 치료학적 수준으로 환자를 적정하도록 재투약될 수 있었다. 본 발명자들의 비-AAV ITR 측접된 단일 가닥 카세트가 재투여될 수 있는지를 평가하기 위해, hemA 마우스는 0일 및 35일에 B19d135 및 GPVd165 ITR을 함유하는 30 ㎍의 ssDNA가 주사되었다(도 6). GPVd165-FVIII가 투여된 마우스는 관찰의 제1개월 동안 정상의 대략 5%의 안정한 FVIII 수준에 도달하였다. ssDNA의 제2 용량 후, FVIII의 수준은 약간 감소하기 전에 10%로 상승하여서, FVIII 수준에서 2배 증가를 나타낸다. B19d135-FVIII가 투여된 마우스는 제1주 동안 8%의 안정한 FVIII 수준에 도달하였고, 이는 25%로 감소하기 전에 30%로 거의 3.5배 상승했다. 이 데이터는 비-AAV ITR에 의한 단일 가닥 DNA의 재투여가 A 혈우병 마우스에서 FVIII의 안정한 발현 수준을 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 3. B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 보유하는 FVIII 발현 작제물의 생성 및 생체내 평가.
실시예 3a. B19 및 GPV ITR의 최소 필수 서열의 결정.
데펜도바이러스 AAV2 및 GPV, 및 에리트로바이러스 B19(각각 유전자 은행 수탁 번호 NC_001401.2, U25749.1 및 KY940273.1)의 ITR 서열 사이의 비교에 기초하여, 이러한 ITR을 보유하는 유전적 작제물에 의한 진핵 세포의 지속적인 형질도입을 위해 추가의 서열(스페이서, 삽입, 역위, 부가, 및/또는 다른 파르보바이러스 ITR의 야생형 서열에 의한 재조합)과 함께 또는 이것 없이 필요한 GPV 및 B19 파르보바이러스 ITR의 최소 서열이 설계되었다(도 3a 및 3b). AAV2, GPV 및 B19 ITR의 서열 정렬은 가변 서열의 스페이서 영역이 없는 연속 서열로서 모든 3개의 바이러스 종(표 2A-2C에 제시) 사이의 보존된 영역 B19v1 및 GPVv1을 밝혀냈다. 마찬가지로, 최소 필수 서열 변이체 B19v3 및 GPVv3은 B19 ITR과 GPV ITR 사이의 서열 비교에 기초하여 설계되었다. GPVd162 ITR을 보유하는 FVIII 발현 작제물이 B19d135 ITR을 보유하는 유전적 작제물보다 생체내 실험에서 더 양호하게 수행되므로, B19v3 서열이 B19와 GPV ITR 서열 사이에 보존된 최소 B19 ITR 서열 영역을 포함하고, GPVv3 서열이 GPV ITR 서열에 존재하는 최소 GPV ITR 서열 영역을 포함하고 B19 ITR 서열이 결여되어 있음이 가설제기되었다(표 2B 및 2C). 서열 B19v2 및 GPVv2는 각각 B19 및 GPV ITR 서열의 ITR 회문 영역에서 제1 135 및 162 뉴클레오타이드 및 상응하는 상보성 135 및 162 뉴클레오타이드를 배제하여 생성되었다(표 2B 및 2C).
실시예 3b. 기능적 유전적 작제물에 대한 B19 및 GPV ITR의 회문 영역 및 이의 유도체의 배향.
파르보바이러스 ITR의 일부는 자가 상보성 회문 영역으로 이루어진다. 재조합 감염성 B19 파르보바이러스에 대해 정배향 및 역배향에서의 회문 영역을 보유하는 구제된 바이러스는 유사한 성장 특성을 나타냄이 이전에 입증되었다(Manaresi, et al.　Virology 508 (2017): 54-62). 따라서, B19 및 GPV ITR 및 이의 유도체를 보유하는 유전적 발현 작제물은 이러한 ITR의 회문 영역이 유전적 발현 카세트와 관련하여 5' 및 3' ITR 조합의 정배향, 역배향 또는 임의의 가능한 조합에 있는지와 무관하게 기능적으로 있음이 제안된다. 이 가설을 검증하기 위해, B19d135 및 GPVd162 ITR, 및 야생형 B19 및 GPV ITR은 동일한 종의 ITR에 대해 동일한 및 역의 상보성 서열을 사용하여 정방향, 역방향 및 역방위 배향으로 FVIIIco6XTEN 발현 카세트로 혼입될 것이다. 이 플라스미드로부터의 단일 가닥 DNA는 실시예 2a, 2b 및 2d에 기재된 바대로 TTPp 프로모터에 의해 유도된 간 지향된 FVIII 발현에 대해 A 혈우병 마우스에서 생성되고 시험될 것이다. 동일한 종의 ITR의 모든 배향의 조사 이외에, GPV 및 B19 야생형 ITR 및 이의 유도체의 조합이 A 혈우병 마우스에서의 FVIII 발현에 대해 또한 생성되고 시험될 것이다. 비상동성 ITR 서열이 원하는 전이유전자의 에피솜 콘카테머화 및 장기간 발현을 향상시킬 수 있는지를 결정하기 위해 이 발현 카세트는 B19 기원의 하나의 ITR 및 GPV 기원의 하나의 ITR을 함유할 것이다. A 혈우병 마우스는 상기 언급된 발현 카세트를 함유하는 10, 20 또는 50 ㎍의 ssDNA에 의한 수력학적 주사를 통해 주사될 것이고, FVIII는 주사 후 주마다 간격으로 수집된 쥣과 혈장으로부터 측정될 것이다. 이들 발현 카세트가 투여된 마우스에서의 FVIII 발현 및 수명에 대한 영향은 B19d135, GPVd162, 및 상응하는 야생형 ITR 발현 카세트가 투여된 마우스에서 FVIII 발현 및 수명과 직접적으로 비교될 것이다(표 2B, 2C, 2D 및 2F).
실시예 3c. HemA 마우스에서 B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 보유하는 유전적 작제물의 전신 주사.
B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 보유하는 ssDNA 작제물로부터 FVIII 생체내 발현을 평가하기 위해, 5, 10, 20 또는 50 ㎍/마우스의 각각의 ssDNA 유전적 발현 카세트는 5-12주령 HemA 마우스에서 HDI를 통해 전신으로 전달될 것이다. 혈액 샘플은 p.i. 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일에, 및 이후 4개월의 기간 동안 매달 1회 수집될 것이다. 혈액에서의 FVIII 활성은 색소생산성 FVIII 활성 검정에 의해 분석될 것이다.
실시예 4. 곤충 세포에서 B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 보유하는 ceDNA 발현 작제물의 제조 및 생체내 평가.
실시예 4a. B19d135 및 GPVd162 ITR의 유도체를 보유하는 ceDNA 발현 작제물을 생성하기 위한 바큘로바이러스 발현 시스템의 용도
실시예 1d에 기재된 AAV-FVIII, B19-FVIII 및 GPV-FVIII 작제물과 유사하게, 바큘로바이러스 발현 시스템은 곤충 세포에서 ceDNA의 형태의 B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 보유하는 유전적 작제물에 대해 FVIII 발현의 제조에 사용될 것이다.
실시예 4b. HemA 마우스에서 B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 보유하는 ceDNA 발현 작제물의 전신 주사.
B19d135 및 GPVd162 비-AAV 파르보바이러스 ITR의 유도체를 보유하는 ceDNA 작제물로부터 FVIII 생체내 발현을 평가하기 위해, 5, 10, 20 또는 50 ㎍/마우스의 각각의 ceDNA 유전적 발현 카세트는 5-12주령 HemA 마우스에서 HDI를 통해 전신으로 전달될 것이다. 혈액 샘플은 p.i. 1일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일에, 및 이후 4개월의 기간 동안 매달 1회 수집될 것이다. 혈액에서의 FVIII 활성은 색소생산성 FVIII 활성 검정에 의해 분석될 것이다.
실시예 5. ssDNA 및 ceDNA FVIII 발현 작제물의 지질 나노입자 제제의 생성
각각의 ssDNA 또는 ceDNA가 실시예 1 및 4에 기재된 바대로 제조된 후, 각각의 유전적 작제물은 마이크로유체 혼합(LNP-ssDNA 및 LNP-ceDNA)에 의해 적절한 지질 조성물을 사용하여 지질 나노입자(LNP)로 제제화될 것이다. 지질 대 DNA의 비(N/P)는 세포 형질도입 및 FVIII 발현을 최적화하도록 조정될 것이다. LNP로 제제화된 AAV 또는 비-AAV 파르보바이러스 ITR에 의해 측접된 FVIII 발현 카세트를 암호화하는 모 플라스미드는 형질도입 효율에 대한 대조군으로서 사용될 것이다.
실시예 6. LNP-ssDNA 및 LNP-ceDNA의 시험관내 및 생체내 평가
실시예 6a. 배양된 간세포에서 ssDNA 및 ceDNA 매개된 FVIII 발현의 시험관내 평가.
ssDNA 또는 ceDNA FVIII 발현 유전적 작제물 및 상응하는 모 대조군 플라스미드는 표적화된 유전자 전달에 대해 실시예 5에 기재된 바대로 LNP로 제제화되었다. Huh7 세포는 1 x 105개의 세포/웰로 24웰 조직 배양 플레이트에 시딩되고 밤새 항온처리되었다. 다음날, LNP-ssDNA 또는 제제는 1000, 500, 250, 125 및 62.5 ng/웰로 세포에 첨가되었다. 배양 배지는 형질도입후 24시간에 배지 변화 후 형질도입후 48시간에 수확되었다. 배양 배지에서의 FVIII 활성은 인간 혈장 FACT 표준품과 비교하여 색소생산성 FVIII 활성 검정에 의해 측정되었다. CAGp 프로모터 하에 FVIIIco6XTEN 카세트를 보유하고 AAV ITR에 의해 측접된 플라스미드는 72, 36 및 18의 N/P 비에서 지질 나노입자에서 캡슐화되었다(도 8a). Huh7 세포의 형질도입 후, FVIII는 순화 배지에서 측정되었다. N/P 비가 18인 세포의 형질도입은 36 및 72의 비의 FVIII 수준 증가를 생성시키고, 1 ㎍/mL의 피크 용량은 2 IU/mL 초과를 일으켰다. 이 데이터는 간 표적 세포에서의 LNP 전달의 유용성을 입증한다. LNP 전달을 통해 간 특이적 프로모터 하에 ssDNA의 형질도입 효율을 조사하기 위해, TTPp 프로모터 하에 FVIIIco6XTEN 카세트는 2 N/p 비에서 캡슐화되고 Huh7 세포는 형질도입도었다(도 8b). 본 발명자들의 이전의 데이터(도 8a)와 일치하게, 18의 N/P 비는 36의 비와 비교하여 FVIII 활성 수준을 증가시켰다. 추가로, 이 데이터는 간 세포에서의 FVIII ssDNA의 개념 증명 LNP 전달을 입증하였다. 24시간 후, 2 ㎍/mL의 단일 가닥 FVIIIco6XTEN-AAV로 형질도입된 대략 2 x 105개의 Huh7 세포는 0.33 IU/mL FVIII를 생성하였다.
부가적으로, 세포 히스톤이 rAAV 에피솜을 따라 규칙적으로 배치되어서, 세포 염색체 DNA 뉴클레오솜 패턴과 유사한 염색질 유사 구조를 생성시키는 것으로 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 표적 세포의 지속적인 형질도입에 필요한 염색질 유사 뉴클레오솜 구조를 확립하는 이 작제물의 능력은 또한 사우던 블롯에 의해 평가될 것이다.
실시예 6b. 정맥내 투여 후 HemA 마우스에서의 LNP 제제화된 ssDNA- 및 ceDNA 매개된 장기간 FVIII 발현의 평가.
5-12주령 HemA 마우스는 IV 주사, N=4/그룹을 통해 5, 10, 20, 40, 100 ㎍/마우스에서 LNP-ssDNA, LNP-ceDNA 또는 LNP-pDNA(플라스미드 대조군)가 투여될 것이다. 혈액 샘플은 최대 6개월 동안 주사 후 48시간에 시작한 선택된 시점에 수집될 것이고, 혈액에서의 FVIII 활성은 색소생산성 FVIII 활성 검정에 의해 분석될 것이다. LNP-ssDNA 또는 LNP-ceDNA로 처리된 마우스에서의 FVIII 발현 프로필은 실시예 1 및 4에 기재된 각각의 유전적 작제물에 대해 LNP-pDNA로 처리된 마우스의 것과 비교될 것이다.
실시예 6c. 부스터 주사 후 ssDNA 또는 ceDNA 매개된 FVIII 발현의 생체내 평가.
실시예 6b에서 LNP-ssDNA 또는 LNP-ceDNA로 처리된 마우스의 하위집단은 초기 주사 후 2개월에 동일한 용량에서 상응하는 LNP의 추가의 IV 주사 부스트가 주어질 것이다. 혈액 샘플은 최대 6개월 동안 부스터 주사 후 48시간에 시작하는 선택된 시점에 수집될 것이다. 혈액에서의 FVIII 활성은 색소생산성 FVIII 활성 검정에 의해 분석될 것이다. LNP-ssDNA 또는 LNP-ceDNA로 처리된 마우스에서의 FVIII 발현 프로필은 상응하는 LNP-pDNA로 처리된 마우스의 것과 비교될 것이다.
실시예 7. 유전자 치료에서의 일반 사용을 위해 B19 또는 GPV 기원의 ITR을 보유하는 유전적 발현 작제물의 이용성.
실시예 7a. B19 또는 GPV 기원의 ITR을 보유하는 리포터 유전적 작제물의 생성.
유전자 치료 분야에서 일반 사용에 대한 플랫폼으로서 비-AAV ITR 기반 유전적 발현 시스템의 이용성을 입증하기 위해, 발현 카세트를 포함하는 리포터 작제물은 실시예 1b에 기재된 작제물에 기초하여 B19d135 또는 GPVd162 ITR과 측접된 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 루시퍼라제(luc)에 의해 생성되었다. 따라서, B19-FVIIIco6XTEN(도 1c) 및 GPV-FVIIIco6XTEN(도 1d)에서의 FVIII의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 종래의 분자 클로닝 기법에 의해 GFP 또는 luc의 ORF에 의해 대체되었다.
쥣과 페닐알라닌 수산화효소(PAH) 전이유전자(도 7a)를 함유하는 B19d135 또는 GPVd162 ITR에 의해 플랭킹된 발현 카세트가 또한 생성되었고, 이는 페닐케톤뇨증의 관련 마우스 모델에서 PAH 발현 및 혈액 페닐알라닌 농도의 감소를 평가하기 위해 사용되었다. 이 모델을 이용하여, PKU 마우스(n = 3)는 간 발현을 위해 수력학적 주사를 통해 비-AAV ITR에 의해 측접된 ssDNA가 200 ㎍ 투여되었다. 혈액 샘플은 3일, 7일, 14일, 28일, 42일, 56일, 70일 및 81일에 수집되었고, 혈장은 페닐알라닌 농도 결정을 위해 단리되었다(도 7b-7c). B19d135 ITR을 함유하는 발현 카세트를 받는 마우스는 3일에 370 ㎍/mL에서 210 ㎍/mL로의 페닐알라닌 수준의 감소를 나타냈고, 이는 81일에 걸쳐 안정하게 유지되었다(도 7b). GPVd162 ITR 카세트를 받은 마우스는 14일에 350 ㎍/mL에서 310 ㎍/mL로의 혈액 페닐알라닌 수준의 감소를 나타났고, 이는 42일에 250 ㎍/mL의 안정한 수준으로 계속해서 감소했다(도 7c). 혈액 페닐알라닌 농도의 이 감소는 주사 전의 농도와 비교하여 45% 및 30% 감소를 나타낸다(도 7d). 간에서의 쥣과 PAH 단백질의 존재를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯은 주사 후 81일에 처리된 마우스로부터 취한 간 용해물에서 수행되었다. 쥣과 PAH 단백질을 검출하기 위해 항-FLAG 태그 항체를 사용하여, 도 7e는 처리된 6마리의 동물 중 5마리에서 검출 가능한 쥣과 PAH 단백질을 나타내고, 유의미하게 더 높은 단백질 수준은 B19d135 ITR을 함유하는 ssDNA로 처리된 마우스에서 관찰되었다. 이 데이터는 도 7b-7d에서 관찰된 혈액 페닐알라닌 감소와 일치하였다. 종합하면, 이것은 단일 가닥 DNA 전달이 기능적 간 효소의 장기간 발현을 생성시킨다는 것을 나타낸다.
실험에 사용된 다양한 PAH 작제물의 서열은 표 10A 및 10B에 기재되어 있다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
실시예 7b. B19 또는 GPV 기원의 ITR을 보유하는 ssDNA 리포터 유전적 작제물의 제조.
ssDNA 리포터/PAH 작제물은 실시예 1c에 기재된 바대로 제조될 것이다. 간단히, 플라스미드는 LguI로 분해될 것이다. 95℃에서의 LguI 분해의 이중 가닥 DNA 단편 산물(리포터 발현 카세트 및 플라스미드 골격)을 변성하고 이후 회문 ITR 서열이 폴딩하도록 4℃ 아래로 냉각시켜 형성된 헤어핀 ITR 구조를 갖는 ssDNA 단편이 생성될 것이다(도 1a). 생성된 ssDNA 작제물은 간, 근육 조직, 눈에서의 광수용체 및 중추 신경계(CNS)의 지속적인 형질도입을 확립하는 능력에 대해 마우스에서 시험될 것이다.
실시예 7c. ssDNA 매개된 리포터 발현의 생체내 평가.
생체내 지속적인 전이유전자 발현을 매개하기 위해 실시예 7b에 기재된 ssDNA 리포터 작제물의 능력을 입증하기 위해, 5-12주령 마우스(4마리의 동물/그룹)는 전신으로, 국소로 표적 근육 조직 및 CNS 세포에, 및/또는 망막하에 표적 광수용체 세포로 5, 10, 또는 20 ㎍/마우스의 리포터 ssDNA가 주사될 것이다.
B19 및 GPV ITR 기반 발현 작제물로부터의 PAH의 발현을 평가하기 위해, 관련 질환 마우스 모델이 사용될 것이다. 이 유전적 작제물은 간을 표적화하도록 HDI에 의해 전신으로 전달될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOVERATIV THERAPEUTICS INC. <120> NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF FOR NON-VIRAL GENE THERAPY <130> 615113: SA9-465PC <150> 62/716,826 <151> 2018-08-09 <160> 198 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFVIII-5 <400> 1 atgcaaatcg aactgagcac ctgtttcttc ctctgcctgc tgagattctg tttctccgcg 60 acccgccgat actacctggg agcagtggag ctctcctggg attacatgca gagcgacctt 120 ggggagctgc ccgtggatgc caggttccct ccccgggtgc caaagtcgtt tccgttcaac 180 acctccgtgg tgtacaagaa aactctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaatatc 240 gccaagccca gacctccctg gatggggctg ttgggaccta ccatccaagc ggaggtgtac 300 gacactgtgg tcatcactct gaagaacatg gcctcgcatc ccgtgtccct gcacgccgtg 360 ggagtgtctt actggaaagc gtccgagggg gccgaatacg acgaccagac ctcgcagaga 420 gaaaaggaag atgacaaggt gttcccagga ggatcgcaca cctacgtgtg gcaagtgttg 480 aaggagaacg gcccaatggc ctccgacccg ctgtgcctga cctactcgta cctgtcccac 540 gtggacctcg tgaaggacct caactcggga ctgattggag ccctgctggt ctgcagggaa 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cacttccgaa tccgccaccc cggagtcagg gccaggatct 300 gaacccgcta cctcaggcag tgagacgcca ggaacgagcg agtccgctac accggagagt 360 gggccaggga gccctgctgg atctcctacg tccactgagg aagggtcacc agcgggctcg 420 cccaccagca ctgaagaagg tgcctcgagc 450 <210> 56 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XTEN AE144-6B, protein sequence <400> 56 Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Thr Ser Glu Ser 1 5 10 15 Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu 20 25 30 Ser Gly Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Gly Pro Gly 35 40 45 Ser Glu Pro Ala Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Glu Pro Ala 50 55 60 Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ser Pro Ala Gly Ser Pro Thr Ser 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly 85 90 95 Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly Ser Glu Pro Ala 100 105 110 Thr Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu 115 120 125 Ser Gly Pro Gly Thr Ser Thr Glu Pro Ser Glu Gly Ser Ala Pro Gly 130 135 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atcgcctggg 240 acatcgagca ccgggtcgcc aggagcatcg cccggaacat ccagcacagg aagccccggc 300 gcgtcgcccg ggacatcaag cacaggttcc ccgggatcga gcacgccgtc cggagccact 360 ggatcaccag ggagctcgac accttccggc gcaacgggat cgcccggagc cagcccgggt 420 acgtcaagca ctggctcccc tgcctcgagc 450 <210> 66 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> XTEN AG144-F, protein sequence <400> 66 Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ser Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser 20 25 30 Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro 35 40 45 Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro 50 55 60 Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser 65 70 75 80 Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Pro Ser Ala Ser Thr Gly Thr Gly Pro 85 90 95 Gly Thr Pro Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Thr 100 105 110 Pro Ser Gly Ala Thr Gly Ser Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Gly Ala 115 120 125 Thr Gly Ser Pro Gly Ala Ser Pro Gly Thr Ser Ser Thr Gly Ser Pro 130 135 140 <210> 67 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XTEN AG144-F, DNA sequence <400> 67 ggcgcgccag gctccagccc ctccgcgagc acgggaaccg gaccaggttc gtcaccctca 60 gcatcaacgg ggacgggacc gggggcgtca ccaggaacgt cctccaccgg ctcgccgggt 120 gcatcacccg gaacgtcatc gaccggatcg ccagggagct cgacgccatc aggcgcaaca 180 ggatcacctg gctcaagccc tagcgcgtca accggcacgg gtccgggtgc ctcccctggc 240 acgtccagca ccggatcacc cggatcgagc ccatccgcct caaccggaac cggacccggt 300 acaccagggt cgggaacagc ctcctcgtca ccaggctcct caaccccctc gggagccacg 360 ggttcgcccg gttcgtcaac gccttccgga gcaactggta gccccggagc atcgccagga 420 acttcgagca cggggtcgcc cgcctcgagc 450 <210> 68 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFVIII-1 DNA Sequence <400> 68 atgcagattg agctgtctac ttgctttttc ctgtgcctgc tgaggttttg cttttccgct 60 acacgaaggt attatctggg ggctgtggaa ctgtcttggg attacatgca gagtgacctg 120 ggagagctgc cagtggacgc aaggtttccc cctagagtcc ctaagtcatt ccccttcaac 180 actagcgtgg tctacaagaa aacactgttc gtggagttta ctgatcacct gttcaacatc 240 gcaaagccta ggccaccctg gatgggactg ctggggccaa caatccaggc cgaggtgtac 300 gacaccgtgg tcattacact taagaacatg gcctcacacc ccgtgagcct gcatgctgtg 360 ggcgtcagct actggaaggc ttccgaagga gcagagtatg acgatcagac ttcccagaga 420 gaaaaagagg acgataaggt gtttcctggc ggatctcata cctacgtgtg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gccctatggc ctccgaccct ctgtgcctga cctactctta tctgagtcac 540 gtggacctgg tcaaggatct gaacagcggc ctgatcggag ccctgctggt gtgcagggaa 600 ggaagcctgg ctaaggagaa aacccagaca ctgcataagt tcattctgct gttcgccgtg 660 tttgacgaag ggaaatcatg gcacagcgag acaaagaata gtctgatgca ggacagggat 720 gccgcttcag ccagagcttg gcccaaaatg cacactgtga acggctacgt caatcgctca 780 ctgcctgggc tgatcggctg ccaccgaaag agcgtgtatt ggcatgtcat cgggatgggc 840 accacacctg aagtgcactc cattttcctg gagggacata cctttctggt ccgcaaccac 900 cgacaggctt ccctggagat ctctccaatt accttcctga cagcacagac tctgctgatg 960 gacctggggc agttcctgct gttttgccac atcagctccc accagcatga tggcatggag 1020 gcttacgtga aagtggactc ttgtcccgag gaacctcagc tgcggatgaa gaacaatgag 1080 gaagcagaag actatgacga tgacctgacc gactccgaga tggatgtggt ccgattcgat 1140 gacgataaca gcccctcctt tatccagatt agatctgtgg ccaagaaaca ccctaagaca 1200 tgggtccatt acatcgcagc cgaggaagag gactgggatt atgcaccact ggtgctggca 1260 ccagacgatc gctcctacaa atctcagtat ctgaacaatg ggccacagag gattggcaga 1320 aagtacaaga aagtgcggtt catggcatat accgatgaga ccttcaagac tcgcgaagcc 1380 atccagcacg agagcggcat cctgggacca ctgctgtacg gagaagtggg agacaccctg 1440 ctgatcattt tcaagaacca ggccagccgg ccttacaata tctatccaca tgggattaca 1500 gatgtgcgcc ctctgtacag caggagactg ccaaagggcg tcaaacacct gaaggacttc 1560 ccaatcctgc ccggagaaat cttcaagtac aagtggactg tcaccgtcga ggatggcccc 1620 actaagagcg accctcggtg cctgacccgc tactattcta gtttcgtgaa tatggaaaga 1680 gatctggcaa gcggactgat cggaccactg ctgatttgtt acaaagagag cgtggatcag 1740 agaggcaacc agatcatgtc cgacaagcgg aatgtgattc tgttcagtgt ctttgacgaa 1800 aacaggtcat ggtacctgac cgagaacatc cagagattcc tgcctaatcc agctggggtg 1860 cagctggaag atcctgagtt tcaggcatct aacatcatgc atagtattaa tggctacgtg 1920 ttcgacagtt tgcagctgag cgtgtgcctg cacgaggtcg cttactggta tatcctgagc 1980 attggggcac agacagattt cctgagcgtg ttcttttccg gctacacttt taagcataaa 2040 atggtctatg aggacacact gactctgttc cccttcagcg gcgaaaccgt gtttatgagc 2100 atggagaatc ccggactgtg gattctgggg tgccacaaca gcgatttcag aaatcgcgga 2160 atgactgccc tgctgaaagt gtcaagctgt gacaagaaca ccggggacta ctatgaagat 2220 tcatacgagg acatcagcgc atatctgctg tccaaaaaca atgccattga accccggtct 2280 tttagtcaga atcctccagt gctgaagagg caccagaggg agatcacccg cactaccctg 2340 cagagtgatc aggaagagat cgactacgac gatacaattt ctgtggaaat gaagaaagag 2400 gacttcgata tctatgacga agatgagaac cagagtcctc gatcattcca gaagaaaacc 2460 aggcattact ttattgccgc agtggagcgg ctgtgggatt atggcatgtc ctctagtcct 2520 cacgtgctgc gaaatagggc ccagtcagga agcgtcccac agttcaagaa agtggtcttc 2580 caggagttta cagacgggtc ctttactcag ccactgtaca ggggcgaact gaacgagcac 2640 ctgggactgc tggggcccta tatcagagca gaagtggagg ataacattat ggtcaccttc 2700 agaaatcagg cctctcggcc ttacagtttt tattcaagcc tgatctctta cgaagaggac 2760 cagcgacagg gagctgaacc acgaaaaaac ttcgtgaagc ctaatgagac caaaacatac 2820 ttttggaagg tgcagcacca tatggcccca acaaaagacg agttcgattg caaggcatgg 2880 gcctattttt ctgacgtgga tctggagaag gacgtgcaca gtggcctgat tggcccactg 2940 ctggtgtgcc atactaacac cctgaatcca gcccacggcc ggcaggtcac tgtccaggag 3000 ttcgctctgt tctttaccat ctttgatgag acaaagagct ggtacttcac cgaaaacatg 3060 gagcgaaatt gcagggctcc atgtaacatt cagatggaag accccacatt caaggagaac 3120 taccgctttc atgctatcaa tggatacatc atggatactc tgcccgggct ggtcatggca 3180 caggaccaga gaatccggtg gtatctgctg agcatgggca gcaacgagaa tatccactca 3240 attcatttca gcgggcacgt gtttactgtc aggaagaaag aagagtacaa gatggccctg 3300 tacaacctgt atcccggcgt gttcgaaacc gtcgagatgc tgcctagcaa ggccggaatc 3360 tggagagtgg aatgcctgat tggagagcac ctgcatgctg ggatgtctac cctgtttctg 3420 gtgtacagta ataagtgtca gacacccctg ggaatggcat ccgggcatat cagggatttc 3480 cagattaccg catctggaca gtacggacag tgggcaccta agctggctag actgcactat 3540 tccggatcta tcaacgcttg gtccacaaaa 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Sequence <220> <223> ET Promoter, DNA sequence <400> 69 ctcgaggtca attcacgcga gttaataatt accagcgcgg gccaaataaa taatccgcga 60 ggggcaggtg acgtttgccc agcgcgcgct ggtaattatt aacctcgcga atattgattc 120 gaggccgcga ttgccgcaat cgcgaggggc aggtgacctt tgcccagcgc gcgttcgccc 180 cgccccggac ggtatcgata agcttaggag cttgggctgc aggtcgaggg cactgggagg 240 atgttgagta agatggaaaa ctactgatga cccttgcaga gacagagtat taggacatgt 300 ttgaacaggg gccgggcgat cagcaggtag ctctagagga tccccgtctg tctgcacatt 360 tcgtagagcg agtgttccga tactctaatc tccctaggca aggttcatat ttgtgtaggt 420 tacttattct ccttttgttg actaagtcaa taatcagaat cagcaggttt ggagtcagct 480 tggcagggat cagcagcctg ggttggaagg agggggtata aaagcccctt caccaggaga 540 agccgtcaca cagatccaca agctcctgcc accatgg 577 <210> 70 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFVIII-5 <400> 70 atgcaaatcg aactgagcac ctgtttcttc ctctgcctgc tgagattctg tttctccgcg 60 acccgccgat actacctggg agcagtggag ctctcctggg attacatgca gagcgacctt 120 ggggagctgc ccgtggatgc caggttccct ccccgggtgc 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cggaatggag 1020 gcatacgtga aggtcgattc ctgccctgag gaaccccagc tccgcatgaa gaacaatgag 1080 gaagccgagg actacgacga cgacctgacg gatagcgaga tggatgtggt ccggttcgat 1140 gacgataaca gcccttcctt catccaaatt cgctcggtgg caaagaagca ccccaagacc 1200 tgggtgcatt acattgcggc ggaagaagag gactgggatt atgccccgct tgtcctcgct 1260 cctgacgacc ggagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gtccacagag gatcggtaga 1320 aagtacaaga aggtccgctt catggcctat accgacgaaa ccttcaaaac tagagaggcc 1380 atccaacacg aatccggcat cctgggcccg ctcttgtacg gagaagtcgg cgacaccctt 1440 ctcattatct tcaagaacca ggcttcccgg ccgtacaaca tctatccgca tgggatcact 1500 gacgtgcgcc cactgtactc gcggcgcctg cccaagggtg tcaaacacct gaaggatttt 1560 ccgatccttc cgggagaaat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga agatggccca 1620 actaagtctg accctagatg cctcacccgc tactactcat ccttcgtcaa catggagcgc 1680 gacctggcca gcggactgat cggcccgctg ctgatttgct acaaggaatc agtggaccaa 1740 cggggaaacc agatcatgtc ggataagagg aacgtcatcc tcttctccgt gtttgacgaa 1800 aaccggtcgt ggtacctgac tgaaaacatc cagcggttcc tccccaaccc 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accaagagcg atcctaggtg tctgactcgg tactactcca gcttcgtgaa catggaacgg 1680 gacctggcat cgggactcat tggaccgctg ctgatctgct acaaagagtc ggtggatcaa 1740 cgcggcaacc agatcatgtc cgacaagcgc aacgtgatcc tgttctccgt gtttgatgaa 1800 aacagatcct ggtacctcac tgaaaacatc cagaggttcc tcccaaaccc cgcaggagtg 1860 caactggagg accctgagtt tcaggcctcg aatatcatgc actcgattaa cggttacgtg 1920 ttcgactcgc tgcagctgag cgtgtgcctc catgaagtcg cttactggta cattctgtcc 1980 atcggcgccc agactgactt cctgagcgtg ttcttttccg gttacacctt taagcacaag 2040 atggtgtacg aagataccct gaccctgttc cctttctccg gcgaaacggt gttcatgtcg 2100 atggagaacc cgggtctgtg gattctggga tgccacaaca gcgactttcg gaaccgcgga 2160 atgactgccc tgctgaaggt gtcctcatgc gacaagaaca ccggagacta ctacgaggac 2220 tcctacgagg atatctcagc ctacctcctg tccaagaaca acgcgatcga gccgcgcagc 2280 ttcagccaga acccgcctgt gctgaagagg caccagcgag aaattacccg gaccaccctc 2340 caatcggatc aggaggaaat cgactacgac gacaccatct cggtggaaat gaagaaggaa 2400 gatttcgata tctacgacga ggacgaaaat cagtcccctc gctcattcca aaagaaaact 2460 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tacaatctgt accccggggt gttcgaaact gtggagatgc tgccgtccaa ggccggcatc 3360 tggagagtgg agtgcctgat cggagagcac ctccacgcgg ggatgtccac cctcttcctg 3420 gtgtactcga ataagtgcca gaccccgctg ggcatggcct cgggccacat cagagacttc 3480 cagatcacag caagcggaca atacggccaa tgggcgccga agctggcccg cttgcactac 3540 tccggatcga tcaacgcatg gtccaccaag gaaccgttct cgtggattaa ggtggacctc 3600 ctggccccta tgattatcca cggaattaag acccagggcg ccaggcagaa gttctcctcc 3660 ctgtacatct cgcaattcat catcatgtac agcctggacg ggaagaagtg gcagacttac 3720 aggggaaact ccaccggcac cctgatggtc tttttcggca acgtggattc ctccggcatt 3780 aagcacaaca tcttcaaccc accgatcata gccagatata ttaggctcca ccccactcac 3840 tactcaatcc gctcaactct tcggatggaa ctcatggggt gcgacctgaa ctcctgctcc 3900 atgccgttgg ggatggaatc aaaggctatt agcgacgccc agatcaccgc gagctcctac 3960 ttcactaaca tgttcgccac ctggagcccc tccaaggcca ggctgcactt gcagggacgg 4020 tcaaatgcct ggcggccgca agtgaacaat ccgaaggaat ggcttcaagt ggatttccaa 4080 aagaccatga aagtgaccgg agtcaccacc cagggagtga agtcccttct gacctcgatg 4140 tatgtgaagg agttcctgat tagcagcagc caggacgggc accagtggac cctgttcttc 4200 caaaacggaa aggtcaaggt gttccagggg aaccaggact cgttcacacc cgtggtgaac 4260 tccctggacc ccccactgct gacgcggtac ttgaggattc atcctcagtc ctgggtccat 4320 cagattgcat tgcgaatgga agtcctgggc tgcgaggccc aggacctgta ctga 4374 <210> 72 <211> 4824 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFVIII-6-XTEN <400> 72 atgcagattg agctgtccac ttgtttcttc ctgtgcctcc tgcgcttctg tttctccgcc 60 actcgccggt actaccttgg agccgtggag ctttcatggg actacatgca gagcgacctg 120 ggcgaactcc ccgtggatgc cagattcccc ccccgcgtgc caaagtcctt cccctttaac 180 acctccgtgg tgtacaagaa aaccctcttt gtcgagttca ctgaccacct gttcaacatc 240 gccaagccgc gcccaccttg gatgggcctc ctgggaccga ccattcaagc tgaagtgtac 300 gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gcgtcccacc ccgtgtccct gcatgcggtc 360 ggagtgtcct actggaaggc ctccgaagga gctgagtacg acgaccagac tagccagcgg 420 gaaaaggagg acgataaagt gttcccgggc ggctcgcata cttacgtgtg gcaagtcctg 480 aaggaaaacg gacctatggc atccgatcct ctgtgcctga cttactccta cctttcccat 540 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caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340 ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400 atacaaaatg 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caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300 gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360 ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420 caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480 aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540 ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600 ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660 gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720 aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780 ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840 aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900 aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960 agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020 ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080 aaaaacatga 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tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820 aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880 tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940 gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000 gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060 attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120 cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180 caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240 tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300 cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360 atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420 accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480 cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540 cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600 agtaaagcaa 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gagatcaatc tgacccacat cgagagcaga cccagcagac tgaacaagga cgagtacgag 300 ttcttcacct acctggacaa gcggagcaag cctgtgctgg gcagcatcat caagagcctg 360 agaaacgaca tcggcgccac cgtgcacgag ctgagcagag acaaagaaaa gaacaccgtg 420 ccatggttcc ccaggaccat ccaagagctg gacagattcg ccaaccagat cctgagctat 480 ggcgccgagc tggacgctga tcaccctggc tttaaggacc ccgtgtaccg ggccagaaga 540 aagcagtttg ccgatatcgc ctacaactac cggcacggcc agcctattcc tcgggtcgag 600 tacaccgagg aagagagaaa gacctggggc accgtgttca gaaccctgaa ggccctgtac 660 aagacccacg cctgctacga gcacaaccac atcttcccac tgctggaaaa gtactgcggc 720 ttccgcgagg acaatatccc tcagctcgaa gacgtgtccc agttcctgca gacctgcacc 780 ggctttagac tgaggcctgt tgccggactg ctgagcagca gagattttct cggcggcctg 840 gccttcagag tgttccactg tacccagtac atcagacacg gcagcaagcc catgtacacc 900 cctgagcctg atatctgcca cgagctgctg ggacatgtgc ccctgttcag cgatagaagc 960 ttcgcccagt tcagccaaga gatcggactg gcttctctgg gagcccctga cgagtacatt 1020 gagaagctgg ccaccatcta ctggttcacc gtggaattcg gcctgtgcaa agagggcgac 1080 agcatcaagg 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420 aatgtctatc aatatatagt tgctctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 480 ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 540 gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 600 caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 660 cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 720 ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 780 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc 840 actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta 900 ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg 960 ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg 1020 ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc 1080 gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc 1140 tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac 1200 ggcccttctc cttcgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg 1260 tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg 1320 gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt 1380 ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt 1440 cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt 1500 ggatcgcgaa gccgccacca tggactacaa agaccatgac ggtgattata aagatcatga 1560 tatcgattac aaggatgacg atgacaaggc tgctgtggtt ctggaaaatg gcgtgctgag 1620 ccggaagctg agcgacttcg gacaagagac aagctacatc gaggacaaca gcaaccagaa 1680 tggcgccgtg tctctgatct tcagcctgaa agaagaagtg ggcgccctgg ccaaggtgct 1740 gagactgttc gaggaaaacg agatcaatct gacccacatc gagagcagac ccagcagact 1800 gaacaaggac gagtacgagt tcttcaccta cctggacaag cggagcaagc ctgtgctggg 1860 cagcatcatc aagagcctga gaaacgacat cggcgccacc gtgcacgagc tgagcagaga 1920 caaagaaaag aacaccgtgc catggttccc caggaccatc caagagctgg acagattcgc 1980 caaccagatc ctgagctatg gcgccgagct ggacgctgat caccctggct ttaaggaccc 2040 cgtgtaccgg gccagaagaa agcagtttgc cgatatcgcc tacaactacc ggcacggcca 2100 gcctattcct cgggtcgagt acaccgagga agagagaaag acctggggca ccgtgttcag 2160 aaccctgaag gccctgtaca agacccacgc ctgctacgag cacaaccaca tcttcccact 2220 gctggaaaag tactgcggct tccgcgagga caatatccct cagctcgaag acgtgtccca 2280 gttcctgcag acctgcaccg gctttagact gaggcctgtt gccggactgc tgagcagcag 2340 agattttctc ggcggcctgg ccttcagagt gttccactgt acccagtaca tcagacacgg 2400 cagcaagccc atgtacaccc ctgagcctga tatctgccac gagctgctgg gacatgtgcc 2460 cctgttcagc gatagaagct tcgcccagtt cagccaagag atcggactgg cttctctggg 2520 agcccctgac gagtacattg agaagctggc caccatctac tggttcaccg tggaattcgg 2580 cctgtgcaaa gagggcgaca gcatcaaggc ttatggcgct ggactgctgt ctagcttcgg 2640 cgagctgcag tactgtctga gcgacaagcc taagctgctg cccctggaac tggaaaagac 2700 cgcctgccaa gagtacacag tgaccgagtt ccagcctctg tactacgtgg ccgagagctt 2760 caacgacgcc aaagaaaaag tgcggacctt cgccgccacc attcctcggc cttttagcgt 2820 cagatacgac ccctacacac agcgcgtgga agtgctggac aacacacagc agctgaagat 2880 tctggccgac tccatcaaca gcgaagtggg cattctgtgt cacgccctgc agaagatcaa 2940 gagctgagca agtaatgagc gctgatcata atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 3000 gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa 3060 tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat 3120 cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt 3180 gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc 3240 tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc 3300 ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg 3360 ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga 3420 cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc 3480 tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc 3540 tttgggccgc ctccccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 3600 gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 3660 taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 3720 ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 3780 gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaacgggct cgagaagctt ctagatatcc 3840 tctcttaagg tagcatcgag atttaaatta gggataacag ggtaatggcg cgggccgcaa 3900 aatttaaaag aagacaccaa atcagatgcc gccggtcgcc gccggtaggc gggacttccg 3960 gtacaagatg gcggacaatt acgtcatttc ctgtgacgtc atttcctgtg acgtcacttc 4020 cggtgggcgg gacttccgga attagggttg gctctgggcc agcgcttggg gttgacgtgc 4080 cactaagatc aagcggcgcg ccgcttgtct tagtgtcaag gcaaccccaa gcaagctggc 4140 ccagag 4146 <210> 198 <211> 4214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide sequence <400> 198 cggtgacgtg tttccggctg ttaggttgac cacgcgcatg ccgcgcggtc agcccaatag 60 ttaagccgga aacacgtcac cggaagtcac atgaccggaa gtcacgtgac cggaaacacg 120 tgacaggaag cacgtgaccg gaactacgtc accggatgtg cgtcaccgga agcatgtgac 180 cggaacttgc gtcacttccc cctcccctga ttggctggtt cgaacgaacg aaccctccaa 240 tgagactcaa ggacaagagg atattttgcg cgccaggaag tggcggcaat tcagtcgata 300 actataacgg tcctaaggta gcgatttaaa tacgcgctct cttaaggtag ccccgggacg 360 cgtcaattga gatctggatc cggtaccgaa ttcgcggccg cctcgacgac tagcgtttag 420 taatgagacg cacaaactaa tatcacaaac tggaaatgtc tatcaatata tagttgctct 480 agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 540 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 600 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 660 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 720 agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 780 atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 840 atgcatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 900 acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 960 gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 1020 gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 1080 gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg 1140 ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1200 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctccttcgg gctgtaatta 1260 gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 1320 ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 1380 ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 1440 cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 1500 ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattggatcg cgaagccgcc accatggact 1560 acaaagacca tgacggtgat tataaagatc atgatatcga ttacaaggat gacgatgaca 1620 aggctgctgt ggttctggaa aatggcgtgc tgagccggaa gctgagcgac ttcggacaag 1680 agacaagcta catcgaggac aacagcaacc agaatggcgc cgtgtctctg atcttcagcc 1740 tgaaagaaga agtgggcgcc ctggccaagg tgctgagact gttcgaggaa aacgagatca 1800 atctgaccca catcgagagc agacccagca gactgaacaa ggacgagtac gagttcttca 1860 cctacctgga caagcggagc aagcctgtgc tgggcagcat catcaagagc ctgagaaacg 1920 acatcggcgc caccgtgcac gagctgagca gagacaaaga aaagaacacc gtgccatggt 1980 tccccaggac catccaagag ctggacagat tcgccaacca gatcctgagc tatggcgccg 2040 agctggacgc tgatcaccct ggctttaagg accccgtgta ccgggccaga agaaagcagt 2100 ttgccgatat cgcctacaac taccggcacg gccagcctat tcctcgggtc gagtacaccg 2160 aggaagagag aaagacctgg ggcaccgtgt tcagaaccct gaaggccctg tacaagaccc 2220 acgcctgcta cgagcacaac cacatcttcc cactgctgga aaagtactgc ggcttccgcg 2280 aggacaatat ccctcagctc gaagacgtgt cccagttcct gcagacctgc accggcttta 2340 gactgaggcc tgttgccgga ctgctgagca gcagagattt tctcggcggc ctggccttca 2400 gagtgttcca ctgtacccag tacatcagac acggcagcaa gcccatgtac acccctgagc 2460 ctgatatctg ccacgagctg ctgggacatg tgcccctgtt cagcgataga agcttcgccc 2520 agttcagcca agagatcgga ctggcttctc tgggagcccc tgacgagtac attgagaagc 2580 tggccaccat ctactggttc accgtggaat tcggcctgtg caaagagggc gacagcatca 2640 aggcttatgg cgctggactg ctgtctagct tcggcgagct gcagtactgt ctgagcgaca 2700 agcctaagct gctgcccctg gaactggaaa agaccgcctg ccaagagtac acagtgaccg 2760 agttccagcc tctgtactac gtggccgaga gcttcaacga cgccaaagaa aaagtgcgga 2820 ccttcgccgc caccattcct cggcctttta gcgtcagata cgacccctac acacagcgcg 2880 tggaagtgct ggacaacaca cagcagctga agattctggc cgactccatc aacagcgaag 2940 tgggcattct gtgtcacgcc ctgcagaaga tcaagagctg agcaagtaat gagcgctgat 3000 cataatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 3060 gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 3120 cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 3180 ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 3240 actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc 3300 cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 3360 ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg 3420 ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 3480 ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 3540 cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gctgatcagc 3600 ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 3660 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 3720 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 3780 ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 3840 ggaaagaacg ggctcgagaa gcttctagat atcctctctt aaggtagcat cgagatttaa 3900 attagggata acagggtaat ggcgcgggcc gccacttcct ggcgcgcaaa atatcctctt 3960 gtccttgagt ctcattggag ggttcgttcg ttcgaaccag ccaatcaggg gagggggaag 4020 tgacgcaagt tccggtcaca tgcttccggt gacgcacatc cggtgacgta gttccggtca 4080 cgtgcttcct gtcacgtgtt tccggtcacg tgacttccgg tcatgtgact tccggtgacg 4140 tgtttccggc ttaactattg ggctgaccgc gcggcatgcg cgtggtcaac ctaacagccg 4200 gaaacacgtc accg 4214

Claims (123)

  1. 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자로서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 제1 ITR은 서열 번호 180에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 ITR은 서열 번호 181에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 제1 ITR은 서열 번호 183에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 ITR은 서열 번호 184에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 제1 ITR은 서열 번호 185에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 ITR은 서열 번호 186에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 제1 ITR은 서열 번호 187에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제2 ITR은 서열 번호 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는, 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 서로의 역상 보체(reverse complement)인, 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터인, 핵산 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 프로모터는 근육, 중추 신경계(CNS), 눈, 간, 심장, 신장, 췌장, 폐, 피부, 방광, 요로, 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택되는 장기에서의 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하는, 핵산 분자.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 간세포, 내피 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 동양혈관 세포, 구심성 뉴런, 원심성 뉴런, 뉴런간, 신경교 세포, 성상세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 뇌실막 세포, 폐 상피 세포, 슈반 세포, 위성 세포, 광수용체 세포, 망막 신경절 세포, 또는 임의의 이들의 조합에서의 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하는, 핵산 분자.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 5'에 위치한, 핵산 분자.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터는 마우스 타이레틴 프로모터(mTTR: mouse thyretin promoter), 내인성 인간 VIII 인자 프로모터(F8), 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, α1-안티트립신(AAT), 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 데스민(DES), SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, tMCK 및 포스포글리세레이트 키나제(PGK: phosphoglycerate kinase) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 인트론 서열을 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서, 인트론 서열은 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 5'에 위치한, 핵산 분자.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 인트론 서열은 프로모터의 3'에 위치한, 핵산 분자.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 서열은 합성 인트론 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론 서열은 서열 번호 115 또는 192를 포함하는, 핵산 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서, 전사후 조절 요소는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 3'에 위치한, 핵산 분자.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 전사후 조절 요소는 돌연변이된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE: woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element), 마이크로RNA 결합 부위, DNA 핵 표적화 서열, 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 핵산 분자.
  22. 제21항에 있어서, 마이크로RNA 결합 부위는 miR142-3p에 대한 결합 부위를 포함하는, 핵산 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 카세트는 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  24. 제23항에 있어서, 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A), 액틴 폴리(A), 헤모글로빈 폴리(A), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함하는, 핵산 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 카세트는 인핸서 서열을 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  27. 제26항에 있어서, 인핸서 서열은 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치한, 핵산 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 5'에서 3'로 제1 ITR, 유전적 카세트 및 제2 ITR을 포함하고; 유전적 카세트는 조직 특이적 프로모터 서열, 인트론 서열, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 전사후 조절 요소, 및 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  29. 제28항에 있어서, 유전적 카세트는 5'에서 3'로 조직 특이적 프로모터 서열, 인트론 서열, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열, 전사후 조절 요소 및 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서,
    (a) 조직 특이적 프로모터 서열은 TTT 프로모터를 포함하고;
    (b) 인트론은 합성 인트론이고;
    (c) 전사후 조절 요소는 WPRE를 포함하고;
    (d) 3' UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGHpA를 포함하는, 핵산 분자.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산을 포함하는, 핵산 분자.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산을 포함하는, 핵산 분자.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 응고 인자, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 항체, 이의 단편, 또는 임의의 이들의 조합을 암호화하는, 핵산 분자.
  34. 제33항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 아드레노메둘린(AM: adrenomedullin), 안지오포이에틴(Ang: angiopoietin), 자가분비 운동 인자, 골 형태발생 단백질(BMP: bone morphogenetic protein)(예를 들어, BMP2, BMP4, BMP5, BMP7), 섬모 신경영양 인자 패밀리 구성원(예를 들어, 섬모 신경영양 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor), 백혈병 억제 인자(LIF: leukemia inhibitory factor), 인터류킨-6(IL-6)), 콜로니 자극 인자(예를 들어, 대식세포 콜로니 자극 인자(m-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)), 표피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor), 에프린(예를 들어, 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3), 에리쓰로포이에틴(EPO: erythropoietin), 섬유아세포 성장 인자(FGF: fibroblast growth factor)(예를 들어, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23), 소 태아 소마토트로핀(FBS: foetal bovine somatotrophin), GDNF 패밀리 구성원(예를 들어, 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF: glial cell line-derived neurotrophic factor), 뉴투린, 퍼세핀, 아르테민), 성장 분화 인자-9(GDF9: growth differentiation factor-9), 간세포 성장 인자(HGF: hepatocyte growth factor), 간세포암 유래 성장 인자(HDGF: hepatoma-derived growth factor), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(예를 들어, 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 또는 IGF-2, 인터류킨(IL)(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7), 각질세포 성장 인자(KGF: keratinocyte growth factor), 이동 자극 인자(MSF: migration-stimulating factor), 대식세포 자극 단백질(MSP: macrophage-stimulating protein 또는 간세포 성장 인자-유사 단백질(HGFLP: hepatocyte growth factor-like protein)), 마이오스타틴(GDF-8), 뉴레귤린(예를 들어, 뉴레귤린 1(NRG1), NRG2, NRG3, NRG4), 뉴트로트로핀(예를 들어, 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF: brain-derived neurotrophic factor), 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor), 뉴트로트로핀-3(NT-3), NT-4, 태반 성장 인자(PGF: placental growth factor), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor), 레날라아제(RNLS: renalase), T-세포 성장 인자(TCGF: T-cell growth factor), 트롬보포이에틴(TPO: thrombopoietin), 형질전환 성장 인자(예를 들어, 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), TGF-β, 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자를 암호화하는, 핵산 분자.
  35. 제33항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 호르몬을 암호화하는, 핵산 분자.
  36. 제33항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 사이토카인을 암호화하는, 핵산 분자.
  37. 제33항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체 또는 이의 단편을 암호화하는, 핵산 분자.
  38. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 디스트로핀 X-연관, MTM1(마이오튜불라린), 티로신 수산화효소, AADC, 사이클로하이드롤라아제, SMN1, FXN(프라탁신), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA(MPS I), IDS(MPS II), PAH, GAA(산 알파-글루코시다아제), 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 유전자를 암호화하는, 핵산 분자.
  39. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는, 핵산 분자.
  40. 제39항에 있어서, miRNA는 SOD1, HTT, RHO, 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 표적 유전자의 발현을 하향조절하는, 핵산 분자.
  41. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 I 인자(FI), II 인자(FII), III 인자(FIII), IV 인자(FVI), V 인자(FV), VI 인자(FVI), VII 인자(FVII), VIII 인자(FVIII), IX 인자(FIX), X 인자(FX), XI 인자(FXI), XII 인자(FXII), XIII 인자(FVIII), 폰 빌레브란트 인자(VWF: Von Willebrand factor), 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐, 피브로넥틴, 안티트롬빈 III, 헤파린 보인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 억제제(ZPI: Z-related protease inhibitor), 플라스미노겐, 알파 2-안티플라스민, 조직 플라스미노겐 활성자(tPA: tissue plasminogen activator), 유로키나제, 플라스미노겐 활성자 억제제-1(PAI-1), 플라스미노겐 활성자 억제제-2(PAI2), 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 응고 인자를 암호화하는, 핵산 분자.
  42. 제41항에 있어서, 응고 인자는 FVIII인, 핵산 분자.
  43. 제42항에 있어서, FVIII는 전장 성숙 FVIII를 포함하는, 핵산 분자.
  44. 제43항에 있어서, FVIII는 서열 번호 106을 갖는 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  45. 제42항에 있어서, FVIII는 A1 도메인, A2 도메인, A3 도메인, C1 도메인, C2 도메인, 및 부분 또는 무 B 도메인을 포함하는, 핵산 분자.
  46. 제45항에 있어서, FVIII는 서열 번호 109의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자는 이종성 모이어티를 포함하는, 핵산 분자.
  48. 제47항에 있어서, 이종성 모이어티는 알부민 또는 이의 단편, 면역글로불린 Fc 영역, 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 β 아단위의 C 말단 펩타이드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 이종성 모이어티는 FVIII의 N 말단 또는 C 말단에 연결되거나, FVIII에서의 2개의 아미노산 사이에 삽입되는, 핵산 분자.
  50. 제49항에 있어서, 이종성 모이어티는 표 4에 기재된 삽입 부위로부터 선택된 하나 이상의 삽입 부위에서 2개의 아미노산 사이에 삽입되는, 핵산 분자.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII는 A1 도메인, A2 도메인, C1 도메인, C2 도메인, 선택적인 B 도메인 및 이종성 모이어티를 추가로 포함하고, 이종성 모이어티는 성숙 FVIII(서열 번호 106)에 상응하는 아미노산 745의 바로 하류에 삽입되는, 핵산 분자.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII는 FcRn 결합 파트너를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  53. 제52항에 있어서, FcRn 결합 파트너는 면역글로불린 불변 도메인의 Fc 영역을 포함하는, 핵산 분자.
  54. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII를 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된, 핵산 분자.
  55. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII를 암호화하는 핵산 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 핵산 분자.
  56. 제55항에 있어서, FVIII를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 107의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  57. 제55항에 있어서, FVIII를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 71의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  58. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 코돈 최적화된, 핵산 분자.
  59. 제58항에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 핵산 분자.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 전달제에 의해 제형화된, 핵산 분자.
  61. 제60항에 있어서, 전달제는 지질 나노입자를 포함하는, 핵산 분자.
  62. 제60항에 있어서, 전달제는 리포솜, 비지질 중합체성 분자 및 엔도솜, 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 정맥내, 경피, 진피내, 피하, 폐 또는 경구 전달, 또는 임의의 이들의 조합을 위해 제형화된, 핵산 분자.
  64. 제63항에 있어서, 핵산 분자는 정맥내 전달을 위해 제형화된, 핵산 분자.
  65. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  66. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  67. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제65항의 벡터, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  68. 제66항의 숙주 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  69. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 분자 및 이를 필요로 하는 대상체에게 핵산 분자를 투여하기 위한 설명서를 포함하는, 키트.
  70. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 분자의 도입을 위한 바큘로바이러스 시스템.
  71. 제70항에 있어서, 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 분자는 곤충 세포에서 생산되는, 바큘로바이러스 시스템.
  72. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 나노입자 전달 시스템.
  73. 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 적합한 조건 하에 제66항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  74. (내용 없음)
  75. 응고 활성을 갖는 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 적합한 조건 하에 제66항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 응고 활성을 갖는 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 필요로 하는 대상체에서 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 방법으로서, 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제65항의 벡터 또는 제67항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 응고 인자의 발현을 필요로 하는 대상체에서 응고 인자를 발현시키는 방법으로서, 제41항 내지 제57항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제65항의 벡터, 제75항의 폴리펩타이드 또는 제67항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  78. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제65항의 벡터 또는 제67항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  79. 응고 인자 결핍을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제41항 내지 제57항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제65항의 벡터, 제75항의 폴리펩타이드 또는 제67항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 응고 인자 결핍의 치료를 필요로 하는 대상체에서 응고 인자 결핍을 치료하는 방법으로서, 제41항 내지 제57항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제65항의 벡터, 제75항의 폴리펩타이드 또는 제67항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 핵산 분자는 정맥내로, 경피로, 진피내로, 피하로, 경구로, 폐로, 또는 임의의 이들의 조합으로 투여되는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 핵산 분자는 정맥내 투여되는, 방법.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  84. 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유류인, 방법.
  85. 제79항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  86. 제79항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 대한 핵산 분자의 투여는 투여 전의 대상체에서의 FVIII 활성에 비해 FVIII 활성을 증가시키고, FVIII 활성은 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배만큼 증가한, 방법.
  87. 제79항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 출혈 장애를 갖는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 출혈 장애는 혈우병인, 방법.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 출혈 장애는 A 혈우병인, 방법.
  90. 출혈 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 장애를 치료하는 방법으로서, 응고 인자를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  91. A 혈우병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 A 혈우병을 치료하는 방법으로서, VIII 인자(FVIII)를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  92. 간의 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간의 대사 장애를 치료하는 방법으로서, 대상체에서 결핍된 간 연관된 대사 효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR인, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  94. 간의 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 간의 대사 장애를 치료하는 방법으로서, 대상체에서 결핍된 간 연관된 대사 효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  95. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산을 포함하는, 방법.
  96. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산을 포함하는, 방법.
  97. 제92항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 간의 대사 장애는 페닐케톤뇨증(PKU: phenylketonuria), 우레아 사이클 질환, 리소좀 저장 장애 및 글리코겐 저장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 간의 대사 장애는 페닐케톤뇨증(PKU)인, 방법.
  99. 제92항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 정맥내로, 경피로, 진피내로, 피하로, 경구로, 폐로, 또는 임의의 이들의 조합으로 투여되는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 핵산 분자는 정맥내 투여되는, 방법.
  101. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  102. 제92항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유류인, 방법.
  103. 제92항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  104. 페닐케톤뇨증(PKU)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 방법으로서, 페닐알라닌 수산화효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적 카세트를 측접시키는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하는 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산을 포함하는, 방법.
  106. 제104항에 있어서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산을 포함하는, 방법.
  107. 제104항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 전달제에 의해 제형화된, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 전달제는 지질 나노입자를 포함하는, 방법.
  109. 핵산 분자를 클로닝하는 방법으로서, 복잡한 2차 구조가 가능한 핵산 분자를 적합한 벡터로 삽입하는 단계, 및 생성된 벡터를 SbcCD 복합체에서의 파괴를 포함하는 박테리아 숙주 균주로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  110. 제109항에 있어서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcC 유전자 및/또는 SbcD 유전자에서의 유전적 파괴를 포함하는, 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcC 유전자에서의 유전적 파괴를 포함하는, 방법.
  112. 제109항 또는 제110항에 있어서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcD 유전자에서의 유전적 파괴를 포함하는, 방법.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비아데노 연관된 바이러스(비-AAV) ITR인, 방법.
  114. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  115. 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분자는 유전적 카세트를 추가로 포함하고, 유전적 카세트는 제1 ITR과 제2 ITR에 의해 측접된, 방법.
  116. 제115항에 있어서, 유전적 카세트는 이종성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  117. 제109항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 적합한 벡터는 저카피 벡터인, 방법.
  118. 제109항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 적합한 벡터는 pBR322인, 방법.
  119. 제109항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 숙주 균주는 십자형 DNA 구조를 풀 수 없는, 방법.
  120. 제109항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 숙주 균주는 유전자형 sbcC, recD, mcrA, ΔmcrBCF를 포함하는 PMC103인, 방법.
  121. 제109항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 숙주 균주는 유전자형 recBC, recJ, sbcBC, mcrA, ΔmcrBCF를 포함하는 PMC107인, 방법.
  122. 제109항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 숙주 균주는 유전자형 recB, recJ, sbcC, mcrA, ΔmcrBCF, umuC, uvrC를 포함하는 SURE인, 방법.
  123. 핵산 분자를 클로닝하는 방법으로서, 복잡한 2차 구조가 가능한 핵산 분자를 적합한 벡터로 삽입하는 단계 및 생성된 벡터를 SbcCD 복합체에서의 파괴를 포함하는 박테리아 숙주 균주로 도입하는 단계를 포함하고, 핵산 분자는 제1 역방위 말단 반복부(ITR) 및 제2 ITR을 포함하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 서열 번호 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 또는 188에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 유도체와 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
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