CN110320195B - 一种比色荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种比色荧光探针及其制备方法和应用，其中比色荧光探针是以发橙红色荧光的金纳米团簇与发蓝色荧光的乙二胺修饰的氧化石墨烯混合，在此混合溶液中加入铜离子使金纳米团簇的荧光猝灭，即构成比色荧光探针。在金纳米团簇与乙二胺修饰的氧化石墨烯的混合溶液中加入铜离子会使金纳米团簇的荧光猝灭，而氧化石墨烯蓝色荧光不变；再加入镉离子，会使金纳米团簇的橙红色荧光增强，同时氧化石墨烯的蓝色荧光不变，此时体系荧光颜色呈粉红色。此即构成了一个“开‑关‑开”型比色荧光探针，荧光颜色可呈“红‑蓝‑红”的变化。本发明比色荧光探针的镉离子检测限可低至33.33nM，且具有良好的选择性。

Description

一种比色荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种比色荧光探针及其制备方法和应用，属于荧光分析及重金属离子检测领域。

背景技术

镉因具有诸多优良的性质，使其在冶金、电子、电气、原子能、电镀等领域得到了广泛的应用。但由于镉是一种毒性很大的重金属，对环境和人体的危害极大。因此，如何简便、快速、灵敏、准确、成本低廉地检测各种环境样品、工业废水以及生物组织里的镉离子含量引起人们极大的关注。

传统的镉离子检测方法主要有分光光度法、原子荧光法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体原子发射法、电感耦合等离子体质谱法等。这些方法均具有较高的检测灵敏度、较好的选择性以及准确的检测结果，但普遍缺点是仪器价格昂贵、体积大，检测时间长，并且样品预处理步骤复杂、时间长、易受污染等。为解决这些问题，国内外学者研究开发了许多快速检测镉离子的方法，目前主要有酶分析法、免疫分析法、试纸法、生物化学传感器法等。与传统的检测方法相比，大部分快速检测方法灵敏度和准确性较低，但其具有检测快速、操作简便、成本低廉等优点。

近年来，人们开展了纳米材料荧光探针的制备及其检测镉离子方面的研究工作，并已取得了诸多相关的进展，如：镉离子检测用量子点荧光传感器及其检测方法(CN103592276A)、检测镉离子的双功能磁性荧光探针制备方法及其应用(CN105400517A)、量子点-有机染料复合物关/开型镉离子比率荧光探针及其制备方法(CN102936501A)、一种镉离子和抗坏血酸检测用的碳量子点/金团簇比率荧光探针(CN106047342A)等。这些文献报道的内容不仅有效地发挥了上述两类方法的优点，而且较好地克服了其缺点。但这些方法在解决前述问题的同时，尚存在如下的不足：(1)有的专利中使用了有毒的量子点(如CN103592276A、CN105400517A、CN102936501A中报道的CdTe、CdS量子点等)来作为检测镉离子时的荧光材料；(2)有的专利中使用的荧光材料的制备条件较苛刻(如CN106047342A中碳量子点的水热制备条件为150℃～250℃、6～24h等)；(3)未能实现镉离子的现场实时快速可视化定量检测等。

发明内容

本发明针对上述现有技术所存在的不足，旨在提供一种比色荧光探针及其制备方法和应用，可克服现有技术存在的问题，拥有检测镉离子用的荧光材料无毒或低毒、制备方法较温和，对镉离子能进行现场实时快速可视化定量检测等特点。

本发明比色荧光探针，是以发橙红色荧光的金纳米团簇与发蓝色荧光的乙二胺修饰的氧化石墨烯混合，在此混合溶液中加入铜离子使金纳米团簇的荧光猝灭，即构成比色荧光探针。在金纳米团簇与乙二胺修饰的氧化石墨烯的混合溶液中加入铜离子会使金纳米团簇的荧光猝灭，而氧化石墨烯蓝色荧光不变；再加入镉离子，会使金纳米团簇的橙红色荧光增强，同时氧化石墨烯的蓝色荧光不变，此时体系荧光颜色呈粉红色。此即构成了一个“开-关-开”型比色荧光探针，荧光颜色可呈“红-蓝-红”的变化。

进一步地，金纳米团簇与乙二胺修饰的氧化石墨烯之间的体积比为2.0～3.0:1。

本发明比色荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：金纳米团簇(GSH-AuNCs)的制备

将0.20～0.40mL、0.10mol/L的谷胱甘肽和0.15～0.25mL、0.10mol/L的HAuCl₄置于反应釜中，加入超纯水，于60～90℃下搅拌至溶液呈淡黄色时反应结束，所得溶液经透析膜(3.5kDa)透析纯化24h，即得金纳米团簇，于4℃下保存备用。

步骤2：发光氧化石墨烯(EDA-GO)的制备

将0.05～0.2g氧化石墨烯(氧化石墨烯是以修正后的Hummer方法制备的。其制备方法详见参考文献：Chen J,Yao B W,Li C,Shi G Q.An improved Hummers method foreco-friendly synthesis of graphene oxide[J].Carbon,201,64:225-229)和10～30mL二氯亚砜置于反应釜中，于70～90℃下搅拌反应1h～4h；离心除去多余的二氯亚砜，用四氢呋喃清洗两遍，将固体样品置于清水洗净的反应釜中，加入10～30mL1,2-乙二胺，于90～110℃下搅拌反应2h～6h，旋蒸除去过量的乙二胺，用乙醇清洗3次，于100℃烘箱中干燥，得到发光氧化石墨烯，分散于水中于4℃下保存备用。

步骤3：比色荧光探针的制备

将金纳米团簇和发光氧化石墨烯以体积比2.0～3.0:1的比例混合，再加入10～20μmol/L铜离子溶液混匀，使金纳米团簇的荧光猝灭，即得比色荧光探针。

本发明比色荧光探针的应用，是在可视化定量检测镉离子时作为检测试剂使用。检测方法包括如下步骤：

取本发明比色荧光探针溶液90～108μL，在其中加入pH为11.0的缓冲溶液稀释至2mL，再加入不同浓度(0～50μmol/L)的CdCl₂溶液，在室温下静置反应7分钟，于激发波长为310nm时用荧光光谱仪记录350nm～750nm范围内的荧光光谱，以荧光强度比I₆₀₂/I₄₁₄和对应的镉离子浓度作图，获得标准曲线；再将待测样品测得的荧光强度I₆₀₂/I₄₁₄比值代入到标准曲线中，即可获得该待测样品中的镉离子含量。

本发明比色荧光探针的应用，是将所述比色荧光探针溶液制成荧光试纸，并结合智能手机获取荧光试纸的颜色信息，从而实现基于荧光试纸与智能手机联用的现场实时可视化定量检测镉离子。具体包括如下步骤：

步骤1：在清洗干净的商用墨盒中注入比色荧光探针溶液；将探针墨水通过与计算机连接的喷墨打印机打印在滤纸上；

步骤2：向步骤1打印好的荧光试纸上滴加不同浓度的镉离子溶液(0～50μmol/L)，试纸呈现由蓝到红的颜色变化；通过智能手机程序(比如颜色识别器)对荧光试纸拍照(在365nm紫外灯照射下拍摄)并识别试纸颜色的RGB值，以R/B的比值与镉离子浓度之间拟合线性关系(即标准曲线)，再将待测样品测得的R/B比值代入到标准曲线中，即可实现荧光试纸与智能手机联用的现场实时快速可视化定量检测该样品的镉离子含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、用于检测镉离子的比色荧光探针由发光氧化石墨烯、金纳米团簇及铜离子混合溶液构成，其中两种荧光材料具有低毒、荧光寿命长、生物相容性好的特点；引入铜离子将金纳米团簇荧光猝灭，可提高检测镉离子的灵敏性及排除金团簇被其他阳离子猝灭的干扰，镉离子检测限可低至33.33nM，且具有良好的选择性。

2、将比色荧光探针印刷成试纸条，可实现镉离子检测过程的可视化。

3、使用智能手机应用程序(颜色识别器)识别比色探针溶液或试纸颜色的RGB值，将R/B的比值与镉离子浓度绘制成标准曲线，可实现镉离子含量的现场实时快速可视化定量检测，同时可简化检测设备，节约检测时间。

附图说明

图1本发明检测镉离子的比色荧光探针构建方法示意图。

图2本发明荧光试纸与智能手机联用的现场实时快速可视化定量检测镉离子方法示意图。

图3金纳米团簇(A)、发光氧化石墨烯(B)、加铜离子后的比色荧光探针(C)、加镉离子的含铜比色荧光探针(D)的TEM图。从此图中可看出：(1)金纳米团簇的平均粒径为1nm左右，且其存在一定的团聚现象。(2)发光氧化石墨烯呈不规则薄片状。(3)在比色荧光探针中加入铜离子后，金纳米团簇的平均粒径略有增大，约为1.4nm。(4)在含铜比色荧光探针中加入镉离子后，金纳米团簇的平均粒径有显著增大，约为30nm。

图4比色荧光探针分别对铜离子(A)和镉离子(B)响应的荧光光谱图及相应的荧光照片(365nm紫外灯照射下拍摄)。从图(A)中可看出：随着铜离子浓度的增加，比色荧光探针在602nm处的荧光强度逐渐降低，直到15μmol/L铜离子使其荧光完全猝灭，同时荧光颜色从粉色变为蓝色。从图(B)中可看出：向含有15μmol/L铜离子的比色荧光探针溶液加入镉离子溶液，602nm处的荧光重新恢复并继续增强，伴随着颜色明显的从蓝色变为红色。

图5比色荧光探针对其他十六种金属离子的选择性和抗干扰性图(其中A图为50μmol/L的各种金属离子加入荧光探针后的荧光强度比柱状图；B图为比色荧光探针(a)、同时向a加入50μmol/L其他十六种干扰离子(b)、向b中加入50μM镉离子(c)的荧光光谱图。从图A中可看出：大多数的金属离子对比色荧光探针几乎无影响，但加入50μmol/L镉离子的比色荧光探针，其602nm处的荧光明显增强并且荧光颜色明显变红。从图B中可看出：同时加入50μmol/L干扰离子时，602nm处的荧光仅增加2.3倍，而再加入50μmol/L镉离子荧光增强可达10.8倍。结果表明此比色荧光探针用于检测镉离子具有较好的选择性和抗干扰能力。

图6荧光试纸与智能手机联用快速可视化定量检测镉离子的部分结果。其中图A为镉离子浓度与荧光试纸颜色的关系及荧光试纸显色的时间；图B为智能手机识别荧光试纸RGB值的示意图；图C为试纸的R/B比值与镉离子浓度的关系。从图A中可看出：当将0～50μmol/L的镉离子溶液分别滴加在荧光试纸上，试纸呈现出从蓝色向红色变化，且颜色在2mins内即可稳定不变。从图B中可看出：利用智能手机应用程序(颜色识别器)可获取荧光试纸上的颜色信息(RGB值)。从图C中可看出：荧光试纸的R/B比值与镉离子浓度紧密相关，且在镉离子浓度为0～8μmol/L范围内具有良好的线性关系(R²＝0.9808)，检测限计算结果为100.9nmol/L。

具体实施方式

一、发光氧化石墨烯和金纳米团簇比色荧光探针及其试纸的制备

(1)金纳米团簇(GSH-AuNCs)的制备

将0.20～0.40mL、0.10mol/L谷胱甘肽和0.15～0.25mL、0.10mol/LHAuCl₄置于反应釜中，加超纯水使物料总体积为10.00mL；先于25℃下搅拌5min，再于70℃下搅拌至溶液呈淡黄色时止。所得溶液经透析膜透析纯化24h后，于4℃下保存备用。

(2)发光氧化石墨烯(EDA-GO)的制备

将0.05～0.2g氧化石墨烯和10～30mL二氯亚砜置于反应釜中，于70～90℃下搅拌反应1h～4h；离心除去多余的二氯亚砜，用四氢呋喃清洗两遍，将固体样品置于清水洗净的反应釜中；加入10～30mL 1,2-乙二胺，于90～110℃下搅拌反应2h～6h；旋蒸除去过量的乙二胺，用乙醇清洗3次，于100℃烘箱中干燥；将干燥后的固体样品再分散于水中于4℃下保存备用。

(3)比色荧光探针的制备

将金纳米团簇和发光氧化石墨烯以体积比为2.0～3.0:1混合，再与10～20μmol/L铜离子混匀后，即得比色荧光探针。

(4)荧光试纸的制备

将商用墨盒用超纯水清洗，直至墨粉完全清除干净，放置烘箱中于60℃下烘干。用比色荧光探针代替墨水注入空墨盒中，将探针墨水通过与计算机连接的喷墨打印机打印在滤纸上，重复打印20次，以增加探针的数量。

二、发光氧化石墨烯和金纳米团簇比色荧光探针及其试纸在检测镉离子方面的应用

(1)比色荧光探针溶液定量检测镉离子

将比色荧光探针溶液置于3mL比色皿中，再用pH为11.0的缓冲溶液稀释至2mL。加入不同浓度(0～50μmol/L)的CdCl₂溶液，并室温下放置反应7分钟。于激发波长为310nm时用荧光光谱仪记录350nm～750nm范围内的荧光光谱。荧光照片在365nm紫外灯照射下用数码相机拍摄。在荧光强度比I₆₀₂/I₄₁₄和镉离子浓度之间拟合线性关系(工作曲线)，结果显示镉离子浓度为0～4μmol/L范围内具有良好的线性关系(R²＝0.9900)，检测限计算结果为33.33nmol/L。再测得某样品的荧光强度比I₆₀₂/I₄₁₄值，将其代入到工作曲线中，则可得出该样品中的镉离子含量。

(2)荧光试纸与智能手机联用的现场实时快速可视化定量检测镉离子

将0～50μmol/L的镉离子溶液滴加在荧光试纸上，试纸呈现明显的由蓝到红的颜色变化，且颜色变化在2mins内稳定。用智能手机程序(颜色识别器)对荧光试纸拍照并识别试纸颜色的RGB值。在RGB值与镉离子浓度之间拟合线性关系(工作曲线)，得到镉离子浓度为0～8μmol/L范围内与RGB值之间有好的线性关系(R²＝0.9808)，检测限计算结果为100.9nmol/L。再测得某样品的RGB值，将其代入到工作曲线中，即可实现荧光试纸与智能手机联用的现场实时快速可视化定量测出该样品的镉离子含量。

(3)定量检测实际水样中的镉离子

用湖水(取自合肥市蜀山湖)和淘米水(米购买于当地超市)作为实际水样检测镉离子。用0.22μm微滤膜过滤实际水样以除去不溶性杂质，并用其配制不同浓度的镉离子标准溶液，加入荧光探针溶液中和试纸条上。通过荧光光谱仪记录荧光强度及用智能手机识别试纸的RGB值。通过三次独立实验获得平均值，并计算镉离子的回收率。具体结果如下表所示。

表1比色荧光探针溶液对实际水样中镉离子的定量检测结果

表2荧光试纸和智能手机联用对实际水样中镉离子的定量检测结果

从表1、表2的数据可以看出，当镉离子浓度分别为1、3、20和50μmol/L时，用荧光光谱仪测试比色荧光探针溶液的荧光强度比获得的回收率为94.7％～100.7％，用智能手机识别试纸RGB值检测镉离子获得回收率为90.2％～100.5％。

Claims (8)

1.一种比色荧光探针，其特征在于：

所述比色荧光探针是以发橙红色荧光的金纳米团簇与发蓝色荧光的乙二胺修饰的氧化石墨烯混合，在此混合溶液中加入铜离子使金纳米团簇的荧光猝灭，即构成比色荧光探针；

所述金纳米团簇是通过如下步骤制备获得：

将0.20～0.40mL、0.10mol/L的谷胱甘肽和0.15～0.25mL、0.10mol/L的HAuCl₄置于反应釜中，加入超纯水，于60～90℃下搅拌至溶液呈淡黄色时反应结束，所得溶液经透析膜透析纯化24h，即得金纳米团簇，于4℃下保存备用；

所述乙二胺修饰的氧化石墨烯是通过如下步骤制备获得：

将0.05～0.2g氧化石墨烯和10～30mL二氯亚砜置于反应釜中，于70～90℃下搅拌反应1h～4h；离心除去多余的二氯亚砜，用四氢呋喃清洗，将固体样品置于清水洗净的反应釜中，加入10～30mL1,2-乙二胺，于90～110℃下搅拌反应2h～6h，旋蒸除去过量的乙二胺，用乙醇清洗，于100℃烘箱中干燥，得到发光氧化石墨烯，分散于水中于4℃下保存备用；

金纳米团簇与乙二胺修饰的氧化石墨烯之间的体积比为2.0～3.0:1。

2.一种权利要求1所述的比色荧光探针的应用，其特征在于：

所述比色荧光探针在可视化定量检测镉离子时作为检测试剂使用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤：

取比色荧光探针溶液90～108μL，在其中加入pH为11.0的缓冲溶液稀释至2mL，再加入不同浓度的CdCl₂溶液，在室温下静置反应7分钟，于激发波长为310nm时用荧光光谱仪记录350nm～750nm范围内的荧光光谱，以荧光强度比I₆₀₂/I₄₁₄和对应的镉离子浓度作图，获得标准曲线；再将待测样品测得的荧光强度比值I₆₀₂/I₄₁₄代入到标准曲线中，即可获得该待测样品中的镉离子含量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述CdCl₂溶液的浓度范围为0～50μmol/L。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：

在绘制标准曲线时，至少存在五个不同的浓度点值。

6.一种权利要求1所述的比色荧光探针的应用，其特征在于：

将所述比色荧光探针溶液制成荧光试纸，并结合智能手机获取荧光试纸的颜色信息，从而实现基于荧光试纸与智能手机联用的现场实时可视化定量检测镉离子。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：在清洗干净的商用墨盒中注入比色荧光探针溶液；将探针墨水通过与计算机连接的喷墨打印机打印在滤纸上；

步骤2：向步骤1打印好的荧光试纸上滴加不同浓度的镉离子溶液，试纸呈现由蓝到红的颜色变化；通过智能手机程序对荧光试纸拍照并识别试纸颜色的RGB值，以R/B的比值与镉离子浓度之间拟合线性关系即可获得标准曲线，再将待测样品测得的R/B比值代入到标准曲线中，即可实现荧光试纸与智能手机联用的现场实时快速可视化定量检测该样品的镉离子含量。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

镉离子溶液的浓度范围为0～50μmol/L。

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