CN110317825A

CN110317825A - 一种以发根农杆菌介导的大豆毛状根诱导转化方法

Info

Publication number: CN110317825A
Application number: CN201910352893.9A
Authority: CN
Inventors: 樊颖伦; 吕山花
Original assignee: Liaocheng University
Current assignee: Liaocheng University
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN110317825B

Abstract

本发明公开一种以发根农杆菌介导的大豆毛状根诱导转化方法，包括如下步骤：选取大豆播种后在真叶即将展开时的幼苗，在子叶节下0.2‑0.8cm处的下胚轴处进行横切，在带子叶的幼苗的下胚轴切口处蘸发根农杆菌菌液后扦插，并浇注含所述发根农杆菌菌液的发根诱导营养液进行培养。本发明的优点节省大豆种植基质和空间；毛状根产生的时间缩短，节省了操作步骤和时间，尤其是在研究根瘤菌和大豆之间互作时，减少了其它根瘤菌的污染。

Description

一种以发根农杆菌介导的大豆毛状根诱导转化方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种以发根农杆菌介导的毛状根诱导转化方法，尤其涉及大豆毛状根转化方法。

背景技术

目前，大豆遗传转化技术的方法主要有根癌农杆菌（Ti）介导的遗传转化获得稳定的转基因植株和发根农杆菌（Ri）介导的毛状根转化法。根癌农杆菌（Ti）介导的遗传转化其不足是转化率极低，筛选转化体较难。发根农杆菌（Ri）介导的毛状根转化是一种快速获得转基因嵌合体植株的方法，在研究大豆与根瘤菌间的共生固氮、大豆根部基因特异表达等研究中应用广泛。

发根农杆菌（Ri）介导的毛状根转化是一种快速获得转基因嵌合体植株的方法。目前在大豆毛状根转化过程中，常用的高效转化菌株为K599，转化方法采用下胚轴穿刺法（Kereszt A, Li D et al (2007) Agrobacterium rhizogenes- mediatedtransformation of soybean to study root biology. Nat Protoc 2:948–952），其中公开的方法如下：（1）将大豆种子播种在蛭石中，光照培养，5天后进行穿刺接种。（2）携有目的载体的发根农杆菌菌液在含有载体筛选抗生素及链霉素（浓度50mg/L，下同）固体LB培养基中28℃培养2天，挑取单克隆加入含上述抗生素的液体LB培养基500ul过夜，取200ul菌液，涂布到LB固体培养基上，过夜培养，用涂布器收集菌体用于穿刺。（3）待大豆子叶尚未展开时，同1ml注射器穿刺大豆下胚轴（图1.a），然后保湿光照培养。（4）长出转基因毛状根后，剪掉主根（图1.b），进行移栽，缓苗后进行接种等相关研究（图1.c）。但这种下胚轴穿刺法存在以下缺点：（1）毛状根转化效率受基因型的影响：有些大豆品种产生毛状根的效率只有50%。（2）形成毛状根的时间较长：一般情况下穿刺14天后开始看到毛状根产生，30天后基本不再有新的毛状根产生。大部分品种产生毛状根的时间约为15-30天左右。（3）形成毛状根后，需要剪掉主根，重新移栽，在这一过程中，大豆需要缓苗、并且容易造成人为的污染。也有研究采用子叶来诱导毛状根的，即将培养7-10天的大豆子叶切下，并在子叶节处深切数刀，在活化的发根农杆菌菌液中浸泡的方式来诱导毛状根（宗晓秋等，发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建议，华中农业大学学报，2012年第31卷第6期第699-703页），其缺点在于也需要切下诱导的毛状根和移栽培养，操作相对比较复杂和培养条件要求较为严格。

因此，需要寻找或研发更有效的更容易操作的发根农杆菌介导的大豆毛状根转化方法。

发明内容

本发明针对下胚轴穿刺法存在的缺点，进行技术改进，以期克服其缺点，要解决的技术问题为：缩短毛状根转化的周期、提高产生毛状根的效率；减少操作步骤，减少人为污染。

本发明采用横切大豆幼苗的下胚轴，将发根农杆菌涂抹在切开处，扦插到蛭石中，并浇注发根农杆菌菌液，培养后可见切口处膨大并长出毛状根，称此方法为扦插一步法。

为了确保这种方法能够成功，首先解决大豆幼苗的下胚轴在横切后扦插不存活的问题，对此需要采取横切扦插后，需要保证足够湿度,其次要确保能够有效诱导长出毛状根，一方面要选择特定的生长阶段的大豆细幼苗，同时需要选择好横切的位置。

对此，本发明因此提供一种以发根农杆菌介导的大豆毛状根诱导转化方法，包括如下步骤：选取大豆播种后在真叶即将展开时的幼苗，在子叶节下0.2-0.8 cm处的下胚轴处进行横切，在带子叶的幼苗的下胚轴切口处蘸发根农杆菌菌体后扦插，并浇注含所述发根农杆菌菌液的发根诱导营养液进行培养,优选地营养液中含有0.5mM MgSO₄；1mM CaCl₂；0.7mM KH₂PO₄；0.5mM Na₂HPO₄；0.05mM Fe-EDTA；0.5mM NH₄NO₃；1×Hougland Minor Salt。

优选地，其中所述培养时的温度为20-24℃，在培养温度下相对湿度80%以上,优选85%以上,如85-90%。为了保持湿度，采取如下方式：通过通光率80%以上,优选90%的材料如高通光保鲜袋罩上以保持湿度,放到培养架上正常光照培养（如16 h光照，24℃；8 h黑暗，20℃）。

优选地，横切的位置是在子叶节下0.4-0.6cm，最优选为0.45-0.55cm处。

优选地，所述横切是与下胚轴倾斜40-50度角，优选为45度角切下。

在一个实施方式，所述扦插是将带子叶的幼苗的下胚轴切口处蘸发根农杆菌菌体后，放入预先插孔的蛭石中，并用一侧的蛭石压实。

优选地，所述发根农杆菌是发根农杆菌K599。

优选地，下胚轴切口处蘸发根农杆菌，即在固体LB培养基上培养的发根农杆菌菌体；其后浇注含所述发根农杆菌的菌液，其浓度为OD₆₀₀=0.05以上，优选为0.1以上，例如在0.1-0.15为优选菌液浓度。

在一个相对具体实施方式中，本发明方法操作步骤如下：

（1）第一天，大豆播种：将表面灭菌的种子播种在灭菌的蛭石中，播种深度1.5cm，并用无菌水浇灌充足；

（2）第四天，农杆菌活化培养：携有目的载体的发根农杆菌K599（自身具有链霉素抗性，Str+）保存菌液在固体LB培养基（含有目的载体抗生素和链霉素，链霉素浓度为25mg/L）中28℃过夜培养；

（3）第六天，农杆菌大量培养：接种2-3个单克隆菌到无抗生素的固体LB培养基培养过夜；

（4）第七天，扦插转化：第七天后真叶即将展开，左手捏住子叶，大豆子叶节下0.5cm处用灭菌/锋利的解剖刀片，与下胚轴倾斜45度角切下，下胚轴切口处蘸K599的菌体，放入预先插孔的蛭石中，并用一侧的蛭石压实;

（5）用5ml浓度为OD₆₀₀=0.1的K599菌液发根诱导营养液（含有0.5mM MgSO₄；1mM CaCl₂；0.7mM KH₂PO₄；0.5mM Na₂HPO₄；0.05mM Fe-EDTA；0.5mM NH₄NO₃；1×Hougland Minor Salt），罩上高通光保鲜袋，放到培养架上光照培养（16 h光照，24℃；8 h黑暗，20℃）；

（6）培养至长出新的毛状根：在切开处有新根长出，可以接种根瘤菌或开展其它相关实验。

本发明采用横切下胚轴的方式，在采取前述提及的措施，而将发根农杆菌体涂抹在切开处，确保扦插存活，浇注发根农杆菌菌液，在切开部位直接产生使毛状根，实现了毛状根转化的快速、高效、一步化完成。因而，本发明具有下述明显的有益效果：（1）节省大豆种植基质和空间：大豆转化幼苗的培养，每盒（8cm*11cm*9cm）可以种植20棵大豆，适合大规模的培养。（2）毛状根产生的时间缩短：采用此横切-扦插法产生毛状根的时间比穿刺法快5-7天。（3）不受基因型的影响：应用此方法大豆产生转基因毛状根的比例达到90-100%，不受基因型的影响。（4）本发明扦插后，不需要像穿刺方法那样剪掉主根再进行移栽，节省了操作步骤和时间，尤其是在研究根瘤菌和大豆之间互作时，减少了其它根瘤菌的污染。

附图说明

图1.现有技术的大豆毛状根转化下胚轴穿刺法

a. 注射器穿刺大豆下胚轴，b.长出转基因毛状根后，剪掉主根，c.移栽。

图2.实施例一大豆品种Williams 82毛状根转化扦插一步法过程

a. 真叶即将展开时的幼苗，b. 下胚轴切口处蘸发根农杆菌，c. 扦插至蛭石中，d.第10天时长出毛状根的情况，e.第17天时长出毛状根的情况。

图3实施例二大豆中黄13号毛状根转化扦插一步法第17天长根情况。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，以列好的理解本发明，但其不构成对本发明的限制。其中没有特别说明的操作如培养基等按常规方式。

实施例一

（1）第一天，大豆品种Williams 82（大豆基因组测序公开品种）播种：将表面灭菌的种子播种在灭菌的蛭石中，播种深度1.5cm，并用无菌水浇灌充足。

（2）第四天，农杆菌活化培养：携有目的载体的发根农杆菌K599（自身具有链霉素抗性，Str+）保存菌液在固体LB培养基（含有目的载体抗生素和链霉素，链霉素浓度为25mg/L）中28℃过夜培养。

（3）第六天，发根农杆菌K599大量培养：接种2-3个单克隆菌到无抗生素的固体LB培养基培养过夜。

（4）第七天，扦插转化：大豆播种7天后真叶即将展开（图2.a），左手捏住子叶，大豆子叶节下0.5cm处用灭菌且锋利的解剖刀片，与下胚轴倾斜45度角切下，下胚轴切口处蘸在固体LB培养基上培养的发根农杆菌K599，即从固体培养基上用涂布器收集的菌体（图2.b），放入预先插孔的蛭石中，并用一侧的蛭石压实（图2.c）。

（5）用5ml有K599菌液（OD₆₀₀=0.1）的发根诱导营养液，营养液的具体组成0.5mMMgSO₄；1mM CaCl₂；0.7mM KH₂PO₄；0.5mM Na₂HPO₄；0.05mM Fe-EDTA；0.5mM NH₄NO₃；1×Hougland Minor Salt，罩上高压PE高通光保鲜袋（厚度为0.03mm，通光率90%），放到培养架上光照培养；

（6）扦插后第10天开始长出新的毛状根：在下胚轴切口处有新根长出（图2.d）。扦插后第15天，毛新生状根平均长度在5cm左右，扦插第17天后，平均每株新生根为15条左右，平均根长可达9cm（图2.e）。此时可以接种根瘤菌或开展其它相关实验。

实施例二

本实施例采用的大豆品种是中黄13号，其具体操作参照实施例一的方式，如图3所示在第17天后的切开处的长根情况。

Claims

1.一种以发根农杆菌介导的大豆毛状根诱导转化方法，包括如下步骤：选取大豆播种后在真叶即将展开时的幼苗，在子叶节下0.2-0.8cm处的下胚轴处进行横切，在带子叶的幼苗的下胚轴切口处蘸发根农杆菌体后扦插，并浇注含所述发根农杆菌菌液的发根诱导营养液进行培养。

2.如权利要求1所述的大豆毛状根诱导转化方法，其特征在于：发根诱导营养液的培养基组成为0.5mM MgSO₄；1mM CaCl₂；0.7mM KH₂PO₄；0.5mM Na₂HPO₄；0.05mM Fe-EDTA；0.5mMNH₄NO₃；1×Hougland Minor Salt。

3.如权利要求1所述的大豆毛状根诱导转化方法，其特征在于，横切的位置是在子叶节下0.4-0.6cm，最优选为0.45-0.55cm处。

4.如权利要求1所述的大豆毛状根诱导转化方法，其特征在于，所述横切是与下胚轴倾斜40-50度角，优选为45度角切下。

5.如权利要求1所述的大豆毛状根诱导转化方法，其特征在于，其中所述培养时的相对湿度80%以上,优选85%以上,如85-90%。

6.如权利要求5所述的大豆毛状根诱导转化方法，其特征在于，通过通光率80%以上,优选90%的材料如高通光保鲜袋罩上以保持湿度，进行光照培养，优选光照条件是16 h光照，24度；8 h黑暗，20度。

7.如权利要求5所述的大豆毛状根诱导转化方法，其特征在于，所述扦插是将带子叶的幼苗的下胚轴切口处蘸发根农杆菌菌体后，放入预先插孔的蛭石中，并用一侧的蛭石压实。

8.如权利要求5所述的大豆毛状根诱导转化方法，其特征在于，浇注含所述发根农杆菌的菌液浓度为OD₆₀₀=0.05以上，优选为0.1以上，例如在0.1-0.15为优选菌液浓度。

9.如权利要求1至8任一项所述的大豆毛状根诱导转化方法，其特征在于，所述发根农杆菌是发根农杆菌K599。