KR20230003478A - 비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도 - Google Patents

비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도 Download PDF

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KR20230003478A
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Abstract

본 출원은 전이유전자의 전달 및 발현을 위한 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터를 설명한다. ceDNA 벡터는 2개의 ITR 서열이 플랭킹된 발현 카세트를 포함하며, 여기서 발현 카세트는 GBA 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 인코딩한다. 일부 ceDNA 벡터는 조절 스위치를 포함하는 시스-조절 요소를 추가로 포함한다. ceDNA 벡터를 사용하여 시험관내, 생체외 및 생체내에서 GBA 단백질의 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 위한 방법 및 세포주가 본원에 추가로 제공된다. 세포, 조직 또는 대상에서 GBA 단백질의 발현에 유용한 ceDNA 벡터를 포함하는 방법 및 조성물, 및 GBA 단백질을 발현하는 상기 ceDNA 벡터로 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 GBA 단백질은 질환, 예를 들어 고셰병의 치료를 위해 발현될 수 있다.

Description

비-바이러스성 DNA 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2020년 3월 24일자 출원된 미국 임시 출원 제62/993,866호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자문서로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이러한 서열목록은 그 전체가 본원에 참조로서 인용된다. 2021년 3월 24일자 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 131698-06620_SL.txt이고, 크기는 255,294바이트이다.
기술분야
본 개시내용은 대상 또는 세포에서 전이유전자(transgene) 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위한 비(非)바이러스성 벡터를 포함하는 유전자 치료 분야에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 구조체, 프로모터, 벡터 및 숙주 세포뿐 아니라, 표적 세포, 조직, 기관 또는 유기체로 외인성 DNA 서열을 전달하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용은 세포에서 베타-글루코세레브로시다아제(GBA)를 발현시키기 위해, 예를 들어 고셰병(Gaucher disease)을 앓고 있는 대상의 치료를 위한 GBA 치료 단백질을 발현시키기 위해 비바이러스성 ceDNA 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법 및 조성물은, 예를 들어 이를 필요로 하는 대상, 예를 들어 고셰병 또는 GBA 결핍증을 앓고 있는 대상의 세포 또는 조직에서 GBA 단백질을 발현시키는 방식으로 질환의 치료를 위해 적용될 수 있다.
유전자 치료는 유전자 발현 프로파일의 이상으로 인한 유전자 돌연변이 또는 후천성 질환을 앓고 있는 환자의 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 유전자 치료는 장애, 질환, 악성종양 등을 초래할 수 있는, 결함이 있는 유전자, 또는 비정상적인 유전자 조절 또는 발현, 예를 들어 과소발현(underexpression) 또는 과발현으로 인한 의학적 병태의 치료 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 결함이 있는 유전자로 인한 질환 또는 장애는 교정(corrective) 유전 물질을 환자에게 전달하여 환자 내에서 유전 물질의 치료적 발현을 유도하거나, 또는 예를 들어 교정 유전 물질을 이용하여 결함 유전자를 변경하거나 침묵시켜 환자 내에서 유전 물질의 치료적 발현을 유도하는 방식으로 치료, 예방 또는 개선될 수 있다.
유전자 치료의 기초는, 예를 들어 긍정적인 기능획득 효과, 부정적인 기능손실 효과 또는 또 다른 결과를 유도할 수 있는 활성 유전자 산물(때때로 전이유전자로 지칭됨)을 전사 카세트에 공급하는 것이다. 이러한 결과는 활성화 항체 또는 융합 단백질 또는 억제성 (중화) 항체 또는 융합 단백질의 발현에 기인할 수 있다. 유전자 치료는 또한 다른 인자로 인한 질환 또는 악성종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 단일 유전자의 변이로 인한 장애인 인간 단일유전자 장애는 정상 유전자를 표적세포에 전달하여 발현시키는 방식으로 치료될 수 있다. 교정 유전자를 환자의 표적세포에 전달하여 발현시키는 것은 조작된 바이러스 및 바이러스성 유전자 전달 벡터의 사용을 포함하는 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다. 다수의 이용 가능한 바이러스 유래 벡터(예를 들어, 재조합 레트로바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 등) 중에서, 재조합 아데노연관바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated virus)는 유전자 치료에서 다목적 벡터로서 인기를 얻고 있다.
아데노연관바이러스(AAV: adeno-associated virus)는 파르보바이러스과에 속하며, 더욱 구체적으로는 데펜도파르보바이러스(Dependoparvovirus) 속을 구성한다. AAV 유래 벡터(즉, rAVV 또는 AAV 벡터)는 다음과 같은 이유로 유전 물질의 전달에 매력적이다: (i) 이는 근세포와 뉴런을 포함하는 다양한 비(非)분열 및 분열 세포 유형을 감염(형질도입)시킬 수 있는 능력이 있음; (ii) 이는 바이러스 구조 유전자가 없기 때문에, 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 반응, 예를 들어 인터페론 매개 반응을 감소시킬 수 있음; (iii) 야생형 바이러스는 인간에서 비(非)병적으로 간주됨; (iv) 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있는 야생형 AAV와 대조적으로, 복제불능 AAV 벡터에는 복제(rep) 유전자가 결여되어 있고 일반적으로 에피솜으로 지속되기 때문에, 삽입 돌연변이유발 또는 유전독성의 위험을 제한할 수 있음; 및 (v) 다른 벡터 시스템과 비교하여, AAV 벡터는 일반적으로 상대적으로 불량한 면역원인 것으로 여겨져 중요한 면역 반응((ii) 참조)을 촉발시키지 않기 때문에, 벡터 DNA의 지속, 및 잠재적으로 치료용 전이유전자의 장기 발현을 얻을 수 있음.
하지만, 유전자 전달 벡터로서 AAV 입자를 사용하는 데에는 몇 가지 주요 결함이 있다. rAAV와 관련된 하나의 주요 단점은 약 4.5 kb로 제한된 이종 DNA 바이러스 패키징 용량으로(Dong 등의 문헌(1996); Athanasopoulos 등의 문헌(2004); Lai 등의 문헌(2010)), 그 결과, AAV 벡터의 사용은 150,000 Da 단백질 코딩 용량 미만으로 제한되어 있다. 두 번째 단점은, 집단에서 야생형 AAV 감염의 유병률로 인해, rAAV 유전자 치료 후보가 환자에서 벡터를 제거하는 중화 항체의 존재에 대해 스크리닝되어야 한다는 점이다. 세 번째 단점은, 초기 치료에서 제외되지 않았던 환자에게의 재투여를 막는 캡시드 면역원성과 관련이 있다. 환자의 면역계는 향후 치료를 방해하는 높은 역가의 항-AAV 항체를 생성하는 면역계를 자극하기 위해 "부스터(booster)" 주사로서 효과적으로 작용하는 벡터에 반응할 수 있다. 일부 최근 보고서는, 고용량 조건에서 면역원성에 대한 우려를 나타낸다. 또 다른 주목할 만한 단점은, 단일가닥 AAV DNA가 이종 유전자 발현 전 이중가닥 DNA로 전환되어야 한다는 점을 고려할 때, AAV 매개 유전자 발현의 개시가 상대적으로 느리다는 점이다.
또한, 캡시드를 갖는 통상적인 AAV 비리온은 AAV 게놈, rep 유전자 및 cap 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 플라스미드들의 도입을 통해 생성된다(Grimm 등의 문헌(1998)). 하지만, 이러한 캡시드화된 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 유형을 비효율적으로 형질도입하는 것으로 확인되었으며, 캡시드 또한 면역 반응을 유도한다.
따라서, 유전자 치료를 위한 아데노연관바이러스(AAV) 벡터의 사용은 (환자 면역 반응으로 인해) 환자에게의 단회 투여, 최소 바이러스 패키징 용량(약 4.5 kb)으로 인한 AAV 벡터에서 전달에 적합한 전이유전자 유전 물질의 제한된 범위, 및 느린 AAV 매개 유전자 발현으로 인해 제한된다.
고셰병은 글루코세레브로시드(glucocerebroside)로 불리는 일종의 지방(지질)이 적절하게 분해될 수 없는 상염색체 열성 유전 대사 장애이다. 고셰병은 가장 흔한 리소좀 축적 장애로, 유병률은 대략 1:100,000이고, 일반 인구집단에서의 연간 발병률은 1:60,000이다. 고셰병에서, 효소 글루코세레브로시다아제의 결핍은 유해한 양의 특정 지질, 특히 당지질 글루코세레브로시드가 전신에, 특히 골수, 비장 및 간 내에 축적되게 한다. 고셰병은 GBA로 불리는 단일 유전자의 돌연변이로 인해 유발될 수 있다. GBA 유전자의 돌연변이는 매우 낮은 수준의 글루코세레브로시다아제 베타(당업계에 베타-글루코세레브로시다아제로도 공지되어 있음)를 초래한다. 고셰병의 임상 증상의 범위는 광범위하며, 유전자형과 표현형 사이에 직접적인 상관관계가 결여되어 있을 수 있다. 하지만, 고셰병은 전통적으로 중추신경계 손상의 부재(제1형), 또는 존재 및 중증도(제2형 및 제3형)에 따라 크게 3가지 별개의 유형으로 분류되었다. 고셰병에 대한 현재의 치료법은 일부 전신 증상을 개선할 수 있는 정맥내 또는 경구 약물을 포함하지만, 이러한 질환의 신경학적 증상은 여전히 불치성으로 남아있다. 고셰병의 질환 변형(disease-modifying) 치료법에 대한 상당한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
고셰병의 치료를 위해 세포, 조직 또는 대상에서 치료용 GBA 단백질의 발현을 가능하게 하는 기술이 해당 분야에 필요하다.
본원에 기재된 기술은 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 캡시드 미함유(예를 들어, 비바이러스성) DNA 벡터(본원에서 "폐쇄형 DNA 벡터" 또는 "ceDNA 벡터"로 지칭됨)(여기서 ceDNA 벡터는 베타-글루코세레브로시다아제(GBA) 핵산 서열 또는 이의 코돈 최적화된 버전을 포함함)로부터 GBA 단백질의 발현에 의한 고셰병의 치료 방법 및 이의 치료를 위한 조성물에 관한 것이다. 이러한 ceDNA 벡터는 치료, 모니터링 및 진단을 위한 GBA 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 고셰병의 치료를 위해 GBA를 발현하는 ceDNA 벡터를 대상에게 적용하는 것은, 다음과 같은 측면에서 유용하다: (i) 질환 변형 수준의 GBA 효소를 제공함, 최소 침습성으로 전달이 이루어짐, 반복 가능하고 용량 반응성임, 치료 효과의 개시가 신속함, 간에서 교정 GBA 효소의 발현을 지속시킴 및/또는 결함 효소의 적절한 약리학적 수준이 달성되도록 적정할 수 있음.
일부 구현예에서, GBA를 발현하는 ceDNA 벡터는 선택적으로 리포좀 나노입자 제형(LNP)으로 존재한다. 고셰병의 치료를 위한 본원에 기재된 ceDNA LNP 제형은 하기를 포함하는 하나 이상의 유익을 제공할 수 있다: 질환 변형 수준의 GBA 단백질을 제공함, 최소 침습성으로 전달이 이루어짐, 반복 가능하고 용량 반응성임, 전형적으로 치료적 개입 수일 이내에 치료 효과가 신속하게 개시됨, 순환에서 교정 GBA 단백질의 발현 수준을 지속시킴, 결함이 있는 응고인자의 적절한 약리학적 수준이 달성되도록 적정할 수 있음.
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 세포에서 GBA 치료 단백질의 발현을 가능하게 하는, GBA를 인코딩하는 유전자를 포함하는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 캡시드 미함유(예를 들어, 비바이러스성) DNA 벡터(본원에서 "폐쇄형 DNA 벡터" 또는 "ceDNA 벡터"로 지칭됨)에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, GBA를 인코딩하는 유전자는 이종 유전자이다.
본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질 생산의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 상보적 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA 분자(선형, 연속 및 비캡시드화된 구조)로서, 이는 5' 역말단반복(ITR) 서열과 3' ITR 서열을 포함하며, 여기서 5' ITR과 3' ITR은 서로에 대해 동일한 대칭인 3차원 구성을 가질 수 있거나(즉, 대칭 또는 실질적으로 대칭임), 또는 대안적으로, 5' ITR과 3' ITR은 서로에 대해 상이한 3차원 구성을 가질 수 있다(즉, 비대칭인 ITR). 또한, ITR은 동일하거나 상이한 혈청형에서 유래한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 기하학적 공간에서의 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다(즉, 이들은 동일하거나 서로에 대해 거울상임). 일부 구현예에서, 하나의 ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 기술의 일부 양태는 상기 기재된 GBA 단백질의 개선된 단백질 발현 및/또는 생산을 위한 ceDNA 벡터로서, 표 5에 개시된 임의의 GBA 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 플랭킹하는 ITR 서열을 포함하며, 여기서 ITR 서열은 (i) 적어도 하나의 WT ITR과 적어도 하나의 변형된 AAV 역말단반복서열(ITR)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 2개의 변형된 ITR(여기서 mod-ITR 쌍은 서로에 대해 상이한 3차원 공간 구성을 가짐)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR), 또는 (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍(여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐), 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍(여기서 각각의 mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 임의의 것에서 선택되는 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 진핵세포에서 생산될 수 있기 때문에, 곤충 세포에서 원핵세포 DNA 변형 및 박테리아 내독소 오염이 없다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은, 부분적으로, 비제한적으로 간의 세포를 포함하는 세포에서 적어도 하나의 GBA 단백질 또는 하나 초과의 GBA 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있는, 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)의 발견에 관한 것이다.
따라서, 하나의 양태에서, 2개의 상이한 AAV 역말단반복서열(ITR) 사이에 배치된 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 적어도 하나 포함하는 DNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터)로서, 여기서 ITR 중 하나는 기능성 AAV 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 하나의 ITR에 비해 결실, 삽입 또는 치환을 포함하며; 여기서 전이유전자는 GBA 단백질을 인코딩하고; DNA 벡터에서 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 DNA는, 미변성 겔 상에서 분석 시, 선형 및 비연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 갖는 DNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터)가 본원에 제공된다. 하나의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터로부터 생체내에서 GBA 단백질을 발현시켜 GBA 단백질을 전달하는 것, 나아가, FIX 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 사용하여 고셰병을 치료하는 것을 포함한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 본원에서 고려된다.
본 개시내용의 양태는 본원에 기재된 바와 같은 세포에서 GBA 단백질 발현에 유용한 ceDNA 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예는 본원에 제공된 방법으로 생산된 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, GBA 단백질 생산을 위한 캡시드 미함유(예를 들어, 비바이러스성) DNA 벡터(ceDNA 벡터)는, 첫 번째 5' 역말단반복서열(예를 들어, AAV ITR); 핵산 서열; 및 3' ITR(예를 들어, AAV ITR)을 이러한 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형을 포함하는 플라스미드(본원에서 "ceDNA-플라스미드"로 지칭됨)로부터 수득되며, 여기서 5' ITR과 3'ITR은 서로 비대칭일 수 있거나, 본원에 기재된 바와 같이 대칭(예를 들어, WT-ITR 또는 변형된 대칭인 ITR)일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 본 개시내용을 읽은 후 당업자가 이해하게 되는 다수의 수단에 의해 수득 가능하다. 예를 들어, 본 개시내용의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스일 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 ITR 사이에 작동 가능하게 배치된 제한 클로닝 부위(예를 들어, 서열번호 123 및/또는 서열번호 124)를 포함하며, 여기에, 예를 들어 전이유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트, 예를 들어 GBA를 인코딩하는 핵산이 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대칭 또는 비대칭인 ITR(변형된 또는 WT ITR)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스)으로부터 생산된다.
허용(permissive) 숙주 세포에서, 예를 들어 Rep의 존재 하에서, 적어도 2개의 ITR을 갖는 폴리뉴클레오타이드 주형을 복제하여 GBA 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 다음과 같은 2단계를 거친다: 첫 번째로, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스 게놈 등)으로부터의 주형의 절제("회수") 단계, 및 두 번째로, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계. 다양한 AAV 혈청형의 Rep 단백질 및 Rep 결합 부위는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 당업자는 적어도 하나의 기능성 ITR에 기반하여 핵산 서열에 결합하고 이를 복제하는 혈청형에서 Rep 단백질을 선택하는 것을 이해한다. 예를 들어, 복제 가능한 ITR이 AAV 혈청형 2에서 유래하는 경우, 상응하는 Rep는 AAV2 또는 AAV4 Rep을 갖는 AAV2 ITR과 같은 해당 혈청형과는 함께 작동하지만, AAV5 Rep과는 함께 작동하지 않는 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 복제 시, 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 ceDNA 벡터는 허용 세포에 계속 축적되고, ceDNA 벡터는 바람직하게는 표준 복제 조건 하 Rep 단백질 존재 하에서 시간의 경과에 따라 충분히 안정하여, 예를 들어 적어도 1 pg/세포, 바람직하게는 적어도 2 pg/세포, 바람직하게는 적어도 3 pg/세포, 더욱 바람직하게는 적어도 4 pg/세포, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 5 pg/세포의 양으로 축적된다.
따라서, 본 개시내용의 하나의 양태는, 하기 단계를 포함하는, 상기와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산 방법에 관한 것이다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스)을 보유하는 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포) 집단을, Rep 단백질의 존재 하에서, 숙주 세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 숙주 세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도하여, 숙주 세포에서 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 생산한다. 하지만, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, 비리온으로 인한 크기 제한이 없다.
숙주 세포에서 단리된 GBA 단백질의 발현에 유용한 ceDNA 벡터의 존재는, 숙주 세포에서 단리된 DNA를 ceDNA 벡터에서 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 변성 및 미변성 겔 상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다.
또한, 세포 또는 대상에서 ceDNA 벡터를 사용하여, 치료적 용도를 갖는 GBA 단백질을 발현시키는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 GBA 단백질은 고셰병의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 치료용 GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 고셰병 치료 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기술의 하나의 양태는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, 여기서 ceDNA 벡터는 2개의 ITR 서열 사이에 작동적으로 배치된 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 ITR 서열은 비대칭, 또는 대칭, 또는 실질적으로 대칭일 수 있고(이러한 용어는 본원에 정의된 바와 같음), ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함하고, 선택적으로 핵산 서열은 전이유전자(예를 들어, GBA 단백질)를 인코딩하고, 벡터는 바이러스 캡시드 내에 있지 않은 ceDNA 벡터에 관한 것이다.
본 개시내용의 이러한 및 다른 양태는 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다.
상기 간략하게 개략되어 있고 하기 보다 상세하게 논의되는 본 개시내용의 구현예는, 첨부된 도면에 도시된 본 개시내용의 예시적인 구현예를 참조로 이해될 수 있다. 하지만, 첨부된 도면은 본 개시내용의 단지 전형적인 구현예를 예시하는 것으로, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 본 개시내용은 다른 동등하게 효과적인 구현예를 허용할 수 있다.
도 1a는, 비대칭인 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 이러한 구현예에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. GBA 전이유전자를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위(R3/R4)에 삽입될 수 있다. 발현 카세트에는 2개의 역말단반복서열(ITR), 즉, 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 야생형 AAV2 ITR과 발현 카세트의 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR이 플랭킹되어 있으므로, 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 ITR은 서로에 대해 비대칭이다.
도 1b는, CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트와 함께, 비대칭인 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. GBA 전이유전자를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위에 삽입될 수 있다. 발현 카세트에는 2개의 역말단반복서열(ITR), 즉, 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR과 발현 카세트의 다운스트림(3'-말단)에 있는 야생형 ITR이 플랭킹되어 있다.
도 1c는, 인핸서/프로모터, GBA 전이유전자, 전사 후 요소(WPRE) 및 polyA 신호를 함유하는 발현 카세트와 함께, 비대칭인 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위에의 GBA 전이유전자의 삽입을 가능하게 한다. 발현 카세트에는 서로에 대해 비대칭인 2개의 역말단반복서열(ITR), 즉, 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR과 발현 카세트의 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR이 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' ITR과 3' ITR은 모두 변형된 ITR이지만, 상이한 변형을 갖는다(즉, 이들은 동일한 변형을 갖지 않음).
도 1d는, CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. GBA 전이유전자를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트에는 2개의 변형된 역말단반복서열(ITR)이 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' 변형된 ITR과 3' 변형된 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1e는, 인핸서/프로모터, 전이유전자, 전사 후 요소(WPRE) 및 polyA 신호를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위에의 전이유전자(예를 들어, GBA)의 삽입을 가능하게 한다. 발현 카세트에는 2개의 변형된 역말단반복서열(ITR)이 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' 변형된 ITR과 3' 변형된 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1f는, CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 WT-ITR 또는 실질적으로 대칭인 WT-ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 전이유전자(예를 들어, GBA)를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트에는 2개의 야생형 역말단반복서열(WT-ITR)이 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1g는, 인핸서/프로모터, 전이유전자(예를 들어, GBA 단백질을 인코딩하는 핵산 서열), 전사 후 요소(WPRE) 및 polyA 신호를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위에의 전이유전자(예를 들어, GBA 단백질을 인코딩하는 핵산 서열)의 삽입을 가능하게 한다. 발현 카세트에는 2개의 야생형 역말단반복서열(WT-ITR)이 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 2a는, A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE')가 확인되는 AAV2의 야생형 좌측 ITR(서열번호 52)의 T-형 스템-루프 구조를 제공하고, 또한 말단 분해 부위(trs)를 보여준다. RBE는 Rep 78 또는 Rep 68과 상호작용하는 것으로 여겨지는 일련의 4개의 이중체 사량체를 함유한다. 나아가, RBE'는 또한 구조체 내 야생형 ITR 또는 돌연변이된 ITR 상에 어셈블링된 Rep 복합체와 상호작용하는 것으로 여겨진다. D 및 D' 영역은 전사인자 결합 부위와 다른 보존된 구조를 함유한다. 도 2b는, A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE')가 확인되는 AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T-형 스템-루프 구조를 포함하는 야생형 좌측 ITR(서열번호 53)에서의 제안된 Rep 촉매화된 닉킹 및 결찰 활성을 보여주고, 또한 말단 분해 부위(trs), 및 몇몇 전사인자 결합 부위와 다른 보존된 구조를 포함하는 D 및 D' 영역을 보여준다.
도 3a는, 야생형 좌측 AAV2 ITR(서열번호 54)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 아암의 1차 구조(폴리뉴클레오타이드 서열)(좌측)와 2차 구조(우측)를 보여준다. 도 3b는, 좌측 ITR에 대한 예시적인 돌연변이된 ITR(변형된 ITR로도 지칭됨) 서열을 보여준다. 예시적인 돌연변이된 좌측 ITR(ITR-1, 좌측)(서열번호 113)의 A-A' 아암의 RBE 부분과 C 아암 및 B-B' 아암의 1차 구조(좌측)와 예측된 2차 구조(우측)가 제시되어 있다. 도 3c는, 야생형 우측 AAV2 ITR(서열번호 55)의 A-A' 루프의 RBE 함유 부분과 B-B' 및 C-C' 아암의 1차 구조(좌측)와 2차 구조(우측)를 보여준다. 도 3d는, 예시적인 우측 변형된 ITR을 보여준다. 예시적인 돌연변이 우측 ITR(ITR-1, 우측)(서열번호 114)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 B-B' 및 C 아암의 1차 구조(좌측)와 예측된 2차 구조(우측)가 제시되어 있다. 좌측 및 우측 ITR(예를 들어, AAV2 ITR, 또는 다른 바이러스 혈청형 또는 합성 ITR)의 임의의 조합이 본원에 교시된 바와 같이 사용될 수 있다. 도 3a 내지 도 3d 각각에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA를 생산하는 데 사용되는 플라스미드 또는 박미드/바큐로바이러스 게놈에 사용된 서열을 나타낸다. 또한, 도 3a 내지 도 3d 각각에는, 플라스미드 또는 박미드/바큐로바이러스 게놈의 ceDNA 벡터 구성 및 예측된 깁스 자유 에너지 값에서 추론된 상응하는 ceDNA 2차 구조가 포함되어 있다.
도 4a는, 도 4b의 개략도에 기재된 공정에서 본원에 개시된 바와 같은 GBA의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산에 유용한 바큐로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 제조하는 업스트림 공정을 예시하는 개략도이다. 도 4b는 예시적인 ceDNA 생산 방법의 개략도이고, 도 4c는 ceDNA 벡터 생산을 확인하기 위한 생화학적 방법 및 공정을 예시한다. 도 4d 및 도 4e는, 도 4b의 ceDNA 생산 공정 동안 수득된 세포 펠릿에서 수거된 DNA에서 ceDNA의 존재를 식별하는 공정을 설명하는 개략도이다. 도 4d는, 절단되지 않은 채로 유지되거나 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 후, 미변성 겔 또는 변성 겔 상에서 전기영동에 적용된 예시적인 ceDNA에 대한 개략적인 예상 밴드를 보여준다. 가장 좌측의 개략도는 미변성 겔이며, 이는 이중체 및 절단되지 않은 형태에서 ceDNA가, 더 빠르게 이동하는 더 작은 단량체와 단량체 크기의 2배인 더 느리게 이동하는 이량체로 보이는, 적어도 단량체와 이량체 상태로 존재함을 시사한다. 좌측에서 두 번째 개략도는, ceDNA가 제한 엔도뉴클레아제로 절단되는 경우, 본래 밴드가 사라지고, 절단 후 남아있는 예상 단편 크기에 상응하는 더 빠르게 이동하는(예를 들어, 더 작은) 밴드가 나타남을 보여준다. 변성 조건 하에서, 본래 이중체 DNA는 단일가닥이며, 이는 상보적 가닥이 공유결합으로 연결되어 있기 때문에, 미변성 겔 상에서 관찰된 것 보다 2배 더 큰 종으로 이동한다. 따라서, 우측에서 두 번째 개략도에서, 소화된 ceDNA는 미변성 겔에서 관찰된 것과 유사한 밴딩 분포를 보여주지만, 밴드는 미변성 겔 대응물의 2배 크기의 단편으로 이동한다. 가장 우측의 개략도는, 변성 조건 하에서 절단되지 않은 ceDNA가 단일가닥 개방형 고리로 이동하기 때문에, 관찰된 밴드는 고리가 개방되지 않은 미변성 조건에서 관찰된 것의 2배 크기임을 보여준다. 이러한 도면에서, "kb"는, 문맥에 따라, 뉴클레오타이드 사슬 길이(예를 들어, 변성 조건에서 관찰된 단일가닥 분자의 경우) 또는 염기쌍의 수(예를 들어, 미변성 조건에서 관찰된 이중가닥 분자의 경우)를 기반으로 뉴클레오타이드 분자의 상대적인 크기를 나타내는 데 사용된다. 도 4e는, 비연속 구조를 갖는 DNA를 보여준다. ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어, 중성 및 변성 조건 모두에서 상이한 크기(1 kb 및 2 kb)를 갖는 2개의 DNA 단편을 생성할 수 있다. 도 4e는, 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA를 또한 보여준다. ceDNA 벡터는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어, 중성 조건에서는 1 kb 및 2 kb로 이동하는 2개의 DNA 단편을 생성할 수 있지만, 변성 조건에서는 가닥이 연결된 채로 유지되어 2 kb 및 4 kb로 이동하는 단일 가닥을 생성할 수 있다.
도 5는, 엔도뉴클레아제로 소화되거나(+) 소화되지 않은(-) ceDNA 벡터의 변성 겔 전개의 예시적인 도면이다(ceDNA 구조체 1 및 2의 경우 EcoRI; ceDNA 구조체 3 및 4의 경우 BamH1; ceDNA 구조체 5 및 6의 경우 SpeI; 및 ceDNA 구조체 7 및 8의 경우 XhoI). 구조체 1 내지 구조체 8은 국제 특허 출원 PCT/US18/49996의 실시예 1에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 별표로 강조된 밴드의 크기를 결정하고 도면의 하단에 제공하였다.
도 6은 실시예 7에 기재된 실험의 결과를 도시한 것으로, 구체적으로 LNP-polyC 대조군으로 처리된 마우스(가장 좌측에 있는 마우스)와 LNP-ceDNA-루시퍼라아제로 처리된 4마리 마우스(가장 좌측에 있는 마우스를 제외한 나머지 모든 마우스)에서 얻은 IVIS 이미지를 보여준다. 4마리의 ceDNA 처리된 마우스는 마우스의 간 함유 영역에서 유의한 형광을 나타낸다.
도 7은, 실시예 8에 기재된 실험의 결과를 도시한 것이다. 어두운 반점은 발현된 ceDNA 전이유전자에서 생성된 단백질의 존재를 나타내며, 이는 투여된 LNP-ceDNA와 간세포의 결합을 입증한다.
도 8a 및 도 8b는, 실시예 9에 제시된 안구 연구의 결과를 도시한 것이다. 도 8a는, JetPEI®-ceDNA-루시퍼라아제가 주사된 래트의 눈(좌측 상단)과 동일한 래트의 주사되지 않은 눈(우측 상단), 또는 플라스미드-루시퍼라아제 DNA가 주사된 래트의 눈(좌측 하단)과 동일한 래트의 주사되지 않은 눈(우측 하단)의 대표적인 IVIS 이미지를 보여준다. 도 8b는, 각각의 처리군에서 처리된 눈 또는 상응하는 처리되지 않은 눈에서 관찰된 평균 광도의 그래프를 보여준다. ceDNA 처리된 래트는 99일에 걸쳐 장기간 유의한 형광(및 따라서 루시퍼라아제 전이유전자 발현)을 나타냈으며, 이는 플라스미드-루시퍼라아제로 처리된 래트에서 최소량의 상대적 형광(및 따라서 루시퍼라아제 전이유전자 발현)이 관찰되었던 것과 뚜렷한 대조를 이룬다.
도 9a 및 도 9b는, 실시예 10에 기재된 Rag2 마우스에서의 ceDNA 지속성 및 재투여 연구의 결과를 도시한 것이다. 도 9a는, LNP-ceDNA-Luc 처리된 야생형 c57bl/6 마우스 또는 Rag2 마우스에서 관찰된 시간 경과에 따른 총 플럭스(flux)의 그래프를 보여준다. 도 9b는, Rag2 마우스에서 루시퍼라아제 전이유전자의 발현 수준에 대한 재투여의 영향을 보여주는 그래프를 제공하며, 여기서 재투여 후 안정한 발현의 증가가 관찰되었다(화살표는 재투여 시점을 나타냄).
도 10은, 실시예 11에 기재된 처리된 마우스에서의 ceDNA 루시퍼라아제 발현 연구에서 얻은 데이터를 제공하며, 이는 연구 기간에 걸친 마우스의 각 그룹에서의 총 플럭스를 나타낸다. 높은 수준의 메틸화되지 않은 CpG는 시간 경과에 따라 마우스에서 관찰된 보다 낮은 총 플럭스와 상관관계가 있었지만, 간 특이적 프로모터의 사용은 적어도 77일에 걸친 ceDNA 벡터로부터 전이유전자의 지속적인 안정한 발현과 상관관계가 있었다.
도 11a 및 도 11b는, 네이키드 ceDNA-GBA가 유체역학적으로 주사된 CD-1 마우스에서의 GBA 활성을 도시한 것이다. 도 11a는, 3일차에 측정된, 동물당 0.1 μg, 1.0 μg 또는 10.0 μg 농도의 ceDNA-GBA v1, ceDNA-GBA v2, ceDNA-GBA v3, ceDNA-GBA v4, ceDNA-GBA v5 또는 ceDNA-GBA v6으로 처리된 CD-1 마우스의 혈장 내 GBA 활성 수준을 보여준다. 도 11b는, 7일차에 측정된, 동물당 0.1 μg, 1.0 μg 또는 10.0 μg 농도의 ceDNA-GBA v1, ceDNA-GBA v2, ceDNA-GBA v3, ceDNA-GBA v4, ceDNA-GBA v5 또는 ceDNA-GBA v6으로 처리된 CD-1 마우스의 혈장 내 GBA 활성 수준을 보여준다.
GBA 치료 단백질 또는 이의 단편을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 ceDNA 벡터를 사용하여 고셰병을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, GBA 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 제공된다. 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현은 치료 단백질이 이것이 발현되는 세포 외부로 분비되는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서 발현된 GBA 단백질은 이것이 발현되는 세포 내에서 작용하거나 기능할 수 있다(예를 들어, 이의 효과를 발휘함). 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상의 간, 근육(예를 들어, 골격근), 또는 GBA 치료 단백질 생산 및 다수의 전신 구획으로의 분비를 위한 데포로서 작용할 수 있는 다른 신체 부위에서 GBA 단백질을 발현시킨다.
I. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 면역학 및 분자생물학에서의 상용 용어 정의는, 하기 문헌에서 확인할 수 있다: 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)]; 문헌[Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013)]; 문헌[Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)]; 문헌[Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]; 문헌[Immunology by Werner Luttmann, Elsevier, 2006]; 문헌[Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)]; 문헌[Lewin's Genes XI, Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)]; 문헌[Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)]; 문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)]; 문헌[Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)]; 문헌[Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005]; 및 문헌[Current Protocols in Immunology (CPI), John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)](상기 문헌들의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨).
본원에 사용된 "이종 뉴클레오타이드 서열" 및 "전이유전자"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 혼입되고, 이에 의해 전달 및 발현될 수 있는 (캡시드 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 이외의) 관심 핵산을 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, "이종 핵산"이라는 용어는, 이와 접촉해 있는 세포 또는 대상에 존재하거나, 이에 의해 발현되거나 이에서 유도되지 않는 핵산(또는 전이유전자)을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "발현 카세트" 및 "전사 카세트"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 하나 이상의 프로모터, 또는 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 전이유전자를 포함하지만, 캡시드 인코딩 서열, 다른 벡터 서열 또는 역말단반복 영역을 포함하지 않는 핵산의 선형 스트레치를 나타낸다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스-작용 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 억제제), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사 후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"이라는 용어는, 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타낸다. 따라서, 이러한 용어에는, 단일가닥, 이중가닥 또는 다중가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체가 포함된다. "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 단일가닥 또는 이중가닥 DNA의 약 5개 내지 약 100개 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 하지만, 본 개시내용을 목적을 위해, 올리고뉴클레오타이드의 길이에는 상한이 없다. 올리고뉴클레오타이드는 "올리고머" 또는 "올리고"로도 공지되어 있으며, 유전자에서 단리되거나, 당업계에 공지된 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"이라는 용어는, 기재되는 구현예에 적용되는 바에 따라, 단일가닥(예컨대 센스 및 안티센스) 및 이중가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
DNA는, 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, DNA-DNA 이중체, 사전 축합된 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이러한 그룹의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. DNA는 미니서클, 플라스미드, 박미드, 미니유전자, 미니스트링 DNA(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 폐쇄형 선형 이중체 DNA(CELiD 또는 ceDNA), 개뼈형(dbDNA™) DNA, 덤벨형 DNA, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, 바이러스성 RNA(vRNA) 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산에는, 합성, 자연 발생 및 비자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 공지된 뉴클레오타이드 유사체, 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예에는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노), 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA™) 및 펩타이드 핵산(PNA)이 포함된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 퇴화 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP 및 상보적 서열뿐 아니라, 명백하게 제시된 서열을 암시적으로 포함한다.
"뉴클레오타이드"는, 당 옥시리보오스(DNA) 또는 리보오스(RNA), 염기 및 포스페이트기를 함유한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트기를 통해 함께 연결된다.
"염기"에는, 퓨린 및 피리미딘(이에는 천연 화합물인 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체가 추가로 포함됨) 및 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체(이에는, 비제한적으로, 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응성기가 대체된 변형이 포함됨)가 포함된다.
본원에 사용된 "핵산 구조체"라는 용어는, 자연 발생 유전자에서 단리되거나, 자연에 달리 존재하지 않을 수 있는 방식으로 핵산의 분절을 함유하도록 변형되거나 또는 합성된, 단일가닥 또는 이중가닥의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산 구조체라는 용어는, 핵산 구조체가 본 개시내용의 코딩 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 함유하는 경우, "발현 카세트"라는 용어와 동의어이다. "발현 카세트"는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 코딩 서열을 포함한다.
"혼성화 가능한" 또는 "상보적인" 또는 "실질적으로 상보적인"이란, 핵산(예를 들어, RNA)이 이에 대한 비공유결합을 가능하게 하는, 즉, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 및/또는 G/U 염기 쌍을 형성하거나, 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 시험관내 및/또는 생체내 조건 하에서 서열 특이적인 역평행 방식으로 또 다른 핵산(즉, 상보적인 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산)에 "어닐링", 또는 "혼성화"하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 표준 왓슨-크릭 염기 짝짓기에는, 아데닌(A)과 티미딘(T)의 짝짓기, 아데닌(A)과 우라실(U)의 짝짓기, 및 구아닌(G)과 시토신(C)의 짝짓기가 포함된다. 또한, 당업계에는 2개의 RNA 분자(예를 들어, dsRNA) 사이의 혼성화, 구아닌(G)과 우라실(U)의 염기 쌍에 대해서도 공지되어 있다. 예를 들어, G/U 염기 짝짓기는 tRNA 안티코돈과 mRNA 코돈의 염기 짝짓기의 맥락에서 유전자 코드의 축퇴(즉, 중복)에 부분적으로 관여한다. 본 개시내용의 맥락에서, 대상 DNA 표적화 RNA 분자의 단백질-결합 분절(dsRNA 이중체)의 구아닌(G)은 우라실(U)에 상보적인 것으로 간주되며, 그 반대도 마찬가지이다. 이와 같이, G/U 염기쌍이 주어진 뉴클레오타이드 위치에서 대상 DNA 표적화 RNA 분자의 단백질-결합 분절(dsRNA 이중체)로 만들어질 수 있는 경우, 해당 위치는 비상보적인 것으로 간주되지 않고, 대신 상보적인 것으로 간주된다.
"펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 코딩된 및 비코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 나타낸다.
특정 GBA 단백질을 "인코딩하는" DNA 서열은 특정 RNA 및/또는 단백질로 전사되는 DNA 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역되는 RNA(mRNA)를 인코딩할 수 있거나, DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역되지 않는 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA 또는 DNA 표적화 RNA; "비코딩" RNA 또는 "ncRNA"로도 불림)를 인코딩할 수 있다.
본원에 사용된 "융합 단백질"이라는 용어는, 적어도 2개의 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 예를 들어, 융합 단백질은 (i) GBA 또는 이의 단편과, (ii) 적어도 하나의 비(非)관심 유전자(GOI: gene of interest) 단백질을 포함할 수 있다. 본원에 포함되는 융합 단백질에는, 비제한적으로, 항체, 또는 GBA 단백질에 융합된 항체의 Fc 또는 항원 결합 단편, 예를 들어 수용체, 리간드, 효소 또는 펩타이드의 세포외 도메인이 포함된다. 융합 단백질의 일부인 GBA 단백질 또는 이의 단편은 단일특이적 항체, 또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있다.
본원에 사용된 "게놈 세이프 하버(safe harbor) 유전자" 또는 "세이프 하버 유전자"라는 용어는, 암의 촉진 또는 내인성 유전자 활성에 대한 유의한 부정적인 결과 없이, 서열이 예측 가능한 방식으로 통합 및 기능할 수 있도록(예를 들어, 관심 단백질을 발현시킴) 핵산 서열이 삽입될 수 있는 유전자 또는 유전좌위를 나타낸다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자는 또한 삽입된 핵산 서열이 비(非)세이프 하버 부위보다 더 높은 수준으로 효율적으로 발현될 수 있는 유전좌위 또는 유전자이다.
본원에 사용된 "유전자 전달"이라는 용어는, 유전자 치료의 적용을 위해 외래 DNA가 숙주 세포에 전달되는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 "말단반복서열" 또는 "TR"이라는 용어는, 적어도 하나의 최소 필수 복제 기점과 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는, 임의의 바이러스 말단반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열("RBS")(RBE(Rep-결합 요소)로도 지칭됨)과 말단 분해 부위("TRS")는 함께 "최소 필수 복제 기점"을 구성하기 때문에, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 주어진 스트레치 내에서 서로 역 보체인 TR은, 전형적으로 "역말단반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 회수를 매개한다. 예상치 못하게 발견된 바와 같이, 전체 길이에 걸쳐 역 보체가 아닌 TR은 여전히 야생형 ITR의 전형적인 기능을 수행할 수 있기 때문에, 본원에 사용된 ITR이라는 용어는 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 TR을 나타낸다. 당업자는, 복잡한 ceDNA 벡터 구성에서, 2개 초과의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비(非)AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비AAV ITR에서 유도될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파르보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 개 파르보바이러스, 소 파르보바이러스, 마우스 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 인간 파르보바이러스 B-19)를 포함하는 파르보바이러스과에서 유도될 수 있거나, 또는 SV40 복제 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀(이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있음)이 ITR로서 사용될 수 있다. 파르보바이러스과 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과(Densovirinae)의 2개의 아과로 이루어진다. 데펜도파르보바이러스에는, 비제한적으로, 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하는 척추동물 숙주에서 복제 가능한 아데노연관바이러스(AAV)의 바이러스과가 포함된다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5'에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3'에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
"야생형 ITR" 또는 "WT-ITR"은, 예를 들어 Rep 결합 활성 및 Rep 닉킹 능력을 보유하는, AAV 또는 다른 데펜도바이러스 내 자연 발생 ITR 서열의 서열을 나타낸다. 임의의 AAV 혈청형의 WT-ITR의 핵산 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 기본형 자연 발생 서열에서 약간 달라질 수 있기 때문에, 본원에의 사용을 위해 포함된 WT-ITR 서열은 생산 과정 동안 일어나는 자연적으로 발생하는 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로서의 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 WT-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 야생형 ITR인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 WT-ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, ITR은, 기본형 자연 발생 서열에서 벗어난 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖더라도, 변화가 서열의 특성 및 전체 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 한, 야생형 서열인 것으로 간주될 수 있다. 일부 양태에서, 벗어난 뉴클레오타이드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 이것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE')와 말단 분해 부위(trs)를 가지고 있음을 결정하는 방식으로 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 선택적으로, 허용 조건 하에서의 전이유전자 발현을 포함하는 다른 기능을 시험할 수 있다.
본원에 사용된 "변형된 ITR" 또는 "mod-ITR" 또는 "돌연변이 ITR"이라는 구절은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 돌연변이를 갖는 ITR을 나타낸다. 돌연변이는 ITR 내 A 영역, C 영역, C' 영역, B 영역, B' 영역 중 하나 이상을 변경시킬 수 있으며, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성(즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)을 변경시킬 수 있다.
본원에 사용된 "비대칭인 ITR"이라는 용어(이는 "비대칭인 ITR 쌍"으로도 지칭됨)는, 전체 길이에 걸쳐 역 보체가 아닌 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 ITR의 쌍을 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 비대칭인 ITR 쌍은 3D 구조가 기하학적 공간에서 상이한 형상이 되도록 이의 동족 ITR과 대칭인 3차원 공간 구성을 갖지 않는다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR 쌍은 전체적인 기하 구조가 상이하며, 즉, 이들은 3D 공간에서 A, C-C' 및 B-B' 루프의 구성이 상이하다(예를 들어, 하나의 ITR은 동족 ITR과 비교하여 짧은 C-C' 아암 및/또는 짧은 B-B' 아암을 가질 수 있음). 2개의 ITR 사이의 서열 차이는 뉴클레오타이드 부가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있다. 하나의 구현예에서, 비대칭인 ITR 쌍 중 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 하나의 ITR은 본원에 정의된 바와 같이 변형된 ITR(예를 들어, 비야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 비대칭인 ITR 쌍 중 어느 ITR도 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형상을 갖는(즉, 전체 기하 구조가 상이한) 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, 비대칭인 ITR 쌍 중 하나의 mod-ITR은 짧은 C-C' 아암을 가질 수 있고, 다른 하나의 ITR은 동족 비대칭인 mod-ITR과 비교하여 상이한 3차원 공간 구성을 갖도록 상이한 변형(예를 들어, 단일 또는 짧은 B-B' 아암 등)을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "대칭 ITR"이라는 용어는, 야생형 데펜도바이러스 ITR 서열에 비해 돌연변이되거나 변형되고 전체 길이에 걸쳐 역 상보체인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 ITR의 쌍을 나타낸다. ITR 중 어느 것도 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며(즉, 이는 변형된 ITR이며, 돌연변이 ITR로도 지칭됨), 뉴클레오티드 부가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이로 인해 야생형 ITR의 서열과 차이가 있을 수 있다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5'에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3'에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 변형된 ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 변형된 ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, 변형된 ITR은, 역 보체 서열에서 벗어난 일부 뉴클레오타이드 서열을 갖더라도, 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 달리 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 3D 공간에 구성된 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 일부 구현예에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 생성하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5' ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족의 변형된 3' ITR은 C' 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오타이드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 비제한적인 예로서, mod-ITR은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 측정 시 기본형 mod-ITR과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.
"플랭킹"이라는 용어는, 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적인 위치를 나타낸다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B에는 A와 C가 플랭킹되어 있다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 동일하게 적용된다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열의 앞에 있거나 뒤에 있지만, 플랭킹된 서열에 인접하거나 바로 근접할 필요는 없다. 하나의 구현예에서, 플랭킹이라는 용어는, 선형 이중체 ceDNA 벡터의 각 말단에 있는 말단반복을 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA 게놈"이라는 용어는, 적어도 하나의 역말단반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 나타낸다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 이중체 폴리뉴클레오타이드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 혼입된다.
본원에 사용된 "ceDNA 스페이서 영역"이라는 용어는, ceDNA 벡터 또는 ceDNA 게놈에서 기능성 요소를 분리하는 개재 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 최적의 기능을 위해 2개의 기능성 요소를 목적하는 거리로 유지시킨다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은, 예를 들어 플라스미드 또는 바큐로바이러스 내에 ceDNA 게놈의 유전적 안정성을 제공하거나 부가한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은, 클로닝 부위 등에 대한 편리한 위치를 제공하는 방식으로, ceDNA 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 "폴리링커", 또는 공지된 단백질(예를 들어, 전사인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비(非)오픈리딩프레임 서열은, 시스-작용 인자를 분리하기 위해, 예를 들어 말단 분해 부위와 업스트림 전사 조절 요소 사이에 6량체, 12량체, 18량체, 24량체, 48량체, 86량체, 176량체 등을 삽입하는 방식으로, ceDNA 게놈에 배치될 수 있다. 유사하게, 스페이서는 폴리아데닐화 신호 서열과 3'-말단 분해 부위 사이에 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 "Rep 결합 부위", "Rep 결합 요소", "RBE" 및 "RBS"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의해 결합될 때, Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 이의 부위 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있게 하는 Rep 단백질(예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 나타낸다. RBS 서열과 이의 역 보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2에서 식별된 RBS 서열인 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 60)를 포함한다. 다른 공지된 AAV RBS 서열, 및 다른 자연적으로 공지된 또는 합성 RBS 서열을 포함하는, 임의의 공지된 RBS 서열이 본 개시내용의 구현예에서 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, Rep 단백질의 뉴클레아제 도메인은 이중체 핵산 서열 GCTC에 결합하기 때문에, 2개의 공지된 AAV Rep 단백질이 이중체 올리고뉴클레오타이드인 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(서열번호 60) 상에 직접 결합하여 안정적으로 어셈블링된다고 여겨진다. 또한, 가용성 응집된 이형태체(conformer)(즉, 정의되지 않은 수의 상호연관된 Rep 단백질)는 해리되어, Rep 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드에 결합한다. 각각의 Rep 단백질은 각 가닥에서 질소성 염기 및 포스포디에스테르 백본과 상호작용한다. 질소성 염기와의 상호작용은 서열 특이성을 제공하지만, 포스포디에스테르 백본과의 상호작용은 비(非)서열 특이적 또는 덜 서열 특이적이며, 단백질-DNA 복합체를 안정화시킨다.
본원에 사용된 "말단 분해 부위" 및 "TRS"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, Rep가 5' 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하여, 세포 DNA 폴리머라아제, 예를 들어 DNA pol 델타 또는 DNA pol 엡실론을 통해 DNA 연장을 위한 기질로서 작용하는 3' OH를 생성하는 영역을 나타낸다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 조정된 결찰 반응에 참여할 수 있다. 일부 구현예에서, TRS는 염기쌍을 이루지 않은 티미딘을 최소한으로 포함한다. 일부 구현예에서, TRS의 닉킹 효율은 RBS로부터의 동일한 분자 내 거리에 의해 적어도 부분적으로 제어될 수 있다. 수용체 기질이 상보적 ITR인 경우, 생성되는 산물은 분자내 이중체이다. TRS 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2로 식별된 헥사뉴클레오타이드 서열인 5'-GGTTGA-3'(서열번호 61)을 포함한다. 다른 공지된 AAV TRS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 TRS 서열, 예컨대 AGTT(서열번호 62), GGTTGG(서열번호 63), AGTTGG(서열번호 64), AGTTGA(서열번호 65), 및 RRTTRR(서열번호 66)과 같은 다른 모티프를 포함하는, 임의의 공지된 TRS 서열이 본 개시내용의 구현예에서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "ceDNA-플라스미드"라는 용어는, 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 플라스미드를 나타내다.
본원에 사용된 "ceDNA-박미드"라는 용어는, 플라스미드로서 대장균에서 증식할 수 있고, 따라서 바큐로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작용할 수 있는 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바큐로바이러스 게놈을 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA-바큐로바이러스"라는 용어는, 바큐로바이러스 게놈 내에 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바큐로바이러스를 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA-바큐로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-바큐로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주 세포(비제한적으로, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 포함)를 나타낸다.
본원에 사용된 "폐쇄형 DNA 벡터"라는 용어는, 적어도 하나의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖고 벡터의 적어도 일부가 분자내 이중체 구조를 갖는 캡시드 미함유 DNA 벡터를 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 말단 회문구조를 포함하는 폐쇄형 DNA 벡터를 나타낸다. 일부 구현예에서, ceDNA는 2개의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 포함한다.
본원에 정의된 "리포터"란, 검출 가능한 판독물을 제공하는 데 사용될 수 있는 단백질을 나타낸다. 리포터는 일반적으로 형광, 색상 또는 발광과 같은 측정 가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 코딩 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 용이하게 관찰되는 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 나타내게 하고, 루시퍼라아제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉진시키게 하며, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 기질을 착색된 산물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩타이드에는, 비제한적으로 β-락타마아제, β -갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제(AP), 티미딘 키나아제(TK), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 다른 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제, 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들이 포함된다.
본원에 사용된 "이펙터(effector) 단백질"이라는 용어는, 예를 들어 리포터 폴리펩타이드, 또는 보다 적절하게는, 세포를 사멸시키는 폴리펩타이드, 예를 들어 독소, 또는 세포가 선택된 작용제 또는 이의 결여로 인해 사멸하기 쉽게 만드는 작용제로서 검출 가능한 판독물을 제공하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 이펙터 단백질에는, 숙주 세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적으로 하거나 이를 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩타이드가 포함된다. 예를 들어, 이펙터 단백질은, 비제한적으로, 숙주 세포 DNA 서열(게놈 요소인지 또는 염색체외 요소인지에 관계없이)을 표적으로 하는 제한 엔도뉴클레아제, 세포 생존에 필요한 폴리펩타이드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이라아제(gyrase) 저해제 및 리보뉴클레아제 유형 독소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 이펙터 단백질의 발현은, 또 다른 합성 생물학적 회로에 인자로 참여하여, 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.
전사 조절인자는 GBA와 같은 관심 유전자의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 활성화제 및 억제인자를 나타낸다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성화제는 전형적으로 전사 프로모터 근처에 결합하고 RNA 폴리머라아제를 동원하여, 직접 전사를 개시한다. 억제제는 전사 프로모터에 결합하여, RNA 폴리머라아제에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절인자는 이들의 결합하는 위치, 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성화제 또는 억제제로 작용할 수 있다. 전사 조절인자 부류의 비제한적인 예에는, 비제한적으로, 호메오도메인(homeodomain) 단백질, 아연-핑거 단백질, 날개있는 나선형(winged-helix)(포크헤드(forkhead)) 단백질 및 류신-지퍼 단백질이 포함된다.
본원에 사용된 "억제 단백질" 또는 "유도 단백질"은, 조절 서열 요소에 결합하여, 조절 서열 요소에 작동적으로 연결된 서열의 전사를, 각각, 억제 또는 활성화시키는 단백질이다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 억제 및 유도 단백질은 적어도 하나의 입력물질 또는 환경 입력의 존재 또는 부재에 민감하다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은, 예를 들어 분리 가능한 DNA-결합 및 입력물질-결합, 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 형태의 모듈이다.
본원에 사용된 "담체"에는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약학적으로 허용 가능한"이라는 구절은, 숙주에게 투여될 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 "입력물질 반응성 도메인"은, 연결된 DNA 결합 융합 도메인을 해당 조건 또는 입력의 존재에 대해 반응성으로 만드는 방식으로 조건 또는 입력물질에 결합하거나 다르게는 이에 반응하는 전사인자의 도메인이다. 하나의 구현예에서, 조건 또는 입력의 존재는 입력물질 반응성 도메인 또는 이와 융합되는 단백질에서 입체형태 변화를 유도하여, 전사인자의 전사 조절 활성을 변형시킨다.
"생체내"라는 용어는, 다세포 동물과 같은 유기체에서 또는 유기체 내에서 일어나는 검정 또는 과정을 나타낸다. 본원에 기재된 일부 양태에서, 방법 또는 용도는, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때, "생체내"에서 일어난다고 할 수 있다. "생체외"라는 용어는, 다세포 동물 또는 식물의 체외, 예를 들어 특히 외식편, 배양된 세포(1차 세포 및 세포주 포함), 형질전환된 세포주 및 추출된 조직 또는 세포(혈액 세포 포함)에 있는 온전한 막을 갖는 살아있는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 용도를 나타낸다. "시험관내"라는 용어는, 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 검정 및 방법을 나타내며, 세포를 포함하지 않는 배지와 같은 비(非)세포 시스템, 또는 세포 추출물과 같은 세포 시스템에 프로그래밍 가능한 합성 생물학적 회로를 도입하는 것을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "프로모터"라는 용어는, 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 이종 표적 유전자일 수 있는 핵산 서열의 전사를 유도하는 방식으로 또 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 나타낸다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직 특이적 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 전사 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사인자와 같은, 조절 단백질 및 분자에 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 양태의 일부 구현예에서, 프로모터는 프로모터 자체의 발현을 조절하는 전사인자의 발현을 유도할 수 있다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위뿐 아니라, RNA 폴리머라아제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵생물 프로모터는 종종, 항상은 아니지만, "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 함유할 것이다. 유도성 프로모터를 비롯한 다양한 프로모터는, 본원에 개시된 ceDNA 벡터의 전이유전자의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 이의 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 결합될 수 있으며, 배경 위에서 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는 데 필요한 최소한의 염기 또는 요소의 수를 포함하도록 업스트림(5' 방향)으로 연장된다.
본원에 사용된 "인핸서"라는 용어는, 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질(예를 들어, 활성화 단백질 또는 전사인자)과 결합하는 시스-작용 조절 서열(예를 들어, 10개 내지 1,500개 염기쌍)을 나타낸다. 인핸서는 이들이 조절하는 유전자 시작 부위의 업스트림 또는 유전자 시작 부위의 다운스트림에 최대 1,000,000개 염기쌍으로 배치될 수 있다. 인핸서는 인트론 영역 내, 또는 관련없는 유전자의 엑손 영역에 배치될 수 있다.
프로모터는 이것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다고 할 수 있다. "작동 가능하게 연결된", "작동적으로 배치된", "작동적으로 연결된", "제어 하에 있는" 및 "전사 제어 하에 있는"이라는 구절은, 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 조절하는 핵산 서열에 대해 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 "역 프로모터"는, 코딩 가닥이 비코딩 가닥이 되고, 그 반대로도 되도록, 핵산 서열이 역 배향으로 존재하는 프로모터를 나타낸다. 역 프로모터 서열은 다양한 구현예에서 스위치의 상태를 조절하는 데 사용될 수 있다. 또한, 다양한 구현예에서, 프로모터는 인핸서와 함께 사용될 수 있다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비코딩 서열을 단리하여 얻을 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 코딩 핵산 분절은 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 제어 하에 배치되며, 여기서 두 가지 프로모터는 모두 자연 환경에서 작동 가능하게 연결된 인코딩된 핵산 서열과 통상적으로 연관되지 않은 프로모터를 나타낸다. 재조합 또는 이종 인핸서는, 자연 환경에서 주어진 핵산 서열과 통상적으로 연관되지 않은 인핸서를 나타낸다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는, 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포에서 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "자연 발생"이 아닌, 즉, 상이한 전사조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당업계에 공지된 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터와 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본원에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술(PCR 포함)을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호(이들은 각각 본원에 참조로서 인용됨) 참조). 나아가, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비(非)핵 세포소기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 이용될 수 있다고 고려된다.
본원에 기재된 "유도성 프로모터"는, 유도제 또는 유도 작용제의 존재 하에 있거나, 이에 의해 영향을 받거나 또는 이와 접촉될 때 전사 활성을 개시하거나 증강시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 본원에 정의된 "유도제" 또는 "유도 작용제"는, 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는 데 활성이 되는 방식으로 투여되는, 내인성, 또는 통상적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도제 또는 유도 작용제, 즉, 화학물질, 화합물 또는 단백질은, 그 자체가 핵산 서열의 전사 또는 발현 결과일 수 있으며(즉, 유도제는 또 다른 구성요소 또는 모듈에 의해 발현된 유도제 단백질일 수 있음), 이는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 억제제와 같은 특정 작용제의 부재 하에서 유도된다. 유도성 프로모터의 예에는, 비제한적으로, 테트라시클린(tetracycline), 메탈로티오닌(metallothionine), 엑디손(ecdysone), 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유선종양바이러스 말단반복(MMTV-LTR)), 및 다른 스테로이드 반응성 프로모터, 라파마이신(rapamycin) 반응성 프로모터 등이 포함된다.
본원에서 교환가능하게 사용되는 "DNA 조절 서열", "제어 요소" 및 "조절 요소"라는 용어는, 비코딩 서열(예를 들어, DNA 표적화 RNA) 또는 코딩 서열(예를 들어, 부위 지정 변형 폴리펩타이드 또는 Cas9/Csn1 폴리펩타이드)을 제공하고/하거나 이의 전사를 조절하고/하거나, 인코딩된 폴리펩타이드의 전사를 조절하는, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결인자, 단백질 분해 신호 등과 같은 전사 및 번역 제어 서열을 나타낸다.
본원에 사용된 "오픈리딩프레임(ORF)"이라는 용어는, 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 몇몇 뉴클레오타이드 삼중체 서열을 나타내는 것으로 여겨진다. 오픈리딩프레임은 바람직하게는 개시 코돈, 즉, 5'-말단에서 통상적으로 아미노산 메티오닌을 코딩하는 3개의 후속 뉴클레오타이드 조합(ATG), 및 통상적으로 3개 뉴클레오타이드 배수 길이를 나타내는 후속 영역을 함유한다. ORF는 바람직하게는 종결 코돈(예를 들어, TAA, TAG, TGA)에 의해 종결된다. 전형적으로, 이는 오픈리딩프레임의 유일한 종결 코돈이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 오픈리딩프레임은 바람직하게는 개시 코돈(예를 들어, ATG)으로 시작하고, 바람직하게는 종결 코돈(예를 들어, TAA, TGA 또는 TAG)으로 종결되는, 3으로 나눌 수 있는 다수의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이다. 오픈리딩프레임은 단리될 수 있거나, 더 긴 핵산 서열, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터에 혼입될 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"이란, 기재된 바와 같은 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계에 있는 근접부위(juxtaposition)를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터가 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. "발현 카세트"는, ceDNA 벡터에서 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 프로모터 또는 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 포함한다. 적합한 프로모터에는, 예를 들어 조직 특이적 프로모터가 포함된다. 프로모터는 또한 AAV 기원일 수 있다.
본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 본 개시내용에 따른 ceDNA 벡터로 치료(예방적 치료 포함)가 제공되는 인간 또는 동물을 나타낸다. 통상적으로, 동물은, 비제한적으로, 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는, 비제한적으로, 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 스파이더 원숭이 및 마카크(macaque), 예를 들어 레서스(Rhesus)가 포함된다. 설치류에는, 마우스, 래트, 마멋(woodchuck), 페럿(ferret), 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는, 비제한적으로, 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종류(예를 들어, 집고양이), 갯과 종류(예를 들어, 개, 여우, 늑대), 조류(예를 들어, 닭, 에뮤, 타조) 및 어류(송어, 메기 및 연어)가 포함된다. 본원에 기재된 양태의 특정 구현예에서, 대상은 포유류, 예를 들어 영장류 또는 인간이다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상은 유아 또는 어린이일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 신생아 또는 태어나지 않은 대상, 예를 들어 자궁에 있는 대상일 수 있다. 바람직하게는, 대상은 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이러한 예에 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유류는 질환 및 장애의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 가축 및/또는 애완동물에 대해 사용될 수 있다. 인간 대상은 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족, 예를 들어 코카시안(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 임상 설정에서의 환자 또는 다른 대상일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 이미 치료를 받고 있다. 일부 구현예에서, 대상은 배아, 태아, 신생아, 유아, 아동, 청소년 또는 성인이다. 일부 구현예에서, 대상은 인간 태아, 인간 신생아, 인간 유아, 인간 아동, 인간 청소년 또는 인간 성인이다. 일부 구현예에서, 대상은 동물 배아, 또는 비인간 배아 또는 비인간 영장류 배아이다. 일부 구현예에서, 대상은 인간 배아이다.
본원에 사용된 "숙주 세포"라는 용어는, 본 개시내용의 핵산 구조체 또는 ceDNA 발현 벡터를 이용한 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입 등에 민감한 임의의 세포 유형을 나타낸다. 비제한적인 예로서, 숙주 세포는 단리된 1차 세포, 다능성줄기세포, CD34+ 세포), 유도된 다능성줄기세포, 또는 다수의 불멸화된 세포주 중 임의의 것(예를 들어, HepG2 세포)일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 조직, 기관 또는 유기체의 제자리 또는 생체내 세포일 수 있다.
"외인성"라는 용어는, 천연 공급원 이외의 세포에 존재하는 물질을 나타낸다. 본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산(예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산) 또는 폴리펩타이드로서, 통상적으로 발견되지 않으며 인간이 이러한 세포 또는 유기체에 도입하고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대안적으로, "외인성"은, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산 또는 폴리펩타이드로서, 비교적 낮은 수준으로 발견되며, 인간이, 예를 들어 이소성(ectopic) 발현 또는 수준을 생성하도록 이러한 세포 또는 유기체 내 핵산 또는 폴리펩타이드의 양을 증가시키기 위해 도입하고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대조적으로, "내인성"이라는 용어는, 생물학적 시스템 또는 세포에 고유한 물질을 나타낸다.
"서열 동일성"이라는 용어는, 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 본 개시내용의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 상기 Rice 등의 문헌(2000) 참조)의 니들(Needle) 프로그램(바람직하게는 버전 3.0.0 이상)에서 구현된 바와 같이 니들만 브니쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(상기 Needleman 및 Wunsch의 문헌(1970) 참조)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 매개변수는 갭 오픈 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "최장 동일성"의 출력(-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)은 동일성%로 사용되며, 이는 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시뉴클레오타이드 x 100)/(정렬 길이 - 정렬의 총 갭 수). 정렬의 길이는 바람직하게는 적어도 10개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 25개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오타이드이다.
본원에 사용된 "상동성" 또는 "상동"이라는 용어는, 최대 서열 동일성%를 달성하기 위해, 필요한 경우, 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 표적 염색체 상의 상응하는 서열의 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 뉴클레오타이드 잔기의 백분율로 정의된다. 뉴클레오타이드 서열 상동성%를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내에서 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 상동성 아암의 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)은, 서열이 숙주 세포의 상응하는 천연 또는 미편집된 핵산 서열(예를 들어, 게놈 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상 동일한 경우, "상동"인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 "이종"이라는 용어는, 각각, 천연 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 자연 발생 핵산 서열(또는 이의 변이체)에 연결되어, 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하는 키메라 뉴클레오타이드 서열을 생성할 수 있다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 변이형 폴리펩타이드에 연결되어, 융합 변이형 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성할 수 있다. 대안적으로, "이종"이라는 용어는 세포 또는 대상에 자연적으로 존재하지 않는 핵산 서열을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "벡터" 또는 "발현 벡터"는, 세포 내 부착된 분절의 복제를 야기하도록, 또 다른 DNA 분절, 즉, "삽입물"에 부착될 수 있는, 플라스미드, 박미드, 파지, 바이러스, 비리온 또는 코스미드(cosmid)와 같은 레플리콘이다. 벡터는 숙주 세포로의 전달, 또는 상이한 숙주 세포 사이에서의 전달을 위해 설계된 핵산 구조체일 수 있다. 본원에 사용된 벡터는 본래 및/또는 최종 형태가 바이러스성 또는 비바이러스성일 수 있지만, 본 개시내용의 목적을 위해, "벡터"는 일반적으로 본원에 사용된 바와 같은 용어로서의 ceDNA 벡터를 나타낸다. "벡터"라는 용어는, 적절한 제어 요소와 결합될 때 복제 가능하고, 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터 또는 재조합 벡터일 수 있다.
본원에 사용된 "발현 벡터"라는 용어는, 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 벡터를 나타낸다. 발현된 서열은 종종, 반드시는 아니지만, 세포에 대해 이종성일 수 있다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있기 때문에, 2가지 유기체에서, 예를 들어 인간 세포에서 발현을 위해, 원핵 숙주에서 클로닝 및 증폭을 위해 유지될 수 있다. "발현"이라는 용어는, 적용 가능한 경우, 비제한적으로, 예를 들어 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 처리를 포함하는, RNA 및 단백질의 생산, 및 적절한 경우, 단백질 분비에 관여하는 세포 과정을 나타낸다. "발현 산물"에는, 유전자에서 전사된 RNA, 및 유전자에서 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩타이드가 포함된다. "유전자"라는 용어는, 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 때 시험관내 또는 생체내에서 RNA에 전사되는 핵산 서열(DNA)을 의미한다. 유전자는 코딩 영역의 앞뒤 영역, 예를 들어 5' 미번역(5' UTR) 또는 "리더(leader)" 서열과 3' UTR 또는 "트레일러(trailer)" 서열뿐 아니라, 개별 코딩 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다.
"재조합 벡터"란, 이종 핵산 서열, 또는 생체내에서 발현 가능한 "전이유전자"를 포함하는 벡터를 의미한다. 본원에 기재된 벡터가, 일부 구현예에서, 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 에피솜 상태이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 대상에서 관심 뉴클레오타이드를 염색체외 DNA에 높은 카피수로 유지하여, 염색체 통합의 잠재적인 영향을 제거하는 수단을 제공한다.
본원에 사용된 "유전 질환"이라는 구절은, 부분적으로 또는 완전히, 직접적으로 또는 간접적으로, 게놈 내 하나 이상의 비정상에 의해 유발된 질환, 특히 출생 시부터 존재한 병태를 나타낸다. 비정상은 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 비정상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 유전 질환은 낮은 수준의 글루코세레브로시다아제("GCase" 또는 "GBA")를 초래한다. 일부 구현예에 따르면, 유전 질환은 GCase 유전자 내 적어도 2개의 돌연변이로 인한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 유전 질환은 고셰병이다. 일부 구현예에 따르면, 유전 질환은 제1형 고셰병이다. 일부 구현예에 따르면, 유전 질환은 제2형 고셰병이다. 일부 구현예에 따르면, 유전 질환은 제3형 고셰병이다.
본원에 사용된 "투여", "투여하는"이라는 용어 및 이의 변형은, 대상에게 조성물 또는 작용제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA)를 도입하는 것을 나타내며, 하나 이상의 조성물 또는 작용제의 동시 및 순차적 도입을 포함한다. "투여"는, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. "투여"는 또한 시험관내 및 생체외 처리를 포함한다. 대상으로의 조성물 또는 작용제의 도입은, 경구, 폐, 비강, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 종양내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로로 이루어진다. 투여는 자가 투여와 다른 이에 의한 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로로 수행될 수 있다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 이의 의도된 기능을 수행하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상의 정맥에 도입하는 방식으로 투여된다.
본원에 사용된 "핵산 치료제", "치료용 핵산" 및 "TNA"라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 활성 성분으로서 핵산을 사용하는 임의의 치료 양식을 나타낸다. 본원에 사용된 이러한 구절은 RNA 기반 치료제와 DNA 기반 치료제를 나타낸다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. DNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터) 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다. 일부 구현예에 따르면, 치료용 핵산은 ceDNA이다.
본원에 사용된 "면역억제제"라는 용어는, 티로신 키나아제와 같은 단백질 키나아제를 저해하는 소분자, 단클론 항체 또는 폴리펩타이드 안타고니스트의 군을 나타낸다.
본원에 사용된 "치료 효과"라는 용어는, 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 치료 결과를 나타낸다. 치료 효과는, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현 진행의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 치료제의 경우, 치료적 유효량은 초기에 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델에서 결정될 수 있다. 치료적 유효 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효능을 기반으로 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 다른 널리 공지된 방법을 기반으로 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은, 당업자의 능력에 속한다. 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)](상기 문헌은 본원에 참조로서 인용됨)의 챕터 1에서 확인할 수 있는 치료 효과를 결정하는 일반 원리가 하기에 요약되어 있다.
약동학적 원리는, 허용 가능하지 않은 부작용을 최소화하면서 목적하는 정도의 치료 효능을 얻기 위해 투여 요법을 변경하는 기반을 제공한다. 약물의 혈장 농도가 측정될 수 있고 이것이 치료 범위와 관련이 있는 상황에서, 투여량 변경을 위한 추가 지침을 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및/또는 "치료"라는 용어는, 병태의 진행을 중단시키거나, 실질적으로 저해하거나, 느리게 하거나 또는 역전시키는 것; 병태의 임상 증상을 실질적으로 개선하는 것; 또는 병태의 임상 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 통해 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하는 것을 포함한다. 치료는 나아가 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 나타낸다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한하는 것; (c) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 없었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것.
약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것.
본원에 사용된 "증가시키다", "증강시키다", "상승시키다"(및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 증가시키는 작용을 나타낸다.
본원에 사용된 "억제하다", "감소시키다", "방해하다", "저해하다" 및/또는 "줄이다" (및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 감소시키는 작용을 나타낸다.
본원에 사용된 "대조군"은 참조 표준을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대조군은 건강한 환자에서 얻은 음성 대조군 샘플이다. 다른 구현예에서, 대조군은 혈우병으로 진단받은 환자에서 얻은 양성 대조군 샘플이다. 또 다른 구현예에서, 대조군은 과거 대조군 또는 표준 참조 값 또는 값의 범위이다(예컨대 이전에 시험된 대조군 샘플, 예컨대 예후 또는 결과가 알려진 고셰병 환자의 군, 또는 기준선 또는 정상 값을 나타내는 샘플의 군). 시험 샘플과 대조군의 차이는 증가하거나 반대로 감소할 수 있다. 차이는 정성적 차이 또는 정량적 차이, 예를 들어 통계적으로 유의한 차이일 수 있다. 일부 예에서, 차이는, 대조군과 비교하여, 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500% 또는 500% 초과의 증가 또는 감소이다.
본원에 사용된 "포함하는" 또는 "포함하다"라는 용어는, 방법 또는 조성물에 필수적이지만, 필수적인지 여부에 관계없이 명시되지 않은 요소를 포함할 수도 있는, 조성물, 방법, 및 이의 각 구성요소(들)에 관하여 사용된다.
본원에 사용된 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는, 주어진 구현예에 필요한 요소를 나타낸다. 상기 용어는, 해당 구현예의 기본적인 및 신규한 또는 기능적인 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. "포함하는"이라는 용어의 사용은 제한이 아닌 포함을 나타낸다.
"~로 이루어진"이라는 용어는, 구현예의 설명에 언급되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 이의 각 구성요소를 나타낸다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 및/또는 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있는 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, "및"을 포함한다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. "e.g."라는 약어는, 라틴어 예를 들어(exempli gratia)에서 유도된 것이며, 이는 본원에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, "e.g."라는 약어는, "예를 들어"라는 용어와 동의어이다.
실시예 이외에 또는 달리 지시된 경우에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 수치는, 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해해야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 "약"은, 평균 ±1%일 수 있다. 본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 상세하게 설명되지만, 본 개시내용의 범위는 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 본 개시내용의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로, 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 확인되는 다른 요소와 조합으로 참조되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나, 그룹에서 결실될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 발생하는 경우, 본 명세서는 본원에 변형된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹에 대한 서면 기재를 충족시킨다.
임의의 양태의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 개시내용은 인간을 클로닝하는 방법, 인간의 생식계열 유전자 정체성을 변형시키는 방법, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용, 또는 인간 또는 동물에게의 임의의 실질적인 의학적 유익 없이 고통을 야기할 수 있는 동물의 유전적 정체성을 변형시키는 방법, 및 또한 이러한 방법의 결과로서의 동물에 관한 것이 아니다.
다른 용어는 본 개시내용의 다양한 양태의 설명 내에서 본원에 정의된 바와 같다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 다른 간행물(문헌 참조, 등록된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 설명 및 개시하기 위한 목적으로 명백하게 본원에 참조로서 인용된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 개시내용으로 인해 또는 임의의 다른 이유로, 본 발명자가 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 이용 가능한 정보를 기반으로 하며, 이러한 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 승인을 구성하는 것으로 여겨지지 않는다.
본 개시내용의 구현예의 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하거나, 완전한 것으로서 의도되지 않는다. 본 개시내용의 특정 구현예 및 이에 대한 예는 예시의 목적으로 본원에 기재되었으며, 당업자가 이해하는 바와 같이 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 등가의 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 구현예는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 구현예는 조합되어 추가 구현예를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 양태는, 필요한 경우, 본 개시내용의 추가의 구현예를 제공하기 위해 상기 참고문헌 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 이용하도록 변형될 수 있다. 나아가, 생물학적 기능 동등성을 고려할 때, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않는 한 단백질 구조에 약간의 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 및 다른 변경은 상세한 설명을 고려하여 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
전술한 구현예 중 임의의 것의 특정 요소는 조합되거나, 다른 구현예의 요소로 치환될 수 있다. 나아가, 본 개시내용의 특정 구현예와 관련된 이점이 이러한 구현예의 맥락에서 기재되어 있지만, 다른 구현예 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 구현예가 본 개시내용의 범위 내에 속하기 위해 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요가 있는 것은 아니다.
본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이러한 예는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
II. ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질의 발현
본원에 기재된 기술은 일반적으로 비바이러스성 DNA 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터로부터의 세포 내 GBA 단백질의 발현 및/또는 생산에 관한 것이다. GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원의 "ceDNA 벡터 전반"이라는 제목의 섹션에 기재되어 있다. 특히, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 대칭 또는 비대칭인) ITR 쌍과, ITR 쌍 사이에, 프로모터 또는 조절 서열에 작동적으로 연결된 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 전형적인 AAV 벡터, 및 심지어 렌티바이러스 벡터에 비해 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 뚜렷한 이점은, 목적하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 크기 제한이 없다는 점이다. 따라서, 심지어 전장 6.8 kb GBA 단백질도 단일 ceDNA 벡터로부터 발현될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 이를 필요로 하는 대상, 예를 들어 고셰병을 앓고 있는 대상에서 치료용 GBA 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 기재된 ceDNA 벡터 기술은 임의의 복잡성 수준에 맞게 조정될 수 있거나, GBA 단백질의 상이한 구성요소의 발현이 독립적인 방식으로 제어될 수 있는 모듈 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 구체적으로, 본원에 설계된 ceDNA 벡터 기술은 단일 유전자 서열(예를 들어, GBA 단백질)을 발현시키기 위해 단일 ceDNA 벡터를 사용하는 바와 같이 간단할 수 있거나, 다중 ceDNA 벡터를 사용(여기서 각각의 벡터는 상이한 프로모터에 의해 각각 독립적으로 제어되는 다수의 GBA 단백질, 또는 관련 보조인자 또는 부속 단백질을 발현시킴)하는 바와 같이 복잡할 수 있다고 고려된다. 하기 구현예는 본원에서 구체적으로 고려되며, 원하는 바에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 단일 ceDNA 벡터를 사용하여 GBA 단백질의 단일 구성요소를 발현시킬 수 있다. 대안적으로, 단일 ceDNA 벡터를 사용하여 단일 프로모터(예를 들어, 강력한 프로모터)의 제어 하에서 GBA 단백질의 다수의 구성요소(예를 들어, 적어도 2개)를 발현시킬 수 있으며, 선택적으로 IRES 서열(들)을 사용하여, 구성요소, 예를 들어 보조인자 또는 부속 단백질 각각의 적합한 발현을 보장할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 적어도 2개의 삽입물을 포함하는(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄를 발현시킴) 단일 ceDNA 벡터가 또한 본원에서 고려되며, 여기서 각각의 삽입물의 발현은 이의 고유한 프로모터의 제어 하에 있다. 프로모터는 동일한 프로모터의 다중 카피, 다수의 상이한 프로모터 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, GBA 단백질의 구성요소를 상이한 발현 수준으로 발현시키는 것이 종종 바람직하기 때문에, 세포 내 효율적인 GBA 단백질 폴딩 및 조합을 보장하기 위해 발현되는 개별 구성요소의 화학량론을 제어한다.
당업자에 의해 ceDNA 벡터 기술의 추가적인 변형이 구상될 수 있거나, 통상적인 벡터를 사용하는 단백질 생산 방법이 조정될 수 있다.
A. GBA 단백질
일부 구현예에서, GBA 단백질을 인코딩하는 전이유전자는 또한 GBA 단백질이 골지체 및 소포체로 향하도록 분비 서열을 인코딩할 수 있으며, 여기서 GBA 단백질은 ER을 통과하여 세포 밖으로 나올 때 샤페론 분자에 의해 정확한 형태로 폴딩될 것이다. 예시적인 분비 서열에는, 비제한적으로, VH-02(서열번호 88) 및 VK-A26(서열번호 89) 및 Igĸ 신호 서열(서열번호 126)뿐 아니라, 태그된 단백질이 시토졸 외부로 분비되게 하는 Gluc 분비 신호(서열번호 188), 태그된 단백질이 골지로 향하게 하는 TMD-ST 분비 서열(서열번호 189)이 포함된다.
조절 스위치는 또한, GBA 단백질이 목적하는 대로 발현되도록(비제한적으로, 목적하는 발현 수준 또는 양으로 GBA 단백질이 발현되는 것을 포함함), 또는 대안적으로, 세포 신호전달 사건을 포함하는 특정 신호의 존재 또는 부재 하에 있을 때, GBA 단백질의 발현을 미세 조정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질의 발현은 조절 스위치라는 제목의 섹션에 본원에 기재된 바와 같이, 특정 조건이 발생하는 경우, 켜지거나 꺼질 수 있다.
예를 들어, 단지 예시의 목적으로, GBA 단백질은 GBA 단백질의 너무 높은 생산 수준과 같은 바람직하지 않은 반응을 차단하는 데 사용될 수 있다. GBA 유전자는 GBA 단백질을 목적하는 세포로 가져오기 위한 신호 펩타이드 마커를 함유할 수 있다. 하지만, 어느 상황에서도, GBA 단백질의 발현을 조절하는 것이 바람직할 수 있다. ceDNA 벡터는 조절 스위치의 사용을 용이하게 수용한다.
전형적인 AAV 벡터, 및 심지어 렌티바이러스 벡터에 비해 ceDNA 벡터의 뚜렷한 이점은, GBA 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 대한 크기 제한이 없다는 점이다. 따라서, 심지어 전장 GBA뿐 아니라, 선택적으로 임의의 보조인자 또는 부속 단백질도 단일 ceDNA 벡터로부터 발현될 수 있다. 또한, 필요한 화학량론에 따라, 동일한 GBA 단백질의 다수의 분절을 발현시킬 수 있고, 동일하거나 상이한 프로모터를 사용할 수 있고, 각각의 영역의 발현을 미세 조정하기 위해 조절 스위치를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 실시예에 제시된 바와 같이, GBA 단백질의 각각의 도메인에 대해 상이한 프로모터가 사용되는, 이중 프로모터 시스템을 포함하는 ceDNA 벡터가 사용될 수 있다. GBA 단백질의 생산을 위한 ceDNA 플라스미드의 사용은, 기능성 GBA 단백질의 형성을 위한 각각의 도메인의 적절한 비를 유도하는, GBA 단백질의 도메인의 발현을 위한 프로모터의 고유한 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 (예를 들어, 상이한 프로모터의 제어 하에서) GBA 단백질의 상이한 영역을 개별적으로 발현시키는 데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터로부터 발현된 GBA 단백질은 형광, 효소 활성, 분비 신호 또는 면역세포 활성화제와 같은 추가 기능을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA는, 예를 들어 링커 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "링커 도메인"이란, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 임의의 도메인/영역을 함께 연결하는, 약 2개 내지 100개 아미노산 길이의 올리고- 또는 폴리펩타이드 영역을 나타낸다. 일부 구현예에서, 링커는 인접한 단백질 도메인이 서로 자유롭게 이동할 수 있도록, 글리세린 및 세린과 같은 가용성 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 2개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 보장하는 것이 바람직한 경우, 보다 긴 링커가 사용될 수 있다. 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 절단 가능한 링커의 예에는, 2A 링커(예를 들어, T2A), 2A 유사 링커 또는 이들의 기능성 등가물, 및 이들의 조합이 포함된다. 링커는 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스에서 유도된 T2A 링커 영역일 수 있다.
예를 들어 GBA 등의 공지된 및/또는 공개적으로 이용 가능한 단백질 서열을 취하고, 이러한 단백질을 인코딩하기 위해 cDNA 서열을 역으로 조작하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 따라서, cDNA는 의도된 숙주 세포와 매칭되도록 코돈 최적화되고 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터에 삽입될 수 있다.
B. GBA 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터
목적하는 GBA를 인코딩하는 하나 이상의 서열을 갖는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 프로모터, 분비 신호, polyA 영역 및 인핸서와 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 최소한, ceDNA 벡터는 GBA 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다.
고도로 효율적이고 정확한 GBA 단백질 어셈블리를 달성하기 위해, 구체적으로, 일부 구현예에서, GBA 단백질이 이를 단백질 폴딩이 일어나는 ER로 향하게 하는 소포체 ER 리더 서열을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 폴딩을 위해 발현된 단백질(들)을 ER로 향하게 하는 서열.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에는, GBA 단백질이 세포내 표적(들)(예를 들어, 인트라바디) 또는 세포외 표적(들)에 결합될 수 있도록 GBA의 분비 또는 목적하는 세포하 국소화를 지시하는, 세포 또는 세포외 국소화 신호(예를 들어, 분비 신호, 핵 국소화 신호, 미토콘드리아 국소화 신호 등)가 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 모듈 방식으로 임의의 목적하는 GBA 단백질의 어셈블리 및 발현을 가능하게 한다. 본원에 사용된 "모듈(형)"이라는 용어는, 구조체로부터 쉽게 제거될 수 있는 ceDNA 발현 플라스미드의 요소를 나타낸다. 예를 들어, ceDNA 생성 플라스미드의 모듈형 요소는 구조체 내 각각의 요소를 플랭킹하는 고유한 제한 부위 쌍을 포함하여, 개별 요소의 배타적 조작을 가능하게 한다(예를 들어, 도 1a 내지 도 1g 참조). 따라서, ceDNA 벡터 플랫폼은 임의의 목적하는 GBA 단백질 구성의 발현 및 어셈블리를 가능하게 할 수 있다. 다양한 구현예에서, GBA 단백질을 인코딩하는 목적하는 ceDNA 벡터를 어셈블링하는 데 필요한 조작의 양을 감소 및/또는 최소화시킬 수 있는 ceDNA 플라스미드 벡터가 본원에 제공된다.
C. ceDNA 벡터에 의해 발현되는 예시적인 GBA 단백질
특히, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 고셰병의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용되는, 예를 들어, 비제한적으로, GBA 단백질뿐 아니라, 이의 변이체 및/또는 활성 단편을 인코딩할 수 있다. 하나의 양태에서, 고셰병은 인간 고셰병이다.
(i) GBA 치료 단백질 및 이의 단편
본질적으로, 임의의 버전의 GBA 치료 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능성 단편)이 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터에 의해 인코딩되고, 이에서 및 이로부터 발현될 수 있다. 당업자는, GBA 치료 단백질이 GBA 단백질의 모든 스플라이스 변이체 및 이종상동체(ortholog)를 포함한다는 것을 이해할 것이다. GBA 치료 단백질에는, 온전한 분자뿐 아니라, 이의 단편(예를 들어, 기능성 단편)이 포함된다.
GBA
GBA는 당지질 대사의 중간체인 글리코실세라미드의 베타-글리코시드 연결을 절단하는 리소좀 막 단백질이다. 이러한 유전자의 돌연변이는 글루코세레브로시드(GCB)의 축적을 특징으로 하는 상염색체 열성 리소좀 축적 질환인 고세병을 유발한다. GBA는 또한 글루코실세라미다아제 베타, 글루코실세라미다아제, D-글루코실-N-아실스핑고신 글루코히드롤라아제, 베타-글루코세레브로시다아제, 글루코시다아제 베타 산, 산 베타-글루코시다아제, 이미글루세라아제, 알글루세라아제, EC 3.2.1.45, 베타-GC, GLUC, 글루코시다아제 베타 산(글루코실세라미다아제 포함), 글루코실세라미다아제 유사 단백질, 리소좀 글루코세레브로시다아제, GBA1, GCB 또는 GC로 지칭될 수 있다.
전형적인 AAV 벡터, 및 심지어 렌티바이러스 벡터에 비해 ceDNA 벡터의 뚜렷한 이점은, 목적하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 대한 크기 제한이 없다는 점이다. 따라서, 다수의 전장 GBA 치료 단백질도 단일 ceDNA 벡터로부터 발현될 수 있다.
ceDNA 벡터로부터의 GBA 치료 단백질 또는 이의 단편의 발현은 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 비롯한, 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 유도성 또는 억제성 프로모터를 사용하여 공간적으로 및 시간적으로 달성될 수 있다.
하나의 구현예에서, GBA 치료 단백질은 이의 상응하는 천연 GBA 치료 단백질과 비교하여 변경된 아미노산 서열, 조성 또는 구조를 갖는 GBA 치료 단백질을 나타내는 "치료 단백질 변이체"이다. 하나의 구현예에서, GBA는 기능성 버전(예를 들어, 야생형 또는 야생형의 기능을 가짐)이다. 이는 또한, 예를 들어 질환의 동물 모델 및/또는 고셰병의 약물 평가를 위해, 고셰병으로 이어지는 점 돌연변이 또는 결실 돌연변이와 같은 GBA 단백질의 돌연변이 버전을 발현시키는 데 유용할 수 있다. 질환 모델을 생성하기 위해, 돌연변이 또는 변형된 GBA 단백질의 세포 또는 동물 모델 시스템으로의 전달이 이루어질 수 있다. 이러한 세포 또는 동물 모델은 연구 및/또는 약물 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. ceDNA 벡터로부터 발현된 GBA 치료 단백질은 형광, 효소 활성 또는 분비 신호와 같은 추가 기능을 부여하는 서열/모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, GBA 치료 단백질 변이체는 수용 숙주 세포에서 내인성 GBA 치료 단백질과 구별될 수 있도록 하는 식별을 위한 비(非)천연 태그 서열(예를 들어, 면역태그(immunotag))을 포함한다.
예를 들어 GBA 치료 단백질의 공지된 및/또는 공개적으로 이용 가능한 단백질 서열을 취하고, 이러한 단백질을 인코딩하기 위해 cDNA 서열을 역으로 조작하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 따라서, cDNA는 의도된 숙주 세포와 매칭되도록 코돈 최적화되고 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터에 삽입될 수 있다.
하나의 구현예에서, GBA 치료 단백질 인코딩 서열은, 예를 들어 숙주에서 얻은 mRNA를 역전사시키고, PCR을 사용하여 서열을 증폭시키는 방식으로, 기존 숙주 세포 또는 세포주에서 유도될 수 있다.
(ii) ceDNA 벡터를 발현하는 GBA 치료 단백질
목적하는 GBA 치료 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 서열을 갖는 ceDNA 벡터는, 프로모터(예를 들어, 표 7 참조), 분비 신호, polyA 영역(예를 들어, 표 10 참조) 및 인핸서(예를 들어, 표 8 참조)와 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 최소한, ceDNA 벡터는 GBA 치료 단백질 또는 이의 기능성 단편을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. GBA 치료 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 생성하기 위한 예시적인 카세트 삽입물은 도 1a 내지 도 1g에 도시되어 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 하기 표 1에 열거된 서열번호로 식별되는 GBA 서열을 포함한다.
Figure pct00001
(iii) GBA 치료 단백질 및 고셰병의 치료를 위한 이의 용도
본원에 기재된 ceDNA 벡터는 GBA 단백질의 부적절한 발현 및/또는 GBA 단백질 내 돌연변이와 관련된 고셰병의 치료를 위한 치료용 GBA 단백질을 전달하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 임의의 목적하는 GBA 치료 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 예시적인 치료용 GBA 치료 단백질에는, 비제한적으로, 본원의 표 1에 제시된 서열번호(예를 들어, 서열번호 377, 서열번호 378, 서열번호 379, 서열번호 382, 서열번호 383, 서열번호 384)로 식별되는 서열에 의해 발현되는 임의의 GBA 단백질이 포함된다. 일부 구현예에 따르면, 예시적인 GBA 치료 단백질은 서열번호 377과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 예시적인 GBA 치료 단백질은 서열번호 378과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 예시적인 GBA 치료 단백질은 서열번호 379와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 예시적인 GBA 치료 단백질은 서열번호 382와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 예시적인 GBA 치료 단백질은 서열번호 383과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 예시적인 GBA 치료 단백질은 서열번호 384와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 발현된 GBA 치료 단백질은 고셰병의 치료에 기능성이 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 GBA 치료 단백질은 면역계 반응을 야기하기 않는다.
또 다른 구현예에서, GBA 치료 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 이의 기능성 단편)을 인코딩하는 ceDNA 벡터는 키메라 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 구체적으로는, 키메라 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터가, 예를 들어 간, 신장, 담낭, 전립선, 부신에서 선택되는 임의의 하나 이상의 조직에 투여될 수 있다고 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, GBA를 발현하는 ceDNA 벡터가 유아에게 투여되거나 대상의 자궁에 투여되는 경우, GBA를 발현하는 ceDNA 벡터는 고셰병의 생체내 또는 생체외 치료를 위해, 간, 부신, 심장, 장, 폐 및 위에서 선택되는 임의의 하나 이상의 조직, 또는 이의 간 줄기세포 전구체에 투여될 수 있다.
고셰병:
고셰병은 글루코세레브로시드(glucocerebroside)로 불리는 일종의 지방(지질)이 적절하게 분해될 수 없는 상염색체 열성 유전 대사 장애이다. 정상적으로, 신체는 세포막의 정상적인 부분인 글루코세레브로시드를 분해하고 재생시키는 글루코세레브로시다아제로 불리는 효소를 생성한다. 고셰병을 앓고 있는 환자들은 충분한 글루코세레브로시다아제를 생성하지 못한다. 이로 인해 간, 비장, 골수 및 신경계에 특정 지질이 축적되어 정상적인 기능을 방해한다. 고셰병은 GBA로 불리는 단일 유전자의 변화(돌연변이)로 인해 유발된다. GBA 유전자의 돌연변이는 매우 낮은 수준의 글루코세레브로시다아제를 초래한다. 고셰병을 앓고 있는 환자는 각 부모로부터 GBA 유전자의 돌연변이된 카피를 물려받는다.
고셰병의 치료는 효소 대체 요법(ERT: enzyme replacement therapy) 또는 기질 감소 요법(SRT: substrate reduction therapy)을 포함할 수 있다. 효소 대체 요법(ERT)은 효소의 변형된 버전으로 낮은 수준의 GBA 효소를 상쇄한다. ERT는 약 2주마다 정맥내(IV) 주입을 투여받는 것을 포함한다. 기질 감소 요법(SRT)은 신체에서 생성되는 글루코세레브로시드의 양을 감소시킨다. SRT는 경구 약물로 이용 가능하다. 현재 고셰병을 앓고 있는 환자를 위한 2가지 승인된 경구 SRT 약물이 존재한다: Cerdelga®(엘리글루스타트(eliglustat)) 및 Zavesca®(미글루스타트(miglustat)). 고셰병에 대한 치유 요법은 존재하지 않는다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용의 방법에 따라 치료를 받는 대상은 현재 글루코세레브로시다아제 효소 대체 요법을 받고 있거나 이전에 받은 적이 있는 대상이다.
실험 설계는 하기와 같다: 베타 글루코세레브로시다아제(GBA) 코딩 서열(코돈 최적화된 것)과 보조 발현 요소를 인코딩하는 ceDNA를 LNP 내에 생성하고 이에 봉입시킨다. GBA의 발현 및 분비를 세포 배양물에서 입증한다. 고셰병 마우스 모델 9V/9V 및 9V/null에 0.2 mg/kg 내지 5 mg/kg의 용량 범위 내로의 인간 GBA를 인코딩하는 LNP-ceDNA의 단일 또는 반복 용량을 정맥내로 제공한다. 야생형 수준과 비교한 베타 글루코세레브로시다아제의 수준을 포함하는 베타 글루코세레브로시다아제의 조직 내 발현 및 혈장으로의 분비를 고셰병 모델에서 입증한다. Gb3의 제거뿐 아니라 고셰 세포 수의 감소를 고셰병의 쥣과 모델에서 입증한다. GBA의 조직 내 국소화를 면역조직화학을 통해 입증한다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 GBA 치료 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능성 단편)을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, "유효량"이라는 용어는, 질환 또는 장애의 치료를 위한 "치료적 유효량"으로 단백질의 발현을 유도하는, 투여되는 ceDNA 조성물의 양을 나타낸다.
GBA 치료 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 기능성 단편)을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 투여량 범위는, 역가(예를 들어, 프로모터의 효율)에 따라 달라지며, 고셰병의 치료를 위해 목적하는 효과, 예를 들어 목적하는 GBA 치료 단백질의 발현을 생성하는 데 충분히 큰 양을 포함한다. 투여량은 허용 가능하지 않은 부작용을 야기할 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 ceDNA 벡터의 특정한 특징, 발현 효율, 및 환자의 연령, 병태 및 성별에 따라 달라진다. 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있으며, 전형적인 AAV 벡터와 달리, ceDNA 벡터가 반복 투여를 방해하는 면역 활성화 캡시드 단백질을 포함하지 않기 때문에, 임의의 합병증 사례에서 개별 의사에 의해 조정될 수도 있다.
본원에 기재된 ceDNA 조성물의 투여는 제한된 기간 동안 반복될 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 주기적으로 또는 간헐적 투여로 제공된다. 바람직한 구현예에서, 상기 언급된 용량은 수개월에 걸쳐 투여된다. 치료 지속기간은 대상의 임상 진행과 치료에 대한 반응성에 따라 달라진다. 시간 경과에 따른 부스터 치료도 고려된다. 나아가, 발현 수준은 대상이 성장함에 따라 적정될 수 있다.
GBA 치료 단백질은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월/1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 15년, 적어도 20년, 적어도 30년, 적어도 40년, 적어도 50년 또는 그 이상 동안 대상에서 발현될 수 있다. 장기 발현은 선결된 또는 목적하는 간격으로 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 반복 투여하는 방식으로 달성될 수 있다.
본원에 사용된 "치료적 유효량"이라는 용어는, 질환 바이오마커 발현의 통계적으로 유의하고 측정 가능한 변화, 또는 주어진 질환 증상의 감소를 생성하는 데 충분한(하기 "효능 측정" 섹션 참조), 발현된 GBA 치료 단백질 또는 이의 기능성 단편의 양이다. 이러한 유효량은 주어진 ceDNA 조성물에 대한 임상 시험 및 동물 연구에서 추정될 수 있다.
투여에 필요한 ceDNA 벡터의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 달라지며, 각 개체마다 특정하다. 적합한 투여 방식 또한 가변적이지만, 초기 투여 후, 후속 주사 또는 다른 투여가 하나 이상의 간격으로 반복 투여되는 것이 전형적이다. 대안적으로, 특히 급성 질환/장애 치료의 경우, 생체내 치료법에 대해 명시된 범위로 혈중 농도를 유지하는 데 충분한 연속 정맥내 주입이 고려된다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 유용한 작용제는 국소적으로, 정맥내로(볼루스 또는 연속 주입으로), 세포내 주사로, 조직내 주사로, 경구로, 흡입으로, 복강내로, 근육내로, 피하로, 공동내로 투여될 수 있으며, 목적하는 경우, 연동 수단을 통해, 또는 당업자에게 공지된 다른 수단을 통해 전달될 수 있다. 작용제는, 목적하는 경우, 전신으로 투여될 수 있다. 이는 또한 자궁에 투여될 수 있다.
고셰병에 대한 주어진 치료의 효능은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 하지만, 질환 또는 장애의 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 전부가 유익한 방식으로 변경되거나, 다른 임상적으로 허용되는 질환의 증상 또는 마커가, 예를 들어 GBA 또는 이의 기능성 단편을 인코딩하는 ceDNA 벡터로의 치료 후 적어도 10% 정도 호전되거나 개선되는 경우, 치료는 본원에 사용된 용어로 "유효한 치료"로 간주된다. 효능은 또한 질환의 안정화 또는 의학적 개입의 필요성에 의해 평가되는 바와 같이 개체의 악화 실패로 측정될 수 있다(즉, 질환의 진행이 중단되거나 적어도 느려짐). 이러한 지표의 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 개체 또는 동물(일부 비제한적인 예에는, 인간 또는 포유류가 포함됨)에서의 질환의 임의의 치료를 포함하며, 이에는 (1) 질환을 저해하는 것, 예를 들어 질환 또는 장애의 진행을 중단시키거나 느리게 하는 것; 또는 (2) 질환을 완화시키는 것, 예를 들어 증상의 퇴행을 유발하는 것; 및 (3) 질환의 발달 가능성을 예방하거나 감소시키는 것, 또는 간부전 또는 신부전과 같은 질환과 관련된 2차 질환/장애를 예방하는 것을 포함한다. 질환의 치료를 위한 유효량은, 이를 필요로 하는 포유류에 투여되는 경우, 해당 질환에 대한 유효한 치료(이러한 용어는 본원에 정의된 바와 같음)를 유도하는 데 충분한 양을 의미한다.
작용제의 효능은 고셰병에 대해 특정한 물리적 지표를 평가하는 방식으로 결정될 수 있다. 고셰병 지표의 표준 분석 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한, ceDNA로부터 발현된 GBA 단백질과 함께 사용될 수 있는, 보조인자 또는 다른 폴리펩타이드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNA(코딩 또는 비코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 및 이들의 안티센스 대응물(예를 들어, antagoMiR))를 인코딩할 수 있다. 또한, GBA 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트는 또한, β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들과 같은, 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 고셰병의 치료에 기능성이 있는 GBA 단백질을 발현시키는 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 치료용 GBA 단백질은, 목적하지 않는 경우, 면역계 반응을 야기하지 않는다.
III. GBA 치료 단백질의 생산에 사용되는 ceDNA 벡터 전반
본 개시내용의 구현예는 GBA 전이유전자를 발현시킬 수 있는 폐쇄형 선형 이중체화된(ceDNA) 벡터를 포함하는 방법 및 조성물을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 GBA 단백질을 인코딩하는 서열이다. 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 크기 제한이 없기 때문에, 예를 들어 단일 벡터로부터 전이유전자의 발현에 필요한 모든 구성요소의 발현을 가능하게 한다. GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 바람직하게는 이중체이며, 예를 들어 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 걸쳐 자가 상보적이다(예를 들어, ceDNA는 이중가닥 원형 분자가 아님). ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖기 때문에, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 소화(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 대한 내성이 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노관련바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함한다. ITR 서열은, (i) 적어도 하나의 WT ITR과 적어도 하나의 변형된 AAV 역말단반복서열(mod-ITR)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 2개의 변형된 ITR(여기서 mod-ITR 쌍은 서로에 대해 상이한 3차원 공간 구성을 가짐)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR), 또는 (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍(여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐), 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍(여기서 각각의 mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 임의의 것에서 선택된다.
비제한적으로, 리포좀 나노입자 전달 시스템과 같은 전달 시스템을 추가로 포함할 수 있는, GBA 단백질 생산을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 포함된다. 사용을 위해 포함되는 비제한적인 예시적인 리포좀 나노입자 시스템이 본원에 개시되어 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 ceDNA와 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/050042(이는 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩되는 지질 나노입자 제형.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내 제한적인 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는, 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물에서 생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 실행 가능한 진핵생물에서 생산된 대안을 나타낸다. 이는, 제어 요소, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 전이유전자, 다중 전이유전자 등의 삽입을 허용한다.
도 1a 내지 도 1e는, 비제한적이며 예시적인 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터, 또는 ceDNA 플라스미드의 상응하는 서열의 개략도를 보여준다. GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않으며, 제1 ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있다. 발현 카세트는 전이유전자의 발현을 가능하게 하고/하거나 제어하는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 여기서 발현 카세트는 인핸서/프로모터, ORF 리포터(전이유전자), 전사 후 조절 요소(예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH polyA) 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함할 수 있다.
발현 카세트는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 격리인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 일부 구현예에서, ITR은 전이유전자, 예를 들어 GBA 단백질을 위한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 구성요소, 예를 들어 GBA 단백질의 발현을 제어하고 조절하기 위한 "조절 스위치"라는 제목의 섹션에 본원에 기재된 조절 스위치를 포함하며, 목적하는 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.
발현 카세트는 4000개 초과의 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 뉴클레오타이드, 또는 약 4000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 또는 10,000개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 75,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 1000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 5,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한이 없기 때문에, 대형 발현 카세트를 전달하여 효율적인 전이유전자 발현을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터에는 원핵생물 특이적 메틸화가 없다.
ceDNA 발현 카세트는, 예를 들어 수용 대상에 존재하지 않거나, 이에서 불활성이거나 불충분한 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 발현 가능한 외인성 서열(예를 들어, 오픈리딩프레임) 또는 전이유전자, 또는 목적하는 생물학적 또는 치료 효과를 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 전이유전자는 결함 유전자 또는 전사체의 발현을 교정하는 기능을 할 수 있는 유전자 산물을 인코딩할 수 있다. 원칙적으로, 발현 카세트는 돌연변이로 인해 존재하지 않거나 감소된 단백질, 폴리펩타이드 또는 RNA를 인코딩하거나, 과발현될 때 치료적 유익을 전달하는 것이 본 개시내용의 범위에 속하는 것으로 간주되는 임의의 유전자를 포함할 수 있다.
발현 카세트는 임의의 전이유전자(예를 들어, GBA 단백질을 인코딩함), 예를 들어 대상에서 고셰병의 치료에 유용한 GBA 단백질, 즉, 치료용 GBA 단백질을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 단독으로, 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 또는 비코딩 핵산(예를 들어, RNAi, miR 등)뿐 아니라, 대상의 게놈에 있는 바이러스 서열, 예를 들어 HIV 바이러스 서열 등을 포함하는 핵산 서열 및 외인성 유전자와 조합으로, 대상에서 임의의 관심 GBA 단백질을 전달하고 발현시키는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 치료 목적을 위해(예를 들어, 의학적, 진단적 또는 수의학적 용도로) 또는 면역원성 폴리펩타이드를 위해 사용된다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 또는 RNA(코딩 또는 비코딩; 예를 들어 siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 및 이들의 안티센스 대응물(예를 들어, antagoMiR)), 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 대상의 임의의 관심 유전자를 발현시키는 데 유용하다.
발현 카세트는 또한 폴리펩타이드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNA(코딩 또는 비코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 및 이들의 안티센스 대응물(예를 들어, antagoMiR))을 인코딩할 수 있다. 발현 카세트는 또한, β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들과 같은, 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 발현 구조체인 발현 카세트에 제공된 서열은 표적 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"라는 용어는, 관심 척추동물, 예를 들어 마우스 또는 인간의 세포에서 발현 증강을 위해 핵산 서열을 변경하는 과정으로서, 천연 서열(예를 들어, 원핵생물 서열) 중 적어도 하나, 하나 초과 또는 유의한 수의 코돈을, 해당 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하는 과정을 나타낸다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은, 예를 들어 Aptagen의 GENE FORGE® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171), 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서 GBA 단백질을 인코딩하는 핵산은 인간 발현을 위해 최적화된 것이고/것이거나, 당업계에 공지된 바와 같은 인간 GBA 또는 이의 기능성 단편이다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 전이유전자는 GBA 단백질을 인코딩한다. 플라스미드 기반 발현 벡터와 상이한 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 다수의 구조적 특징이 있다. ceDNA 벡터는 다음 특징 중 하나 이상을 보유할 수 있다: 본래(즉, 삽입되지 않은) 박테리아 DNA의 결여; 원핵생물 복제 기점의 결여; 자가 함유, 즉, 이들은 Rep 결합 부위와 말단 분해 부위(RBS 및 TRS)를 포함하는 2개의 ITR 이외의 임의의 서열, 및 ITR 사이의 외인성 서열을 필요로 하지 않음; 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재; 및 박테리아 유형 DNA 메틸화 또는 실제로 포유류 숙주에 의해 비정상적인 것으로 간주되는 임의의 다른 메틸화의 부재. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 임의의 원핵생물 DNA를 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 일부 원핵생물 DNA가, 비제한적인 예로서, 프로모터 또는 인핸서 영역에 외인성 서열로서 삽입될 수 있다고 고려된다. ceDNA 벡터를 플라스미드 발현 벡터와 구별하는 또 다른 중요한 특징은, ceDNA 벡터는 폐쇄형 말단을 갖는 단일가닥 선형 DNA이지만, 플라스미드는 항상 이중가닥 DNA라는 점이다.
본원에 제공된 방법에 의해 생산된 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 바람직하게는 제한 효소 소화 검정으로 측정 시, 비연속 구조라기보다는 선형 및 연속 구조이다(도 4d). 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정적일 뿐 아니라, 재조합되어 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조의 ceDNA 벡터가 바람직한 구현예이다. 연속, 선형, 단일가닥 분자내 이중체 ceDNA 벡터는, AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이, 공유결합으로 결합된 말단을 가질 수 있다. 이러한 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 이중체 핵산 분자인 플라스미드(본원에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 플라스미드의 상보적 가닥은 변성 후 분리되어 2개의 핵산 분자를 생성하지만, 대조적으로, 상보적 가닥을 갖는 ceDNA 벡터는, 단일 DNA 분자이기 때문에, 변성되더라도 단일 분자로 남아있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는, 플라스미드와 달리, 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생산될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터와 ceDNA-플라스미드는 구조(특히, 선형 대 원형)의 측면에서, 또한 이러한 상이한 대상을 생산하고 정제하는 데 사용되는 방법(하기 참조)의 측면에서, 또한 ceDNA-플라스미드의 경우 원핵생물 유형이고 ceDNA 벡터의 경우 진핵생물 유형인 이의 DNA 메틸화의 측면에서 모두 상이하다.
플라스미드 기반 발현 벡터에 비해 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 사용하는 데에는 몇 가지 이점이 존재하며, 이러한 이점에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 1) 플라스미드는 박테리아 DNA 서열을 함유하고 원핵생물 특이적 메틸화, 예를 들어 6-메틸 아데노신 및 5-메틸 시토신 메틸화에 적용되지만, 캡시드 미함유 AAV 벡터 서열은 진핵생물 기원으로 원핵생물 특이적 메틸화를 거치지 않으며; 그 결과, 캡시드 미함유 AAV 벡터는 플라스미드에 비해 염증 및 면역 반응을 유도할 가능성이 적음; 2) 플라스미드는 생산 과정 동안 내성 유전자의 존재를 필요로 하지만, ceDNA 벡터는 그렇지 않음; 3) 원형 플라스미드는 세포에의 도입 시 핵으로 전달되지 않고 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 우회하기 위해서는 과부하가 필요하지만, ceDNA 벡터는 뉴클레아제에 대한 내성을 부여하는 바이러스성 시스-요소, 즉, ITR을 함유하고, 핵을 표적으로 하여 이에 전달되도록 설계될 수 있음. ITR 기능에 없어서는 안 될 최소 정의 요소를, Rep-결합 부위(RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 60))와 말단 분해 부위(TRS; AAV2의 경우 5'-AGTTGG-3'(서열번호 64)), 그리고 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열; 및 4) ceDNA 벡터가 T세포 매개 면역 반응을 유발하는 톨유사(Toll-like) 수용체 패밀리의 멤버와 결합하는 것으로 보고된 원핵생물 유래 플라스미드에서 종종 발견되는 CpG 디뉴클레오타이드의 과대표현(over-representation)을 갖지 않는 것이라고 가정하였다. 대조적으로, 본원에 개시된 캡시드 미함유 AAV 벡터로의 형질도입은, 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온으로 형질도입하기 곤란한 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.
IV. 역말단반복서열(ITR)
본원에 개시된 바와 같은, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 역말단반복서열(ITR) 사이에 배치된 전이유전자 또는 핵산 서열을 함유하며, 여기서 ITR 서열은 비대칭인 ITR 쌍, 또는 대칭 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍(이러한 용어는 본원에 정의된 바와 같음)일 수 있는 ceDNA 벡터가 본원에 포함된다. 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는, (i) 적어도 하나의 WT ITR과 적어도 하나의 변형된 AAV 역말단반복서열(mod-ITR)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 2개의 변형된 ITR(여기서 mod-ITR 쌍은 서로에 대해 상이한 3차원 공간 구성을 가짐)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR), 또는 (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍(여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐), 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍(여기서 각각의 mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 임의의 것에서 선택되는 ITR 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 본 개시내용의 방법은, 비제한적으로, 리포좀 나노입자 전달 시스템과 같은 전달 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, ITR 서열은 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과와 곤충을 감염시키는 덴소바이러스아과의 2개의 아과를 포함하는 파르보바이러스과의 바이러스에서 유래할 수 있다. 파르보바이러스아과(파르보바이러스로 지칭됨)에는, 대부분의 조건 하에서, 생산적인 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로의 동시감염을 필요로 하는 구성원인 데펜도바이러스속이 포함된다. 데펜도바이러스속에는, 통상적으로 인간(예를 들어, 혈청형 2, 3A, 3B, 5 및 6) 또는 영장류(예를 들어, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 아데노연관바이러스(AAV), 및 다른 온혈동물을 감염시키는 관련 바이러스(예를 들어, 소, 개, 말 및 양 아데노연관바이러스)가 포함된다. 파르보바이러스 및 파르보바이러스과의 다른 구성원은 일반적으로 문헌[Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996)]에 기재되어 있다.
본원의 명세서 및 실시예에 예시된 ITR이 AAV2 WT-ITR이지만, 당업자는 상기 언급된 바와 같이 임의의 공지된 파르보바이러스, 예를 들어 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈, 예를 들어 NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261)와 같은 데펜도바이러스 유래의 ITR, 키메라 ITR, 또는 임의의 합성 AAV 유래의 ITR을 사용할 수 있다는 것을 알고 있다. 일부 구현예에서, AAV는 온혈동물, 예를 들어 조류(AAAV), 소(BAAV), 개, 말 및 양 아데노연관바이러스를 감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 B19 파르보바이러스(GenBank 수탁번호: NC 000883), 마우스 유래 미세생쥐바이러스(MVM: Minute Virus from Mouse)(GenBank 수탁번호. NC 001510); 거위 파르보바이러스(GenBank 수탁번호: NC 001701); 뱀 파르보바이러스 1(GenBank 수탁번호. NC 006148)에서 유래한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 논의된 바와 같이, 5' WT-ITR은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있다.
당업자는, ITR 서열이 전형적으로 T-형 또는 Y-형 헤어핀 구조(예를 들어, 도 2a 및 도 3a 참조)인 이중가닥 홀리데이 접합의 공통 구조를 갖고, 여기서 각각의 WT-ITR은 보다 큰 회문구조 아암(A-A')에 포매된 2개의 회문구조 아암 또는 루프(B-B' 및 C-C'), 및 단일가닥 D 서열로 형성된다(여기서, 이러한 회문구조 서열의 순서는 ITR의 플립 또는 플랍 배향을 정의함)는 것을 알고 있다. 예를 들어, 상이한 AAV 혈청형(AAV1 내지 AAV6) 유래의 ITR의 구조 분석 및 서열 비교는 문헌[Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439]; 문헌[Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379]; 문헌[Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14]에 기재된 것을 참조한다. 당업자는, 본원에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열에 기반하여 ceDNA 벡터 또는 ceDNA-플라스미드에 사용되는 임의의 AAV 혈청형 유래의 WT-ITR 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 다른 혈청형 유래의 좌측 ITR에 대한 AAV2의 좌측 ITR의 동일성%: AAV-1(84%), AAV-3(86%), AAV-4(79%), AAV-5(58%), AAV-6(좌측 ITR)(100%) 및 AAV-6(우측 ITR)(82%)을 보여주는, 문헌[Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439]에 기재된 상이한 AAV 혈청형 유래 ITR의 서열 비교(AAV1 내지 AAV6, 및 조류 AAV(AAAV) 및 소 AAV(BAAV)) 참조.
A. 대칭인 ITR 쌍
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로에 대해 대칭이거나 실질적으로 대칭이며, 즉, ceDNA 벡터는, 이의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록, 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 대칭인 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍은, 야생형 ITR이 아닌 변형된 ITR(예를 들어, mod-ITR)일 수 있다. mod-ITR 쌍은 야생형 ITR로부터 하나 이상의 변형을 갖고, 서로 역 보체(역상)인 동일한 서열을 가질 수 있다. 대안적인 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다.
(i) 야생형 ITR
일부 구현예에서, 대칭인 ITR 또는 실질적으로 대칭인 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 야생형(WT-ITR)이다. 즉, 2개의 ITR은 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형의 WT-ITR일 필요는 없다. 즉, 일부 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나는 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 이러한 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 이들은 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서, 하나 이상의 보존적 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 바와 같이, ceDNA 벡터는 서로 역 보체(역상)이거나, 또는 대안적으로, 서로 실질적으로 대칭이며, 즉, WT-ITR 쌍이 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는, 2개의 플랭킹 야생형 역말단반복서열(WT-ITR) 사이에 배치된 전이유전자 또는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV WT-ITR)은 기능성 Rep 결합 부위(RBS; 예를 들어 AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열번호 60)와 기능성 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3', 서열번호 62)를 포함한다.
하나의 양태에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 WT 역말단반복서열(WT-ITR)(예를 들어, AAV WT-ITR) 사이에 작동적으로 배치된 핵산을 인코딩하는 벡터 폴리뉴클레오타이드에서 수득될 수 있다. 즉, 2개의 ITR은 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형의 WT-ITR일 필요는 없다. 즉, 일부 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나는 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 이러한 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 이들은 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서, 하나 이상의 보존적 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래한 것이고, 3' WT-ITR은 동일하거나 상이한 AAV 혈청형에서 유래한 것이다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 서로 거울상이며, 즉, 이들은 대칭이다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 동일한 AAV 혈청형에서 유래한 것이다.
WT ITR은 널리 공지되어 있다. 하나의 구현예에서, 2개의 ITR은 동일한 AAV2 혈청형에서 유래한 것이다. 특정 구현예에서, 다른 혈청형에서 유래한 WT를 사용할 수 있다. 다수의 상동인 혈청형, 예를 들어 AAV2, AAV4, AAV6, AAV8이 존재한다. 하나의 구현예에서, 거의 상동인 ITR(예를 들어, 유사한 루프 구조를 갖는 ITR)이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 보다 다양한 AAV WT ITR, 예를 들어 AAV2와 AAV5가 사용될 수 있으며, 또 다른 구현예에서는, 실질적으로 WT인, 즉, WT의 기본 루프 구조를 갖지만, 특성을 변경시키거나 이에 영향을 미치지 않는 일부 보존적 뉴클레오타이드 변경을 갖는 ITR이 사용될 수도 있다. 동일한 바이러스 혈청형 유래의 WT-ITR이 사용되는 경우, 하나 이상의 조절 서열이 추가로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 ceDNA의 활성, 예를 들어 인코딩된 GBA 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 스위치이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기술의 하나의 양태는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 관한 것으로, 여기서 ceDNA 벡터는 2개의 야생형 역말단반복서열(WT-ITR) 사이에 작동 가능하게 배치된 GBA 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 WT-ITR은 동일한 혈청형, 상이한 혈청형에서 유래하거나, 또는 서로에 대해 실질적으로 대칭일 수 있다(즉, 기하학적 공간에서의 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가짐). 일부 구현예에서, 대칭인 WT-ITR은 기능성 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 전이유전자를 인코딩하고, 여기서 벡터는 바이러스 캡시드 내에 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, WT-ITR은 동일하지만, 서로 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR에서 서열 AACG은 상응하는 부위의 3' ITR에서 CGTT(즉, 역 보체)일 수 있다. 하나의 예에서, 5' WT-ITR 센스 가닥은 ATCGATCG의 서열을 포함하고, 상응하는 3' WT-ITR 센스 가닥은 CGATCGAT(즉, ATCGATCG의 역 보체)의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, WT-ITR ceDNA는 말단 분해 부위와 복제 단백질 결합 부위(RPS)(때때로 복제성 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 추가로 포함한다.
WT-ITR을 포함하는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 예시적인 WT-ITR 서열은 본원의 표 2에 제시되어 있으며, 이는 WT-ITR의 쌍(5' WT-ITR과 3' WT-ITR)으로 나타나 있다.
예시적인 예로서, 본 개시내용은 조절 스위치의 존재 또는 부재 하에 전이유전자(예를 들어, 핵산 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터로서, 캡시드 단백질이 없으며, (a) WT-ITR을 인코딩하는 ceDNA-플라스미드로부터 생산되고(예를 들어, 도 1f 및 도 1g 참조)(여기서 각각의 WT-ITR은 이의 헤어핀 2차 구성에서 동일한 수의 분자내 이중체화된 염기쌍을 가짐)(바람직하게는 참조 서열과 비교하여 이러한 구성에서 임의의 AAA 또는 TTT 말단 루프의 결실을 배제함), (b) 실시예 1의 미변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동에 의해 ceDNA를 식별하는 검정을 사용한 경우 ceDNA로서 식별되는 ceDNA 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, 플랭킹 WT-ITR은 서로 실질적으로 대칭이다. 이러한 구현예에서, 5' WT-ITR은 AAV의 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 3' WT-ITR은 AAV의 상이한 혈청형에서 유래할 수 있기 때문에, WT-ITR은 동일한 역 보체가 아니다. 예를 들어, 5' WT-ITR은 AAV2에서 유래할 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12)에서 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, WT-ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파르보바이러스(예를 들어, 공비단뱀 파르보바이러스), 소 파르보바이러스, 염소 파르보바이러스, 조류 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 말 파르보바이러스, 새우 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스 또는 곤충 AAV 중 임의의 것에서 선택되는 2개의 상이한 파르보바이러스에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, WT ITR의 이러한 조합은 AAV2와 AAV6에서 유래한 WT-ITR의 조합이다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 하나가 다른 하나의 ITR에 대해 역상인 경우, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96%...97%... 98%... 99%....99.5%(및 이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함) 동일하며, 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 일부 구현예에서, WT-ITR 쌍은 대칭인 3차원 공간 구성, 예를 들어 A, C-C', B-B' 및 D 아암의 동일한 3D 구성을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 다른 하나에 대해 역상이며, 서로 적어도 95% 동일, 적어도 96%...97%... 98%... 99%....99.5% 동일(이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함)하고, 하나의 WT-ITR은 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 60)의 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(trs)를 보유한다. 일부 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 서로 역상이며, 서로 적어도 95% 동일, 적어도 96%...97%... 98%... 99%....99.5% 동일(이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함)하고, 하나의 WT-ITR은 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 60)의 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(trs), 및 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열을 보유한다. 상동성은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, ITR의 구조 요소는 ITR과 큰 Rep 단백질(예를 들어, Rep 78 또는 Rep 68)의 기능적 상호작용에 관여하는 임의의 구조 요소일 수 있다. 특정 구현예에서, 구조 요소는 ITR과 큰 Rep 단백질의 상호작용에 대한 선택성을 제공하며, 즉, 적어도 부분적으로 어느 Rep 단백질이 ITR과 기능적으로 상호작용하는 지를 결정한다. 다른 구현예에서, 구조 요소는, Rep 단백질이 ITR에 결합될 때, 큰 Rep 단백질과 물리적으로 상호작용한다. 각각의 구조 요소는, 예를 들어 ITR의 2차 구조, ITR의 핵산 서열, 둘 이상의 요소 사이의 간격, 또는 상기 중 임의의 것의 조합일 수 있다. 하나의 구현예에서, 구조 요소는 A 및 A' 아암, B 및 B' 아암, C 및 C' 아암, D 아암, Rep 결합 부위(RBE) 및 RBE'(즉, 상보적 RBE 서열), 및 말단 분해 부위(trs)로 이루어지는 군에서 선택된다.
단지 예로서, 표 2는 WT-ITR의 예시적인 조합을 나타낸다.
표 2: 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형, 또는 상이한 파르보바이러스 유래의 WT-ITR의 예시적인 조합. 표시된 순서는 ITR 위치의 위치를 나타내지 않으며, 예를 들어 "AAV1, AAV2"는, ceDNA가 5' 위치에 WT-AAV1 ITR을 3' 위치에 WT-AAV2 ITR을 포함할 수 있거나, 그 반대로, 5' 위치에 WT-AAV2 ITR을 3' 위치WT-AAV1 ITR을 포함할 수 있음을 나타낸다. 약어: AAV 혈청형 1(AAV1), AAV 혈청형 2(AAV2), AAV 혈청형 3(AAV3), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11) 또는 AAV 혈청형 12(AAV12); AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈(예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), 온혈동물 유래의 ITR(조류 AAV(AAAV), 소 AAV(BAAV), 개, 말 및 양 AAV), B19 파르보바이러스 유래의 ITR(GenBank 수탁번호: NC 000883), 마우스 유래 미세생쥐바이러스(MVM)(GenBank 수탁번호: NC 001510); 거위: 거위 파르보바이러스(GenBank 수탁번호: NC 001701); 뱀: 뱀 파르보바이러스 1(GenBank 수탁번호: NC 006148).
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
단지 예로서, 표 3은 일부 상이한 AAV 혈청형 유래의 예시적인 WT-ITR의 서열 식별자를 보여준다.
Figure pct00006
일부 구현예에서, WT-ITR 서열의 핵산 서열은 변형될 수 있으며(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드, 또는 그 안의 임의의 범위의 뉴클레오타이드 변형), 여기서 변형은 상보적 뉴클레오타이드로, 예를 들어 C의 경우 G, 및 그 반대로, 및 A의 경우 T, 및 그 반대로의 치환이다.
본 개시내용의 특정 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 서열번호 1, 2, 5 내지 14 중 어느 하나에서 선택되는 핵산 서열로 이루어진 WT-ITR을 갖지 않는다. 본 발명의 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서열번호 1, 2, 5 내지 14 중 어느 하나에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WT-ITR을 갖는 경우, 플랭킹 ITR은 또한 WT이고, ceDNA 벡터는, 예를 들어 본원 및 국제 출원 PCT/US18/49996(예를 들어, PCT/US18/49996의 표 11 참조)에 개시된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다. 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치와, 서열번호 1, 2, 5 내지 14 중 어느 하나에서 선택되는 핵산 서열을 갖는 선택된 WT-ITR을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분을 보유하는 WT-ITR 구조를 포함할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는, 예시 목적으로 야생형 ITR을 사용하여, ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 보여준다. 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위(예를 들어, RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 60))와 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어, 5'-AGTT-3'(서열번호 62))를 포함하는 하나 이상의 기능성 WT-ITR 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능성이다. 대안적인 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 서로 실질적으로 대칭인 2개의 WT-ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능성이고, 적어도 하나의 WT-ITR은 비기능성이다.
B. 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 ceDNA 벡터에 대한 변형된 ITR(mod-ITR) 전반
본원에 논의된 바와 같이, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대칭인 ITR 쌍 또는 비대칭인 ITR 쌍을 포함할 수 있다. 두 경우 모두, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 변형된 ITR일 수 있으며, 여기서 차이점은, 첫 번째 경우(즉, 대칭인 mod-ITR), mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 갖지만(즉, 동일한 A-A', C-C' 및 B-B' 아암 구성을 가짐), 두 번째 경우(즉, 비대칭인 mod-ITR), mod-ITR은 상이한 3차원 공간 구성을 갖는다(즉, 상이한 A-A', C-C' 및 B-B' 아암 구성을 가짐)는 점이다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터에서 ITR 중 적어도 하나는 기능성 Rep 결합 부위(RBS; 예를 들어 AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열번호 60)와 기능성 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3', 서열번호 62)를 포함한다. 하나의 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 비기능성 ITR이다. 하나의 구현예에서, 상이한 또는 변형된 ITR은 각각 상이한 혈청형 유래의 야생형 ITR이 아니다.
ITR의 특정 변경 및 돌연변이가 본원에 상세하게 설명되어 있지만, ITR의 맥락에서, "변경된" 또는 "돌연변이된" 또는 "변형된"은 뉴클레오타이드가 야생형, 참조 또는 본래 ITR 서열에 비해 삽입, 결실 및/또는 치환된 것을 나타낸다. 변경된 또는 돌연변이된 ITR은 조작된 ITR일 수 있다. 본원에 사용된 "조작된"은, 인간의 손에 의해 조작된 양태를 나타낸다. 예를 들어, 폴리펩타이드는, 폴리펩타이드의 적어도 하나의 양태, 예를 들어 이의 서열이, 자연에 존재하는 양태와 상이하도록 인간의 손에 의해 조작된 경우, "조작된" 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, mod-ITR은 합성일 수 있다. 하나의 구현예에서, 합성 ITR은 하나 초과의 AAV 혈청형에서 유래한 ITR 서열을 기반으로 한다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV 기반 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV 유래 서열을 갖지 않거나 일부만 갖지만, 상기 기재된 ITR 구조를 보존한다. 일부 양태에서, 합성 ITR은 야생형 Rep 또는 특정 혈청형의 Rep와 우선적으로 상호작용할 수 있거나, 또는 일부 경우에, 야생형 Rep에 의해 인식되지 않고 돌연변이된 Rep에 의해서만 인식될 수 있다.
당업자는 공지된 수단을 통해 다른 혈청형에서 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, A, A', B, B', C, C' 또는 D 영역에 변경이 존재하는 지 여부를 결정하고, 또 다른 혈청형에서 상응하는 영역을 결정한다. 기본 설정의 BLAST®(Basic Local Alignment Search Tool) 또는 다른 상동성 정렬 프로그램을 사용하여 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 본 개시내용은 나아가 상이한 AAV 혈청형의 조합인 mod-ITR, 즉, 하나의 mod-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고 다른 하나의 mod-ITR은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있는 mod-ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 집단 및 복수의 ceDNA 벡터를 제공한다. 이론에 구애됨 없이, 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터의 하나의 ITR은 AAV2 ITR 서열에서 유래하거나 이를 기반으로 할 수 있고, 다른 하나의 ITR은 AAV 혈청형1(AAV1), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11) 또는 AAV 혈청형 12(AAV12) 중 임의의 하나 이상의 ITR 서열에서 유래하거나 이를 기반으로 할 수 있다.
임의의 파르보바이러스 ITR이 ITR로서 또는 변형을 위한 기본 ITR로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파르보바이러스는 데펜도바이러스이다. 더욱 바람직하게는, AAV이다. 선택된 혈청형은 혈청형의 조직 친화성을 기반으로 할 수 있다. AAV2는 폭넓은 조직 친화성을 갖고, AAV1은 뉴런 및 골격근을 우선적으로 표적화하고, AAV5는 뉴런, 망막색소상피세포 및 광수용체를 우선적으로 표적화한다. AAV6은 골격근 및 폐를 우선적으로 표적화한다. AAV8은 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 우선적으로 표적화한다. AAV9는 간, 골격 및 폐 조직을 우선적으로 표적화한다. 하나의 구현예에서, 변형된 ITR은 AAV2 ITR을 기반으로 한다.
보다 구체적으로, 특정 대형 Rep 단백질과 기능적으로 상호작용하는 구조 요소의 능력은 구조 요소의 변형을 통해 변경될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소의 핵산 서열은 ITR의 야생형 서열과의 비교를 통해 변형시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, ITR의 구조 요소(예를 들어, A 아암, A' 아암, B 아암, B' 아암, C 아암, C' 아암, D 아암, RBE, RBE' 및 trs)는 제거되어, 상이한 파르보바이러스의 야생형 구조 요소로 대체될 수 있다. 예를 들어, 대체 구조는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파르보바이러스(예를 들어, 공비단뱀 파르보바이러스), 소 파르보바이러스, 염소 파르보바이러스, 조류 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 말 파르보바이러스, 새우 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스 또는 곤충 AAV에서 유래할 수 있다. 예를 들어, ITR은 AAV2 ITR일 수 있고, A 또는 A' 아암, 또는 RBE는 AAV5의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, ITR은 AAV5 ITR일 수 있고, C 또는 C' 아암, RBE, 및 trs는 AAV2의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, AAV ITR은 B 및 B' 아암이 AAV2 ITR B 및 B' 아암으로 대체된 AAV5 ITR일 수 있다.
단지 예로서, 표 4는 변형된 ITR 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 예시적인 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타내며, 여기서 X는 상응하는 야생형 ITR에 대한 해당 섹션에서의 적어도 하나의 핵산의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타낸다. 일부 구현예에서, C 및/또는 C' 및/또는 B 및/또는 B'의 임의의 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 예를 들어, 변형이 단일 아암 ITR(예를 들어, 단일 C-C' 아암 또는 단일 B-B' 아암), 또는 변형된 C-B' 아암 또는 C'-B 아암, 또는 적어도 하나의 절단된 아암(예를 들어, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암)을 갖는 2개의 아암 ITR 중 임의의 것을 생성하는 경우, 적어도 단일 아암, 또는 2개의 아암 ITR 중 적어도 하나의 아암(여기서 하나의 아암은 절단될 수 있음)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 일부 구현예에서, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암은 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 갖는다.
Figure pct00007
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 mod-ITR은 본원에 개시된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 mod-ITR 쌍을 포함하며, 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A'와 C 사이, C와 C' 사이, C'와 B 사이, B와 B' 사이, 및 B'와 A 사이에서 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C 또는 C' 또는 B 또는 B' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 여전히 스템-루프의 말단 루프를 보존한다. 일부 구현예에서, C 및 C' 및/또는 B 및 B' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 대안적인 구현예에서, C와 C' 사이 및/또는 B와 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 A 뉴클레오타이드(즉, AAA)를 보유한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A', A 및/또는 D에서 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용되는 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용되는 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A 및/또는 A' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용되는 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 D 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상(또는 상기 제시된 개수 내 임의의 범위)의 뉴클레오타이드를 변형시켜) 변형된 구조 요소를 생성할 수 있다. 하나의 구현예에서, ITR에 대한 특정 변형은 본원에 예시된 것(예를 들어, 서열번호 3, 4, 15 내지 47, 101 내지 116 또는 165 내지 187), 또는 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 도 7a 및 도 7b에 제시된 것이다(예를 들어, PCT/US2018/064242의 서열번호 97 내지 98, 101 내지 103, 105 내지 108, 111 내지 112, 117 내지 134, 545 내지 54). 일부 구현예에서, ITR을 변형시킬 수 있다(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상(또는 상기 제시된 개수 내 임의의 범위)의 뉴클레오타이드를 변형시킴). 다른 구현예에서, ITR은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 15 내지 서열번호 47, 서열번호 101 내지 서열번호 116 또는 서열번호 165 내지 서열번호 187의 변형된 ITR 중 하나, 또는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 15 내지 서열번호 47, 서열번호 101 내지 서열번호 116 또는 서열번호 165 내지 서열번호 187의 A-A' 아암의 RBE 함유 섹션, 및 C-C' 및 B-B' 아암, 또는 국제 특허 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용된)의 표 2 내지 표 9(즉, 서열번호 110 내지 서열번호 112, 서열번호 115 내지 서열번호 190, 서열번호 200 내지 서열번호 468)에 제시된 바와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은, 예를 들어 특정 아암의 전부, 예를 들어 A-A' 아암의 전부 또는 일부, 또는 B-B' 아암의 전부 또는 일부, 또는 C-C' 아암의 전부 또는 일부의 제거 또는 결실, 또는 대안적으로, 스템(예를 들어, 단일 아암)을 캡핑하는 최종 루프가 여전히 존재하는 한, 루프의 스템을 형성하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 도 7a의 ITR-21 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 도 3b의 ITR-1 또는 도 7a의 ITR-45 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거, 및 B-B' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 염기쌍의 제거의 임의의 조합이 고려되며, 예를 들어 C-C' 아암에서 6개의 염기쌍이 제거되고 B-B' 아암에서 2개의 염기쌍이 제거될 수 있다. 예시적인 예로서, 도 3b는, C 부분과 C' 부분 각각에서 적어도 7개의 염기쌍 결실, C 영역과 C' 영역 사이의 루프에서 뉴클레오타이드의 치환, 및 변형된 ITR이 2개의 아암을 포함하며 이 중 적어도 하나의 아암(예를 들어, C-C')이 절단되도록 B 영역과 B' 영역 각각에서의 적어도 하나의 염기쌍 결실을 갖는 예시적인 변형된 ITR을 보여준다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 또한 B-B' 아암이 또한 WT ITR에 비해 절단되도록 B 영역과 B' 영역 각각에서의 적어도 하나의 염기쌍 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 비해 1개 내지 50개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개 또는 50개)의 뉴클레오타이드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 WT ITR 서열에 비해 1개 내지 30개의 뉴클레오타이드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 비해 2개 내지 20개의 뉴클레오타이드 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은, DNA 복제(예를 들어, Rep 단백질에 의한 RBE에의 결합, 또는 말단 분해 부위에서의 닉킹)를 방해하지 않도록, A 또는 A' 영역의 RBE 함유 부분에서 임의의 뉴클레오타이드 결실을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에의 사용을 위해 포함된 변형된 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 B, B', C, 및/또는 C' 영역에 하나 이상의 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 대칭인 ITR 쌍 또는 비대칭인 ITR 쌍을 포함하는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치와, 서열번호 3, 4, 15 내지 47, 101 내지 116 또는 165 내지 187로 이루어지는 군 중 어느 하나에서 선택되는 핵산 서열을 갖는 선택된 적어도 하나의 변형된 ITR을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 구조 요소의 구조는 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소는 스템의 높이 및/또는 루프 내 뉴클레오타이드 수가 변경된다. 예를 들어, 스템의 높이는 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드일 수 있다. 하나의 구현예에서, 스템의 높이는 약 5개 뉴클레오타이드 내지 약 9개 뉴클레오타이드일 수 있으며, Rep와 기능적으로 상호작용한다. 또 다른 구현예에서, 스템의 높이는 약 7개 뉴클레오타이드일 수 있으며, Rep와 기능적으로 상호작용한다. 또 다른 예에서, 루프는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, RBE 또는 연장된 RBE 내 GAGY 결합 부위 또는 GAGY 관련 결합 부위의 수가 증가 또는 감소할 수 있다. 하나의 예에서, RBE 또는 연장된 RBE는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개, 또는 그 이상의 GAGY 결합 부위, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 GAGY 결합 부위를 포함할 수 있다. 각각의 GAGY 결합 부위는, 서열이 Rep 단백질에 결합하는 데 충분하다면, 독립적으로 정확한 GAGY 서열 또는 GAGY에 유사한 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 2개의 요소(예컨대, 비제한적으로, RBE와 헤어핀) 사이의 간격을 변경시켜(예를 들어, 증가 또는 감소시켜), 큰 Rep 단백질과의 기능적 상호작용을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 간격은 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 야생형 AAV2 ITR 구조에 대해 변형된 ITR 구조를 포함할 수 있지만, 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분은 여전히 보유한다. 도 2a 및 도 2b는, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 보여준다. 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위(예를 들어, RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 60))와 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어, 5'-AGTT-3'(서열번호 62))를 포함하는 하나 이상의 기능성 ITR 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR(wt 또는 변형된 ITR)은 기능성이다. 대안적인 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 서로 상이하거나 비대칭인 2개의 변형된 ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 변형된 ITR은 기능성이고, 적어도 하나의 변형된 ITR은 비기능성이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 변형된 ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은, 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에 변형을 갖는다. 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 국제 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)의 표 2(즉, 서열번호 135 내지 190, 200 내지 233); 표 3(예를 들어, 서열번호 234 내지 263); 표 4(예를 들어, 서열번호 264 내지 293); 표 5(예를 들어, 본원의 서열번호 294 내지 318); 표 6(예를 들어, 서열번호 319 내지 468; 및 표 7 내지 표 9(예를 들어, 서열번호 101 내지 110, 111 및 112, 115 내지 134) 또는 표 10A 또는 표 10B(예를 들어, 서열번호 9, 100, 469 내지 483, 484 내지 499)에 열거되어 있다.
일부 구현예에서, 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 mod-ITR 쌍을 포함하는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 변형된 ITR은, 국제 특허 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 및 표 10A 및 표 10B에 제시된 것들 중 임의의 것 또는 이들의 조합에서 선택된다.
비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 mod-ITR 쌍을 포함하는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 상기 각 부류의 추가의 예시적인 변형된 ITR은 표 5A 및 표 5B에 제공되어 있다. 표 5A의 우측 변형된 ITR의 예측된 2차 구조는 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242의 도 7a에 제시되어 있고, 표 5B의 좌측 변형된 ITR의 예측된 2차 구조는 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242의 도 7b에 제시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
표 5A 및 표 5B는 예시적인 우측 및 좌측 변형된 ITR의 서열 식별자를 보여준다.
Figure pct00008
Figure pct00009
하나의 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로에 대해 비대칭이며, 즉, 이들은 서로 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR이고, 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있거나, 또는 그 반대로 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 ITR과 제2 ITR은 모두 mod-ITR이지만, 상이한 서열을 갖거나 상이한 변형을 갖기 때문에, 동일한 변형된 ITR이 아니고, 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는, WT-ITR과 비교하여 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 하나의 ITR에 반영되지 않거나; 또는 대안적으로, 비대칭인 ITR이 변형된 비대칭인 ITR 쌍을 갖고 서로에 대해 상이한 서열과 상이한 3차원 형상을 가질 수 있는 ITR을 포함한다. GBA 단백질의 발현 및 ceDNA-플라스미드를 생성에 사용하기 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 비대칭인 ITR은 표 5A 및 표 5B에 제시되어 있다.
대안적인 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 대칭인 mod-ITR을 포함하며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 서열을 갖지만, 서로 역 보체(역상)이다. 일부 구현예에서, 대칭인 mod-ITR 쌍은 동일한 AAV 혈청형의 야생형 ITR 서열에 대한 결실, 삽입 또는 치환 중 적어도 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 대칭인 ITR에서 부가, 결실 또는 치환은 동일하지만, 서로 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR의 C 영역에의 3개의 뉴클레오타이드의 삽입은 3' ITR의 C' 영역 내 상응하는 섹션에의 3개의 역 보체 뉴클레오타이드의 삽입으로 반영될 것이다. 단지 예시의 목적으로, 부가가 5' ITR에의 AACG인 경우, 이러한 부가는 상응하는 부위의 3' ITR에의 CGTT이다. 예를 들어, 5' ITR 센스 가닥이 ATCGATCG인 경우, G와 A 사이에 AACG가 부가되면 ATCG AACG ATCG(서열번호 51)의 서열이 생성된다. 상응하는 3' ITR 센스 가닥은 CGATCGAT(ATCGATCG의 역 보체)이고, T와 C 사이에 CGTT(즉, AACG의 역 보체)가 부가되어, CGAT CGTT CGAT(서열번호 49)(ATCG AACG ATCG(서열번호 51)의 역 보체) 서열이 생성된다.
대안적인 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 하나의 변형된 ITR은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 변형된 ITR은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 동일한 영역에 동일한 돌연변이(예를 들어, 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 치환)을 가질 수 있다. 달리 말하면, 단지 예시의 목적으로, 5' mod-ITR은 AAV2에 유래할 수 있고 C 영역에 결실을 가질 수 있으며, 3' mod-ITR은 AAV5에서 유래할 수 있고 C' 영역에 상응하는 결실을 가질 수 있으며, 단, 5' mod-ITR과 3' mod-ITR은 동일하거나 대칭인 3차원 공간 구성을 갖고, 이들은 변형된 ITR 쌍으로서 본원에의 사용을 위해 포함된다.
일부 구현예에서, 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다. 단지 예로서, 실질적으로 대칭인 ITR은 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 대칭인 공간 구성을 가질 수 있다. 이는, G-C 쌍이, 예를 들어 C-G 쌍으로, 또는 그 반대로 변형되거나, A-T 쌍이 T-A 쌍으로, 또는 그 반대로 변형되는 경우에 일어날 수 있다. 따라서, ATCG AACG ATCG(서열번호 51)로서의 변형된 5’ ITR과 CGAT CGTT CGAT(서열번호 49)로서의 변형된 3’ ITR(즉, ATCG AACG ATCG(서열번호 51)의 역 보체)의 상기 예시적인 예를 사용하면, 이러한 변형된 ITR은, 예를 들어 5’ ITR이 ATCG AAC C ATCG(서열번호 50)의 서열(여기서, 추가의 G가 C로 변형됨)을 갖고, 실질적으로 대칭인 3’ ITR이 A에 더하여 T의 상응하는 변형 없이 CGAT CGTT CGAT(서열번호 49)의 서열을 갖는 경우, 여전히 대칭일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 변형된 ITR 쌍은 대칭인 입체화학을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다.
표 6은, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 예시적인 대칭인 변형된 ITR 쌍 및 이의 상응하는 서열번호(즉, 좌측 변형된 ITR과 대칭인 우측 변형된 ITR)을 보여준다. 서열의 볼드체(적색) 부분은 부분 ITR 서열(즉, A-A', C-C' 및 B-B' 루프의 서열)을 식별하며, 이는 또한 도 31a 내지 도 46b에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 변형된 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 60)의 RBE, ACTGAGGC(서열번호 69)의 스페이서, 스페이서 보체 GCCTCAGT(서열번호 70) 및 GAGCGAGCGAGCGCGC(서열번호 71)의 RBE'(즉, RBE에 대한 보체)를 포함할 수 있다.
Figure pct00010
일부 구현예에서, 비대칭인 ITR 쌍을 포함하는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원의 표 5A 및 표 5B 중 임의의 하나 이상에 제시된 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열에서의 임의의 변형에 상응하는 변형을 갖는 ITR, 또는 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 도 7a 및 도 7b에 제시된, 또는 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 또는 표 10A 및 표 10B에 개시된 서열을 포함할 수 있다.
V. 예시적인 ceDNA 벡터
상기 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍, 대칭인 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍 중 어느 하나를 포함하는, 재조합 ceDNA 발현 벡터 및 GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 플랭킹 ITR 서열과 전이유전자를 갖는 GBA 단백질의 발현을 위한 재조합 ceDNA 벡터로서, 여기서 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이고, ceDNA는 플랭킹 ITR 사이에 위치한 관심 핵산 서열(예를 들어, 전이유전자의 핵산을 포함하는 발현 카세트)을 추가로 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없는 재조합 ceDNA 벡터에 관한 것이다.
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 발현 벡터는, 적어도 하나의 ITR이 변경된 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열(들)을 포함하는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 ceDNA 벡터일 수 있다. 본 개시내용의 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터가 도입되는 숙주 세포와 양립 가능하다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 선형일 수 있다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 염색체외 엔티티로서 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 숙주 세포의 게놈으로의 공여체 서열의 통합을 가능하게 하는 요소(들)을 함유할 수 있다. 본원에 사용된 "전이유전자"와 "이종 핵산 서열"은 동의어이며, 본원에 기재된 바와 같이 GBA 단백질을 인코딩한다.
이제 도 1a 내지 도 1g를 참조하면, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 제조에 유용한 2개의 비제한적인 플라스미드의 기능성 구성요소의 개략도가 제시되어 있다. 도 1a, 도 1b, 도 1d, 도 1f는, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 구조체 또는 ceDNA 플라스미드의 상응하는 서열을 보여준다. ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않고, 제1 ITR, 발현 가능한 전이유전자 카세트 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있으며, 여기서 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이다. GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않고, 제1 ITR, 발현 가능한 전이유전자(단백질 또는 핵산) 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있으며, 여기서 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이다. 일부 구현예에서, 발현 가능한 전이유전자 카세트는, 필요한 경우, 인핸서/프로모터, 하나 이상의 상동성 아암, 공여체 서열, 전사 후 조절 요소(예를 들어, WPRE, 예를 들어 서열번호 67)), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH polyA, 예를 들어 서열번호 68)를 포함한다.
도 5는, 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 플라스미드 구조체로부터 ceDNA의 생산을 확인시켜 주는 겔이다. ceDNA는, 상기 도 4a 및 실시예에 논의된 바와 같이, 겔에서의 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
A. 조절 요소.
본원에 정의된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 시스-조절 요소의 특정 조합을 추가로 포함할 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 격리인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 예시적인 프로모터는 표 7에 열거되어 있다. 예시적인 인핸서는 표 8에 열거되어 있다. 일부 구현예에서, ITR은 전이유전자, 예를 들어 GBA 단백질을 위한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하는 추가 구성요소, 예를 들어 전이유전자의 발현을 조절하는 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치, 또는 GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 포함한다. 본 개시내용에 사용될 수 있는 조절 스위치를 비롯한 조절 요소는 국제 특허 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 보다 충분히 논의되어 있다.
구현예에서, 제2 핵산 서열은 조절 서열과, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 유전자 조절 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 숙주 세포에서 뉴클레아제의 발현을 제어하는 데 적합하다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 본 개시내용의 뉴클레아제(들)을 인코딩하는 핵산 서열과 같은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 지시할 수 있는, 적합한 프로모터 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 핵산 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 연결된 인트론 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터의 효능을 증가시키기 위해 인핸서 서열이 프로모터의 업스트림에 제공된다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 인핸서와 프로모터를 포함하며, 여기서 제2 핵산 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열의 업스트림에 있는 인트론 서열을 포함하고, 인트론은 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위(들)을 포함하고, 프로모터는 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다.
합성적으로, 또는 실시예에 본원에 기재된 바와 같은 세포 기반 생산 방법을 사용하여 생산된 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, WHP 전사 후 조절 요소(WPRE)(예를 들어, 서열번호 67)와 BGH polyA(서열번호 68) 같은 시스-조절 요소의 특정 조합을 추가로 포함할 수 있다. 발현 구조체에 사용하기에 적합한 발현 카세트는 바이러스 캡시드에 의해 부과된 패키징 제약에 의해 제한되지 않는다.
(i). 프로모터
당업자는, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 프로모터가 이를 촉진시키는 특정 서열에 적절하게 조정되어야 한다는 것을 이해할 것이다. ceDNA 벡터에서 유용한 전이유전자(예를 들어, GBA)에 작동적으로 연결된 예시적인 프로모터는 본원의 표 7에 개시되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 발현 카세트는 전체 발현 수준 및 세포 특이성에 영향을 미칠 수 있는 프로모터, 예를 들어 표 7에서 선택되는 프로모터 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 전이유전자 발현, 예를 들어 GBA 단백질의 발현을 위해, 이는 고도로 활성인 바이러스 유래의 극초기 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 특정 세포 유형에 대한 전이유전자 발현을 제한하고, 조절되지 않은 이소성 발현으로 인한 독성 효과 및 면역 반응을 감소시키기 위해 조직 특이적 진핵생물 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 CAG 프로모터(서열번호 72)와 같은 프로모터 또는 합성 조절 요소를 함유할 수 있다. CAG 프로모터는 (i) 시토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, (ii) 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함한다. 대안적으로, 발현 카세트는 알파-1-항트립신(AAT) 프로모터(서열번호 73 또는 서열번호 74), 간 특이적(LP1) 프로모터(서열번호 75 또는 서열번호 76), 또는 인간 신장인자-1 알파(EF1a) 프로모터(예를 들어, 서열번호 77 또는 서열번호 78)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트에는, 하나 이상의 구성적 프로모터, 예를 들어 레트로바이러스 라우스육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 또는 시토메갈로바이러스(CMV) 극초기 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐, 예를 들어 서열번호 79)가 포함된다. 대안적으로, 유도성 프로모터, 전이유전자에 대한 천연 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 당업계에 공지된 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.
표 7 및 상기 기재된 것들을 포함하는 적합한 프로모터는, 바이러스에서 유도될 수 있고, 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물 유기체를 포함하는 임의의 유기체에서 유도될 수 있다. 적합한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라아제(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터에는, 비제한적으로, SV40 초기 프로모터, 마우스 유선종양바이러스 긴말단반복서열(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순헤르페스바이러스(HSV) 프로모터, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 극초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스육종(rous sarcoma)바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 소형 핵 프로모터(U6, 예를 들어, 서열번호 80)(문헌[Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)]), 증강된 U6 프로모터(예를 들어, 문헌[Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17))], 인간 H1 프로모터(H1)(예를 들어, 서열번호 81 또는 서열번호 155), CAG 프로모터, 인간 알파 1-항트립신(HAAT) 프로모터(예를 들어, 서열번호 82) 등이 포함된다. 특정 구현예에서, 이러한 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 이의 다운스트림 인트론 함유 말단에서 변경된다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)을 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 대해 이질적이다.
하나의 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료용 단백질을 인코딩하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료용 단백질을 인코딩하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 공지되어 있고 특징분석되어 있다. 사용되는 프로모터 영역은 SV40 인핸서(서열번호 126)를 비롯한 하나 이상의 추가 조절 서열(예를 들어, 천연), 예를 들어 인핸서(예를 들어, 서열번호 79 및 서열번호 83)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 또한 인간 유비퀴틴 C(hUbC), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자 유래의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 조직 특이적 프로모터, 예컨대 천연 또는 합성의 인간 알파 1-항트립신(HAAT)과 같은 간 특이적 프로모터일 수 있다. 하나의 구현예에서, 간으로의 전달은, 간세포 표면에 존재하는 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체를 통해, 간세포에 대한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 내인성 ApoE 특이적 표적화를 사용하여 달성될 수 있다.
본 개시내용에 따라 사용하기에 적합한 프로모터의 비제한적인 예에는, 표 7에 열거된 프로모터 중 임의의 것, 또는 예를 들어 CAG 프로모터(서열번호 72), HAAT 프로모터(서열번호 82), 인간 EF1-α 프로모터(서열번호 77) 또는 EF1a 프로모터의 단편(서열번호 78), IE2 프로모터(예를 들어, 서열번호 84) 및 래트 EF1-α 프로모터(서열번호 85), mEF1 프로모터(서열번호 59) 또는 1E1 프로모터 단편(서열번호 125) 중 임의의 것이 포함된다.
(ii) 인핸서
일부 구현예에서, GBA를 발현하는 ceDNA는 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 일부 구현예에서, 인핸서 서열은 프로모터 서열의 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 인핸서 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 예시적인 인핸서 및 이의 상응하는 서열번호는 하기 표 8에 열거되어 있다.
Figure pct00018
(iii) 5' UTR 서열 및 인트론 서열
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 5' UTR 서열 및/또는 5' ITR 서열의 3'에 위치한 인트론 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' UTR은 전이유전자, 예를 들어 GBA 단백질을 인코딩하는 서열의 5'에 위치한다. 예시적인 5' UTR 서열 및 이의 상응하는 서열번호는 표 9A에 열거되어 있다.
Figure pct00019
Figure pct00020
(iv) 3' UTR 서열
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 3' ITR 서열 5'에 위치한 3' UTR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' UTR은 전이유전자, 예를 들어 GBA 단백질을 인코딩하는 서열의 3'에 위치한다. 예시적인 3' UTR 서열 및 이의 상응하는 서열번호는 표 9B에 열거되어 있다.
Figure pct00021
(v). 폴리아데닐화 서열:
ceDNA 벡터로부터 발현되는 mRNA를 안정화시키고, 핵 방출 및 번역을 돕기 위해, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 서열을 포함시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개 또는 그 이상의 아데닌 또는 디뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 약 43개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 50개의 뉴클레오타이드, 약 40개 내지 55개의 뉴클레오타이드, 약 45개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 약 35개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 개시된 범위 사이의 임의의 범위의 뉴클레오타이드를 포함한다.
발현 카세트는 당업계에 공지된 임의의 폴리아데닐화 서열 또는 이의 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화(polyA) 서열은 표 10에 열거된 임의의 것들로부터 선택된다. 예를 들어, 비제한적으로, 소 BGHpA(예를 들어, 서열번호 68) 또는 바이러스 SV40pA(예를 들어, 서열번호 86)에서 단리된 자연 발생 서열, 또는 합성 서열(예를 들어, 서열번호 87)을 포함하는, 당업계에 일반적으로 공지된 다른 polyA 서열이 또한 사용될 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, USE 서열은 SV40pA 또는 이종 polyA 신호와 조합으로 사용될 수 있다. PolyA 서열은 GBA 단백질을 인코딩하는 전이유전자의 3'에 위치한다.
발현 카세트는 또한 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사 후 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우드척 간염바이러스(WHP: Woodchuck Hepatitis Virus) 전사 후 조절 요소(WPRE)(예를 들어, 서열번호 67)가 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용된다. 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)로부터의 전사 후 요소와 같은 다른 전사 후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비 서열은 전이유전자, 예를 들어 VH-02 및 VK-A26 서열, 예를 들어 서열번호 88 및 서열번호 89에 연결될 수 있다.
Figure pct00022
(vi). 핵 국소화 서열
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 NLS는 아미노 말단에 또는 그 근처에, 카르복시 말단에 또는 그 근처에, 또는 이들의 조합에 위치한다(예를 들어, 아미노 말단에 있는 하나 이상의 NLS 및/또는 카르복시 말단에 있는 하나 이상의 NLS). 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 서로 독립적으로, 단일 NLS가 하나 초과의 카피에 존재하고/하거나 하나 이상의 카피에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합으로 존재하도록 선택될 수 있다. NLS의 비제한적인 예는 표 11에 제시되어 있다.
Figure pct00023
B. ceDNA 벡터의 추가 구성요소
본 개시내용의 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유전자 발현을 위한 다른 구성요소를 인코딩하는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 특정 유전자 표적화 사건을 선택하기 위해, 보호 shRNA를 마이크로RNA에 포매시키고, 고도로 활성인 유전좌위, 예컨대 알부민 유전좌위에 부위 특이적으로 통합되도록 설계된 재조합 ceDNA 벡터에 삽입할 수 있다. 이러한 구현예는 문헌[Nygaard et al., A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo, Gene Therapy, June 8, 2016]에 기재된 바와 같이 임의의 유전적 배경에서 유전자 변형된 간세포의 생체내 선별 및 확장을 위한 시스템을 제공할 수 있다. 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 형질전환된 세포, 트랜스펙션된 세포, 형질도입된 세포 등의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 선별 마커를 함유할 수 있다. 선별 마커는 유전자의 산물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구성에 대한 원영양성, NeoR 등을 제공하는 유전자이다. 특정 구현예에서, 양성 선별 마커는 NeoR과 같은 공여체 서열에 혼입된다. 음성 선별 마커는 공여체 서열의 다운스트림에 혼입될 수 있으며, 예를 들어 음성 선별 마커를 인코딩하는 핵산 서열 HSV-tk는 공여체 서열의 다운스트림에 있는 핵산 구조체에 혼입될 수 있다.
C. 조절 스위치
분자 조절 스위치는 신호에 반응하여 측정 가능한 상태 변화를 생성하는 스위치이다. 이러한 조절 스위치는 ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질 발현의 출력을 제어하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터와 유용하게 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 GBA 단백질의 발현을 미세조정하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 이는 ceDNA 벡터의 생물학적 봉쇄(biocontainment) 기능으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 제어 가능하고 조절 가능한 방식으로 ceDNA 벡터에서 GBA 단백질의 발현을 개시 또는 중단(즉, 셧다운)하도록 설계된 "ON/OFF" 스위치이다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 스위치가 활성화되면 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포의 프로그래밍된 사멸을 거치도록 지시할 수 있는 "사멸 스위치"를 포함할 수 있다. GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 예시적인 조절 스위치는, 전이유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있으며, 이는 국제 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 보다 충분히 논의되어 있다.
(i) 이원 조절 스위치
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 GBA 단백질의 발현을 제어 가능하게 조절하는 역할을 할 수 있는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, ceDNA 벡터의 ITR 사이에 위치한 발현 카세트는 GBA 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 조절 영역, 예를 들어 프로모터, 시스-요소, 억제인자, 인핸서 등을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 조절 영역은 하나 이상의 보조인자 또는 외인성 작용제에 의해 조절된다. 단지 예로서, 조절 영역은 소분자 스위치, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 비제한적인 예는, 호르몬 유도성 또는 금속 유도성 프로모터이다. 다른 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소에는, 비제한적으로, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터가 포함된다.
(ii) 소분자 조절 스위치
다양한 업계 공지 소분자 기반 조절 스위치가 당업계에 공지되어 있으며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터와 조합되어 조절 스위치 제어된 ceDNA 벡터를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 문헌[Taylor, et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15]에 개시된 바와 같은 작동적으로 연결된 전이유전자의 발현을 제어하는 인공 프로모터와 함께인, 직교 리간드/핵 수용체 쌍, 예를 들어 레티노이드 수용체 변이체/LG335 및 GRQCIMFI; 조작된 스테로이드 수용체, 예를 들어 프로게스테론에 결합할 수 없지만 RU486(미페프리스톤(mifepristone))에 결합하는 C-말단 절단을 갖는 변형된 프로게스테론 수용체(미국 특허 제5,364,791호); 초파리의 엑디손 수용체 및 이의 엑디스테로이드 리간드(문헌[Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517]); 또는 문헌[Sando R 3rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8]에 개시된 바와 같은 항생제 트리메토프림(TMP: trimethoprim)에 의해 제어되는 스위치 중 어느 하나 또는 이들의 조합에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자를 제어하거나 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 조절 스위치는, 미국 특허 제8,771,679호 및 제6,339,070호에 개시된 것들과 같은 전구약물 활성화 스위치이다.
(iii) "패스코드" 조절 스위치
일부 구현예에서, 조절 스위치는 "패스코드 스위치" 또는 "패스코드 회로"일 수 있다. 패스코드 스위치는, 특정 조건이 발생하는 경우에 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자 발현 제어를 미세 조정하는 것을 가능하게 하며, 즉, 전이유전자 발현 및/또는 억제가 일어나기 위해서는 조건의 조합이 존재해야 한다. 예를 들어, 전이유전자의 발현이 일어나기 위해서는, 적어도 조건 A 및 B가 발생해야 한다. 패스코드 조절 스위치는, 전이유전자의 발현이 일어나기 위해 존재하는 임의의 수의 조건, 예를 들어 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 그 이상의 조건일 수 있다. 일부 구현예에서는, 적어도 2개의 조건(예를 들어, 조건 A, B)이 발생해야 하고, 일부 구현예에서는, 적어도 3개의 조건(예를 들어, A, B 및 C, 또는 A, B 및 D)이 발생해야 한다. 단지 예로서, 패스코드 "ABC" 조절 스위치를 갖는 ceDNA에서 유전자 발현이 일어나기 위해서는, 조건 A, B 및 C가 존재해야 한다. 조건 A, B 및 C는 다음과 같을 수 있다: 조건 A는 병태 또는 질환의 존재이고, 조건 B는 호르몬 반응이고, 조건 C는 전이유전자 발현에 대한 반응이다. 예를 들어, 전이유전자가 결함이 있는 EPO 유전자를 편집하는 경우, 조건 A는 만성신장질환(CKD)의 존재이고, 조건 B는 대상의 신장이 저산소 상태인 경우에 발생하고, 조건 C는 신장에서 에리트로포이에틴 생산 세포(EPC) 동원이 손상되거나; 또는 대안적으로, HIF-2 활성화가 손상되는 경우이다. 산소 수준이 증가하거나 목적하는 EPO 수준에 도달하는 경우, 전이유전자는 다시 3가지 조건이 발생할 때까지 꺼지고, 다시 켜지게 된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 포함된 패스코드 조절 스위치 또는 "패스코드 회로"는, 생물학적 봉쇄 조건을 정의하는 데 사용되는 환경 신호의 범위 및 복잡성을 확장시키기 위해 혼성체 전사인자(TF)를 포함한다. 선결된 조건의 존재 하에서 세포 사멸을 촉발시키는 데드맨 스위치와 반대로, "패스코드 회로"는 특정 "패스코드"의 존재 하에서 세포 생존 또는 전이유전자 발현을 가능하게 하며, 선결된 환경 조건 또는 패스코드가 존재하는 경우에만 전이유전자 발현 및/또는 세포 생존을 가능하게 하도록 용이하게 재프로그래밍될 수 있다.
본원에 개시된 조절 스위치의 임의의 및 모든 조합, 예를 들어 소분자 스위치, 핵산 기반 스위치, 소분자-핵산 혼성체 스위치, 전사 후 전이유전자 조절 스위치, 번역 후 조절, 방사선 제어 스위치, 저산소증 매개 스위치, 및 본원에 개시된 바와 같은 당업자에게 공지된 다른 조절 스위치가, 본원에 개시된 바와 같은 패스코드 조절 스위치에 사용될 수 있다. 사용을 위해 포함된 조절 스위치는 또한 리뷰 논문인 문헌[Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015)]에 논의되어 있고, Kis의 표 1에 요약되어 있다. 일부 구현예에서, 패스코드 시스템에 사용되는 조절 스위치는 국제 특허 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)의 표 11에 개시된 스위치 중 임의의 것 또는 스위치의 조합에서 선택될 수 있다.
(iv). 전이유전자 발현을 제어하는 핵산 기반 조절 스위치
일부 구현예에서, ceDNA에 의한 GBA 단백질의 발현을 제어하는 조절 스위치는 핵산 기반 제어 메커니즘을 기반으로 한다. 예시적인 핵산 제어 메커니즘은 당업계에 공지되어 있으며, 사용을 위해 고려된다. 예를 들어, 이러한 메커니즘은, 예를 들어 US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, 미국 특허 제9,222,093호 및 EP 출원 EP288071에 개시된 것들, 및 문헌[Villa JK et al., Microbiol Spectr. 2018 May;6(3)]에 개시된 것과 같은 리보스위치를 포함한다. WO2018/075486 및 WO2017/147585에 개시된 것들과 같은 대사산물 반응성 전사 바이오센서가 또한 포함된다. 사용을 위해 고려되는 다른 업계 공지 메커니즘에는, siRNA 또는 RNAi 분자(예를 들어, miR, shRNA)를 이용한 전이유전자의 침묵(silencing)이 포함된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 전이유전자의 일부에 상보적인 RNAi 분자를 인코딩하는 조절 스위치를 포함할 수 있다. 전이유전자(예를 들어, GBA 단백질)가 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 경우라도 이러한 RNAi가 발현되면, 상보적 RNAi 분자에 의해 침묵하게 되고, 전이유전자가 ceDNA 벡터에 의해 발현될 때 RNAi가 발현되지 않으면, 전이유전자(예를 들어, GBA 단백질)는 RNAi에 의해 침묵하게 되지 않는다.
일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2002/0022018에 개시된 바와 같은 조직 특이적 자가 불활성화 조절 스위치이며, 이에 의해 조절 스위치는 전이유전자 발현이 달리 불리할 수 있는 부위에서 전이유전자(예를 들어, GBA 단백질)를 의도적으로 차단한다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2014/0127162 및 미국 특허 제8,324,436호에 개시된 바와 같은 재조합효소 가역적 유전자 발현 시스템이다.
(v). 전사 후 및 번역 후 조절 스위치.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의한 GBA 단백질의 발현을 제어하는 조절 스위치는 전사 후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이러한 조절 스위치는 US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, EP 특허 제2707487호 및 문헌[Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534]; 문헌[Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858]에 개시된 바와 같은, 테트라시클린 또는 테로필린에 민감한 압타자임(aptazyme) 리보스위치일 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자는 리간드 민감성(OFF-스위치) 압타머를 함유하는 저해성 siRNA와 전이유전자를 모두 인코딩할 수 있으며, 최종 결과는 리간드 민감성 ON-스위치가 되는 것으로 예상된다.
(vi). 다른 예시적인 조절 스위치
환경 변화에 의해 촉발되는 것들을 포함하는 임의의 공지된 조절 스위치가, ceDNA 벡터에 의한 GBA 단백질의 발현을 제어하기 위해 ceDNA 벡터에 사용될 수 있다. 추가의 예에는, 비제한적으로, 문헌[Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018)]의 BOC 방법; 유전 코드 확장 및 비(非)생리학적 아미노산; 방사선 제어 또는 초음파 제어 온/오프 스위치(예를 들어, 문헌[Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul;7(13):1121-5]; 미국 특허 제5,612,318호; 제5,571,797호; 제5,770,581호; 제5,817,636호; 및 WO1999/025385A1 참조)가 포함된다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 미국 특허 제7,840,263호; US2007/0190028A1에 개시된 바와 같은 이식 가능한 시스템에 의해 제어되며, 여기서 유전자 발현은 ceDNA 벡터 내 전이유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 활성화시키는 전자기 에너지를 포함하는 하나 이상의 에너지 형태에 의해 제어된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 고려되는 조절 스위치는, 저산소증 매개 또는 스트레스 활성화 스위치, 예를 들어 WO1999060142A2, 미국 특허 제5,834,306호; 제6,218,179호; 제6,709,858호; US2015/0322410; 문헌[Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368]에 개시된 바와 같은 것들뿐 아니라, 예를 들어 미국 특허 제9,394,526호에 개시된 바와 같은, FROG, TOAD 및 NRSE 요소, 및 조건부 유도성 침묵 요소(저산소증 반응 요소(HRE), 염증 반응 요소(IRE) 및 전단 응력 활성화 요소(SSAE) 포함)이다. 이러한 구현예는, 허혈 후, 허혈 조직 및/또는 종양에서 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 발현을 조정하는 데 유용하다.
(vii). 사멸 스위치
본원에 기재된 다른 구현예는 사멸 스위치를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 사멸 스위치는, 대상의 시스템으로부터 도입된 ceDNA 벡터를 영구적으로 제거하는 수단으로서, ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시키거나 프로그래밍된 세포 사멸에 거치게 할 수 있다. 당업자는, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에서의 사멸 스위치의 사용이, 전형적으로 대상이 수용 가능하게 손실할 수 있는 제한된 수의 세포, 또는 세포자멸사가 바람직한 세포 유형(예를 들어, 암 세포)에 대한 ceDNA 벡터의 표적화와 결합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 모든 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 "사멸 스위치"는, 입력 생존 신호 또는 다른 명시된 조건의 부재 하에서 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 신속하고 강력한 세포 사멸을 제공하도록 설계된다. 달리 말하면, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 사멸 스위치는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 세포 생존을 특정한 입력 신호에 의해 정의된 환경으로 제한할 수 있다. 이러한 사멸 스위치는, 대상에서 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 제거하거나, 인코딩된 GBA 단백질을 발현하지 않도록 보장하는 것이 바람직한 경우에 생물학적 생물봉쇄 기능으로 작용한다.
당업자에게 공지된 다른 사멸 스위치, 예를 들어 US2010/0175141; US2013/0009799; US2011/0172826; US2013/0109568에 개시된 것뿐 아니라, 문헌[Jusiak et al, Reviews in Cell Biology and molecular Medicine; 2014; 1-56]; 문헌[Kobayashi et al., PNAS, 2004; 101; 8419-9]; 문헌[Marchisio et al., Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310-319]; 및 문헌[Reinshagen et al., Science Translational Medicine, 2018, 11]에 개시된 사멸 스위치가, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에의 사용을 위해 포함되며, 상기 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
따라서, 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 이펙터 독소 또는 리포터 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 사멸 스위치 핵산 구조체를 포함할 수 있으며, 여기서 이펙터 독소(예를 들어, 사멸 단백질) 또는 리포터 단백질의 발현은 선결된 조건에 의해 제어된다. 예를 들어, 선결된 조건은 환경 작용제, 예를 들어 외인성 작용제의 존재일 수 있으며, 그렇지 않으면 세포는 이펙터 독소(예를 들어, 사멸 단백질)의 발현이 기본 설정이 되어 사멸되게 된다. 대안적인 구현예에서, 선결된 조건은 2개 이상의 환경 작용제의 존재이며, 예를 들어 세포는 2개 이상의 필요한 외인성 작용제가 공급되는 경우에만 생존할 것이고, 둘 중 어느 하나가 없는 경우에, ceDNA를 포함하는 세포는 사멸된다.
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 전이유전자의 생체내 발현(예를 들어, GBA 단백질의 발현)을 효과적으로 종결시키는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 파괴하기 위해 사멸 스위치를 혼입하도록 변형된다. 구체적으로, ceDNA 벡터는 정상적인 생리학적 조건 하의 포유류 세포에서 기능성이 아닌 스위치-단백질을 발현하도록 추가로 유전자 조작된다. 이러한 스위치-단백질을 특이적으로 표적화하는 환경 조건 또는 약물의 투여 시에만, 스위치-단백질을 발현하는 세포가 파괴되어 치료용 단백질 또는 펩타이드의 발현이 종결될 것이다. 예를 들어, HSV-티미딘 키나아제를 발현하는 세포는 간시클로버(ganciclovir) 및 시토신 데아미나아제와 같은 약물의 투여 시 사멸될 수 있다고 보고되었다. 예를 들어 문헌[Dey and Evans, Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase (HSV-TK), in Targets in Gene Therapy, edited by You (2011)]; 및 문헌[Beltinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8699-8704 (1999)] 참조. 일부 구현예에서 ceDNA 벡터는 DISE(생존 유전자 제거로 인해 유도된 사멸(Death Induced by Survival gene Elimination))로 지칭되는 siRNA 사멸 스위치를 포함할 수 있다(문헌[Murmann et al., Oncotarget. 2017; 8:84643-84658, Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo]).
D. 예시적인 ceDNA-GBA 벡터
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA-GBA 벡터는 하기 표 12에 제시된 ceDNA-GBA 벡터에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터로서, 여기서 적어도 하나의 핵산 서열은 적어도 하나의 GBA 단백질을 인코딩하고, ceDNA 벡터는 표 12에 제시된 ceDNA-GBA 벡터에서 선택되는 ceDNA 벡터를 제공한다.
Figure pct00024
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 385를 포함하는 ceDNA-GBAv1이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 385와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 386을 포함하는 ceDNA-GBAv2이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 386과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 387을 포함하는 ceDNA-GBAv3이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 387과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 388을 포함하는 ceDNA-GBAv4이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 388과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 389를 포함하는 ceDNA-GBAv5이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 389와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 390을 포함하는 ceDNA-GBAv6이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 390과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 표 13에 제시된 프로모터/5'UTR, ORF 및 3'UTR/polyA 세트를 포함한다.
Figure pct00025
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 385와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 ceDNA-GBAv1이며, 여기서 ceDNA-GBAv1은 세르핀A TTRe_프로모터 세트를 포함하는 프로모터/5'UTR, hGBA베타_ORF_v1을 포함하는 ORF 및 WPRE_3'UTR│bGH를 포함하는 3' UTR/polyA를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 386과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 ceDNA-GBAv2이며, 여기서 ceDNA-GBAv1은 세르핀A TTRe_프로모터 세트를 포함하는 프로모터/5'UTR, hGBA_최적화된 COOL_CAImax를 포함하는 ORF 및 WPRE_3'UTR│bGH를 포함하는 3' UTR/polyA를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 387과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 ceDNA-GBAv3이며, 여기서 ceDNA-GBAv1은 세르핀A TTRe_프로모터 세트를 포함하는 프로모터/5'UTR, hGBA_최적화된 CpG 최소_COOL_v3을 포함하는 ORF 및 WPRE_3'UTR│bGH를 포함하는 3' UTR/polyA를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 388과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 ceDNA-GBAv4이며, 여기서 ceDNA-GBAv1은 세르핀A TTRe_프로모터 세트를 포함하는 프로모터/5'UTR, hGBA_최적화된 A1ATsp_Gsco를 포함하는 ORF 및 WPRE_3'UTR│bGH를 포함하는 3' UTR/polyA를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 389와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 ceDNA-GBAv5이며, 여기서 ceDNA-GBAv1은 세르핀A TTRe_프로모터 세트를 포함하는 프로모터/5'UTR, hGBA_최적화된 CHYsp_Gsco를 포함하는 ORF 및 WPRE_3'UTR│bGH를 포함하는 3' UTR/polyA를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 390과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 ceDNA-GBAv6이며, 여기서 ceDNA-GBAv1은 세르핀A TTRe_프로모터 세트를 포함하는 프로모터/5'UTR, hGBA_최적화된 Gsco를 포함하는 ORF 및 WPRE_3'UTR│bGH를 포함하는 3' UTR/polyA를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, GBA 단백질은 서열번호 385에 제시된 ORF 서열의 번역에 의해 생성된다. 일부 구현예에 따르면, ORF 서열은 서열번호 385의 핵산 잔기 581 내지 2191로 제시된다.
일부 구현예에 따르면, GBA 단백질은 서열번호 386에 제시된 ORF 서열의 번역에 의해 생성된다. 일부 구현예에 따르면, ORF 서열은 서열번호 386의 핵산 잔기 581 내지 2191로 제시된다.
일부 구현예에 따르면, GBA 단백질은 서열번호 387에 제시된 ORF 서열의 번역에 의해 생성된다. 일부 구현예에 따르면, ORF 서열은 서열번호 387의 핵산 잔기 581 내지 2191로 제시된다.
일부 구현예에 따르면, GBA 단백질은 서열번호 388에 제시된 ORF 서열의 번역에 의해 생성된다. 일부 구현예에 따르면, ORF 서열은 서열번호 388의 핵산 잔기 581 내지 2146으로 제시된다.
일부 구현예에 따르면, GBA 단백질은 서열번호 389에 제시된 ORF 서열의 번역에 의해 생성된다. 일부 구현예에 따르면, ORF 서열은 서열번호 389의 핵산 잔기 581 내지 2128로 제시된다.
일부 구현예에 따르면, GBA 단백질은 서열번호 390에 제시된 ORF 서열의 번역에 의해 생성된다. 일부 구현예에 따르면, ORF 서열은 서열번호 390의 핵산 잔기 581 내지 2191로 제시된다.
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 385를 포함하며, 여기서 하기 (nt…nt)로 지정된 서열번호 385의 핵산 위치에는 하기 구성요소가 존재한다:
1..141 = 좌측-ITR_v1
142..183 = 스페이서_좌측-ITR_v2.1
184..266 = HS-CRM8_SERP_인핸서
472..562 = MVM_인트론
563..570 = PmeI_부위
574..580 = Mod_최소_공통_Kozak
581..2191 = hGBA베타_ORF_v1
2195..2202 = PacI_부위
2203..2783 = WPRE_3pUTR
2784..3008 = bGH
3009..3069 = 스페이서_우측-ITR_v1
3070..3199 = 우측-ITR_v1
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 386을 포함하며, 여기서 하기 (nt…nt)로 지정된 서열번호 386의 핵산 위치에는 하기 구성요소가 존재한다:
1..141 = 좌측-ITR_v1
142..183= 스페이서_좌측-ITR_v2.1
184..266 = HS-CRM8_SERP_인핸서
472..562 = MVM_인트론
563..570 = PmeI_부위
574..580 = Mod_최소_공통_Kozak
581..2191 = hGBA_COOL_CAImax
2195..2202 = PacI_부위
2203..2783 = WPRE_3pUTR
2784..3008 = bGH
3009..3069 = 스페이서_우측-ITR_v1
3070..3199 = 우측-ITR_v1
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 387을 포함하며, 여기서 하기 (nt…nt)로 지정된 서열번호 387의 핵산 위치에는 하기 구성요소가 존재한다:
1..141= 좌측-ITR_v1
142..183 = 스페이서_좌측-ITR_v2.1
184..266 = HS-CRM8_SERP_인핸서
472..562 = MVM_인트론
563..570 = PmeI_부위
574..580 = Mod_최소_공통_Kozak
581..2191= hGBA_CpGmin_COOL_v3
2195..2202 = PacI_부위
2203..2783 = WPRE_3pUTR
2784..3008 = bGH
3009..3069 = 스페이서_우측-ITR_v1
3070..3199 = 우측-ITR_v1
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 388을 포함하며, 여기서 하기 (nt…nt)로 지정된 서열번호 388의 핵산 위치에는 하기 구성요소가 존재한다:
1..141 = 좌측-ITR_v1
142..183 = 스페이서_좌측-ITR_v2.1
184..266 = HS-CRM8_SERP_인핸서
472..562 = MVM_인트론
563..570 = PmeI_부위
574..580 = Mod_최소_공통_Kozak
581..2146 = hGBA_A1ATsp_GSco
2150..2157 = PacI_부위
2158..2738 = WPRE_3pUTR
2739..2963 = bGH
2964..3024 = 스페이서_우측-ITR_v1
3025..3154 = 우측-ITR_v1
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 389를 포함하며, 여기서 하기 (nt…nt)로 지정된 서열번호 389의 핵산 위치에는 하기 구성요소가 존재한다:
1..141 = 좌측-ITR_v1
142..183 = 스페이서_좌측-ITR_v2.1
184..266 = HS-CRM8_SERP_인핸서
472..562 = MVM_인트론
563..570 = PmeI_부위
574..580 = Mod_최소_공통_Kozak
581..2128 = hGBA_CHYsp_Gsco
2132..2139 = PacI_부위
2140..2720 = WPRE_3pUTR
2721..2945 = bGH
2946..3006 = 스페이서_우측-ITR_v1
3007..3136 = 우측-ITR_v1
일부 구현예에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 서열번호 390을 포함하며, 여기서 하기 (nt…nt)로 지정된 서열번호 390의 핵산 위치에는 하기 구성요소가 존재한다:
1..141 = 좌측-ITR_v1
142..183 = 스페이서_좌측-ITR_v2.1
184..266 = HS-CRM8_SERP_인핸서
472..562 = MVM_인트론
563..570 = PmeI_부위
574..580 = Mod_최소_공통_Kozak
581..2191 = hGBA_Gsco
2195..2202 = PacI_부위
2203..2783 = WPRE_3pUTR
2784..3008 = bGH
3009..3069 = 스페이서_우측-ITR_v1
3070..3199 = 우측-ITR_v1
VI. ceDNA 벡터의 상세한 생산 방법
A. 생산 전반
본원에 정의된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)의 섹션 IV에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 곤충 세포를 사용하여 생산될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 합성적으로, 일부 구현예에서 2019년 1월 18일자 출원된 국제 출원 PCT/US19/14122(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 개시된 바와 같은 무세포 방법으로 생산될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 하나의 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 하기 단계를 포함하는 공정에 따라 수득될 수 있다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스)을 보유하는 숙주 세포(예를 들어, 곤충 세포) 집단을, Rep 단백질의 존재 하에서, 숙주 세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 숙주 세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도하여, 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 생산한다. 하지만, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, AAV 또는 다른 바이러스 기반 벡터에 자연적으로 부과되는 것과 같은 크기 제한이 없다.
숙주 세포에서 단리된 ceDNA 벡터의 존재는, 숙주 세포에서 단리된 DNA를 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 소화된 DNA 물질을 미변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 문헌[Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879]에 기재된 바와 같이, 비바이러스성 DNA 벡터의 생산에서 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 주형(ceDNA 주형)을 이의 자체 게놈에 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주의 용도를 제공한다. 바람직하게는, Rep는 약 3의 MOI에서 숙주 세포에 첨가된다. 숙주 세포주가 포유류 세포주, 예를 들어 HEK293 세포인 경우, 상기 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스바이러스와 같은 제2 벡터를 사용하여 Rep 단백질을 세포에 도입하여, Rep 및 헬퍼 바이러스의 존재 하에서 ceDNA의 절제 및 증폭을 가능하게 할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 제조하는 데 사용되는 숙주 세포는 곤충 세포이고, 바큐로바이러스는 Rep 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 예를 들어 도 4a 내지 도 4c 및 실시예 1에 기재된 바와 같은 ceDNA에 대한 비바이러스성 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형을 전달하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 Rep 단백질을 발현하도록 조작된다.
이어서, 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리한다. 상기 세포에서 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존율, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 바큐로바이러스 감염 후 세포를 성장시키고 ceDNA 벡터를 생산하기에 충분한 시간 후에, 하지만 바큐로바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 수거한다. DNA 벡터는 Qiagen Endo-Free Plasmid 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 DNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
DNA 벡터는 DNA의 정제에 대해 당업자에게 공지된 임의의 수단을 통해 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로 정제된다.
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 존재는, 세포에서 단리된 벡터 DNA를 DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 소화 및 미소화된 DNA 물질을 겔 전기영동을 사용하여 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다. 도 4c 및 도 4d는, 본원의 공정에 의해 생산된 폐쇄 말단 ceDNA 벡터의 존재를 확인하는 하나의 구현예를 예시한다.
B. ceDNA 플라스미드
ceDNA-플라스미드는 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 추후 생산에 사용되는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 적어도 다음과 같은 요소를 전사 방향으로 작동적으로 연결된 구성요소로서 제공하기 위해 공지된 기술을 사용하여 구축될 수 있다: (1) 변형된 5' ITR 서열; (2) 시스-조절 요소, 예를 들어 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 인핸서 등을 함유하는 발현 카세트; 및 (3) 변형된 3' ITR 서열(여기서, 3' ITR 서열은 5' ITR 서열에 대칭임). 일부 구현예에서, ITR이 플랭킹된 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 발현 카세트는 AAV 게놈의 rep 및 cap 코딩 영역을 대체한다.
하나의 양태에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 "ceDNA-플라스미드"로 본원에 지칭되는 플라스미드로부터 수득되며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' ITR은 서로 대칭이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' 변형된 ITR은 동일한 변형을 갖는다(즉, 이들은 서로에 대해 역 보체 또는 대칭임).
추가의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 시스템에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 없음). 또한, 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 바람직한 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 AAV2에 대한 기능성 AAV cap 및 AAV rep 유전자 GG-3′, 및 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열이 없다.
본 개시내용의 ceDNA-플라스미드는 당업계에 널리 공지된 임의의 AAV 혈청형의 게놈의 천연 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈에서 유도된다. 예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses(Springer가 유지 관리하는 URL에서 이용 가능함)(www 웹 주소: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(참고: URL 또는 데이터베이스에 대한 참조는 현재 본 출원의 유효 출원일자의 URL 또는 데이터베이스의 내용을 나타냄). 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV2 게놈에서 유도된다. 또 다른 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 이러한 AAV 게놈 중 하나에서 유도된 5' 및 3' ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 백본이다.
ceDNA-플라스미드는 선택적으로 ceDNA 벡터 생산 세포주의 확립에 사용하기 위한 선별 가능한 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 선별 마커는 3' ITR 서열의 다운스트림(즉, 3')에 삽입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선별 마커는 5' ITR 서열의 업스트림(즉, 5')에 삽입될 수 있다. 적절한 선별 마커에는, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선별 마커, 예를 들어 블라스티시딘(blasticidin) S 내성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 제네티신(geneticin) 등일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약물 선별 마커는 블라스티시딘 S 내성 유전자이다.
GBA 단백질의 발현을 위한 예시적인 ceDNA(예를 들어, rAAV0) 벡터는 rAAV 플라스미드에서 생산된다. rAAV 벡터의 생산 방법은 (a) 상기 기재된 바와 같은 rAAV 플라스미드를 갖는 숙주 세포를 제공하는 단계로서, 여기서 숙주 세포와 플라스미드에는 모두 캡시드 단백질 인코딩 유전자가 없는 단계, (b) ceDNA 게놈의 생성을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (c) 세포를 수거하고 상기 세포로부터 생산된 AAV 게놈을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
C. ceDNA 플라스미드로부터 ceDNA 벡터를 제조하는 예시적인 방법
GBA 단백질의 발현을 위한 캡시드 미함유 ceDNA 벡터를 제조하는 방법, 특히 생체내 실험에 충분한 벡터를 충분히 고수율로 제공하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산 방법은 (1) 발현 카세트와 2개의 대칭인 ITR 서열을 포함하는 핵산 구조체를 숙주 세포(예를 들어, Sf9 세포)에 도입하는 단계, (2) 선택적으로, 예를 들어 플라스미드 상에 존재하는 선별 마커를 사용하여 클론 세포주를 확립하는 단계, (3) Rep 코딩 유전자를 (상기 유전자를 운반하는 바큐로바이러스로 트랜스펙션 또는 감염시켜) 상기 곤충 세포에 도입하는 단계, 및 (4) 세포를 수거하고 ceDNA 벡터를 정제하는 단계를 포함한다. ceDNA 벡터의 생산을 위한, 상기 기재된 발현 카세트와 2개의 ITR 서열을 포함하는 핵산 구조체는, ceDNA 플라스미드, 또는 하기 기재되는 바와 같이 ceDNA 플라스미드를 이용하여 생성된 박미드 또는 바큐로바이러스의 형태일 수 있다. 핵산 구조체는 트랜스펙션, 바이러스 형질도입, 안정적인 통합 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
D. 세포주
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산에 사용되는 숙주 세포주는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(예컨대, Sf9, Sf21) 또는 트리코플루시아 니 세포에서 유도된 곤충 세포주, 또는 다른 무척추동물, 척추동물 또는 다른 진핵생물 세포주(포유류 세포 포함)를 포함할 수 있다. HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, 단핵구 및 성숙 및 미성숙 수지상세포와 같은 당업자에게 공지된 다른 세포주가 또한 사용될 수 있다. 숙주 세포주는 고수율 ceDNA 벡터 생산을 위한 ceDNA-플라스미드의 안정적인 발현을 위해 트랜스펙션될 수 있다.
ceDNA-플라스미드는 당업계에 공지된 시약(예를 들어, 리포좀, 인산칼슘) 또는 물리적 수단(예를 들어, 전기천공)을 사용하여 일시적 트랜스펙션에 의해 Sf9 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, ceDNA-플라스미드를 게놈에 안정적으로 통합시킨 안정한 Sf9 세포주가 확립될 수 있다. 이러한 안정적인 세포주는 선별 마커를 상기 기재된 바와 같은 ceDNA 플라스미드에 혼입시키는 방식으로 확립될 수 있다. 세포주를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 ceDNA 플라스미드가 항생제와 같은 선별 마커를 포함하는 경우, ceDNA-플라스미드로 트랜스펙션시키고 ceDNA-플라스미드 DNA를 게놈에 통합시킨 세포는 세포 성장 배지에 항생제를 첨가하여 선별할 수 있다. 이어서, 세포의 내성 클론을 단일 세포 희석 또는 집락 전달 기술로 단리하고, 증식시킬 수 있다.
E. ceDNA 벡터의 단리 및 정제
ceDNA 벡터를 수득하고 단리하는 공정의 예는, 도 4a 내지 도 4e, 및 하기 특정예에 기재되어 있다. 본원에 개시된 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바큐로바이러스로 추가로 형질전환된, AAV Rep 단백질(들)을 발현하는 생산 세포로부터 수득될 수 있다. ceDNA 벡터의 생산에 유용한 플라스미드에는, GBA 단백질을 인코딩하는 플라스미드, 또는 하나 이상의 REP 단백질을 인코딩하는 플라스미드가 포함된다.
하나의 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드(Rep-플라스미드), 박미드(Rep-박미드) 또는 바큐로바이러스(Rep-바큐로바이러스)에서 생산 세포에 전달된 AAV Rep 단백질(Rep 78 또는 Rep 68)을 인코딩한다. Rep-플라스미드, Rep-박미드 및 Rep-바큐로바이러스는 상기 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다.
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산 방법은 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 발현 구조체는 플라스미드(예를 들어, ceDNA-플라스미드), 박미드(예를 들어, ceDNA-박미드) 및/또는 바큐로바이러스(예를 들어, ceDNA-바큐로바이러스)일 수 있다. 단지 예시로서, ceDNA-벡터는 ceDNA-바큐로바이러스 및 Rep-바큐로바이러스로 동시 감염된 세포에서 생성될 수 있다. Rep-바큐로바이러스에서 생성된 Rep 단백질은 ceDNA-바큐로바이러스를 복제하여 ceDNA-벡터를 생성할 수 있다. 대안적으로, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 Rep-플라스미드, Rep-박미드 또는 Rep-바큐로바이러스에 전달된 AAV Rep 단백질(Rep78/52)을 인코딩하는 서열을 포함하는 구조체로 안정적으로 트랜스펙션된 세포에서 생성될 수 있다. ceDNA-바큐로바이러스를 세포에 일시적으로 트랜스펙션시키고, Rep 단백질을 통해 복제하여, ceDNA 벡터를 생산할 수 있다.
박미드(예를 들어, ceDNA-박미드)를 Sf9, Sf21, Tni(트리코플루시아 니) 세포, High Five 세포와 같은 허용 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 대칭인 ITR과 발현 카세트를 포함하는 서열을 포함하는 재조합 바큐로바이러스인 ceDNA-바큐로바이러스를 생성할 수 있다. ceDNA-바큐로바이러스를 다시 곤충 세포에 감염시켜, 차세대 재조합 바큐로바이러스를 수득할 수 있다. 선택적으로, 상기 단계를 1회 또는 다회 반복하여 재조합 바큐로바이러스를 보다 많은 양으로 생산할 수 있다.
상기 세포에서 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존율, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 통상적으로, 세포는 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터)를 생산하기 위한 바큐로바이러스 감염 후 충분한 시간 후에, 하지만 바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 수거될 수 있다. ceDNA-벡터는 Qiagen ENDO-FREE PLASMID® 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 Sf9 세포에서 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 ceDNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 업계 공지 핵산 정제 방법뿐 아니라, 상업적으로 입수 가능한 DNA 추출 키트가 채택될 수 있다.
대안적으로, 정제는 세포 펠릿을 알칼리성 용해 과정에 적용하고, 생성된 용해물을 원심분리하고, 크로마토그래피 분리를 수행하는 방식으로 구현될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 상기 공정은 핵산을 보유하는 이온 교환 컬럼(예를 들어, SARTOBIND Q®) 상에 상청액을 로딩한 후, 용리(예를 들어, 1.2 M NaCl 용액을 이용하여)하고, 겔 여과 컬럼(예를 들어, 6 fast flow GE) 상에서 추가로 크로마토그래피 정제를 수행하는 방식으로 수행될 수 있다. 이어서, 캡시드 미함유 AAV 벡터를, 예를 들어 침전으로 회수한다.
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한 엑소좀 또는 미세입자 형태로 정제될 수 있다. 다수의 세포 유형이 가용성 단백질뿐 아니라, 복합 단백질/핵산 카고를 막 미세소포 배출을 통해 방출하는 것으로 공지되어 있다(Cocucci 등 (2009); EP 10306226.1). 이러한 소포에는 미세소포(미세입자로도 지칭됨) 및 엑소좀(나노소포로도 지칭됨)이 포함되며, 이 둘 모두 카고로서 단백질과 RNA를 포함한다. 미세소포는 원형질막의 직접 버딩(budding)으로부터 생성되고, 엑소좀은 다소포성 엔도좀과 원형질막의 융합 시 세포외 환경으로 방출된다. 따라서, ceDNA 벡터 함유 미세소포 및/또는 엑소좀은 ceDNA-플라스미드, 또는 ceDNA-플라스미드를 이용하여 생성된 박미드 또는 바큐로바이러스로 형질도입된 세포에서 단리될 수 있다.
배양 배지를 여과 또는 20,000 x g에서의 초원심분리에 적용하여 미세소포를 단리하고, 100,000 x g에서의 초원심분리하여 엑소좀을 단리할 수 있다. 초원심분리의 최적 기간은 실험적으로 결정될 수 있고, 소포가 단리되는 특정 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지를 먼저 저속 원심분리(예를 들어, 2000 x g에서 5분 내지 20분 동안)로 정제하고, 예를 들어 AMICON® 스핀 컬럼(Millipore, Watford, UK)을 사용하여 스핀 농축에 적용한다. 미세소포와 엑소좀은 미세소포와 엑소좀 상에 존재하는 특정 표면 항원을 인식하는 특정 항체를 사용하여 FACS 또는 MACS를 통해 추가로 정제될 수 있다. 다른 미세소포 및 엑소좀 정제 방법에는, 비제한적으로, 면역침강, 친화성 크로마토그래피, 여과, 및 특정 항체 또는 압타머가 코팅된 자성 비드가 포함된다. 정제 시, 소포를, 예를 들어 인산염 완충 염수로 세척한다. ceDNA 함유 소포를 전달하는 데 미세소포 또는 엑소좀을 사용하는 하나의 이점은, 이러한 소포가 각각의 세포 유형에 대한 특정 수용체에 의해 인식되는 막 단백질을 포함하기 때문에 다양한 세포 유형에 대해 표적화될 수 있다는 점이다. (또한 EP 10306226 참조)
본원의 개시내용의 또 다른 양태는, ceDNA 구조체가 그 자체의 게놈에 안정적으로 통합된 숙주 세포주로부터 ceDNA 벡터를 정제하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로 정제된다.
국제 출원 PCT/US18/49996의 도 5는, 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 ceDNA-플라스미드 구조체로부터 ceDNA의 생산을 확인시켜 주는 겔을 보여준다. ceDNA는, 실시예에서 도 4d에 대해 논의된 바와 같이, 겔에서의 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
VII. 약학적 조성물
또 다른 양태에서, 약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터와, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대상의 세포, 조직 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상에게의 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약학적 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 치료용 투여(예를 들어, 비경구 투여)의 목적하는 경로에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다. 치료 목적의 약학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시켜 제조할 수 있고, 이어서 ceDNA 벡터를 포함하는 여과 멸균된 것을 제형화하여 핵산의 전이유전자를 수용자의 세포에 전달함으로써, 그 안의 전이유전자 또는 공여체 서열의 치료적 발현을 유도할 수 있다. 상기 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 약학적 활성 조성물은 다양한 목적을 위한 전이유전자를 세포, 예를 들어 대상의 세포에 전달하도록 제형화될 수 있다.
치료 목적을 위한 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 국소, 전신, 양막내, 경막내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내(예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 경막내, 방광내, 결막(예를 들어, 안와외, 안와내, 안와후방, 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막하, 간질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내 및 점막(예를 들어, 구강, 설하, 비강) 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다.
일부 양태에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 하나 이상의 ceDNA 벡터를 숙주 세포에 전달하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포로부터 생산되거나 이러한 세포를 포함하는 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 진균)가 본원에 제공된다. 핵산의 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주사, 유전자총, 리포좀, 면역리포좀(immunoliposome), 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 및 DNA의 작용제 증강된 흡수를 포함할 수 있다. 리포펙션은, 예를 들어 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호 및 제4,897,355호에 기재되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있다(예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 전달은 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직(예를 들어, 생체내 투여)으로 이루어질 수 있다.
핵산을 세포에 전달하는 다양한 기술 및 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA와 같은 핵산은 지질 나노입자(LNP), 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 리포플렉스 또는 코어-쉘 나노입자로 제형화될 수 있다. 전형적으로, LNP는 핵산(예를 들어, ceDNA) 분자, 하나 이상의 이온화 가능하거나 양이온성인 지질(또는 이의 염), 하나 이상의 비이온성 또는 중성 지질(예를 들어, 인지질), 응집을 방지하는 분자(예를 들어, PEG 또는 PEG-지질 접합체), 및 선택적으로 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)로 구성된다.
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA와 같은 핵산을 세포에 전달하는 또 다른 방법은, 핵산을 세포에 의해 내재화된 리간드와 접합시키는 것이다. 예를 들어, 리간드는 세포 표면 상의 수용체에 결합하여 세포내이입을 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산의 뉴클레오타이드에 공유결합으로 연결될 수 있다. 핵산을 세포에 전달하기 위한 예시적인 접합체는, 예를 들어 WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 및 WO2017/177326에 기재되어 있다.
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터와 같은 핵산은 또한 트랜스펙션에 의해 세포에 전달될 수 있다. 유용한 트랜스펙션 방법에는, 비제한적으로, 지질 매개 트랜스펙션, 양이온성 중합체 매개 트랜스펙션 또는 인산칼슘 침전이 포함된다. 트랜스펙션 시약은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이에는, 비제한적으로, TurboFect 트랜스펙션 시약(Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject 시약(Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P 단백질 트랜스펙션 시약(New England Biolabs), CHARIOT™ 단백질 전달 시약(Active Motif), PROTEOJUICE™ 단백질 트랜스펙션 시약(EMD Millipore), 293fectin, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™(Roche, Basel, Switzerland), FUGENE™ HD(Roche), TRANSFECTAM™(Transfectam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™(Promega), TFX-20™(Promega), TFX-50™(Promega), TRANSFECTIN™(BioRad, Hercules, Calif.), SILENTFECT™(Bio-Rad), Effectene™(Qiagen, Valencia, Calif.), DC-chol(Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™(Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.), DHARMAFECT 1™(Dharmacon, Lafayette, Colo.), DHARMAFECT 2™(Dharmacon), DHARMAFECT 3™(Dharmacon), DHARMAFECT 4™(Dharmacon), ESCORT™ III(Sigma, St. Louis, Mo.) 및 ESCORT™ IV(Sigma Chemical Co.)가 포함된다. ceDNA와 같은 핵산은, 또한 당업자에게 공지된 미세유체 방법을 통해 세포에 전달될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 투여는, 비제한적으로, 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉에 도입하는 데 통상적으로 사용되는 경로 중 임의의 것에 의해 이루어져 있다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에 널리 공지되어 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
핵산 벡터의 도입 방법에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 미국 특허 제5,928,638호에 기재된 방법에 따라 조혈줄기세포에 전달될 수 있다.
본 개시내용에 따른 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대상의 세포 또는 표적 기관으로의 전달을 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다. 예시적인 리포좀 및 리포좀 제형(비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관능기 함유 화합물을 포함함)은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일자 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242(예를 들어, "약학적 제형"이라는 제목의 섹션 참조)에 개시되어 있다.
당업계에 공지된 다양한 전달 방법 또는 이의 변형을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 표적화된 세포로의 DNA 유입이 용이하도록 기계적, 전기적, 초음파, 유체역학적 또는 레이저 기반 에너지에 의해 세포막에 일시적으로 침투하는 방식으로 전달된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 세포막을 일시적으로 파괴하거나, 크기 제한 채널을 통해 세포를 밀어넣거나, 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 전달될 수 있다. 일부 경우에, ceDNA 벡터만 네이키드 DNA로서 간, 신장, 담낭, 전립선, 부신, 심장, 장, 폐 및 위, 피부, 흉선, 심장근 또는 골격근에서 선택되는 임의의 하나 이상의 조직에 직접 주사된다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 유전자 총에 의해 전달된다. 캡시드 미함유 AAV 벡터로 코팅된 금 또는 텅스텐 구형 입자(직경 1 μm 내지 3 μm)는 가압 가스에 의해 고속으로 가속화되어 표적 조직 세포에 침투할 수 있다.
GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 구체적으로 본원에서 고려된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 지질 전달 시스템, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 리포좀을 이용하여 제형화된다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 숙련된 의사에 의해 임의의 목적하는 경로로 투여된다. 상기 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입, 협측 투여, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 경막내 및 관절내, 또는 이들의 조합을 포함하는 상이한 경로로 대상에게 투여될 수 있다. 수의학적 사용을 위해, 상기 조성물은 통상의 수의학적 관행에 따라 적합하게 허용 가능한 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적절한 투여 방식 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 상기 조성물은 전형적인 시린지, 무바늘 주사 장치, "미세사출법(microprojectile bombardment) 유전자 총", 또는 전기천공("EP"), 유체역학적 방법 또는 초음파와 같은 다른 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다.
일부 경우에, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유체역학적 주사에 의해 전달되는데, 이는 임의의 수용성 화합물 및 입자를 사지 전체의 내부 기관 및 골격근에 직접 세포내 전달하기 위한 간단하고 매우 효율적인 방법이다.
일부 경우에, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 DNA 입자의 내부 기관 또는 종양 세포로의 세포내 전달을 용이하게 하기 위해 막 내에 나노범위 공극을 만들어 초음파를 통해 전달되므로, 플라스미드 DNA의 크기 및 농도는 상기 시스템의 효율에 큰 역할을 한다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 핵산을 함유하는 입자를 표적세포 내로 농축시키기 위해 자기장을 사용하는 자기주입법(magnetofection)을 통해 전달된다.
일부 경우에, 양이온성 리포좀/미셀 또는 양이온성 중합체에 속하는 다가양이온성 나노머 입자에 의한 음으로 하전된 핵산의 압축을 포함하는, 예를 들어 나노머 복합체를 사용하는 화학적 전달 시스템이 사용될 수 있다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질에는, 비제한적으로, 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아닌 함유 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체(예를 들어, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-리신, 프로타민, 다른 양이온성 중합체) 및 지질-중합체 혼성체가 포함된다.
A. 엑소좀
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 엑소좀에 패키징되는 방식으로 전달된다. 엑소좀은 다소포체와 원형질막의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 세포내이입 기원의 작은 막 소포이다. 이의 표면은 공여체 세포의 세포막 유래의 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 엑소좀을 생산한 세포의 세포질을 함유하고, 표면에 모세포(parental cell)의 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 내피세포, B 및 T 림프구, 비만세포(MC)뿐 아니라, 수지상세포(DC)를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 직경이 10 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 30 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 100 nm인 엑소좀이 사용을 위해 고려된다. 엑소좀은 이의 공여체 세포를 사용하거나 특정 핵산을 도입하는 방식으로 표적세포로의 전달을 위해 단리될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 접근법을 사용하여 본 개시내용의 캡시드 미함유 AAV 벡터를 함유하는 엑소좀을 생성할 수 있다.
B. 미세입자/나노입자
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 지질 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 지질 나노입자는, 예를 들어 문헌[Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507]에 개시된 바와 같은, 이온화 가능한 아미노 지질(예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질(폴리에틸렌 글리콜-디미리스톨글리세롤, PEG-DMG)을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 1000 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 300 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 300 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 200 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 25 nm 내지 약 200 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제제(예를 들어, 다수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는, 평균 크기(예를 들어, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 전형적으로 평균 크기가 약 100 nm 이하인 크기 분포를 갖는다.
당업계에 공지된 다양한 지질 나노입자를 사용하여 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자를 사용하는 다양한 전달 방법은 미국 특허 제9,404,127호, 제9,006,417호 및 제9,518,272호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 금 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 핵산은, 예를 들어 문헌[Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083]에 기재된 바와 같이, 금 나노입자에 공유결합으로 결합되거나, 금 나노입자에 비공유결합으로 결합될 수 있다(예를 들어, 전하-전하 상호작용에 의해 결합됨). 일부 구현예에서, 금 나노입자-핵산 접합체는, 예를 들어 미국 특허 제6,812,334호에 기재된 방법을 사용하여 생성된다.
C. 접합체
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 세포 흡수를 증가시키는 작용제에 접합된다(예를 들어, 공유결합으로 결합됨). "세포 흡수를 증가시키는 작용제"는 지질 막을 통한 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친유성 화합물(예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 침투 펩타이드(CPP)(예를 들어, 페네트라틴(penetratin), TAT, Syn1B, 등) 및 폴리아민(예를 들어, 스페르민(spermine))에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 작용제의 추가 예는, 예를 들어 문헌[Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 중합체(예를 들어, 중합체 분자) 또는 폴레이트 분자(예를 들어, 엽산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 중합체에 접합된 핵산의 전달은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 미국 특허 제8,987,377호에 기재된 바와 같이 폴리(아미드) 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 핵산은 미국 특허 제8,507,455호에 기재된 바와 같이 엽산 분자에 접합된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 미국 특허 제8,450,467호 기재된 바와 같이 탄수화물에 접합된다.
D. 나노캡슐
대안적으로, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현 가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 회피하기 위해, 이러한 초미세 입자(크기 약 0.1 μm)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 고려된다.
E. 리포좀
본 개시내용에 따른 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대상의 세포 또는 표적 기관으로의 전달을 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.
리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 리포좀은 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖도록 개발되었다(미국 특허 제5,741,516호). 나아가, 잠재적인 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다(미국 특허 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호).
F. 예시적인 리포좀 및 지질 나노입자(LNP) 조성물
본 개시내용에 따른 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 세포, 예를 들어 전이유전자의 발현을 필요로 하는 세포로의 전달을 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.
ceDNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 2018년 9월 7일자 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일자 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242(이들은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 개시되어 있으며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 위한 방법 및 조성물에의 사용을 위해 고려된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 면역원성/항원성을 감소시키고, 화합물(들)에 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관능기(소위 "PEG화 화합물")를 갖는 하나 이상의 화합물을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 또는, 리포좀 제형은 단순히 추가 구성요소로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함한다. 이러한 양태에서, PEG 또는 PEG 관능기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 연장 방출 또는 제어 방출 프로파일로 API를 전달하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 관련 양태에서, 리포좀 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련 양태에서, 리포좀 제형은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 API를 방출하는 승온에서 물리적 전이를 거치는 구성요소로 API를 캡슐화한다.
일부 양태에서, 리포좀 제형은 스핑고미엘린과, 본원에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 옵티좀을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질, HSPC(수소첨가된 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(달걀 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(디에루코일포스파티딜콜린); DOPE(디올레오일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), 콜레스테릴 설페이트(CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), DOPC(디올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 56:38:5의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형의 전체 지질 함량은 2 mg/mL 내지 16 mg/mL이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을, 각각, 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질과 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, PEG화 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 접합체 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질과 에탄올아민 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질, 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤 중 하나 이상을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 DOPC/ DEPC; 및 DOPE를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약학적 부형제, 예를 들어 수크로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 통상의 나노입자에 비해 크기가 크고, 크기가 약 150 nm 내지 250 nm인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 외부에 단리된 ceDNA를 갖는 혼합물에 약염기를 첨가하여, 본원에 개시 또는 기재된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩되는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포좀 외부의 pH를 대략 7.3으로 증가시키고, API를 리포좀으로 유도한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 내부에서 산성인 pH를 갖는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 리포좀의 내부는 pH 4 내지 6.9, 더욱 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 리포좀내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 중합체성 또는 비중합체성의 고도로 하전된 음이온과, 리포좀내 포획제, 예를 들어 폴리포스페이트 또는 수크로오스 옥타설페이트가 이용된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 ceDNA와 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 PCT/US2018/050042(이는 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA로 제조되고 로딩되는 지질 나노입자 제형. 이는, 이온화 가능한 지질을 양성자화하고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵형성에 유용한 에너지를 제공하는, 낮은 pH에서의 에탄올성 지질과 수성 ceDNA의 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 수준으로 농축될 수 있다.
일반적으로, 지질 입자는 약 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA의 (질량 또는 중량)비로 제조된다. 일부 구현예에서, 지질 대 ceDNA 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질과 ceDNA의 양은 목적하는 N/P 비, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL 범위일 수 있다.
이온화 가능한 지질은 전형적으로 낮은 pH에서 핵산 카고, 예를 들어 ceDNA를 응축시키고, 막 회합과 융합원성(fusogenicity)을 유도하는 데 이용된다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질은 산성 조건 하에서, 예를 들어 6.5 이하의 pH에서 양으로 하전되거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 이온화 가능한 지질은 또한 본원에서 양이온성 지질로 지칭된다.
예시적인 이온화 가능한 지질은 국제 PCT 특허 출원 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 및 WO2013/086354, 및 미국 특허 공보 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 및 US2013/0195920에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
Figure pct00026
.
지질 DLin-MC3-DMA는 문헌[Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 WO2015/074085에 기재된 바와 같은 지질 ATX-002이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 WO2012/040184에 기재된 바와 같은 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 WO2015/199952에 기재된 바와 같은 화합물 6 또는 화합물 22이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
비제한적으로, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20% 내지 90%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 이온화 가능한 지질 몰 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20% 내지 70%(몰), 30% 내지 60%(몰) 또는 40% 내지 50%(몰)일 수 있다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol% 내지 약 90 mol%를 차지한다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 비양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비이온성 지질에는, 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질이 포함된다. 따라서, 비양이온성 지질은 중성의 하전되지 않은 지질, 쯔비터이온성(zwitterionic) 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 전형적으로 융합원성을 증강시키는 데 이용된다.
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 비양이온성 지질은 2018년 9월 7일자 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 예시적인 비양이온성 지질은 국제 출원 공보 WO2017/099823 및 미국 특허 공보 US2018/0028664에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
비양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 30%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 비양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5% 내지 20%(몰) 또는 10% 내지 15%(몰)이다. 다양한 구현예에서, 이온화 가능한 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 임의의 인지질을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 지질 나노입자는 막 온전성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.
지질 나노입자에 사용될 수 있는 하나의 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체이다. 예시적인 콜레스테롤 유도체는 국제 출원 WO2009/127060 및 미국 특허 공보 US2010/0130588에 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
스테롤과 같은 막 온전성을 제공하는 구성요소는, 지질 나노입자에 존재하는 지질의 0 내지 50%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20% 내지 50%(몰) 또는 30% 내지 40%(몰)이다.
일부 양태에서, 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 접합된 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 저해하고/하거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 접합된 지질에는, 비제한적으로, PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 접합된 지질 분자는 PEG-지질 접합체, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질이다. 예시적인 PEG-지질 접합체에는, 비제한적으로, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), peg화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는, 예를 들어 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 및 US2017/0119904에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 US2018/0028664에 정의된 바와 같은 화합물이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 US20150376115 또는US2016/0376224에 개시되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
PEG-DAA 접합체는, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 일부 예에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000],
PEG 이외의 분자와 접합된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체) 및 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체가 PEG-지질 대신 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 예시적인 접합된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA-지질 접합체 및 양이온성 중합체-지질은, 국제 특허 출원 공보 WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 및 WO2010/006282; 미국 특허 출원 공보 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 및 US20110123453; 및 US 특허 US5,885,613, US6,287,591, US6,320,017 및 US6,586,559에 기재되어 있으며, 상기 모든 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 다시 말해서, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 다시 말해서, 치료제는 치료 목적 및 목적하는 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, LNP 내 ceDNA가 고셰병 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항-고셰병 작용제(예를 들어, 화학요법제 또는 다른 고셰병 치료제(비제한적으로, 소분자 또는 항체를 포함함)일 수 있다. 또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 감염의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항미생물제(예를 들어, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다. 또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 면역 반응을 조절하는 화합물(예를 들어, 면역억제제, 면역자극 화합물 또는 하나 이상의 특정 면역 경로를 조절하는 화합물)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 단백질 또는 상이한 화합물, 예컨대 치료제를 인코딩하는 ceDNA와 같은 상이한 화합물을 함유하는 상이한 지질 나노입자의 상이한 칵테일이, 본 개시내용의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 화합물은 면역조절제이다. 예를 들어, 추가 화합물은 면역억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 화합물은 면역자극제이다. 또한, 지질 나노입자 캡슐화된 곤충 세포에서 생산된 또는 합성적으로 생산된 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터와, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제형은 수크로오스, 트리스, 트레할로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.
ceDNA 벡터는 입자의 지질 부분과 복합체화되거나, 지질 나노입자의 지질 위치에서 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA는 지질 나노입자의 지질 위치에서 완전히 캡슐화되어, 예를 들어 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 내 ceDNA는 지질 나노입자를 37℃에서 적어도 약 20분, 30분, 45분 또는 60분 동안 뉴클레아제에 노출시킨 후 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 내 ceDNA는 상기 입자를 혈청에서 37℃에서 적어도 약 30분, 45분 또는 60분, 또는 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간 또는 36시간 동안 인큐베이션한 후 실질적으로 분해되지 않는다.
특정 구현예에서, 지질 나노입자는 대상, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 실질적으로 비독성이다. 일부 양태에서, 지질 나노입자 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 고체 코어 입자이다. 다른 구현예에서, 지질 나노입자는 비(非)이중층 구조, 즉, 비(非)라멜라(즉, 비이중층) 형태를 갖는다. 비제한적으로, 비이중층 형태는, 예를 들어 3차원 튜브, 막대, 입방 대칭 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자의 형태(라멜라 대 비라멜라)는, 예를 들어 US2010/0130588에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 용이하게 평가 및 특징분석될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 추가의 구현예에서, 비라멜라 형태를 갖는 지질 나노입자는 전자 밀도가 높다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 지질 나노입자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
지질 구성요소의 조성 및 농도를 제어하는 방식으로, 지질 접합체가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 결국, 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어 pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여, 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어할 수 있다. 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법이, 본 개시내용을 기반으로 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어하여 지질 입자 크기를 제어할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정될 수 있다.
VIII. 사용 방법
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, GBA 단백질을 인코딩함)을 표적세포(예를 들어, 숙주 세포)로 전달하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 GBA 단백질을 이를 필요로 하는 대상의 세포에 전달하여 고셰병을 치료하는 방법일 수 있다. 본 개시내용은 GBA 단백질 발현의 치료 효과가 발생하도록, 대상의 세포에서 ceDNA 벡터에 인코딩된 GBA 단백질의 생체내 발현을 가능하게 한다. 이러한 결과는 ceDNA 벡터 전달의 생체내 및 시험관내 모델 모두에서 확인되었다.
또한, 본 개시내용은 GBA 단백질을 이를 필요로 하는 대상의 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 GBA 단백질을 인코딩하는 본 개시내용의 ceDNA 벡터의 다회 투여를 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 캡시드화된 바이러스 벡터에 대해 통상적으로 관찰되는 바와 같은 면역 반응을 유도하지 않기 때문에, 이러한 다회 투여 전략은 ceDNA 기반 시스템에서 큰 성공을 거둘 가능성이 높다. ceDNA 벡터는 목적하는 조직의 세포를 트랜스펙션시키고, 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 GBA 단백질의 발현을 제공하는 데 충분한 양으로 투여된다. 통상적인 및 약학적으로 허용 가능한 투여 경로에는, 비제한적으로, 망막 투여(예를 들어, 망막하 주사, 맥락막상 주사 또는 유리체내 주사), (예를 들어, 리포좀 제형 내의) 정맥내 투여, 선택된 기관(예를 들어, 간, 신장, 담낭, 전립선, 부신, 심장, 장, 폐 및 위로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 조직)으로의 직접 전달, 근육내 투여 및 다른 비경구 투여 경로가 포함된다. 투여 경로는, 목적하는 경우, 조합될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 전달은 발현된 GBA 단백질의 전달에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 통상적으로 생산된(예를 들어, 세포 기반 생산 방법(예를 들어, 곤충세포 생산 방법)을 사용하여) 또는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는, 유전자 치료의 일부를 제공하기 위해 제공된 다른 전달 시스템과 함께 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따른 ceDNA 벡터와 조합될 수 있는 시스템의 하나의 비제한적인 예에는, GBA 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터의 효과적인 유전자 발현을 위한 하나 이상의 보조인자 또는 면역억제제를 별도로 전달하는 시스템이 포함된다.
본 개시내용은 또한 대상에서 고셰병을 치료하는 방법으로서, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를, 대상의 이를 필요로 하는 표적세포(특히, 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. ceDNA 벡터는 담체의 존재 하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 선택된 ceDNA 벡터는 고셰병의 치료에 유용한 GBA 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는, 대상에게 도입될 때, 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 목적하는 GBA 단백질의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 목적하는 GBA 단백질 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 벡터는 다양한 목적을 위해 GBA 단백질을 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자는, 예를 들어 GBA 단백질 산물의 기능을 연구하기 위해, 예를 들어 전이유전자를 보유하는 체세포 유전자도입 동물 모델을 생성하기 위해, 연구 목적으로 사용되는 GBA 단백질을 인코딩한다. 또 다른 예에서, 전이유전자는 고셰병의 동물 모델을 생성하는 데 사용되는 GBA 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 인코딩된 GBA 단백질은 포유류 대상에서 고셰병 상태의 치료 또는 예방에 유용하다. GBA 단백질은 유전자의 발현 감소, 발현 결여 또는 기능장애와 연관된 고셰병을 치료하는 데 충분한 양으로 환자에게 전달(예를 들어, 환자에서 발현)될 수 있다.
원칙적으로, 발현 카세트는 돌연변이로 인해 존재하지 않거나 감소된 GBA 단백질을 인코딩하거나, 과발현될 때 치료적 유익을 전달하는 것이 본 개시내용의 범위에 속하는 것으로 간주되는 핵산 또는 임의의 전이유전자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 삽입되지 않은 박테리아 DNA는 존재하지 않으며, 바람직하게는 본원에 제공된 ceDNA 조성물에는 박테리아 DNA가 존재하지 않는다.
ceDNA 벡터는 한 종의 ceDNA 벡터에 제한되지 않는다. 이와 같이, 또 다른 양태에서, 상이한 단백질 또는 동일한 GBA 단백질을 발현하지만, 상이한 프로모터 또는 시스-조절 요소에 작동적으로 연결된 다수의 ceDNA 벡터는, 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상에게 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 따라서, 이러한 전략은 동시에 다수의 단백질의 유전자 치료 또는 유전자 전달을 가능하게 할 수 있다. GBA 단백질의 상이한 부분을, 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있으며 별도로 조절될 수 있는 별개의 ceDNA 벡터(예를 들어, GBA 단백질의 기능에 필요한 상이한 도메인 및/또는 보조인자)로 분리하는 것이 가능할 수 있으며, 이를 통해 GBA 단백질의 발현 제어에 추가적인 수준을 부가할 수 있다. 바이러스 캡시드의 부재로 인한 항캡시드 숙주 면역 반응의 결여를 고려할 때, 전달은 또한 중요하게는, 임상 설정에서 유전자 치료를 위해, 후속으로 용량을 증가시키거나 감소시키면서 다회 수행될 수 있다. 캡시드가 존재하지 않기 때문에 항-캡시드 반응이 일어나지 않을 것으로 예상된다.
본 개시내용은 또한 대상에서 고셰병을 치료하는 방법으로서, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 본원에 개시된 ceDNA 벡터를, 대상의 이를 필요로 하는 표적세포(특히, 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. ceDNA 벡터는 담체의 존재 하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 ceDNA 벡터는 고셰병을 치료하는 데 유용한 관심 핵산 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는, 대상에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 목적하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
IX. GBA 단백질 생산을 위한 ceDNA 벡터의 전달 방법
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 다양한 적합한 방법에 의해 시험관내 또는 생체내 표적세포에 전달될 수 있다. ceDNA 벡터만 적용되거나 주사될 수 있다. CeDNA 벡터는 트랜스펙션 시약 또는 다른 물리적 수단의 도움 없이 세포에 전달될 수 있다. 대안적으로, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 DNA의 세포에의 진입을 용이하게 하는 임의의 업계 공지 트랜스펙션 시약 또는 다른 업계 공지 물리적 수단, 예를 들어 리포좀, 알코올, 폴리리신 풍부 화합물, 아르기닌 풍부 화합물, 인산칼슘, 미세소포, 미세주사, 전기천공 등을 사용하여 전달될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 통상적으로 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온으로 형질도입하기 곤란한 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.
본원에 기재된 기술의 하나의 양태는, GBA 단백질을 세포에 전달하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 생체내 및 시험관내 방법의 경우, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 방법뿐 아니라, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 바람직하게는 생물학적 유효량으로 세포에 투여된다. ceDNA 벡터가 생체내 세포(예를 들어, 대상)에 투여되는 경우, ceDNA 벡터의 생물학적 유효량은 표적세포에서 GBA 단백질의 형질도입 및 발현을 유도하는 데 충분한 양이다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 투여 방식에는, 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 경막내, 안구내, 경피, 내피내, 자궁내(또는 알내(in ovo)), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내[골격근, 횡격막근 및/또는 심장근에의 투여 포함], 흉막내, 뇌내 및 관절내)가 포함된다. 투여는 전신적으로 이루어지거나, 간 또는 다른 곳(예를 들어, 임의의 신장, 담낭, 전립선, 부신, 심장, 폐 및 위)으로 직접 전달될 수 있다.
투여는 국소(예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면, 및 경피 투여), 림프내 등뿐 아니라, 직접적인 조직 또는 기관 주사(예를 들어, 비제한적으로, 간뿐 아니라, 눈, 골격근, 심장근, 횡격막근을 포함하는 근육, 또는 뇌)로 이루어질 수 있다.
ceDNA 벡터의 투여는, 비제한적으로, 간 및/또는 또한 눈, 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 신장, 비장, 췌장, 피부로 이루어지는 군에서 선택되는 부위를 포함하는 대상의 임의의 부위에 이루어질 수 있다.
임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 치료, 개선 및/또는 예방하고자 하는 병태의 특성 및 중증도에 따라, 및 사용되는 특정 ceDNA 벡터의 특성에 따라 달라질 것이다. 또한, ceDNA는 하나 초과의 GBA 단백질을 단일 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 칵테일)로 투여하는 것을 가능하게 한다.
A. ceDNA 벡터의 근육내 투여
일부 구현예에서, 대상에서 질환을 치료하는 방법은, 치료적 유효량의 GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 대상의 이를 필요로 하는 표적세포(특히, 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대상의 근육 조직에 투여된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 투여는, 비제한적으로, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막 또는 눈의 근육으로 이루어지는 군에서 선택되는 부위를 포함하는 대상의 임의의 부위에 이루어질 수 있다.
본 개시내용에 따른 골격근에의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 투여는, 비제한적으로, 사지(예를 들어, 상완(upper arm), 하완(lower arm), 상각(upper leg) 및/또는 하각(lower leg)), 등, 목, 머리(예를 들어, 혀), 흉곽, 복부, 골반/회음 및/또는 손(발)가락의 골격근에의 투여를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류(선택적으로, 다리 및/또는 팔의 격리된 사지 관류; 예를 들어[Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464] 참조), 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 사지 관류, 선택적으로 격리된 사지 관류에 의해(예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여에 의해), 대상(예를 들어, DMD와 같은 근디스트로피를 앓고 있는 대상)의 간, 눈, 사지(팔 및/또는 다리)에 투여된다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 "유체역학적" 기술을 이용하지 않고 투여될 수 있다.
예를 들어, 통상적인 바이러스 벡터의 (예를 들어, 망막으로의) 조직 전달은 종종 혈관구조의 압력을 증가시키고, 내피세포 장벽을 가로지르는 바이러스 벡터의 능력을 촉진시키는 유체역학적 기술(예를 들어, 대량의 정맥내/정맥내 투여)에 의해 증강된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 고용량 주입 및/또는 상승된 혈관내압(예를 들어, 정상 수축기압 초과, 예를 들어 정상 수축기압보다 혈관내압의 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 이하의 증가)과 같은 유체역학적 기술의 부재 하에서 투여될 수 있다. 이러한 방법은 부종, 신경 손상 및/또는 구획 증후군과 같은 유체역학적 기술과 관련된 부작용을 감소시키거나 회피할 수 있다.
나아가, 골격근에 투여되는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물은, 사지(예를 들어, 상완, 하완, 상각 및/또는 하각), 등, 목, 머리(예를 들어, 혀), 흉곽, 복부, 골반/회음 및/또는 손(발)가락의 골격근에 투여될 수 있다. 적합한 골격근에는, 비제한적으로, 새끼벌림근(손), 새끼벌림근(발), 엄지벌림근, 새끼중족골벌림근(abductor ossis metatarsi quinti), 짧은엄지벌림근, 긴엄지벌림근, 짧은모음근, 엄지모음근(adductor hallucis), 긴모음근, 큰모음근, 엄지모음근(adductor pollicis), 팔꿈치근, 목갈비근, 무릎관절근, 위팔두갈래근, 넙다리두갈래근, 상완근, 상완요골근, 협근, 부리위팔근, 눈썹주름근, 삼각근, 입꼬리내림근, 아래입술내림근, 이복근, 배측골간근(손), 배측골간근(발), 짧은노쪽손목폄근, 긴노쪽손목폄근, 자쪽손목폄근, 새끼폄근, 손가락폄근, 짧은발가락폄근, 긴발가락폄근, 짧은엄지폄근(extensor hallucis brevis), 긴엄지폄근(extensor hallucis longus), 집게폄근, 짧은엄지폄근(extensor pollicis brevis), 긴엄지폄근(extensor pollicis longus), 노쪽손목굽힘근, 자쪽손목굽힘근, 짧은새끼굽힘근(손), 짧은새끼굽힘근(발), 짧은발가락굽힘근, 긴발가락굽힘근, 깊은손가락굽힘근, 얕은손가락굽힘근, 짧은엄지굽힘근(flexor hallucis brevis), 긴엄지굽힘근(flexor hallucis longus), 짧은엄지굽힘근(flexor pollicis brevis), 긴엄지굽힘근(flexor pollicis longus), 전두근, 장딴지근, 턱끝목뿔근, 큰볼기근, 중간볼기근, 작은볼기근, 두덩정강근, 엉덩갈비근, 허리엉덩갈비근, 등엉덩갈비근, 엉덩근, 아래쌍동이근, 하사근, 하직근, 가시아래근, 가시사이근, 가시돌기사이근, 가쪽날개근, 가쪽곧은근, 넓은등근, 입꼬리올림근, 위입술올림근, 위입술콧방울올림근, 눈꺼풀올림근, 어깨올림근, 긴회전근, 머리가장긴근, 목가장긴근, 등가장긴근, 긴머리근, 긴목근, 충양근(손), 충양근(손), 깨물근, 안쪽날개근, 안쪽곧은근, 중사각근, 뭇갈래근, 턱목뿔근, 아래머리빗근, 위머리빗근, 바깥폐쇄근, 속폐쇄근, 후두근, 어깨목뿔근, 새끼맞섬근, 엄지맞섬근, 눈둘레근, 입둘레근, 배측골간근, 짧은손바닥근, 긴손바닥근, 두덩근, 큰가슴근, 작은가슴근, 짧은종아리근, 긴종아리근, 셋째종아리근, 궁둥구멍근, 척측골간근, 장딴지빗근, 넓은목근, 오금근, 뒤경추늑골근, 네모엎침근, 원엎침근, 큰허리근, 넙다리네모근, 발바닥네모근, 앞머리곧은근, 가쪽머리곧은근, 큰뒤머리곧은근, 작은뒤머리곧은근, 넙다리곧은근, 큰마름근, 작은마름근, 입꼬리당김근, 넙다리빗근, 최소목갈비근, 반막모양근, 반가시근, 목반가시근, 등반가시근, 반힘줄모양근, 앞톱니근, 짧은회전근, 가자미근, 머리가시근, 목가시근, 등가시근, 머리널판근, 목널판근, 흉쇄유돌근, 복장목뿔근, 복장방패근, 붓목뿔근, 빗장밑근, 어깨밑근, 위쌍동이근, 상사근, 상직근, 손뒤침근, 가시위근, 관자근, 넙다리근막긴장근, 큰원근, 작은원근, 흉부근, 갑상선골근, 앞정강근, 뒤정강근, 승모근, 위팔세갈래근, 중간넓은근, 가쪽넓은근, 안쪽넓은근, 큰광대근 및 작은광대근, 및 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 골격근이 포함된다.
횡격막근에의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터로부터 발현된 전이유전자의 표적조직으로의 전달은 또한 ceDNA 벡터를 포함하는 합성 데포를 전달하는 방식(여기서 ceDNA 벡터를 포함하는 데포가 골격근, 평활근, 심장근 및/또는 횡격막근 조직에 이식됨)으로 달성될 수 있거나, 또는 근육조직을 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 포함하는 필름 또는 다른 매트릭스와 접촉시킬 수 있다. 이러한 이식 가능한 매트릭스 또는 기재는 미국 특허 제7,201,898호에 기재되어 있다.
심장근에의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 투여는, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 격막에의 투여를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 정맥내 투여, 대동맥내 투여와 같은 동맥내 투여, 직접 심장 주사(예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실에) 및/또는 관상동맥 관류에 의해 심장근에 전달될 수 있다.
평활근에의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여는 평활근에, 근처에 및/또는 위에 존재하는 내피세포에 이루어질 수 있다. 평활근의 비제한적인 예에는, 눈의 홍채, 폐의 세기관지, 후두근(성대), 위의 근육층, 식도, 위장관의 소장 및 대장, 요관, 요도의 배뇨근, 자궁근층, 음경 또는 전립선이 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 골격근, 횡경막근 및/또는 심장근에 투여된다. 대표적인 구현예에서, 본 개시내용에 따른 ceDNA 벡터는 골격근, 심장근 및/또는 횡경막근의 장애를 치료 및/또는 예방하는 데 사용된다.
구체적으로, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물은, 눈근육(예를 들어, 외직근, 내직근, 상직근, 하직근, 상사근, 하사근), 얼굴근육(예를 들어, 뒤통수이마근, 관자마루근, 눈살근, 코근, 비중격내림근, 눈둘레근, 눈썹주름근, 눈썹내림근, 귓바퀴근, 입둘레근, 입꼬리내림근, 입꼬리당김근, 큰광대근, 작은광대근, 위입술올림근, 위입술콧방울올림근, 아래입술내림근, 입꼬리올림근, 협근, 턱끝근) 또는 혀근육(예를 들어, 이설근, 설골설근, 연골설근, 경상설근, 구개설근, 상종설근, 하종설근, 설수직근 및 설횡근) 중 하나 이상의 근육에 전달될 수 있다고 고려된다.
(i) 근육내 주사: 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물은, 바늘을 사용하여 대상의 주어진 근육, 예를 들어 골격근(예를 들어, 삼각근, 가쪽넓은근, 둔부의 복면근, 둔부의 배면근 또는 유아의 앞가쪽 허벅지)의 하나 이상의 부위에 주사될 수 있다. ceDNA를 포함하는 조성물은 다른 근육세포 아형에 도입될 수 있다. 근육세포 아형의 비제한적인 예에는, 골격근세포, 심장근세포, 평활근세포 및/또는 횡격막근세포가 포함된다.
근육내 주사 방법은 당업자에게 공지되어 있기 때문에 본원에 상세하게 기재되어 있지 않다. 하지만, 근육내 주사를 수행하는 경우, 환자의 연령 및 크기, 조성물의 점도뿐 아니라, 주사 부위를 기반으로 적절한 바늘 크기가 결정되어야 한다. 표 14는, 예시적인 주사 부위 및 상응하는 바늘 크기에 대한 지침을 제공한다:
Figure pct00027
특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 적은 부피로, 예를 들어 주어진 대상에 대하여 표 14에 개략된 바와 같은 예시적인 부피로 제형화된다. 일부 구현예에서, 대상은 목적하는 경우, 주사 전 전신 또는 국소 마취제를 투여받을 수 있다. 이는 특히, 다회 주사를 필요로 하거나, 상기 제시된 통상의 주사 부위보다 더 깊은 근육에 주사되는 경우 바람직하다.
일부 구현예에서, 근육내 주사는 ceDNA 벡터의 세포 흡수를 증강시키기 위해 전기천공, 전달 압력(delivery pressure) 또는 트랜스펙션 시약의 사용과 조합될 수 있다.
(ii) 트랜스펙션 시약: 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 근관 또는 근육조직으로의 벡터의 흡수를 촉진시키기 위해 하나 이상의 트랜스펙션 시약을 포함하는 조성물로 제형화된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 핵산은 본원의 다른 곳에 기재된 방법을 사용한 트랜스펙션을 통해 근육세포, 근관 또는 근육조직에 투여된다.
(iii) 전기천공: 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 ceDNA의 세포로의 진입을 촉진시키는 담체의 부재 하에서, 또는 생리학적으로 불활성인 약학적으로 허용 가능한 담체(즉, 캡시드 미함유 비바이러스성 벡터의 근관으로의 흡수를 개선시키거나 증강시키지 않는 임의의 담체)의 존재 하에서 투여된다. 이러한 구현예에서, 캡시드 미함유 비바이러스성 벡터의 흡수는 세포 또는 조직의 전기천공에 의해 촉진될 수 있다.
세포막은 자연적으로 세포질로의 세포외 통과에 저항한다. 이러한 저항을 일시적으로 감소시키는 하나의 방법은, 전기장을 사용하여 세포에 영구적인 손상을 야기하지 않으면서 세포에 공극을 형성하는 "전기천공"이다. 이러한 공극은 DNA 벡터, 약학적 약물, DNA 및 다른 극성 화합물이 세포의 내부에 접근할 수 있을 만큼 충분히 크다. 시간이 경과함에 따라, 세포막의 공극이 닫혀, 세포는 다시 불투과성이 된다.
전기천공은, 예를 들어 외인성 DNA를 살아있는 세포에 도입하기 위한 시험관내 및 생체내 적용에 모두 사용될 수 있다. 시험관내 적용은 전형적으로 살아있는 세포의 샘플을, 예를 들어 DNA를 포함하는 조성물과 혼합한다. 이어서, 세포를 평행판과 같은 전극 사이에 배치하고, 세포/조성물 혼합물에 전기장을 인가한다.
다수의 생체내 전기천공 방법이 존재하며; 전극은, 예를 들어 처리하고자 하는 세포 영역 위에 놓인 표피를 잡는 캘리퍼와 같은 다양한 구성으로 제공될 수 있다. 대안적으로, 보다 깊은 곳에 위치한 세포에 접근하기 위해 바늘 모양 전극을 조직에 삽입할 수 있다. 어느 경우든, 예를 들어 핵산을 포함하는 조성물이 처리 영역에 주사되고, 전극이 해당 영역에 전기장을 인가한다. 일부 전기천공 적용에서, 이러한 전기장은 약 10 ms 내지 60 ms 지속기간 동안 100 V/cm 내지 500 V/cm 정도의 단일 구형파 펄스를 포함한다. 이러한 펄스는, 예를 들어 BTX Division of Genetronics, Inc에서 제조한 Electro Square Porator T820의 공지된 어플리케이션에서 생성될 수 있다.
전형적으로, 예를 들어 핵산의 성공적인 흡수는 근육이 즉시 전기적으로 자극되거나, 예를 들어 근육으로의 주사에 의해 조성물이 투여된 직후에만 일어난다.
특정 구현예에서, 전기천공은 전기장의 펄스를 사용하거나, 저전압/장펄스 치료 요법을 사용하여(예를 들어, 구형파 펄스 전기천공 시스템을 사용하여) 달성된다. 펄스 전기장을 생성할 수 있는 예시적인 펄스 생성기에는, 예를 들어 지수 파형을 생성할 수 있는 ECM600과 구형파 형태를 생성할 수 있는 ElectroSquarePorator(T820)(둘 모두 Genetronics, Inc(San Diego, Calif.)의 사업부인 BTX에서 입수 가능함)이 포함된다. 구형파 전기천공 시스템은 설정된 전압까지 빠르게 상승하고, 설정된 시간(펄스 길이) 동안 해당 수준을 유지한 후, 빠르게 0으로 떨어지는 제어된 전기 펄스를 전달한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 캡시드 미함유 비바이러스성 벡터를 포함하는 조성물의 존재 하에서 조직의 전기천공과 관련이 있을 수 있는 통증을 감소시키기 위해, 예를 들어 국소 마취제가 치료 부위에 주사로 투여된다. 또한, 당업자는 근육의 섬유증, 괴사 또는 염증을 유발하는 과도한 조직 손상을 최소화 및/또는 방지하는 조성물의 용량을 선택해야 한다는 것을 이해할 것이다.
(iv) 전달 압력: 일부 구현예에서, 근육 조직으로의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 전달은, 대용량과 사지로 공급하는 동맥(예를 들어, 장골동맥)으로의 신속한 주사의 조합을 사용하는 전달 압력에 의해 촉진된다. 이러한 투여 방식은, 전형적으로 혈관 클램프의 지혈대를 사용하여 근육이 전신 순환으로부터 분리되는 동안, ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 사지 혈관계에 주입하는 것을 포함하는 다양한 방법을 통해 달성될 수 있다. 하나의 방법에서, 상기 조성물은 사지 혈관계를 통해 순환하여 세포로의 혈관외유출을 가능하게 한다. 또 다른 방법에서, 혈관내 유체역학적 압력을 증가시켜, 혈관층을 확장시키고, 근육 세포 또는 조직으로의 ceDNA 벡터의 흡수를 증가시킨다. 하나의 구현예에서, ceDNA 조성물은 동맥 내로 투여된다.
(v) 지질 나노입자 조성물: 일부 구현예에서, 근육내 전달을 위한 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 리포좀을 포함하는 조성물로 제형화된다.
(vi) 근육 조직을 표적으로 하는 ceDNA 벡터의 전신 투여: 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 간접 전달 투여를 통해 근육을 표적화하도록 제형화되며, 여기서 ceDNA는 간이 아니라 근육으로 수송된다. 따라서, 본원에 기재된 기술은, 예를 들어 전신 투여에 의한, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 근육 조직으로의 간접 투여를 포함한다. 이러한 조성물은 국소적으로, 정맥내로(볼루스 또는 연속 주입으로), 세포내 주사로, 조직내 주사로, 경구로, 흡입으로, 복강내로, 피하로, 공동내로 투여될 수 있으며, 목적하는 경우, 연동 수단을 통해, 또는 당업자에게 공지된 다른 수단을 통해 전달될 수 있다. 작용제는, 목적하는 경우, 예를 들어 정맥내 주입에 의해 전신으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 근육 세포/조직으로의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 흡수는, 벡터를 근육 조직으로 우선적으로 지시하는 표적화 작용제 또는 모이어티를 사용하여 증가된다. 따라서, 일부 구현예에서, 캡시드 미함유 ceDNA 벡터는 신체의 다른 세포 또는 조직에 존재하는 캡시드 미함유 ceDNA 벡터의 양과 비교하여 근육 조직에 농축될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물은 근육 세포에 대한 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 발현된 유전자 산물은 작용하고자 의도된 조직에 특이적인 표적화 모이어티를 포함한다. 표적화 모이어티는 세포 또는 조직의 세포내, 세포 표면 또는 세포외 바이오마커를 표적화하고, 이와 상호작용하고, 이와 커플링하고/하거나 이와 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 복합체를 포함할 수 있다. 바이오마커는, 예를 들어 세포 프로테아제, 키나아제, 단백질, 세포 표면 수용체, 지질 및/또는 지방산을 포함할 수 있다. 표적화 모이어티가 표적화, 상호작용, 커플링 및/또는 결합할 수 있는 바이오마커의 다른 예에는, 특정 질환과 관련된 분자가 포함된다. 예를 들어, 바이오마커는 표피 성장 인자 수용체 및 트랜스페린 수용체와 같은 암 발달과 관련이 있는 세포 표면 수용체를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는, 비제한적으로, 표적 근육 조직에서 발현되는 분자에 결합하는, 합성 화합물, 천연 화합물 또는 산물, 거대분자 엔티티, 생명공학적으로 조작된 분자(예를 들어, 폴리펩타이드, 지질, 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항체 단편) 및 작은 엔티티(예를 들어, 소분자, 신경전달물질, 기질, 리간드, 호르몬 및 원소 화합물)를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 표적화 모이어티는, 예를 들어 표적세포의 특정 목적하는 분자를 자연적으로 인식하는 수용체를 포함하는 수용체 분자를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 수용체 모이어티에는, 표적 분자와의 상호작용 특이성을 증가시키도록 변형된 수용체, 해당 수용체에 의해 자연적으로 인식되지 않는 목적하는 표적 분자와 상호작용하도록 변형된 수용체, 및 이러한 수용체의 단편이 포함된다(예를 들어, 문헌[Skerra, 2000, J. Molecular Recognition, 13:167-187] 참조). 바람직한 수용체는 케모카인 수용체이다. 예시적인 케모카인 수용체는, 예를 들어 문헌[Lapidot et al, 2002, Exp Hematol, 30:973-81] 및 문헌[Onuffer et al, 2002, Trends Pharmacol Sci, 23:459-67]에 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 추가의 표적화 모이어티는, 예를 들어 트랜스페린(Tf) 리간드와 같은, 표적세포의 특정 목적하는 수용체를 자연적으로 인식하는 리간드를 포함하는 리간드 분자를 포함할 수 있다. 이러한 리간드 분자에는, 표적 수용체와의 상호작용 특이성을 증가시키도록 변형된 리간드, 해당 리간드에 의해 자연적으로 인식되지 않는 목적하는 수용체와 상호작용하도록 변형된 리간드, 및 이러한 리간드의 단편이 포함된다.
또 다른 구현예에서, 표적화 모이어티는 압타머를 포함할 수 있다. 압타머는 표적세포의 목적하는 분자 구조에 특이적으로 결합하도록 선택된 올리고뉴클레오타이드이다. 압타머는 전형적으로 파지 디스플레이의 친화성 선별과 유사한 친화성 선별 과정(시험관내 분자 진화로도 공지됨)의 산물이다. 이러한 과정은, 예를 들어 병든 면역원에 결합하는 고체 지지체를 사용한 후, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 면역원이 결합된 핵산을 증폭시키는 친화성 분리의 여러 차례 탠덤 반복을 수행하는 것을 포함한다. 따라서, 각 회차의 친화성 분리는 목적하는 면역원에 성공적으로 결합하는 분자의 핵산 집단을 풍부하게 한다. 이러한 방식으로, 핵산의 랜덤 풀은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 압타머를 생성하도록 "교육"될 수 있다. 압타머는 전형적으로 RNA이지만, 비제한적으로, 펩타이드 핵산(PNA) 및 포스포로티오에이트 핵산과 같은 DNA 또는 이의 유사체 또는 유도체일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는, 예를 들어 캡시드 미함유 비바이러스성 벡터 또는 유전자 산물이 특정 조직을 표적화하도록 집속된 광선의 빔으로부터 방출되는 광분해성 리간드(즉, '케이징된(caged)' 리간드)를 포함할 수 있다.
상기 조성물이 대상의 하나 이상의 근육 내 여러 부위로 전달되는 것이 또한 고려된다. 즉, 주사는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개, 적어도 95개, 적어도 100개의 주사 부위에 이루어질 수 있다. 이러한 부위는 단일 근육 영역에 퍼져 있을 수 있거나, 여러 근육에 분포되어 있을 수 있다.
B. 비근육 위치에의 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 투여
또 다른 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 간에 투여된다. ceDNA 벡터는 또한 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 상이한 영역에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터는 또한 척수, 뇌간(연수, 교뇌), 중뇌(시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑색질, 송과체), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽을 포함하는 대뇌, 피질, 기저핵, 해마 및 편도체), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구에 도입될 수 있다. ceDNA 벡터는 (예를 들어, 요추천자에 의해) 뇌척수액에 전달될 수 있다. GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 나아가 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 CNS에 혈관내 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 비제한적으로, 경막내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내(예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에서), 비강내, 이내, 안구내(예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위(예를 들어, 테논낭하(sub-Tenon's region)) 전달뿐 아니라, 운동 뉴런으로의 역행 전달을 통한 근육내 전달을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 경로를 통해 눈의 목적하는 영역(들)에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 직접 주사(예를 들어, 정위주사)를 통해 액체 제형으로 CNS 내 목적하는 영역 또는 구획에 투여된다. 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 목적하는 영역에의 국소 적용 또는 에어로졸 제형의 비강내 투여를 통해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 액체 방울의 국소 적용을 통해 이루어질 수 있다. 추가의 대안으로서, ceDNA 벡터는 고체 서방형 제형으로 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호 참조). 추가의 구현예에서, ceDNA 벡터는 운동 뉴런과 관련된 질환 및 장애(예를 들어, 근위축성 측삭경화증(ALS); 척수성근위축(SMA) 등)를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직에 전달될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 고셰병을 앓고 있는 대상에게의 투여를 위한 치료로서 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 선택하는 방법으로서, 치료가 헤모글로빈 농도를 증가시키고/시키거나, 혈소판 수를 증가시키고/시키거나, 간 용적을 감소시키고/시키거나, 비장 용적을 감소시키고/시키거나, 주입 부위 반응 가능성을 (예를 들어, 표준, 예를 들어 본원에 기재된 표준, 예를 들어 고셰병에 대해 상이한 치료(예를 들어 이미글루세라아제 또는 uplyso)를 받고 있는 대상의 코호트에 대한 가능성과 비교하여) 감소시키고/시키거나, 골격 매개변수를 변화(예를 들어, 골밀도를 증가)시키고/시키거나, 고셰병에 대한 가능성을 (예를 들어, 표준, 예를 들어 본원에 기재된 표준, 예를 들어 상이한 치료(예를 들어 이미글루세라아제 또는 uplyso)를 받고 있는 대상에 대한 가능성과 비교하여) 감소시킬 수 있다는 것에 기반하여 치료를 선택하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
C. 생체외 치료
일부 구현예에서, 대상에서 세포가 제거되고, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 그 안에 도입된 후, 세포가 다시 대상에 배치된다. 생체외 치료를 위해 대상에서 세포를 제거한 후, 다시 대상에게 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호; 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 대안적으로, ceDNA 벡터는 또 다른 대상의 세포, 배양된 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원의 세포에 도입되며, 세포는 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터로 형질도입된 세포는 바람직하게는 약학적 담체와 조합으로 "치료적 유효량"으로 대상에게 투여된다. 당업자는, 일부 유익이 대상에게 제공되는 한, 치료 효과가 완전하거나 치유적일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에서 생산되는 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질(때때로 전이유전자 또는 핵산 서열로 지칭됨)을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본원에 논의된 바와 같은 치료 방법에서의 본원에 기재된 ceDNA 벡터의 사용과 대조적으로, 일부 구현예에서, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 항체 및 융합 단백질의 생산을 위해 배양된 세포 및 이러한 세포로부터 단리된 발현된 GBA 단백질에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 배양된 세포는, 예를 들어 항체 또는 융합 단백질의 소규모 또는 대규모 생물제조(biomanufacturing)를 위한 세포 공급원으로서 작용하여, 항체 또는 융합 단백질의 상업적 생산을 위해 사용될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 소규모 생산뿐 아니라 상업적 대규모 GBA 단백질 생산을 포함하는 항체 또는 융합 단백질의 생체내 생산을 위해, 숙주 비인간 대상의 세포에 도입된다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 수의학적 및 의학적 적용 모두에 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 생체외 유전자 전달 방법에 적합한 대상에는, 조류(예를 들어, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유류(예를 들어, 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개 및 토끼)가 모두 포함되며, 이 중 포유류가 바람직하다. 인간 대상이 가장 바람직하다. 인간 대상에는, 신생아, 유아, 청소년 및 성인이 포함된다.
D. 용량 범위
본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 본원에 제공된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, "유효량"이라는 용어는, 고셰병의 치료를 위한 "치료적 유효량"으로 GBA 단백질의 발현을 유도하는, 투여된 ceDNA 조성물의 양을 나타낸다.
생체내 및/또는 시험관내 검정은 선택적으로 사용을 위한 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 이용될 수 있다. 제형에 이용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 병태의 중증도에 따라 달라질 것이며, 당업자의 판단 및 각 대상의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은, 예를 들어 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유도된 용량 반응 곡선에서 추론될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 목적하는 조직의 세포를 트랜스펙션시키고, 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하는 데 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약학적으로 허용 가능한 투여 경로에는, 비제한적으로, 선택된 기관에의 직접 전달(예를 들어, 간에의 문맥내 전달), 경구, 흡입(비강내 및 기관내 전달 포함), 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 다른 비경구 투여 경로와 같은 "투여" 섹션에 상기 기재된 것들이 포함된다. 투여 경로는, 목적하는 경우, 조합될 수 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하는 데 필요한 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 양의 용량은, 비제한적으로, 핵산 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료하고자 하는 특정 질환 또는 장애, 및 유전자(들), RNA 산물(들) 또는 생성되는 발현된 단백질(들)의 안정성을 포함하는 몇 가지 인자에 기반하여 달라질 것이다. 당업자는, 상기 언급된 인자뿐 아니라, 당업계에 널리 공지된 다른 인자를 기반으로, 특정 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 ceDNA 벡터 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
투여 요법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 반복적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 수회 용량이 매일 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 지시된 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 당업자는 올리고뉴클레오타이드가 세포에 투여되는지 대상에 투여되는지에 관계없이, 대상 올리고뉴클레오타이드의 적절한 용량 및 투여 스케줄을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
"치료적 유효 용량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이며, 특정 적용에 따라 달라질 것이다(신경세포는 매우 소량을 필요로 하지만, 전신 주사는 많은 양을 필요로 할 수 있음). 예를 들어, 인간 대상의 골격 또는 심장 근육에의 직접 생체내 주사의 경우, 치료적 유효 용량은 약 1 μg 내지 100 g의 ceDNA 벡터 정도일 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 ceDNA 벡터를 전달하는 데 사용되는 경우, 치료적 유효 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 1 μg 내지 약 100 g의 벡터를 전달할 것으로 예측된다. 나아가, 치료적 유효 용량은 질환의 하나 이상의 증상의 감소를 유도하지만, 유의한 표적외 또는 유의한 부작용을 초래하지 않는, 대상에게 영향을 미치는 데 충분한 양의 전이유전자를 발현시키는 ceDNA 벡터의 양이다. 하나의 구현예에서, "치료적 유효 용량"은 고셰병 바이오마커의 발현의 통계적으로 유의하고 측정 가능한 변화 또는 주어진 질환 증상의 감소를 생성하는 데 충분한 발현된 GBA 단백질의 양이다. 이러한 유효량은 주어진 ceDNA 벡터 조성물에 대한 임상 시험 및 동물 연구에서 측정될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 부형제와 담체 용액의 제형은, 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하는 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로, 당업자에게 널리 공지되어 있다.
시험관내 트랜스펙션의 경우, 세포(1x106개의 세포)에 전달되는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 유효량은, 0.1 μg 내지 100 μg, 바람직하게는 1 μg 내지 20 μg, 더욱 바람직하게는 1 μg 내지 15 μg 또는 8 μg 내지 10 μg 정도의 ceDNA 벡터일 것이다. ceDNA 벡터가 클수록 더 높은 용량이 필요할 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 사용되는 경우, 효과적인 시험관내 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 일반적으로 동일한 양의 ceDNA 벡터를 전달하도록 의도될 것이다.
고셰병의 치료를 위해, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질을 발현시키는 ceDNA 벡터의 적절한 투여량은, 치료하고자 하는 질환의 특정 유형, GBA 단백질의 유형, 고셰병의 중증도 및 경과, 이전 치료, 환자의 임상 이력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 비제한적으로, 다양한 시점에 걸친 단회 또는 다회 투여, 볼루스 투여, 및 펄스 주입을 포함하는 다양한 투약 스케쥴이 본원에서 고려된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라, ceDNA 벡터는, 인코딩된 GBA 단백질이 약 0.3 mg/kg 내지 100 mg/kg(예를 들어, 15 mg/kg 내지 100 mg/kg, 또는 상기 범위 내 임의의 투여량)으로 발현되는 양으로, 1회 이상의 개별 투여 또는 연속 주입으로 투여된다. ceDNA 벡터의 하나의 전형적인 1일 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라, 인코딩된 GBA 단백질을 약 15 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위로 발현시키는 데 충분한 양이다. ceDNA 벡터의 하나의 예시적인 용량은, 본원에 개시된 바와 같은 인코딩된 GBA 단백질을 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 범위로 발현시키는 데 충분한 양이다. 따라서, 인코딩된 GBA 단백질을 약 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg 또는 100 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)으로 발현시키는 데 충분한 양으로의 ceDNA 벡터의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 인코딩된 GBA 단백질을 50 mg 내지 2500 mg 범위의 총 용량으로 발현시키는 데 충분한 양이다. ceDNA 벡터의 예시적인 용량은, 인코딩된 GBA 단백질을 총 약 50 mg, 약 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 720 mg, 약 1000 mg, 약 1050 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg, 약 1800 mg, 약 1900 mg, 약 2000 mg, 약 2050 mg, 약 2100 mg, 약 2200 mg, 약 2300 mg, 약 2400 mg 또는 약 2500 mg(또는 이들의 임의의 조합)으로 발현시키는 데 충분한 양이다. ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질의 발현이 본원의 조절 스위치, 또는 대안적으로 대상에게 투여된 ceDNA 벡터의 다회 용량에 의해 조심스럽게 제어될 수 있기 때문에, ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질의 발현은, 발현된 GBA 단백질의 용량이 간헐적으로, 예를 들어 ceDNA 벡터로부터 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 매월, 2개월마다, 3개월마다 또는 6개월마다 투여될 수 있는 방식으로 제어될 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정으로 모니터링될 수 있다.
특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 인코딩된 GBA 단백질을 15 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg의 용량, 또는 고정 용량, 예를 들어 300 mg, 500 mg, 700 mg, 800 mg 또는 그 이상으로 발현시키는 데 충분한 양으로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질의 발현은, GBA 단백질이 일정 기간 동안 매일, 2일마다, 매주, 2주마다 또는 4주마다 발현되도록 제어된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질의 발현은, GBA 단백질이 일정 기간 동안 2주마다 또는 4주마다 발현되도록 제어된다. 특정 구현예에서, 일정 기간은 6개월, 1년, 18개월, 2년, 5년, 10년, 15년, 20년 또는 환자의 일생이다.
치료는 단회 투여 또는 다회 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 초과의 용량이 대상에게 투여될 수 있으며; ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드의 부재로 인해 항캡시드 숙주 면역 반응을 일으키지 않기 때문에, 사실 필요한 경우 다회 용량이 투여될 수 있다. 이와 같이, 당업자는 적절한 용량의 횟수를 용이하게 결정할 수 있다. 투여되는 용량의 횟수는, 예를 들어 1회 내지 100회, 바람직하게는 2회 내지 20회 용량 정도일 수 있다.
임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 투여에 의해 유발된 전형적인 항바이러스 면역 반응의 결여는(즉, 캡시드 구성요소의 부재)는, GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 숙주에 여러 차례 투여되는 것을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 핵산이 대상에게 전달되는 경우의 횟수는, 2회 내지 10회 범위(예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회)이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상에게 10회 초과로 전달된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력일(calendar day)(예를 들어, 24시간 기간)당 1회 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 2달력일, 3달력일, 4달력일, 5달력일, 6달력일 또는 7달력일당 1회 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력주(calendar week)(예를 들어, 7달력일)당 1회 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 2주에 1회(예를 들어, 2달력주 기간 중 1회) 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력달(calendar month)당 1회(예를 들어, 30달력일 중 1회) 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 6달력달당 1회 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력년(예를 들어, 365일 또는 윤년의 경우 366일)당 1회 이하로 투여된다.
특정 구현예에서, 다양한 간격의 기간, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 목적하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 1회 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 투여)가 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 치료용 GBA 단백질은, 이것이 대상에서 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월/1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 15년, 적어도 20년, 적어도 30년, 적어도 40년, 적어도 50년 또는 그 이상 동안 대상에서 발현되도록, 조절 스위치, 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 하나의 구현예에서, 발현은 선결된 또는 목적하는 간격으로 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 반복 투여하는 방식으로 달성될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 질환의 실질적으로 영구적인 치료 또는 "치유"를 위해, GBA 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 삽입을 가능하게 하는 유전자 편집 시스템의 구성요소(예를 들어, CRISPR/Cas, TALEN, 아연 핑거 엔도뉴클레아제 등)를 추가로 포함할 수 있다. 유전자 편집 구성요소를 포함하는 이러한 ceDNA 벡터는 국제 출원 PCT/US18/64242에 개시되어 있으며, GBA 단백질을 인코딩하는 핵산을 알부민 유전자 또는 CCR5 유전자를 포함하지 않는 세이프 하버 영역에 삽입하기 위해, 5' 및 3' 상동성 아암(예를 들어, 서열번호 151 내지 154, 또는 이와 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 상동성을 갖는 서열)을 포함할 수 있다. 예로서, GBA 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터는, 2019년 3월 1일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2019/020225(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 개시되어 있는, GBA 전이유전자의 게놈 세이프 하버에의 삽입을 위한 적어도 하나의 게놈 세이프 하버(GSH) 특이적 상동성 아암을 포함할 수 있다.
치료 지속기간은 대상의 임상 진행과 치료에 대한 반응성에 따라 달라진다. 초기의 높은 치료 용량 후, 지속적이고 상대적으로 낮은 유지 용량이 고려된다.
E. 단위 투여 형태
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 약학적 조성물은 편리하게 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 맞게 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 눈에 직접 투여되는 점적액으로 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸 생성기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 망막하 주사, 맥락막상 주사 또는 유리체내 주사에 맞게 조정된다.
일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경막내 또는 뇌실내 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 수 있다.
X. 치료 방법
본원에 기재된 기술은 또한 상기 개시된 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 제조하는 방법뿐 아니라, 예를 들어 생체외, 현장외, 시험관내 및 생체내 적용, 방법론, 진단 절차 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 사용하는 방법을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터로부터 발현된 치료용 GBA 단백질은 질환의 치료에 기능성이 있다. 바람직한 구현예에서, 치료용 GBA 단백질은, 목적하지 않는 경우, 면역계 반응을 야기하지 않는다.
대상에서 고셰병을 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께, 대상의 이를 필요로 하는 표적세포(예를 들어, 근육 세포 또는 조직, 다른 병든 세포 유형)에 도입하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. ceDNA 벡터는 담체의 존재 하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는 데 유용한 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특히, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 대상에게 도입될 때, 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 목적하는 GBA 단백질의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 목적하는 GBA 단백질 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
하나 이상의 본 개시내용의 ceDNA 벡터를, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 완충제, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터 조성물 및 제형이 본원에 개시된다. 이러한 조성물은 고셰병의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선시키기 위한, 하나 이상의 진단용 또는 치료용 키트에 포함될 수 있다. 하나의 양태에서, 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능장애는 인간의 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능장애이다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 양태는, 진단적 또는 치료적 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 방법으로서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 양을 이를 필요로 하는 대상의 세포, 조직 또는 기관에; ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질의 발현을 가능하게 하는 데 효과적인 시간 동안 제공하여, 대상에게 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 진단적 또는 치료적 유효량의 GBA 단백질을 제공하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 추가의 양태에서, 대상은 인간이다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 양태는, 대상에서 고셰병, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 병태 또는 외상의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 전반적이고 일반적인 의미에서, 상기 방법은 적어도, 하나 이상의 상기 개시된 GBA 단백질 생산을 위한 ceDNA 벡터를, 이를 필요로 하는 대상에게, 대상에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 병태 또는 외상의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 데 충분한 양으로 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 적어도 포함한다. 이러한 구현예에서, 대상은 GBA 단백질의 효능, 또는 대안적으로, 대상 내 GBA 단백질 또는 GBA 단백질의 조직 위치(세포 및 세포하 위치 포함) 검출을 위해 평가될 수 있다. 이와 같이, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 암 또는 다른 적응증의 검출을 위한 생체내 진단 도구로서 사용될 수 있다. 추가의 양태에서, 대상은 인간이다.
또 다른 양태는, 고셰병 또는 질환 상태의 하나 이상의 증상을 치료하거나 감소시키는 도구로서의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 용도이다. 결함이 있는 유전자가 공지된 다수의 유전병이 존재하며, 이는 전형적으로 2개의 부류로 분류된다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질이 관여할 수 있으며, 전형적으로 우성 방식으로 유전되지만, 항상 우성 방식으로 유전되는 것은 아닌 불균형 상태. 불균형 질환 상태의 경우, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 모델 시스템에서 고셰병 상태를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 질환 상태에 대응하기 위한 노력으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유전 질환의 치료를 가능하게 한다. 본원에 사용된 고셰병 상태는, 질환을 유발하거나 이를 더 중증으로 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 개선하는 방식으로 치료된다.
A. 숙주 세포
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 GBA 단백질 전이유전자를 대상 숙주 세포로 전달한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 광수용체 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 RPE 세포이다. 일부 구현예에서, 대상 숙주 세포는, 예를 들어 혈액세포, 줄기세포, 조혈세포, CD34+ 세포, 간세포, 암세포, 혈관세포, 근육세포, 췌장세포, 신경세포, 안구 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상세포, 섬유아세포를 포함하는 인간 숙주 세포, 또는 비제한적으로, 간의(hepatic)(즉, 간) 세포, 폐세포, 심장세포, 췌장세포, 장세포, 횡격막세포, 신장의(renal)(즉, 신장) 세포, 신경세포, 혈액세포, 골수세포, 또는 유전자 치료가 고려되는 대상의 임의의 하나 이상의 선택된 조직 세포를 포함하는 포유류 기원의 임의의 다른 세포이다. 하나의 양태에서, 대상 숙주 세포는 인간 숙주 세포이다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 당업자에게 자명한 바와 같이 목적에 따라 다양한 숙주 세포를 사용할 수 있다. 공여체 서열을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 구조체 또는 ceDNA 벡터는, 공여체 서열이 이전에 기재된 바와 같이 염색체 통합체로 유지되도록 숙주 세포에 도입된다. 숙주 세포라는 용어는, 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인해 모세포와 동일하지 않은 모세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 공여체 서열 및 이의 공급원에 따라 크게 달라질 수 있다.
숙주 세포는 또한 포유류, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 인간 세포(예를 들어, 1차세포, 줄기세포 또는 불멸화된 세포주)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 생체외로 투여되고, 숙주 세포가 유전자 치료 후 대상에게 전달될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형, 예를 들어 체세포 또는 줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포 또는 혈액세포, 예를 들어 T세포 또는 B세포, 또는 골수세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 동종이계 세포이다. 예를 들어, T세포 게놈 조작은 암 면역요법, HIV 요법(예를 들어, CXCR4 및 CCR5와 같은 수용체 녹아웃)과 같은 질환 조절 및 면역결핍 치료에 유용하다. B세포의 MHC 수용체는 면역요법의 표적이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 숙주 세포, 예를 들어 골수 줄기세포, 예를 들어 CD34+ 세포 또는 유도된 다능성 줄기세포는, 치료용 단백질의 발현을 위해 환자에게 다시 이식될 수 있다.
B. 유전자 치료를 위한 추가의 질환:
일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대상에서의 이상 단백질 발현 또는 유전자 발현과 관련된 고셰병과 연관된 증상을 치료, 예방 또는 개선시키기 위해 상기 설명에 따른 임의의 GBA 단백질을 전달하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 고셰병을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해, 혈액 내 분비 및 순환, 또는 다른 조직으로의 전신 전달을 위한 GBA 단백질의 생산을 위해, GBA 단백질을 골격근, 심장근 또는 횡격막근으로 전달하는 데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 임의의 적합한 수단에 의해, 선택적으로 대상이 흡입하는 ceDNA 벡터를 포함하는 호흡 가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여하는 방식으로 대상의 폐에 투여될 수 있다. 호흡 가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. ceDNA 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업자에게 공지된 바와 같은 압력 구동 에어로졸 분무기 또는 초음파 분무기와 같은 임의의 적합한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,501,729호 참조. ceDNA 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 약학 분야에 공지된 기술에 의해 임의의 고체 미립자 약제 에어로졸 생성기를 이용하여 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 CNS의 조직(예를 들어, 뇌, 눈)에 투여될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 안구 장애에는, 망막, 후방로 및/또는 시신경과 관련된 안과적 장애(예를 들어, 색소성망막염, 당뇨망막병증 및 다른 망막변성질환, 포도막염, 연령관련 황반변성, 녹내장)가 포함된다. 다수의 안과적 질환 및 장애는 (1) 혈관형성, (2) 염증, 및 (3) 변성의 3가지 유형의 징후 중 하나 이상과 연관이 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 항혈관형성 인자; 항염증 인자; 세포 변성을 지연시키거나, 세포 감축을 촉진시키거나, 세포 성장을 촉진시키는 인자, 및 이들의 조합을 전달하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 당뇨망막병증은 혈관형성을 특징으로 한다. 당뇨망막병증은 하나 이상의 항혈관형성 항체 또는 융합 단백질을 안구내로(예를 들어, 유리체에) 또는 안구주위로(예를 들어, 테논낭하에) 전달하는 방식으로 치료될 수 있다. 본 개시내용의 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 추가의 안구 질환에는, 지도형위축, 혈관 또는 "습윤형" 황반변성, PKU, 레베르 선천성 흑암시(LCA), 어셔증후군, 탄성섬유가황색종(PXE), x연관 색소성망막염(XLRP), x연관 망막층간분리(XLRS), 범맥락막위축, 레베르 유전성 시신경병증(LHON), 완전색맹, 추체-간체 디스트로피, 푹스각막내피이상증, 당뇨병성 황반부종, 및 안구의 암 및 종양이 포함된다.
일부 구현예에서, 염증성 안구 질환 또는 장애(예를 들어, 포도막염)가 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 항염증 항체 또는 융합 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 안구내(예를 들어, 유리체 또는 전방) 투여에 의해 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 리포터 폴리펩타이드(예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 알칼리성 포스파타아제와 같은 효소)를 인코딩하는 전이유전자와 관련이 있는 GBA 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 실험 또는 진단 목적에 유용한 리포터 단백질을 인코딩하는 전이유전자는, β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들 중 임의의 것에서 선택된다. 일부 양태에서, 리포터 폴리펩타이드에 연결된 GBA 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터는 진단 목적으로 사용될 수 있을 뿐 아니라, 효율을 측정하기 위해, 또는 이것이 투여되는 대상에서 ceDNA 벡터 활성의 마커로서 사용될 수 있다.
C. ceDNA 벡터를 사용한 성공적인 유전자 발현 시험
ceDNA 벡터에 의한 GBA 단백질의 유전자 전달 효율을 시험하는 데 당업계에 널리 공지된 검정이 사용될 수 있으며, 이는 시험관내 및 생체내 모델로 수행될 수 있다. ceDNA에 의한 GBA 단백질의 발현 수준은 GBA 단백질의 mRNA 및 단백질 수준을 측정하는 방식(예를 들어, 역전사 PCR, 웨스턴 블롯 분석 및 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA))으로 당업자에 의해 평가될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA는, 예를 들어 형광 현미경 또는 발광 플레이트 판독기로 리포터 단백질의 발현을 평가하는 방식으로 GBA 단백질의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있는 리포터 단백질을 포함한다. 생체내 적용의 경우, 유전자 발현이 성공적으로 일어나는 지 여부를 결정하기 위해 주어진 GBA 단백질의 기능을 시험하는 단백질 기능 검정이 사용될 수 있다. 당업자는 시험관내 또는 생체내에서 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 GBA 단백질의 기능을 측정하는 최상의 시험을 결정할 수 있다.
세포 또는 대상에서 ceDNA 벡터로부터의 GBA 단백질의 유전자 발현 효과는 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 10개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 20년 동안 지속될 수 있거나, 영구적일 수 있다고 본원에서 고려된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 카세트, 발현 구조체 또는 ceDNA 벡터 내 GBA 단백질은 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"라는 용어는, 관심 척추동물, 예를 들어 마우스 또는 인간(예를 들어, 인간화)의 세포에서 발현 증강을 위해 핵산 서열을 변경하는 과정으로서, 천연 서열(예를 들어, 원핵생물 서열) 중 적어도 하나, 하나 초과 또는 유의한 수의 코돈을, 해당 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하는 과정을 나타낸다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은, 예를 들어 Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc.), 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
D. ceDNA 벡터로부터의 GBA 단백질 발현 평가를 통한 효능 결정
본질적으로, 단백질 발현을 결정하는 당업계에 공지된 임의의 방법이 ceDNA 벡터로부터 GBA 단백질의 발현을 분석하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법/검정의 비제한적인 예에는, 효소 결합 면역검정(ELISA), 친화성 ELISA, ELISPOT, 연속 희석, 유세포분석, 표면 플라즈몬 공명 분석, 역학적 배제 검정, 질량분석, 웨스턴 블롯, 면역침강 및 PCR이 포함된다.
생체내에서 GBA 단백질 발현을 평가하는 경우, 분석을 위해 대상에서 생물학적 샘플을 얻을 수 있다. 예시적인 생물학적 샘플에는, 생체유체 샘플, 체액 샘플, 혈액(전혈 포함), 혈청, 혈장, 소변, 타액, 생검 및/또는 조직 샘플 등이 포함된다. 생물학적 샘플 또는 조직 샘플은 또한, 비제한적으로, 종양 생검, 대변, 척수액, 흉막액, 유두 흡인물, 림프액, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨생식기의 외부 부분, 눈물, 타액, 모유, 세포(비제한적으로, 혈액 세포 포함), 종양, 기관을 포함하는 개체로부터 단리된 조직 또는 체액의 샘플, 및 또한 시험관내 세포 배양 구성성분의 샘플을 나타낼 수 있다. 상기 용어는 또한 상기 언급된 샘플의 혼합물을 포함한다. "샘플"이라는 용어는 또한 미처리된 또는 전처리된(또는 사전 가공된) 생물학적 샘플을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 검정 및 방법에 사용되는 샘플은 시험하고자 하는 대상에서 채취된 혈청 샘플을 포함한다.
E. 임상 매개변수에 의한 발현된 GBA 단백질의 효능 결정
고셰병에 대한 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 주어진 GBA 단백질의 효능(즉, 기능적 발현)은 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 하지만, 고셰병의 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 전부가 유익한 방식으로 변경되거나, 다른 임상적으로 허용되는 질환의 증상 또는 마커가, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 치료용 GBA 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터로의 치료 후 적어도 10% 정도 호전되거나 개선되는 경우, 치료는 본원에 사용된 용어로 "유효한 치료"로 간주된다. 효능은 또한 고셰병의 안정화 또는 의학적 개입의 필요성에 의해 평가되는 바와 같이 개체의 악화 실패로 측정될 수 있다(즉, 질환의 진행이 중단되거나 적어도 느려짐). 이러한 지표의 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 개체 또는 동물(일부 비제한적인 예에는, 인간 또는 포유류가 포함됨)에서의 질환의 임의의 치료를 포함하며, 이에는 (1) 고셰병을 저해하는 것, 예를 들어 고셰병의 진행을 중단시키거나 느리게 하는 것; 또는 (2) 고셰병을 완화시키는 것, 예를 들어 고셰병 증상의 퇴행을 유발하는 것; 및 (3) 고셰병의 발달 가능성을 예방하거나 감소시키는 것, 또는 고셰병과 관련된 2차 질환/장애를 예방하는 것을 포함한다. 질환의 치료를 위한 유효량은, 이를 필요로 하는 포유류에 투여되는 경우, 해당 질환에 대한 유효한 치료(이러한 용어는 본원에 정의된 바와 같음)를 유도하는 데 충분한 양을 의미한다. 작용제의 효능은 고셰병에 대해 특정한 물리적 지표를 평가하는 방식으로 결정될 수 있다. 의사는 하기를 포함하는 고셰병의 임상 증상 중 임의의 하나 이상을 평가할 수 있다: (i) 감소된 혈청 GBA. GBA의 감소는 고셰병의 치료제 개발에서의 핵심 바이오마커이다.
XI. 항체 또는 융합 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터의 다양한 적용
본원에 개시된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 조성물 및 ceDNA 벡터는 다양한 목적을 위해 GBA 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, GBA 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터는, 예를 들어 고셰병의 기능 또는 진행을 연구하기 위해, 전이유전자를 보유하는 체세포 유전자도입 동물 모델을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, GBA 단백질을 발현하는 ceDNA 벡터는 포유류 대상에서 고셰병 상태 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다.
일부 구현예에서, GBA 단백질은 증가된 발현, 유전자 산물의 증가된 활성 또는 유전자의 부적절한 상향조절과 연관된 질환을 치료하는 데 충분한 양으로 대상에서 ceDNA 벡터로부터 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, GBA 단백질은 단백질의 감소된 발현, 발현의 결여 또는 기능이상과 연관된 고셰병을 치료하는 데 충분한 양으로 대상에서 ceDNA 벡터로부터 발현될 수 있다.
당업자는, 전이유전자가 그 자체로 전사되는 유전자의 오픈리딩프레임이 아니라; 대신 표적 유전자의 프로모터 영역 또는 억제인자 영역일 수 있으며, ceDNA 벡터가 그러한 영역을 변형시킴에 따라 GBA 유전자의 발현을 조절하는 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 조성물 및 ceDNA 벡터는 상기 기재된 바와 같은 다양한 목적을 위해 GBA 단백질을 전달하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 전이유전자는 포유류 대상에서 고셰병 상태의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 하나 이상의 GBA 단백질을 인코딩한다. ceDNA 벡터에 의해 발현되는 GBA 단백질은 비정상 유전자 서열과 연관된 고셰병을 치료하는 데 충분한 양으로 환자에게 투여되어, 하기 중 임의의 하나 이상을 결과로 얻을 수 있다: 증가된 단백질 발현, 단백질의 과잉 활성, 표적 유전자 또는 단백질의 감소된 발현, 발현 결여 또는 기능이상.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, GBA 단백질이 세포 배양 시스템, 또는 대안적으로 유전자도입 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현되는, 진단 및 스크리닝 방법에서의 사용이 고려된다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 양태는 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터로 포유류 세포 집단을 형질도입시키는 방법을 제공한다. 전반적이고 일반적인 의미에서, 상기 방법은 적어도, 집단의 하나 이상의 세포에, 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터 중 하나 이상의 유효량을 포함하는 조성물을 도입하는 단계를 포함한다.
또한, 본 개시내용은 하나 이상의 추가 성분과 함께 제형화되거나, 이의 사용을 위한 하나 이상의 설명서와 함께 준비된, 하나 이상의 본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 조성물을 포함하는 조성물뿐 아니라, 치료용 및/또는 진단용 키트를 제공한다.
본원에 개시된 바와 같은 GBA 단백질의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 투여되는 세포는, 비제한적으로, 신경세포(말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뇌세포 포함), 폐세포, 망막세포, 내피세포(예를 들어, 장 및 호흡기 상피세포), 근육세포, 수지상세포, 췌장세포(섬세포 포함), 간세포, 심근세포, 골세포(예를 들어, 골수줄기세포), 조혈줄기세포, 비장세포, 각질세포, 섬유아세포, 내피세포, 전립선세포, 생식세포 등을 포함하는 임의의 유형일 수 있다. 대안적으로, 세포는 임의의 전구세포일 수 있다. 추가의 대안으로서, 세포는 줄기세포(예를 들어, 신경줄기세포, 간줄기세포)일 수 있다. 또 다른 추가의 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 나아가, 세포는 상기 제시된 바와 같은 임의의 종에서 유래할 수 있다.
A. GBA를 발현하는 ceDNA 벡터의 생산 및 정제
본원에 개시된 ceDNA 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 GBA 단백질을 생산하는 데 사용되게 된다. 이러한 방식으로 생산된 GBA 단백질은 연구 또는 치료적 치료제로서의 추가 사용을 위해 단리되고, 목적하는 기능에 대해 시험되고, 정제될 수 있다. 단백질 생산의 각 시스템에는 고유한 이점/단점이 있다. 시험관내에서 생산된 단백질은 용이하게 정제될 수 있고 단시간에 단백질이 될 수 있지만, 생체내에서 생산된 단백질은 글리코실화와 같은 번역 후 변형을 거칠 수 있다.
ceDNA 벡터를 사용하여 생산된 GBA 치료 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 침전 또는 전기영동을 사용하여 정제될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물로 생산된 GBA 치료 단백질은 목적하는 표적 단백질에의 결합에 대해 시험될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다. 당업자는, ceDNA 벡터가 본원에 기재된 야생형 또는 변형된 ITR 중 임의의 것으로부터 구축될 수 있으며, 하기 예시적인 방법을 사용하여 이러한 ceDNA 벡터를 구축하고 이의 활성을 평가할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 방법이 특정 ceDNA 벡터를 이용하는 것으로 예시되어 있지만, 설명에 따라 임의의 ceDNA 벡터에 적용할 수 있다.
실시예 1: 곤충 세포 기반 방법을 사용한 ceDNA 벡터의 구축
폴리뉴클레오타이드 구조체 주형을 사용한 ceDNA 벡터의 생산은 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)의 실시예 1에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스일 수 있다. 이론에 제한됨 없이, 허용 숙주 세포에서, 예를 들어 Rep의 존재 하에서, 2개의 대칭인 ITR과 발현 구조체를 갖는 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형(여기서, ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열에 대해 변형됨)을 복제하여 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 다음과 같은 2단계를 거친다: 첫 번째로, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스 게놈 등)으로부터의 주형의 절제("회수") 단계, 및 두 번째로, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계.
ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA-플라스미드에서 시작하는 방법이다. 도 1a 및 도 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형은 좌측 변형된 ITR과 우측 변형된 ITR을 포함하고, 상기 ITR 서열 사이에 다음을 갖는다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 전이유전자의 클로닝 부위; (iii) 전사 후 반응 요소(예를 들어, 우드척 간염바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)); 및 (iv) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장호르몬 유전자(BGHpA) 유래). 구조체의 특정 부위에 새로운 유전 구성요소의 도입을 용이하게 하기 위해, 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(R1 내지 R6)(도 1a 및 도 1b에 제시됨)를 또한 각 구성요소 사이에 도입하였다. R3(PmeI) GTTTAAAC(서열번호 123) 및 R4(PacI) TTAATTAA(서열번호 124) 효소 부위를 클로닝 부위로 조작하여, 전이유전자의 오픈리딩프레임을 도입하였다. 이러한 서열을 ThermoFisher Scientific에서 입수한 pFastBac HT B 플라스미드에 클로닝하였다.
ceDNA-박미드의 생산:
DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher)를 제조업체의 설명서에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바큐로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드와 트랜스포사아제 플라스미드의 형질전환체 및 유지를 위해 선택한 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서, 대장균(E. coli)에서의 청백색 스크리닝을 기반으로 하는 양성 선별을 스크리닝하여 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 집락을 선별하고, 10 ml 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-박미드를 대장균에서 단리하고, FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 감염성 바큐로바이러스를 생산하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 내 50 ml 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지(P0 바이러스 함유)에서 세포를 꺼내고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 세포 또는 세포 잔해물로부터 감염성 바큐로바이러스 입자를 분리하였다.
선택적으로, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 나이브(naive) Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큐로바이러스(P0)를 증폭시켰다. 세포의 직경이 18 nm 내지 19 nm(본래 직경 14 nm 내지 15 nm), 밀도가 약 4.0E+6개의 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존율을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 오비탈 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리한 후 배지 중 P1 바큐로바이러스 입자를 수집하여 세포와 잔해물을 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.
시험 구조체를 포함하는 ceDNA-바큐로바이러스를 수집하고, 바큐로바이러스의 감염 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 ml Sf9 세포 배양물(2.5E+6개의 세포/ml)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큐로바이러스로 처리하고, 25℃ 내지 27℃에서 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존율의 변화로 감염성을 측정하였다.
PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)의 도 8a에 개시된 바와 같은 "Rep-플라스미드"를, Rep78(서열번호 131 또는 133)과 Rep52(서열번호 132) 또는 Rep68(서열번호 130)과 Rep40(서열번호 129)을 포함하는 pFASTBACTM-이중 발현 벡터(ThermoFisher)에서 생산하였다. Rep-플라스미드를 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells)(Thermo Fisher)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바큐로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 박미드("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서 대장균에서의 청백색 스크리닝을 포함하는 양성 선별을 통해 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). 단리된 백색 집락을 선별하고, 10 ml의 선택된 배지(LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라시클린)에 접종하였다. 재조합 박미드(Rep-박미드)를 대장균에서 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 감염성 바큐로바이러스를 생산하였다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 ml 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 바큐로바이러스("Rep-바큐로바이러스")를 배양물에서 단리하였다. 선택적으로, 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큐로바이러스(P0)를 증폭시키고, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 배양하였다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 과정을 통해 세포를 분리하여, 배지 내 P1 바큐로바이러스 입자를 수집하였다. Rep-바큐로바이러스를 수집하고, 바큐로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 mL Sf9 세포 배양물(2.5x106개의 세포/mL)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큐로바이러스로 처리하고, 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존율의 변화로 감염성을 측정하였다.
ceDNA 벡터 생성 및 특징분석
도 4b를 참조하여, (1) ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바큐로바이러스를 함유하는 샘플, 및 (2) 상기 기재된 Rep-바큐로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를, 각각, 1:1000 및 1:10,000의 비로, Sf9 세포의 새로운 배양물(2.5E+6개의 세포/ml, 20 ml)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동 감염 4일 내지 5일 후, 세포 직경과 생존율을 검출하였다. 세포 직경이 18 nm 내지 20 nm에 도달하고, 생존율이 약 70% 내지 80%에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿을 먼저 적절한 부피의 물 또는 완충액인 수성 배지에 재현탁시켰다. Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜(Qiagen, 컬럼당 처리되는 세포 펠릿 질량 0.2 mg)을 사용하여, 세포에서 ceDNA 벡터를 단리하고 정제하였다.
Sf9 곤충 세포에서 생산되고 정제된 ceDNA 벡터의 수율을 초기에 260 nm에서의 UV 흡광도를 기반으로 측정하였다.
ceDNA 벡터는 도 4d에 예시된 미변성 또는 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동으로 확인하여 평가할 수 있으며, 여기서 (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 미변성 겔에 비해 변성 겔에서 2배 크기로 이동하는 특징적인 밴드의 존재, 및 (b) 절단되지 않은 물질의 경우 미변성 겔에서 단량체 및 이량체(2x) 밴드의 존재가, ceDNA 벡터 존재의 특징이다.
공동 감염된 Sf9 세포(본원에 기재된 바와 같음)에서 수득된 DNA를, a) ceDNA 벡터 내 오로지 단일 절단 부위만 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로오스 겔 상에서 분별 시 명확하게 확인할 수 있을 만큼 큰 생성된 단편(>800 bp)에 대해 선별된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 단리된 ceDNA 벡터의 구조를 추가로 분석하였다. 도 4d 및 도 4e에 예시된 바와 같이, 비연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터와 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터를 이의 반응 생성물의 크기로 구별할 수 있다: 예를 들어 비연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1 kb 및 2 kb 단편을 생성할 것으로 예상되고, 연속 구조를 갖는 비캡시드화된 벡터는 2 kb 및 4 kb 단편을 생성할 것으로 예상된다.
따라서, 단리된 ceDNA 벡터가 정의에 따라 공유결합으로 폐쇄되어 있다는 것을 정성적으로 입증하기 위해, 샘플을 단일 제한 부위를 갖는 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 바람직하게는 동일하지 않은 크기의 2개의 절단 산물(예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)을 수득하였다. 소화 및 변성 겔 상에서의 전기영동(이는 2개의 상보적 DNA 가닥을 분리함) 후, 선형의 비공유결합으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp의 크기로 분리될 것이지만, 공유결합으로 폐쇄된 DNA(즉, ceDNA 벡터)는 2개의 DNA 가닥이 연결되고 언폴딩되어 (단일가닥이지만) 길이가 2배가 됨으로써, 2배 크기(2000 bp 및 4000 bp)로 분리될 것이다. 나아가, 단량체, 이량체 및 n량체 형태의 DNA 벡터의 소화는 모두 다량체 DNA 벡터의 말단 대 말단 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 분리될 것이다(도 4d 참조).
본원에 사용된 "미변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 식별을 위한 검정"이라는 구절은, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 이어서 소화 산물의 전기영동을 수행하는 방식으로 ceDNA의 폐쇄형 말단을 평가하는 검정을 나타낸다. 하나의 이러한 예시적인 검정이 하기에 이어지지만, 당업자는 이러한 예에 대한 다수의 업계 공지 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x인 산물을 생성하게 되는 관심 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소인 것으로 선택된다. 이는, 미변성 및 변성 겔 모두에 대한 밴드를 분리한다. 변성 전, 샘플에서 완충액을 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR 클린업 키트(clean-up kit) 또는 탈염 "스핀 컬럼", 예를 들어 GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25 컬럼이 엔도뉴클레아제 소화에 대한 일부 업계 공지 옵션이다. 상기 검정은, 예를 들어 i) 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)를 이용하여 DNA를 소화시키는 단계, ii) 예를 들어 Qiagen PCR 클린업 키트에 적용하고, 증류수로 용리하는 단계, iii) 10x 변성 용액(10x = 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA)을 첨가하고, 완충되지 않은 10X 염료를 첨가하고, NaOH 농도가 겔과 겔 박스에서 균일하도록 보장하기 위해 1 mM EDTA 및 200 mM NaOH와 함께 이전에 인큐베이션한 0.8% 내지 1.0% 겔 상에 10X 변성 용액을 4배로 첨가하여 제조된 DNA ladder와 함께 분석하고, 1x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)의 존재 하에서 겔에서 전개시키는 단계를 포함한다. 당업자는, 크기 및 목적하는 결과 타이밍을 기반으로 전기영동을 수행하는 데 어떤 전압을 사용해야 하는 지를 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수하고, 1x TBE 또는 TAE에서 중화시키고, 1x SYBR Gold을 함유한 1x TBE/TAE 또는 증류수로 옮겼다. 이어서, 밴드를, 예를 들어 Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain(DMSO 중 10,000X 농축물) 및 에피형광(청색) 또는 UV(312 nm)를 이용하여 가시화할 수 있다.
생성된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 업계 공지 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 하나의 예시적이고 비제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교하여 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도에 기반하여, 4 μg의 ceDNA 벡터가 겔 상에 로딩되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1 μg인 것으로 공지된 2 kb 밴드와 동등한 경우, 1 μg의 ceDNA 벡터가 존재하며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수 물질의 25%이다. 이어서, 겔 상의 밴드 강도를 밴드가 나타내는 계산된 입력에 대해 플롯팅한다: 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8 kb이고, 절제된 비교용 밴드가 2 kb인 경우, 밴드 강도는 총 입력의 25%로서 플롯팅될 것이며, 이러한 경우 1.0 μg 입력에 대한 값은 0.25 μg일 것이다. ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플롯팅한 후, 회귀선 방정식을 사용하여 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산한 다음, 이를 사용하여 ceDNA 벡터로 표시되는 총 입력의 % 또는 순도%를 결정할 수 있다.
비교 목적으로, 실시예 1에는 곤충 세포 기반 방법 및 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형을 사용한 ceDNA 벡터의 생산 방법이 기재되어 있으며, 이는 또한 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)의 실시예 1에 기재되어 있다. 예를 들어, 실시예 1에 따른 본 개시내용의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스일 수 있다. 이론에 제한됨 없이, 허용 숙주 세포에서, 예를 들어 Rep의 존재 하에서, 2개의 대칭인 ITR과 발현 구조체를 갖는 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형(여기서, ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열에 대해 변형됨)을 복제하여 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 다음과 같은 2단계를 거친다: 첫 번째로, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스 게놈 등)으로부터의 주형의 절제("회수") 단계, 및 두 번째로, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계.
곤충 세포를 사용하는 방법으로 ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA-플라스미드에서 시작하는 방법이다. 도 1a 및 도 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형은 좌측 변형된 ITR과 우측 변형된 ITR을 포함하고, 상기 ITR 서열 사이에 다음을 갖는다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 전이유전자의 클로닝 부위; (iii) 전사 후 반응 요소(예를 들어, 우드척 간염바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)); 및 (iv) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장호르몬 유전자(BGHpA) 유래). 구조체의 특정 부위에 새로운 유전 구성요소의 도입을 용이하게 하기 위해, 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(R1 내지 R6)(도 1a 및 도 1b에 제시됨)를 또한 각 구성요소 사이에 도입하였다. R3(PmeI) GTTTAAAC(서열번호 123) 및 R4(PacI) TTAATTAA(서열번호 124) 효소 부위를 클로닝 부위로 조작하여, 전이유전자의 오픈리딩프레임을 도입하였다. 이러한 서열을 ThermoFisher Scientific에서 입수한 pFastBac HT B 플라스미드에 클로닝하였다.
ceDNA-박미드의 생산:
DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher)를 제조업체의 설명서에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바큐로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드와 트랜스포사아제 플라스미드의 형질전환체 및 유지를 위해 선택한 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서, 대장균(E. coli)에서의 청백색 스크리닝을 기반으로 하는 양성 선별을 스크리닝하여 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 집락을 선별하고, 10 ml 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-박미드를 대장균에서 단리하고, FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 감염성 바큐로바이러스를 생산하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 내 50 ml 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지(P0 바이러스 함유)에서 세포를 꺼내고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 세포 또는 세포 잔해물로부터 감염성 바큐로바이러스 입자를 분리하였다.
선택적으로, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 나이브(naive) Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큐로바이러스(P0)를 증폭시켰다. 세포의 직경이 18 nm 내지 19 nm(본래 직경 14 nm 내지 15 nm), 밀도가 약 4.0E+6개의 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존율을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 오비탈 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리한 후 배지 중 P1 바큐로바이러스 입자를 수집하여 세포와 잔해물을 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.
시험 구조체를 포함하는 ceDNA-바큐로바이러스를 수집하고, 바큐로바이러스의 감염 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 ml Sf9 세포 배양물(2.5E+6개의 세포/ml)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큐로바이러스로 처리하고, 25℃ 내지 27℃에서 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존율의 변화로 감염성을 측정하였다.
"Rep-플라스미드"를 Rep78(서열번호 131 또는 서열번호 133) 또는 Rep68(서열번호 130) 및 Rep52(서열번호 132) 또는 Rep40(서열번호 129) 둘 모두를 포함하는 pFASTBAC™-이중 발현 벡터(ThermoFisher)에서 생산하였다. Rep-플라스미드를 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells)(Thermo Fisher®)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바큐로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 박미드("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서 대장균에서의 청백색 스크리닝을 포함하는 양성 선별을 통해 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). 단리된 백색 집락을 선별하고, 10 ml의 선택된 배지(LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라시클린)에 접종하였다. 재조합 박미드(Rep-박미드)를 대장균에서 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 감염성 바큐로바이러스를 생산하였다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 ml 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 바큐로바이러스("Rep-바큐로바이러스")를 배양물에서 단리하였다. 선택적으로, 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큐로바이러스(P0)를 증폭시키고, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 배양하였다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 과정을 통해 세포를 분리하여, 배지 내 P1 바큐로바이러스 입자를 수집하였다. Rep-바큐로바이러스를 수집하고, 바큐로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 mL Sf9 세포 배양물(2.5x106개의 세포/mL)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큐로바이러스로 처리하고, 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존율의 변화로 감염성을 측정하였다.
ceDNA 벡터 생성 및 특징분석
(1) ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바큐로바이러스를 함유하는 샘플, 및 (2) 상기 기재된 Rep-바큐로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를, 각각, 1:1000 및 1:10,000의 비로, Sf9 세포의 새로운 배양물(2.5E+6개의 세포/ml, 20 ml)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동 감염 4일 내지 5일 후, 세포 직경과 생존율을 검출하였다. 세포 직경이 18 nm 내지 20 nm에 도달하고, 생존율이 약 70% 내지 80%에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿을 먼저 적절한 부피의 물 또는 완충액인 수성 배지에 재현탁시켰다. Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜(Qiagen, 컬럼당 처리되는 세포 펠릿 질량 0.2 mg)을 사용하여, 세포에서 ceDNA 벡터를 단리하고 정제하였다.
Sf9 곤충 세포에서 생산되고 정제된 ceDNA 벡터의 수율을 초기에 260 nm에서의 UV 흡광도를 기반으로 측정하였다. 정제된 ceDNA 벡터를 실시예 5에 기재된 전기영동 방법을 사용하여 적절한 폐쇄형 구성에 대해 평가할 수 있다.
실시예 2: 이중가닥 DNA 분자로부터의 절제를 통한 합성 ceDNA 생산
ceDNA 벡터의 합성 생산은 2019년 1월 18일자 출원된 국제 출원 PCT/US19/14122의 실시예 2 내지 실시예 6에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 이중가닥 DNA 분자의 절제를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 하나의 예시적인 방법. 간략하게, ceDNA 벡터는 이중가닥 DNA 구조체를 사용하여 생성할 수 있다(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 7a 내지 도 8e 참조). 일부 구현예에서, 이중가닥 DNA 구조체는 ceDNA 플라스미드이다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242의 도 6 참조).
일부 구현예에서, ceDNA 벡터 제조용 구조체는 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.
예시 목적으로, 실시예 2는 이러한 방법을 사용하여 생성된 예시적인 폐쇄형 DNA 벡터로서의 ceDNA 벡터의 생산을 설명한다. ITR과 발현 카세트(예를 들어, 핵산 서열)를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드의 절제, 이어서 본원에 기재된 바와 같은 유리된 3' 및 5' 말단의 결찰에 의해 폐쇄형 DNA 벡터를 생성하는 시험관내 합성 생산 방법을 설명하는 상기 실시예에 ceDNA 벡터가 예시되어 있지만, 당업자는, 상기 예시된 바와 같이, 비제한적으로, 개뼈형 DNA, 덤벨형 DNA 등을 포함하는 임의의 목적하는 폐쇄형 DNA 벡터가 생성되도록, 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드 분자를 변형시킬 수 있다는 것을 알고 있다. 실시예 2에 기재된 합성 생산 방법에 따라 생산될 수 있는 항체 또는 융합 단백질의 생산을 위한 예시적인 ceDNA 벡터는, "III ceDNA 벡터 전반"라는 제목의 섹션에 논의되어 있다. ceDNA 벡터에 의해 발현되는 예시적인 항체 및 융합 단백질은, "IIC ceDNA 벡터에 의해 발현되는 예시적인 항체 및 융합 단백질"이라는 제목의 섹션에 논의되어 있다.
상기 방법은 (i) 이중가닥 DNA 구조체로부터 발현 카세트를 인코딩하는 서열을 절제하는 단계, (ii) ITR 중 하나 이상에서 헤어핀 구조를 형성하는 단계, 및 (iii) 유리된 5' 및 3' 말단을 결찰, 예를 들어 T4 DNA 리가아제에 의해 결합하는 단계를 포함한다.
이중가닥 DNA 구조체는, 5'→3' 순서로, 제1 제한 엔도뉴클레아제 부위; 업스트림 ITR; 발현 카세트; 다운스트림 ITR; 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 이어서, 이중가닥 DNA 구조체를 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시켜, 양쪽 제한 엔도뉴클레아제 부위에 이중가닥 절단물을 생성한다. 하나의 엔도뉴클레아제는 2개의 부위를 모두 표적화할 수 있거나, 제한 부위가 ceDNA 벡터 주형에 존재하지 않는 한 각각의 부위는 상이한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있다. 이는 나머지 이중가닥 DNA 구조체로부터 제한 엔도뉴클레아제 부위 사이의 서열을 절제한다(PCT/US19/14122의 도 9 참조). 결찰시켜, 폐쇄형 DNA 벡터를 형성한다.
상기 방법에 사용되는 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형 ITR일 수 있다. 변형된 ITR을 또한 사용할 수 있으며, 여기서 변형은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하거나(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 6 내지 도 8, 도 10 및 도 11b 참조), 2개 이상의 헤어핀 루프(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 6 내지 도 8 및 도 11b 참조) 또는 단일 헤어핀 루프(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 10a, 도 10b 및 도 11b 참조)를 가질 수 있다. 헤어핀 루프 변형된 ITR은 기존 올리고의 유전적 변형 또는 새로운(de novo) 생물학적 및/또는 화학적 합성으로 생성할 수 있다.
비제한적인 예에서, 좌측 및 우측 ITR-6(서열번호 111 및 서열번호 112)은 AAV2의 야생형 ITR로부터 B-B' 및 C-C' 아암의 40개 뉴클레오타이드 결실을 포함한다. 변형된 ITR에 남아있는 뉴클레오타이드는 단일 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예측된다. 상기 구조의 언폴딩 깁스 자유 에너지는 약 -54.4 kcal/mol이다. 기능성 Rep 결합 부위 또는 Trs 부위의 선택적 결실을 비롯한 ITR에 대한 다른 변형이 또한 이루어질 수 있다.
실시예 3: 올리고뉴클레오타이드 구축을 통한 ceDNA 생산
다양한 올리고뉴클레오타이드의 어셈블리를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이, PCT/US19/14122의 실시예 3에 제공되어 있으며, 여기서 ceDNA 벡터는 5' 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계, 및 ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 단계를 통해 생산된다. PCT/US19/14122의 도 11b는, 5' ITR 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 예시적인 방법을 보여준다.
본원에 개시된 바와 같이, ITR 올리고뉴클레오타이드는 WT-ITR(예를 들어, 도 3a, 도 3c 참조) 또는 변형된 ITR(예를 들어, 도 3b 및 도 3d 참조)을 포함할 수 있다. (또한, PCT/US19/14122(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)의 도 6a, 도 6b, 도 7a 및 도 7b 참조). 예시적인 ITR 올리고뉴클레오타이드에는, 비제한적으로, 서열번호 134 내지 서열번호 145가 포함된다(예를 들어, PCT/US19/14122의 표 7 참조). 변형된 ITR은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 무세포 합성에 사용되는 본원에 기재된 바와 같은 WT-ITR 또는 mod-ITR을 포함하는 ITR 올리고뉴클레오타이드는, 유전적 변형, 또는 생물학적 및/또는 화학적 합성으로 생성할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 실시예 2와 실시예 3의 ITR 올리고뉴클레오타이드는 WT-ITR, 또는 본원에 논의된 바와 같은 대칭 또는 비대칭 구성의 변형된 ITR(mod-ITR)을 포함할 수 있다.
실시예 4: 단일가닥 DNA 분자를 통한 ceDNA 생산
합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이 PCT/US19/14122의 실시예 4에 제공되어 있으며, 이는 센스 발현 카세트 서열을 플랭킹하고, 안티센스 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 안티센스 ITR에 공유결합으로 부착된 2개의 센스 ITR을 포함하는 단일가닥 선형 DNA를 사용하며, 이러한 단일가닥 선형 DNA의 말단을 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성한다. 하나의 비제한적인 예는, 단일가닥 DNA 분자를 합성 및/또는 생산하는 단계, 분자의 일부를 어닐링하여 하나 이상의 2차 구조 염기쌍 영역을 갖는 단일 선형 DNA 분자를 형성하는 단계, 및 유리된 5' 및 3' 말단을 서로 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성하는 단계를 포함한다.
ceDNA 벡터 생산을 위한 예시적인 단일가닥 DNA 분자는, 5'→3' 방향으로, 센스 제1 ITR; 센스 발현 카세트 서열; 센스 제2 ITR; 안티센스 제2 ITR; 안티센스 발현 카세트 서열; 및 안티센스 제1 ITR을 포함한다.
실시예 4의 예시적인 방법에 사용되는 단일가닥 DNA 분자는 본원에 기재된 임의의 DNA 합성 방법, 예를 들어 시험관내 DNA 합성으로 형성하거나, 뉴클레아제를 이용하여 DNA 구조체(예를 들어, 플라스미드)를 절단하고 생성된 dsDNA 단편을 용융시켜 ssDNA 단편을 제공하는 방식으로 제공할 수 있다.
센스 및 안티센스 서열 쌍의 계산된 용융 온도 미만으로 온도를 저하시켜 어닐링을 달성할 수 있다. 용융 온도는 특정 뉴클레오타이드 염기 함량과, 사용되는 용액의 특징, 예를 들어 염 농도에 따라 달라진다. 당업자는 임의의 주어진 서열 및 용액 조합에 대한 용융 온도를 쉽게 계산할 수 있다.
어닐링된 분자의 유리된 5' 및 3' 말단을 서로 결찰시키거나 헤어핀 분자에 결찰시켜, ceDNA 벡터를 형성할 수 있다. 적합한 예시적인 결찰 방법 및 헤어핀 분자는 실시예 2 및 실시예 3에 기재되어 있다.
실시예 5: ceDNA의 정제 및/또는 생산 확인
예를 들어 실시예 1에 기재된 곤충 세포 기반 생산 방법, 또는 실시예 2 내지 4에 기재된 합성 생산 방법을 포함하는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 임의의 DNA 벡터 산물을, 당업자에게 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 불순물, 미사용 구성요소 또는 부산물을 제거하기 위해 정제할 수 있고/있거나; 생산된 DNA 벡터(이러한 경우, ceDNA 벡터)가 목적하는 분자인지를 확인하기 위해 분석할 수 있다. DNA 벡터, 예를 들어 ceDNA의 예시적인 정제 방법은, Qiagen Midi Plus 정제 프로토콜(Qiagen) 및/또는 겔 정제를 사용하는 것이다.
ceDNA 벡터의 정체를 확인하는 예시적인 방법은 다음과 같다.
ceDNA 벡터는 도 4d에 예시된 미변성 또는 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동으로 확인하여 평가할 수 있으며, 여기서 (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 미변성 겔에 비해 변성 겔에서 2배 크기로 이동하는 특징적인 밴드의 존재, 및 (b) 절단되지 않은 물질의 경우 미변성 겔에서 단량체 및 이량체(2x) 밴드의 존재가, ceDNA 벡터 존재의 특징이다.
정제된 DNA를, a) ceDNA 벡터 내 오로지 단일 절단 부위만 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로오스 겔 상에서 분별 시 명확하게 확인할 수 있을 만큼 큰 생성된 단편(>800 bp)에 대해 선별된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 단리된 ceDNA 벡터의 구조를 추가로 분석하였다. 도 4c 및 도 4d에 예시된 바와 같이, 비연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터와 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터를 이의 반응 생성물의 크기로 구별할 수 있다: 예를 들어 비연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1 kb 및 2 kb 단편을 생성할 것으로 예상되고, 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 2 kb 및 4 kb 단편을 생성할 것으로 예상된다.
따라서, 단리된 ceDNA 벡터가 정의에 따라 공유결합으로 폐쇄되어 있다는 것을 정성적으로 입증하기 위해, 샘플을 단일 제한 부위를 갖는 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 바람직하게는 동일하지 않은 크기의 2개의 절단 산물(예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)을 수득하였다. 소화 및 변성 겔 상에서의 전기영동(이는 2개의 상보적 DNA 가닥을 분리함) 후, 선형의 비공유결합으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp의 크기로 분리될 것이지만, 공유결합으로 폐쇄된 DNA(즉, ceDNA 벡터)는 2개의 DNA 가닥이 연결되고 언폴딩되어 (단일가닥이지만) 길이가 2배가 됨으로써, 2배 크기(2000 bp 및 4000 bp)로 분리될 것이다. 나아가, 단량체, 이량체 및 n량체 형태의 DNA 벡터의 소화는 모두 다량체 DNA 벡터의 말단 대 말단 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 분리될 것이다(도 4e 참조).
본원에 사용된 "미변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 식별을 위한 검정"이라는 구절은, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 이어서 소화 산물의 전기영동을 수행하는 방식으로 ceDNA의 폐쇄형 말단을 평가하는 검정을 나타낸다. 하나의 이러한 예시적인 검정이 하기에 이어지지만, 당업자는 이러한 예에 대한 다수의 업계 공지 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x인 산물을 생성하게 되는 관심 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소인 것으로 선택된다. 이는, 미변성 및 변성 겔 모두에 대한 밴드를 분리한다. 변성 전, 샘플에서 완충액을 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR 클린업 키트(clean-up kit) 또는 탈염 "스핀 컬럼", 예를 들어 GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25 컬럼이 엔도뉴클레아제 소화에 대한 일부 업계 공지 옵션이다. 상기 검정은, 예를 들어 i) 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)를 이용하여 DNA를 소화시키는 단계, ii) 예를 들어 Qiagen PCR 클린업 키트에 적용하고, 증류수로 용리하는 단계, iii) 10x 변성 용액(10x = 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA)을 첨가하고, 완충되지 않은 10X 염료를 첨가하고, NaOH 농도가 겔과 겔 박스에서 균일하도록 보장하기 위해 1 mM EDTA 및 200 mM NaOH와 함께 이전에 인큐베이션한 0.8% 내지 1.0% 겔 상에 10X 변성 용액을 4배로 첨가하여 제조된 DNA ladder와 함께 분석하고, 1x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)의 존재 하에서 겔에서 전개시키는 단계를 포함한다. 당업자는, 크기 및 목적하는 결과 타이밍을 기반으로 전기영동을 수행하는 데 어떤 전압을 사용해야 하는 지를 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수하고, 1x TBE 또는 TAE에서 중화시키고, 1x SYBR Gold을 함유한 1x TBE/TAE 또는 증류수로 옮겼다. 이어서, 밴드를, 예를 들어 Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain(DMSO 중 10,000X 농축물) 및 에피형광(청색) 또는 UV(312 nm)를 이용하여 가시화할 수 있다. 겔 밴드에서 ceDNA 벡터를 분리하고 이를 재생시키는 방식으로 전술한 겔 기반 방법을 정제 목적에 맞게 조정할 수 있다.
생성된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 업계 공지 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 하나의 예시적이고 비제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교하여 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도에 기반하여, 4 μg의 ceDNA 벡터가 겔 상에 로딩되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1 μg인 것으로 공지된 2 kb 밴드와 동등한 경우, 1 μg의 ceDNA 벡터가 존재하며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수 물질의 25%이다. 이어서, 겔 상의 밴드 강도를 밴드가 나타내는 계산된 입력에 대해 플롯팅한다: 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8 kb이고, 절제된 비교용 밴드가 2 kb인 경우, 밴드 강도는 총 입력의 25%로서 플롯팅될 것이며, 이러한 경우 1.0 μg 입력에 대한 값은 0.25 μg일 것이다. ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플롯팅한 후, 회귀선 방정식을 사용하여 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산한 다음, 이를 사용하여 ceDNA 벡터로 표시되는 총 입력의 % 또는 순도%를 결정할 수 있다.
실시예 6: ceDNA로부터의 제어된 전이유전자 발현: ceDNA 벡터로부터의 전이유전자 발현은 생체내에서 재-용량 투여에 의해 지속되고/되거나 증가될 수 있다.
상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 비대칭인 ITR(예를 들어, 5' WT-ITR(서열번호 2)과 3' mod-ITR(서열번호 3)) 사이에 플랭킹된 예시적인 GBA로서의 루시퍼라아제 전이유전자(서열번호 56)와 CAG 프로모터(서열번호 72)를 포함하는 ceDNA 플라스미드를 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하고, 생체내 상이한 처리 프로그램으로 평가하였다. 이러한 ceDNA 벡터를 실시예 6 내지 10에 기재된 모든 후속 실험에 사용하였다. 실시예 6에서, ceDNA 벡터를 정제하고 지질 나노입자(LNP ceDNA)로 제형화하여, 각 CD-1® IGS 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 리포좀을 지질 나노입자(LNP) 리포좀을 형성하는 데 적합한 4개의 구성요소(양이온성 지질, 헬퍼 지질, 콜레스테롤 및 PEG-지질을 포함함)를 포함하는 지질 블렌드를 이용하여 제형화하였다.
장기간에 걸쳐 ceDNA 벡터로부터 생체내 전이유전자의 지속된 발현을 평가하기 위해, LNP-ceDNA를 멸균 PBS 중의 꼬리 정맥내 주사로 대략 5주령 내지 7주령의 CD-1® IGS 마우스에 투여하였다. 3가지 상이한 투여군을 평가하였다: 0.1 mg/kg, 0.5 mg/kg 및 1.0 mg/kg, 군당 10마리(단, 1.0 mg/kg 군은 군당 15마리였음). 0일차에 주사를 투여하였다. 28일차에, 각 군의 5마리 마우스에게 동일한 용량을 추가로 주사하였다. CD-1® IGS 마우스(Charles River Laboratories; WT 마우스)에게 정맥내 주사한 후, IVIS 이미지화로 루시퍼라아제 발현을 측정하였다. 3일차, 4일차, 7일차, 14일차, 21일차, 28일차, 31일차, 35일차 및 42일차, 및 42일차 내지 110일차 사이에 정기적으로(예를 들어, 매주, 격주 또는 10일마다 또는 2주마다) 150 mg/kg 루시페린 기질을 복강내 주사한 후, IVIS 이미지화로 루시퍼라아제 발현을 평가하였다. 3가지 상이한 투여 프로토콜 후, 적어도 132일 동안 IVIS 이미지화로 측정된 예시적인 GBA 전이유전자로서의 루시퍼라아제 전이유전자 발현(데이터는 제시되지 않음).
LNP-ceDNA 처리된 대상의 재투여, 예를 들어 루시퍼라아제를 발현하는 LNP-ceDNA의 재투여 효과를 조사하기 위해 확장된 연구를 수행하였다. 특히, 발현 수준이 ceDNA 벡터의 1회 이상 추가 투여에 의해 증가될 수 있는 지를 결정하기 위해 평가하였다.
이러한 연구에서, 0일차 및 28일차에 1.0 mg/kg의 초기 정맥내 투여(즉, 프라이밍 투여) 후, CD-1® IGS 마우스에서 IVIS로 ceDNA 벡터로부터의 루시퍼라아제 발현의 체내분포를 평가하였다(군 A). 84일차에 꼬리 정맥에의 3 mg/kg(군 B) 또는 10 mg/kg(군 C)의 꼬리 정맥 주사(1.2 mL)를 통해 ceDNA 벡터의 두 번째 투여를 투여하였다. 이러한 연구에서, 군 A, B 및 C 각각에서 5마리 CD-1® 마우스를 사용하였다. 추가 투여 전 49일차, 56일차, 63일차 및 70일차뿐 아니라, 84일차의 재투여 후, 및 91일차, 98일차, 105일차, 112일차 및 132일차에, 상기 기재된 바와 같이 루시퍼라아제 발현에 대한 마우스의 IVIS 이미지화를 수행하였다. 적어도 110일(평가된 가장 긴 기간)까지 3가지 군 A, B 및 C 모두에서 루시퍼라아제 발현을 평가하고 검출하였다.
루시퍼라아제의 발현 수준은, 루시페린의 존재 하에서 루시퍼라아제 활성의 평가로 결정된 바와 같이, LNP-ceDNA-Luc의 재투여(즉, ceDNA 조성물의 재투여)에 의해 증가되는 것으로 나타났다. 루시퍼라아제 전이유전자 발현은 예시적인 GBA 전이유전자이며, 이는 3가지 상이한 투여 프로토콜(군 A, B 및 C) 후, 적어도 110일 동안 IVIS 이미지화로 측정된다. 임의의 추가 재투여 처리를 받지 않은 마우스(1 mg/kg 프라이밍 투여)(즉, 군 A)에서는 연구 기간에 걸쳐 안정한 루시퍼라아제 발현이 관찰되었다. 3 mg/kg의 ceDNA 벡터를 재투여받은 군 B의 마우스는 군 C의 마우스에 비해 관찰된 광도가 대략 7배 증가된 것으로 나타냈다. 놀랍게도, 10 mg/kg의 ceDNA 벡터를 재투여받은 마우스는 임의의 재투여를 받지 않은 마우스(군 A)보다 관찰된 루시퍼라아제 광도가 17배 증가되었다.
군 A는, 0일차 및 28일차에 꼬리 정맥으로 1 mg/kg ceDNA 벡터의 정맥내 투여 후 CD-1® IGS 마우스에서의 루시퍼라아제 발현을 나타낸다. 군 B 및 군 C는, 첫 번째 시점(0일차)에서 1 mg/kg의 ceDNA 벡터를 투여받고, 84일차 두 번째 시점에서 ceDNA 벡터를 재투여받은 CD-1® IGS 마우스에서의 루시퍼라아제 발현을 나타낸다. ceDNA 벡터의 두 번째 투여(즉, 재투여)는 발현을 적어도 7배, 심지어 최대 17배로 증가시켰다.
군 B에서 재투여 시 ceDNA 벡터 용량(즉, 양)의 3배 증가(즉, 3 mg/kg의 재투여)는, 루시퍼라아제의 발현을 7배 증가시켰다. 또한 예상치 못하게, 군 C에서 재투여 시 ceDNA 벡터 양의 10배 증가(즉, 10 mg/kg 재투여)는 루시퍼라아제의 발현을 17배 증가시켰다. 따라서, ceDNA의 두 번째 투여(즉, 재투여)는 발현을 적어도 7배, 심지어 최대 17배로 증가시켰다. 이는, 재투여를 통한 전이유전자 발현의 증가가 예상했던 것보다 크고, 재투여 시 ceDNA 벡터의 용량 또는 양에 따라 달라지며, 0일차의 초기 프라이밍 투여에 의한 초기 전이유전자 발현에 상승작용을 나타내는 것으로 보인다. 즉, 전이유전자 발현의 용량 의존적 증가는 부가작용이 아니라, 전이유전자의 발현 수준은 용량 의존적이며 각 시점에서 투여된 ceDNA 벡터의 양의 합보다 크다.
군 B 및 군 C는, 두 번째 시점에서 ceDNA 벡터가 재투여되지 않은 대조군 마우스(군 A)와 비교 시 루시퍼라아제 발현의 유의한 용량 의존적 증가를 나타냈다. 종합하면, 이러한 데이터는, ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 발현이 적어도 두 번째 시점에서의 ceDNA 벡터의 재투여(즉, 재투여)에 의해 용량 의존적 방식으로 증가될 수 있음을 보여준다.
종합하면, 이러한 데이터는, ceDNA 벡터로부터의 전이유전자, 예를 들어 GBA의 발현 수준이 적어도 84일 동안 일관된 수준으로 유지될 수 있으며, 적어도 두 번째 시점에서 투여된 ceDNA 벡터의 재투여 후 생체내에서 증가될 수 있음을 입증한다.
실시예 7: LNP-제형화된 ceDNA 벡터의 생체내 지속된 전이유전자 발현
상이한 지질 나노입자를 이용한 실시예 6에서의 결과의 재현성을 마우스의 생체내에서 평가하였다. 0일차에, 실시예 6에서 사용된 바와 상이한 LNP, 또는 polyC를 포함하지만 ceDNA 또는 루시퍼라아제 유전자가 결여되어 있는 동일한 LNP에 캡슐화된 CAG 프로모터에 의해 구동되는 루시퍼라아제 전이유전자를 포함하는 ceDNA 벡터를 마우스에 투여하였다. 구체적으로, 0일차에, 대략 약 4주령의 수컷 CD-1® 마우스를 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여되는 0.5 mg/kg LNP-TTX-루시퍼라아제 또는 대조군 LNP-polyC의 단회 주사로 처리하였다. 14일차에, 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 동물에게 150 mg/kg의 루시페린을 전신으로 투여하였다. 루시페린 투여 대략 15분 후, 생체내 이미지화 시스템(In Vivo Imaging System, "IVIS")을 사용하여 각 동물을 이미지화하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 4마리의 모든 ceDNA 처리된 마우스 간에서 유의한 형광이 관찰되었고, 동물의 주사 부위 이외에서는 다른 형광이 거의 관찰되지 않았으며, 이는 LNP가 ceDNA 구조체의 간 특이적 전달을 매개하고, 전달된 ceDNA 벡터가 투여 후 적어도 2주 동안 이의 전이유전자의 지속된 발현을 제어할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8: ceDNA 벡터 투여에 의한 생체내 간에서의 지속된 전이유전자 발현
별도의 실험으로, 처리된 동물의 간 내에서 LNP를 통해 전달된 ceDNA의 국소화를 평가하였다. 관심 기능성 전이유전자를 포함하는 ceDNA 벡터를 실시예 7에 사용된 바와 동일한 LNP로 캡슐화하고, 0.5 mg/kg의 용량 수준으로 정맥내 주사를 통해 마우스에게 생체내 투여하였다. 6시간 후, 마우스를 종결시키고, 간 샘플을 취하여, 표준 프로토콜에 따라 포르말린 고정시키고 파라핀 포매시켰다. 조직 내 ceDNA 벡터를 가시화하기 위해, ceDNA 전이유전자에 대해 특이적인 프로브를 사용하여 RNAscope® 제자리 혼성화 검정을 수행하고, 발색 반응 및 헤마톡실린 염색(Advanced Cell Diagnostics)을 사용하여 검출하였다. 도 7은, ceDNA가 간세포에 존재함을 나타내는 결과를 보여준다.
실시예 9: 생체내 ceDNA의 지속된 안구 전이유전자 발현
생체내 안구 투여 후 ceDNA 벡터의 관용성 및 발현을 결정하기 위해 간 이외의 조직에서 ceDNA 벡터 전이유전자 발현의 지속성을 평가하였다. 실시예 9에서 예시적인 전이유전자로 루시퍼라아제를 사용하였지만, 당업자는 루시퍼라아제 전이유전자를 표 1에 열거된 것들 중 임의의 것의 GBA 서열 또는 표 13에 열거된 임의의 ceDNA 서열에 포함된 임의의 오픈리딩프레임(ORF)의 FIX 서열로 용이하게 대체할 수 있다.
0일차에, jetPEI® 트랜스펙션 시약(Polyplus)으로 제형화된 루시퍼라아제 전이유전자 또는 jetPEI®로 제형화된 루시퍼라아제를 인코딩하는 플라스미드 DNA를, 둘 모두 0.25 μg/μL의 농도로, 포함하는 ceDNA 벡터 5 μL를 대략 9주령의 수컷 스프래그 돌리(Sprague Dawley) 래트에게 망막하 주사하였다. 각 군에서 4마리의 래트를 시험하였다. 동물을 진정시키고, 33 게이지 바늘을 사용하여 시험 물품을 우측 눈에 망막하 주사하였다. 각 동물의 좌측 눈은 처리하지 않았다. 주사 직후, 망막하 수포(subretinal bleb)의 존재를 확인하기 위해 광간섭단층영상(optical coherence tomography) 또는 안저 이미지화(fundus imaging)를 이용하여 눈을 점검하였다. 래트를 표준 절차에 따라 부프레노르핀(buprenorphine) 및 국소 항생제 연고로 처리하였다.
7일차, 14일차, 21일차, 28일차 및 35일차에, 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 양쪽 군의 동물에게 150 mg/kg의 새로 제조된 루시페린을 전신으로 투여하였다. 루시페린 투여 5분 내지 15분 후, 모든 동물을 이소플루란 마취 하에서 IVIS를 사용하여 이미지화하였다. 눈을 포함하는 관심 영역에서 5분 노출에 걸친 총 플럭스[p/s]와 평균 플럭스(p/s/sr/cm2)를 얻었다. 각 처리 군의 미처리된 눈("주사되지 않음")에서의 평균 강도에 대한 각 처리 군의 처리된 눈("주사됨")에서의 평균 광도로 결과를 그래프화하였다(도 8b). ceDNA 벡터 처리된 눈에서는 유의한 형광을 쉽게 검출할 수 있었지만, 플라스미드 처리된 눈에서는 훨씬 약했다(도 8a). 35일 후, 플라스미드 주사된 래트는 종결시켰지만, ceDNA 처리된 래트에 대해서는 연구를 지속하여, 42일차, 49일차, 56일차, 63일차, 70일차 및 99일차에 루시페린을 주사하고 IVIS 이미지화를 수행하였다. 결과는, 래트 눈에 단회 주사로 도입된 ceDNA 벡터가 생체내 전이유전자 발현을 매개하였고, 그 발현이 주사 후 적어도 99일 동안 높은 수준으로 지속되었음을 입증한다.
실시예 10: Rag2 마우스에서 ceDNA 벡터의 지속된 투여 및 재투여.
ceDNA 벡터의 유전자 발현 카세트에 인코딩된 전이유전자 중 하나 이상이 숙주 환경(예를 들어, 세포 또는 대상)에서 발현되고 발현된 단백질이 외래 종으로 인식되는 상황에서, 숙주는 발현 산물의 원치않는 고갈을 유도할 수 있는 적응성 면역 반응을 일으켜, 잠재적으로 발현 부족으로 혼동될 수 있는 가능성이 있다. 일부 경우에, 이는 정상적인 숙주 환경과 이종성인 리포터 분자에서 일어날 수 있다. 따라서, B세포와 T세포가 결여되어 있기 때문에 루시퍼라아제와 같은 비천연 쥣과 단백질에 대한 적응성 면역 반응을 일으키지 않는 Rag2 마우스 모델에서, 생체내 ceDNA 벡터 전이유전자 발현을 평가하였다. 간략하게, 0일차에, 루시퍼라아제를 발현하는 LNP 캡슐화된 ceDNA 벡터 또는 polyC 대조군 0.5 mg/kg을 c57bl/6 및 Rag2 녹아웃 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 투여하고, 21일차에, 동일한 LNP 캡슐화된 ceDNA 벡터를 동일한 용량 수준으로 특정 마우스에게 재투여하였다. 모든 시험 군은 각각 4마리의 마우스로 이루어져 있었다. 실시예 9에 기재된 바와 같이 루시페린 주사 후 1주 간격으로 IVIS 이미지화를 수행하였다.
IVIS 분석을 통해 관찰된 총 플러스를 비교하면, LNP-ceDNA 벡터-Luc가 투여된 야생형 마우스에서 관찰된 형광(발현된 루시퍼라아제 존재의 간접 측정)은 21일 후 점진적으로 감소했지만, 동일한 처리가 투여된 Rag2 마우스는 42일 실험에 걸쳐 루시퍼라아제의 비교적 일정한 지속된 발현을 나타냈다(도 9a). 야생형 마우스에서 감소가 관찰된 대략 21일의 시점은 적응성 면역 반응이 생성될 것으로 예상할 수 있는 시간에 해당한다. Rag2 마우스에서 LNP-ceDNA 벡터의 재투여는 발현의 현저한 증가를 유도하였으며, 이는 본 연구에서 추적된 적어도 21일에 걸쳐 지속되었다(도 9b). 결과는, 비천연 단백질이 숙주의 ceDNA 벡터로부터 발현될 때 적응성 면역이 역할을 할 수 있으며, 초기 투여로부터 20일 이상이 지난 시간에서 관찰된 발현의 감소는 발현의 감소라기보다는(또는 발현의 감소에 더하여) 발현된 분자에 대한 적응성 면역 반응을 교란시키는 신호일 수 있음을 시사한다. 참고로, 이러한 반응은, 숙주에서 천연 단백질을 발현할 때, 즉, 발현된 분자를 자기 자신으로 적절하게 인식하고 이러한 면역 반응을 발달시키지 않을 것으로 예상되는 경우, 낮을 것으로 예측된다.
실시예 11: 지속된 발현에 대한 간 특이적 발현 및 CpG 조절의 영향
실시예 10에 기재된 바와 같이, 바람직하지 않은 숙주 면역 반응은, 일부 경우에, 그렇지 않으면 도입된 ceDNA 벡터로부터 하나 이상의 목적하는 전이유전자의 발현이 지속될 수 있는 것을 인위적으로 약화시킬 수 있다. ceDNA 벡터로부터 지속된 발현에 대한 잠재적 숙주 면역 반응을 회피 및/또는 약화시키는 영향을 평가하기 위해 2가지 접근법을 취하였다. 첫 번째로, 상기 실시예에 사용된 ceDNA-Luc 벡터가 구성적 CAG 프로모터의 제어 하에 존재했기 때문에, 골수세포 또는 비간 조직에 장기간 노출을 회피하는 것이 임의의 관찰된 면역 효과를 감소시켰는 지 여부를 확인하기 위해, 간 특이적 프로모터(hAAT) 또는 상이한 구성적 프로모터(hEF-1)를 사용하여 유사한 구조체를 제조하였다. 두 번째로, 숙주 면역 반응에 대한 공지된 촉발인자인 CpG 함량이 감소되도록 특정 ceDNA-루시퍼라아제 구조체를 조작하였다. 이러한 조작된 및 프로모터 전환된 ceDNA 벡터를 마우스에 투여할 때 ceDNA 인코딩된 루시퍼라아제 유전자 발현을 측정하였다.
3가지 상이한 ceDNA 벡터를 사용하였으며, 각각은 전이유전자로서 루시퍼라아제를 인코딩하였다. 첫 번째 ceDNA 벡터는 다수의 메틸화되지 않은 CpG(약 350)를 갖고 구성적 CAG 프로모터를 포함하였고("ceDNA CAG"); 두 번째는 중간 정도의 메틸화되지 않은 CpG(약 60)를 갖고 간 특이적 hAAT 프로모터를 포함하였으며("ceDNA hAAT low CpG"); 세 번째는 두 번째 것의 메틸화된 형태로, 메틸화되지 않은 CpG를 함유하지 않고 또한 hAAT 프로모터를 포함하였다("ceDNA hAAT No CpG"). ceDNA 벡터는 그 외에는 동일했다. 벡터를 상기 기재된 바와 같이 준비하였다.
대략 약 4주령의 4마리 수컷 CD-1® 마우스로 구성된 4개의 군을 LNP 또는 polyC 대조군으로 캡슐화된 ceDNA 벡터 중 하나로 처리하였다. 0일차에, 각각의 마우스에게 0.5 mg/kg ceDNA 벡터의 단일 정맥내 꼬리 정맥 주사를 5 mL/kg 부피로 투여하였다. -1일차, -일차, 1일차, 2일차, 3일차, 7일차에 체중을 기록하고, 이후 마우스가 종결될 때까지 매주 기록하였다. 0일차, 1일차 및 35일차에 전혈 및 혈청 샘플을 채취하였다. 7일차, 14일차, 21일차, 28일차 및 35일차에 생전 이미지화(in-life imaging)를 수행하고, 이후 매주 생체내 이미지화 시스템(IVIS)을 사용하여 수행하였다. 이미지화를 위해, 각각의 마우스에 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 주사하였다. 15분 후, 각각의 마우스를 마취시키고, 이미지화하였다. 93일차에 마우스를 종결시키고, 간 및 비장을 비롯한 말단 조직을 채취하였다. 사이토카인 측정은 0일차에 투여 6시간 후에 이루어졌다.
ceDNA 처리된 마우스는 모두 7일차 및 14일차에 유의한 형광을 나타냈지만, 형광은 14일 후 ceDNA CAG 마우스에서 급속하게 감소되었으며, 연구 나머지 기간 동안 보다 점진적으로 감소하였다. 대조적으로, ceDNA hAAT low CpG 및 No CpG 처리된 마우스의 총 플럭스는 일정하게 높은 수준으로 유지되었다(도 10). 이는, ceDNA 벡터를 간으로 특이적으로 전달하는 것이, 단회 주사 후 적어도 77일에 걸쳐 벡터로부터 일관되고 지속적인 전이유전자 발현을 유도했음을 시사한다. CpG 최소화된 또는 CpG 함량이 전혀 없는(CpG 미함유) 구조체는 유사한 지속적인 일관된 발현 프로파일을 나타냈던 반면, 높은 CpG 구성적 프로모터 구조체는 시간 경과에 따라 발현 감소를 나타냈으며, 이는 ceDNA 벡터 도입에 의한 숙주 면역 활성화가 대상에서 이러한 벡터로부터 관찰된 임의의 발현 감소에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는, 숙주 면역 반응, 잠재적으로 전이유전자 특이적 반응이 관찰되는 경우, 조직 제한 프로모터를 선택하고/하거나 ceDNA 벡터의CpG 함량을 변경시키는 방식으로 반응 지속기간을 목적하는 수준으로 조절하는 대안적인 방법을 제공한다.
실시예 12: 고셰병의 치료를 위한 GBA 단백질 발현 ceDNA 벡터.
베타 글루코세레브로시다아제(GBA) 코딩 서열(코돈 최적화된 것)(예를 들어, 표 5 참조)과 보조 발현 요소를 인코딩하는 ceDNA를 실시예 1에 따라 생성하고, 실시예 내 본원에 개시된 바와 같은 LNP 내에 봉입시킨다.
GBA 단백질의 발현 및 분비를 세포 배양물에서 입증한다. 고셰병 마우스 모델 9V/9V 및 9V/null에 0.2 mg/kg 내지 5 mg/kg의 용량 범위 내로의 인간 GBA를 인코딩하는 LNP-ceDNA의 단일 또는 반복 용량을 정맥내로 제공한다. 야생형 수준과 비교한 베타 글루코세레브로시다아제(GBA)의 수준을 포함하는 베타 글루코세레브로시다아제의 조직 내 발현 및 혈장으로의 분비를 고셰병 모델에서 입증한다. GBA의 제거뿐 아니라 고셰 세포 수의 감소를 고셰병의 쥣과 모델에서 입증한다. GBA의 조직 내 국소화를 면역조직화학을 통해 입증한다.
실시예 13: GBA를 발현하는 ceDNA의 유체역학적 전달
설치류의 간에 핵산을 도입하는 널리 공지된 방법은 유체역학적 꼬리 정맥 주사에 의한 것이다. 이러한 시스템에서, 다량의 비캡슐화된 핵산을 가압 주사하면, 세포 투과성이 일시적으로 증가하여 조직 및 세포로의 직접 전달이 이루어진다. 이는, 대식세포 전달과 같은 다수의 숙주 면역계를 우회하는 실험적 메커니즘을 제공하여, 이러한 활성의 부재 하에서 전달 및 발현을 관찰할 수 있는 기회를 제공한다.
각각 야생형 좌측 ITR과 절단 돌연변이 우측 ITR을 갖고, 인간 GBA(코돈 최적화된 것)를 인코딩하는 전이유전자 영역을 갖는 6가지 상이한 ceDNA-GBA 벡터(ceDNA-GBA v1 내지 ceDNA-GBA v6; 도 11a 및 도 11b; 및 표 13)를, 상기 실시예 1 및 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조하고, 정제하였다. 간 특이적 프로모터 세트(TTRe 프로모터에 연결된 세르핀A 인핸서) 제어 하의 ceDNA-GBA 벡터 또는 PBS(벡터 미함유)를 대략 6주령의 수컷CD-1 마우스에 투여하였다.
표 12 및 표 13에 제시된 네이키드 ceDNA-GBA 벡터를 5초 내지 8초에 걸쳐 투여되는 100 mL/kg의 부피로 측면 꼬리 정맥을 통해 유체역학적 정맥내 주사로 동물(군당 4마리 동물)당 0.1 μg, 1.0 μg 또는 10 μg로 전달하였다. 신선한 EDTA 혈장을 SensoLyte® Blue Glucocerebrosidase (GBA) Assay Kit(Anaspec, AS-72258)를 사용하여 3일차 및 7일차에 GCase 활성에 대해 검정하였다. 효소 활성을 4-메틸움벨리페론(4-MU) 표준 곡선에 대해 계산하였다.
도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, GBA(GCase) 활성은 표 13의 각각의 ceDNA-GBA 벡터로 처리된 마우스의 3일차 및 7일차 혈장 샘플에서는 용이하게 검출되었지만, PBS로 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았다. 이러한 실험은, ceDNA-GBA가 유체역학적 주사 후 표적 조직(예를 들어, 간)의 세포에서 GBA를 성공적으로 발현시켰고, 활성 GBA가 처리된 마우스의 혈장에서 용이하게 검출될 수 있었음을 입증했다.
참고문헌
본 명세서 및 본원의 실시예에 인용된, 비제한적으로, 특허 및 특허 출원을 포함하는 모든 간행물 및 참고문헌은, 각각의 개별적인 간행물 또는 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 완전하게 기재된 것으로서 본원에 참조로서 인용되는 것으로 표시된 바와 같이, 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원 또한 간행물 및 참고문헌에 대해 상기 기재된 방식으로 본원에 참조로서 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENERATION BIO CO. HAMM, Luke S. <120> NON-VIRAL DNA VECTORS AND USES THEREOF FOR EXPRESSING GAUCHER THERAPEUTICS <130> 131698-06620 <140> <141> <150> 62/993,866 <151> 2020-03-24 <160> 390 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 2 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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polynucleotide" <400> 46 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 47 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 47 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120 ggttcct 127 <210> 48 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 48 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 49 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 49 cgatcgttcg at 12 <210> 50 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 50 atcgaaccat cg 12 <210> 51 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 51 atcgaacgat cg 12 <210> 52 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 52 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165 <210> 53 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 53 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc 60 cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg 120 cgcagagaga tcactagggg 140 <210> 54 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 54 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 55 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 55 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60 ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 56 <400> 56 000 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <400> 58 000 <210> 59 <400> 59 000 <210> 60 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 60 gcgcgctcgc tcgctc 16 <210> 61 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 61 ggttga 6 <210> 62 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 62 agtt 4 <210> 63 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 63 ggttgg 6 <210> 64 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 64 agttgg 6 <210> 65 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 65 agttga 6 <210> 66 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 66 rrttrr 6 <210> 67 <400> 67 000 <210> 68 <400> 68 000 <210> 69 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 69 actgaggc 8 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/note="Description of Unknown: Nucleoplasmin bipartite NLS sequence" <400> 92 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: C-myc NLS sequence" <400> 93 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: C-myc NLS sequence" <400> 94 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 95 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro 20 25 30 Arg Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 96 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: IBB domain from importin-alpha sequence" <400> 96 Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys 20 25 30 Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val 35 40 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Myoma T protein sequence" <400> 97 Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Myoma T protein sequence" <400> 98 Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu 1 5 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro 1 5 10 <210> 101 <400> 101 000 <210> 102 <400> 102 000 <210> 103 <400> 103 000 <210> 104 <400> 104 000 <210> 105 <400> 105 000 <210> 106 <400> 106 000 <210> 107 <400> 107 000 <210> 108 <400> 108 000 <210> 109 <400> 109 000 <210> 110 <400> 110 000 <210> 111 <400> 111 000 <210> 112 <400> 112 000 <210> 113 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 113 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 114 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 114 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 115 <400> 115 000 <210> 116 <400> 116 000 <210> 117 <211> 5 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 117 Asp Arg Leu Arg Arg 1 5 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 118 Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 119 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis delta virus <400> 119 Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg 1 5 10 <210> 121 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Lys 20 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000 <210> 147 <400> 147 000 <210> 148 <400> 148 000 <210> 149 <400> 149 000 <210> 150 <400> 150 000 <210> 151 <400> 151 000 <210> 152 <400> 152 000 <210> 153 <400> 153 000 <210> 154 <400> 154 000 <210> 155 <400> 155 000 <210> 156 <400> 156 000 <210> 157 <400> 157 000 <210> 158 <400> 158 000 <210> 159 <400> 159 000 <210> 160 <400> 160 000 <210> 161 <400> 161 000 <210> 162 <400> 162 000 <210> 163 <400> 163 000 <210> 164 <400> 164 000 <210> 165 <400> 165 000 <210> 166 <400> 166 000 <210> 167 <400> 167 000 <210> 168 <400> 168 000 <210> 169 <400> 169 000 <210> 170 <400> 170 000 <210> 171 <400> 171 000 <210> 172 <400> 172 000 <210> 173 <400> 173 000 <210> 174 <400> 174 000 <210> 175 <400> 175 000 <210> 176 <400> 176 000 <210> 177 <400> 177 000 <210> 178 <400> 178 000 <210> 179 <400> 179 000 <210> 180 <400> 180 000 <210> 181 <400> 181 000 <210> 182 <400> 182 000 <210> 183 <400> 183 000 <210> 184 <400> 184 000 <210> 185 <400> 185 000 <210> 186 <400> 186 000 <210> 187 <400> 187 000 <210> 188 <400> 188 000 <210> 189 <400> 189 000 <210> 190 <400> 190 000 <210> 191 <400> 191 000 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <400> 193 000 <210> 194 <400> 194 000 <210> 195 <400> 195 000 <210> 196 <400> 196 000 <210> 197 <400> 197 000 <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <400> 199 000 <210> 200 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 200 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60 ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120 ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180 cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240 ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278 <210> 201 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 201 gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60 agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120 gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180 ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240 tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300 cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagg 348 <210> 202 <211> 226 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 202 gtggagaaga gcatgcttga gggctgagtg cccctcagtg ggcagagagc acatggccca 60 cagtccctga gaagttgggg ggaggggtgg gcaattgaac tggtgcctag agaaggtggg 120 gcttgggtaa actgggaaag tgatgtggtg tactggctcc acctttttcc ccagggtggg 180 ggagaaccat atataagtgc agtagtctct gtgaacattc aagctt 226 <210> 203 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 203 ccgtctgtct gcacatttcg tagagcgagt gttccgatac tctaatctcc ctaggcaagg 60 ttcatatttg tgtaggttac ttattctcct tttgttgact aagtcaataa tcagaatcag 120 caggtttgga gtcagcttgg cagggatcag cagcctgggt tggaaggagg gggtataaaa 180 gccccttcac caggagaagc cgtcacacag atccacaagc tcctg 225 <210> 204 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 204 ggcgactcag atcccagcca gtggacttag cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg 60 accttggtta atattcacca gcagcctccc ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat 120 acggacgagg acagggccct gtc 143 <210> 205 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 205 gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt 60 catattgact taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca 120 ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc 180 cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ct 222 <210> 206 <211> 223 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 206 gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt 60 catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca 120 ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc 180 cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ctg 223 <210> 207 <211> 3000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 207 gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc aagtagctgg gactacaggc acgtgccacc 60 atgcccggct aattttttgt atttttagta gaggaggagt ttcatcttgt tagctaggat 120 ggtctagatc tcctgacctc gtgatctgcc cgcctcagcc tcccaaagtg ctgggattac 180 aggtgtgagc caccgtgccc ggccatattt tgatttaaaa tttagcaata atagataaaa 240 ttttcaatca actaagccct tgggccaggg aatgctattc cttaaaaagt gcttctatca 300 atatagcctc tgactcatta ctttgttaat ttttaaattg tatttcattc ctgattaaca 360 ttcccaccca gattattaat tatacaatct gttaactgta gaacctcaaa catgttggat 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 220 cgggggaggc tgctggtgaa tattaaccaa ggtcacccca gttatcggag gagcaaacag 60 gggctaagtc cacatacggg ggaggctgct ggtgaatatt aaccaaggtc accccagtta 120 tcggaggagc aaacaggggc taagtccaca tagggctgga agctaccttt gacatcattt 180 cctctgcgaa tgcatgtata atttctacag aacctattag aaaggatcac ccagcctctg 240 cttttgtaca actttccctt aaaaaactgc caattccact gctgtttggc ccaatagtga 300 gaactttttc ctgctgcctc ttggtgcttt tgcctatggc ccctattctg cctgctgaag 360 acactcttgc cagcatggac ttaaacccct ccagctctga caatcctctt tctcttttgt 420 tttacatgaa gggtctggca gccaaagcaa tcactcaaag ttcaaacctt atcatttttt 480 gctttgttcc tcttggcctt ggttttgtac atcagctttg aaaataccat cccagggtta 540 atgctggggt taatttataa ctaagagtgc tctagttttg caatacagga catgctataa 600 aaatggaaag atctcctgaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg tggggtatta 660 atgtttaatt acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttg 709 <210> 221 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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<211> 1210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 235 ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 60 ccacgtcaga cgaagggcgc aggagcgtcc tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc 120 ggcccgctgc tcataagact cggccttaga accccagtat cagcagaagg acattttagg 180 acgggacttg ggtgactcta gggcactggt tttctttcca gagagcggaa caggcgagga 240 aaagtagtcc cttctcggcg attctgcgga gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg 300 attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc 360 gcggttcttg tttgtggatc gctgtgatcg tcacttggtg agtagcgggc tgctgggctg 420 gccggggctt tcgtggccgc cgggccgctc ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc 480 aagggctgta gtctgggtcc gcgagcaagg ttgccctgaa ctgggggttg gggggagcgc 540 agcaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga atggaagacg cttgtgaggc gggctgtgag 600 gtcgttgaaa caaggtgggg ggcatggtgg gcggcaagaa cccaaggtct tgaggccttc 660 gctaatgcgg gaaagctctt attcgggtga gatgggctgg ggcaccatct ggggaccctg 720 acgtgaagtt 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<400> 242 ccaggcatgg tggctcatac ccgtaatccc agctactcag gaggctgagg caggagaatc 60 acatgaaccc aagaggtgga ggttgcagtg agccaagatt gagccactgt actccagcct 120 gggcaacaga gcaagacttg gtctcagaaa aaaaaaaaaa gtgtatgtct tgactttaaa 180 aaattcaata aactgacctg tcttttttta aaaaacagcc ttttgagggt ataatttaca 240 tatcacagag ttcacctatg taaagtattc aatggttttc aatatattaa cagagttgtg 300 cgaccatcac cataatctaa ctttagaaca ttttcttcat ccccaaaaga aaccttatat 360 ctgttaccag tcactcctca ttcccctccc acccctaccc ctaccccagc attaggcaac 420 cacttattta ttttctgtcc ctatagattt gcctatcttg gacatttcat gtaaatggaa 480 tcatacagta tgtggtcttt tgagaccgtc ttctttcacg tagcatgatt ttgaggttca 540 tctgtgtagc atgtatcagt acttcaatct acatacattt accgtaatta ctgaaccgtt 600 tggactattt tcaataatat tcatttatgt tttctgtttg ttatgctttt tttagtttct 660 ttagtttttt ttaacttttg ttggattgat gacattttct acatacttag tttttaatcc 720 tttgcttatt tagaaactat agattttact ggtacttttt cattgctttt tcttaaaatt 780 ttcagatatt ggttgaactt tgttcagata ttagttgaac tttgtaatta aaaaatggtt 840 aaatattggc 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polynucleotide" <400> 304 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag 360 taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa 420 gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg 480 ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc 540 tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt 600 gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag 660 cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt 720 ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtactg 777 <210> 305 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 305 gtttgctgct tgcaatgttt gcccatttta gggtggacac aggacgctgt ggtttctgag 60 ccaggg 66 <210> 306 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 306 ggaggggtgg agtcgtgacc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca 60 cacagccctc cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc 120 ccatgccacc tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt 180 gtcctggcgt ggtttaggta gtgtgagagg gg 212 <210> 307 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 307 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac 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gcgcgcagct gcctgcagg 3199

Claims (54)

  1. 플랭킹 역말단반복서열(ITR: inverted terminal repeat) 사이에 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터로서,
    여기서 적어도 하나의 핵산 서열이 적어도 하나의 베타 글루코세레브로시다아제(GBA: beta glucocerebrosidase) 단백질을 인코딩하는 ceDNA 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 GBA 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 표 1에 제시된 서열 중 임의의 것 또는 표 13의 오픈리딩프레임(ORF: open reading frame) 서열 중 임의의 것에서 선택되는, ceDNA 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 GBA 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 표 7의 프로모터 중 임의의 것에서 선택되는 프로모터를 포함하는, ceDNA 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표 8의 인핸서 중 임의의 것에서 선택되는 인핸서를 포함하는, ceDNA 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표 9A의 5' UTR 및/또는 인트론 서열 중 임의의 것에서 선택되는 5' UTR 및/또는 인트론 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표 9B의 3' UTR 서열 중 임의의 것에서 선택되는 3' UTR 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표 10의 poly A 서열 중 임의의 것에서 선택되는 적어도 하나의 poly A 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 서열이 cDNA인, ceDNA 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 ITR이 기능성 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함하는, ceDNA 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 파르보바이러스(Parvovirus), 데펜도바이러스(Dependovirus) 및 아데노연관바이러스(AAV: adeno-associated virus)에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것인, ceDNA 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 플랭킹 ITR이 서로에 대해 대칭 또는 비대칭인, ceDNA 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 플랭킹 ITR이 대칭 또는 실질적으로 대칭인, ceDNA 벡터.
  14. 제12항에 있어서, 플랭킹 ITR이 비대칭인, ceDNA 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 야생형이거나, 두 개의 ITR이 모두 야생형 ITR인, ceDNA 벡터.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 플랭킹 ITR이 상이한 바이러스 혈청형에서 유래한 것인, ceDNA 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 플랭킹 ITR이 표 2에 제시된 임의의 바이러스 혈청형 쌍에서 선택되는, ceDNA 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 표 3에 제시된 서열에서 선택되는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 적어도 하나가 ITR의 전반적인 3차원 입체형태에 영향을 미치는 결실, 부가 또는 치환에 의해 야생형 AAV ITR 서열에서 변경된 것인, ceDNA 벡터.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형에서 유도된 것인, ceDNA 벡터.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 합성인, ceDNA 벡터.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 야생형 ITR이 아니거나, 두 개의 ITR이 모두 야생형 ITR이 아닌, ceDNA 벡터.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 A, A', B, B', C, C', D 및 D'에서 선택되는 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것인, ceDNA 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 결실, 삽입 및/또는 치환이 통상적으로 A, A', B, B', C 또는 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조(stem-loop structure)의 전부 또는 일부의 결실을 초래하는 것인, ceDNA 벡터.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것인, ceDNA 벡터.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것인, ceDNA 벡터.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것인, ceDNA 벡터.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템-루프 구조를 포함하는, ceDNA 벡터.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 2개의 루프를 포함하는, ceDNA 벡터.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 단일 루프를 포함하는, ceDNA 벡터.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, ITR이 서로에 대해 역전될 때, 두 개의 ITR이 전반적인 3차원 대칭을 이루는 방식으로 변경되는, ceDNA 벡터.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 표 3, 표 5A, 표 5B 및 표 6에 제시된 서열 중 하나 이상에서 선택되는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 서열이 적어도 하나의 조절 스위치의 제어 하에 있는, ceDNA 벡터.
  34. 제33항에 있어서, 적어도 하나의 조절 스위치가 이원 조절 스위치, 소분자 조절 스위치, 패스코드 조절 스위치, 핵산 기반 조절 스위치, 전사 후 조절 스위치, 방사선 제어 또는 초음파 제어 조절 스위치, 저산소증 매개 조절 스위치, 염증 반응 조절 스위치, 전단 활성화 조절 스위치 및 사멸 스위치에서 선택되는, ceDNA 벡터.
  35. 표 13에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터.
  36. 서열번호 385, 서열번호 386, 서열번호 387, 서열번호 388, 서열번호 389 또는 서열번호 390에서 선택되는 핵산과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터.
  37. 서열번호 385, 서열번호 386, 서열번호 387, 서열번호 388, 서열번호 389 또는 서열번호 390으로 이루어지는 군에서 선택되는 핵산 서열로 이루어진 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터.
  38. 세포를 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 베타 글루코세레브로시다아제(GBA) 단백질을 발현시키는 방법.
  39. 서열번호 385, 서열번호 386, 서열번호 387, 서열번호 388, 서열번호 389 또는 서열번호 390 중 어느 하나에 제시된 ORF 핵산 서열의 번역에 의해 생성된 GBA 단백질.
  40. 제38항에 있어서, 세포가 간 세포 또는 근육 세포인, 방법.
  41. 제38항 또는 제40항에 있어서, 세포가 시험관내 또는 생체내에 존재하는 것인, 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 서열이 진핵세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인, 방법.
  43. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 코돈 최적화된 적어도 하나의 핵산 서열이 표 5 중 임의의 것에서 선택되는, 방법.
  44. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터, 또는 제39항의 GBA 단백질을 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 핵산 서열이 적어도 하나의 베타 글루코세레브로시다아제(GBA) 단백질을 인코딩하는, 고셰병을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법.
  45. 제41항에 있어서, 적어도 하나의 GBA 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열이 표 1에 제시된 서열 중 임의의 것 또는 표 13에 포함된 ORF에서 선택되는, 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, ceDNA 벡터가 정맥내 주사를 통해 투여되는, 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터가 간 세포 또는 근육 세포, 또는 둘 모두에서 GBA 단백질을 발현시키는, 방법.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터가 근육내 주사, 경막내 주사 또는 정맥내 주사 중 임의의 하나 이상을 통해 투여되는, 방법.
  49. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
  50. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 함유하는 세포.
  51. 제50항에 있어서, 간 세포 또는 근육 세포, 또는 둘 모두인, 세포
  52. 제12항 내지 제37항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터와 지질을 포함하는 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 지질이 지질 나노입자(LNP)인, 조성물.
  54. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터, 또는 제52항 또는 제53항의 조성물, 또는 제50항의 세포를 포함하는 키트.
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