CN110106094A

CN110106094A - 耐高温大球盖菇菌株及其应用

Info

Publication number: CN110106094A
Application number: CN201910546457.5A
Authority: CN
Inventors: 姜淑霞; 任纪帆; 朱静娴; 孟宪鹏; 张友朋; 齐广耀
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-06-24
Also published as: CN110106094B

Abstract

本发明公开了一株耐高温大球盖菇菌株Stropharia rugosoannulata，所述菌株的名称为山农球盖3号，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.17676。该菌株具有稳定的耐高温特性和高产性能，是新的菌株，其菌丝和子实体耐高温能力大幅提高，有效解决了生产上初秋早播菌丝不耐高温、晚秋播种来年春末夏初子实体易开伞的问题。

Description

耐高温大球盖菇菌株及其应用

技术领域

本发明涉及食用菌技术领域，具体涉及一株耐高温大球盖菇菌株及其应用。

背景技术

大球盖菇(Strophariarugosoannulata)是一种重要的食、药用真菌，其味美色优，营养丰富，具有增强人体免疫、降低血糖等保健及药用价值。

大球盖菇属于中低温类食用菌，其菌丝生长温度适应范围为5-32℃，子实体形成及生长的温度范围为10-20℃，当气温上升至20℃时子实体易开伞，品质变差，25℃时原基不分化。因此在我国华东地区露天环境下一年只能栽培一次，生产上一般安排在10-11月份播种，来年4月上旬地温稳定在12℃以上开始出菇，但由于气温、地温均回升很快，在温度高于25℃时原基难分化，气温高于20℃时子实体易开伞，产量及质量均明显下降，严重影响生产效益。若8-9月份播种，11-12月份出菇时产品质量好，耐储存，但播种后菌丝遇到30℃以上高温，易造成“烧菌”，导致栽培失败或减产。耐高温大球盖菇菌株的缺乏已成为产业发展的瓶颈。因此，亟需筛选出优质的耐高温大球盖菇菌株。

目前食用菌耐高温菌株的筛选主要是采用菌丝体热激法，即菌丝体在适宜培养条件下培养一定时间后，放入高温条件下进行热刺激1-8h，再取出放在正常温度25℃下进行恢复培养，测量菌丝的生长速度，淘汰耐高温能力差的菌株。但这种方法筛选出的耐高温菌株缺乏代表性及稳定性，随继代培养次数的增加，菌株的异质性也越来越明显；而且容易出现菌丝体耐高温，但高温条件下不能正常出菇的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株耐高温大球盖菇菌株(Strophariarugosoannulata)山农球盖3号。该菌株具有稳定的耐高温特性和高产特性，同时，还具有出菇早、出菇期长、一级菇比例高、抗杂能力强等优点，经过验证，是新的菌株，其菌丝和子实体耐高温能力大幅提高，有效解决了生产上初秋早播菌丝不耐高温、晚秋播种来年春末夏初子实体易开伞的问题。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明提供的耐高温大球盖菇菌株(Stropharia rugosoannulata)，命名为山农球盖3号，该菌株已于2019年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为：CGMCCNO.17676。

本发明的耐高温大球盖菇菌株(Stropharia rugosoannulata)山农球盖3号，菌丝生长温度范围5～42℃，菌丝最适生长温度范围24～32℃，耐最高温度45℃；子实体形成温度范围10～35℃，子实体形成适宜温度范围18～30℃。

本发明所请求保护的耐高温大球盖菇菌株，即包括CGMCC NO.17676所对应的菌株，也包括该菌株繁殖所产生的与所述菌株具有相同遗传学和/或形态学性状的后代。

所述耐高温大球盖菇菌株(Stropharia rugosoannulata)山农球盖3号作为亲本进行育种中的应用也属于本发明的保护范围。

栽培所述耐高温大球盖菇菌株(Stropharia rugosoannulata)山农球盖3号得到的子实体也属于本发明的保护范围。

培养所述耐高温大球盖菇菌株(Stropharia rugosoannulata)山农球盖3号得到的菌丝体和/或孢子也属于本发明的保护范围。

根据本发明的一方面，本发明还涉及所述耐高温大球盖菇菌株(Strophariarugosoan nulata)山农球盖3号的栽培方法，包括如下步骤：

(1)将耐高温大球盖菇菌株(Stropharia rugosoannulata)山农球盖3号培养得到的原种接种到栽培种培养基中，25-27℃条件下培养29-31d，得到栽培种；

(2)将培养料建堆发酵，待料温降至30℃以下时铺料播种，每铺1层料点1层栽培种，共3层料2层菌种，建成梯形堆；

(3)待菌丝长到培养料厚度的2/3以上时开始覆土，覆土材料的含水量保持在20-25％，覆土厚度为3cm；

(4)播种20d后根据料堆情况酌情补水；发菌完成后灌大水催菇，同时增大通风量，促进菌丝扭结形成原基；

(5)出菇期将空气湿度维持在85-95％，加强通风和控制病虫害。

优选的，步骤(1)中，所述栽培种培养基由以下质量百分比的原料组成：

木屑30％、棉籽壳30％、稻壳20％、麦麸18％、石膏1％、生石灰1％；

加水至栽培种培养基的含水量为75％。

优选的，步骤(2)中，所述培养料由以下质量百分比的原料组成：

稻壳45％，杂木屑28％，桑枝10％，玉米芯10％，田园土5％，生石灰2％；

加水至培养料的含水量为75％。

优选的，步骤(3)中，所述覆土材料由晒好的表层土和草炭土按重量比1:1混合并加水润湿制备而成。

根据本发明的一方面，本发明还涉及上述耐高温大球盖菇菌株(Strophariarugosoan nulata)山农球盖3号得到的子实体在食品加工中的应用。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种食品，其含有如上所述菌株；

和/或：

所述菌株培育得到的菌丝体和/或子实体。

本发明的有益效果：

本发明所提供的耐高温大球盖菇菌株(Stropharia rugosoannulata)山农球盖3号是采用单孢杂交育种技术获得，与常规大球盖菇品种相比，菌丝和子实体耐高温能力得到大幅提高，有效解决了生产上初秋早播菌丝不耐高温、晚秋播种来年春末夏初子实体易开伞的问题，生物学效率在85％以上，在生产上具有较高的推广应用价值。可以作为适合早秋栽培的菌丝耐高温、优质高产的大球盖菇栽培品种，达到当年秋末冬初出菇，收获产量高、品质好的子实体；也可以在秋末冬初栽培，来年初夏季节收获产量高、品质好的子实体，解决了常规大球盖菇品种初夏季节出菇子实体质量较差的问题。

附图说明

图1：部分杂交菌株热激后恢复生长实验图。

图2：杂交菌株与亲本菌株的亲缘关系图。

图3：引物对Me5-Em2对应的10株菌株SRAP图谱。

图4：本发明的菌株热激后恢复生长实验图。

图5：春暖棚内地温和气温变化曲线。

图6：冬暖棚内地温和气温变化曲线。

图7：大球盖菇出菇照片。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

术语说明：

子实体：是高等真菌的产孢构造，即果实体，由已组织化了的菌丝体组成。

原基：食用菌出菇之前，由菌丝缠绕扭结形成的一个一个小颗粒，长大后即为一个一个蘑菇。

菌丝：单条管状细丝，为大多数真菌的结构单位。

菌丝体：很多菌丝聚集在一起组成真菌的营养体，即菌丝体。

生物学效率：是指食用菌鲜重与所用的培养料干重之比，常用百分数表示。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

本发明实施例中所用的培养基如下：

再生培养基：马铃薯200.0g，蔗糖20.0g，蛋白胨2.0g，酵母粉2.0g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，渗透压稳定剂1000.0mL，琼脂20.0g。

以0.6mol/L的甘露醇为渗透压稳定剂。

母种培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁1.5g，蛋白胨3.0g，磷酸二氢钾3.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。

液体培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL。

原种培养基：小麦96％，麦麸2％，石膏2％；均为质量百分比。加水至原种培养基的含水量为75％。

栽培种培养基：木屑30％，棉籽壳30％，稻壳20％，麦麸18％，石膏1％，生石灰1％；均为质量百分比。加水至栽培种培养基的含水量为75％。

培养料：稻壳45％，杂木屑28％，桑枝10％，玉米芯10％，菜园土5％，生石灰2％；均为质量百分比。加水至培养料的含水量为75％。

实施例1：耐高温大球盖菇的选育与鉴定

1.亲本的选择：

山东农业大学微生物重点实验室选育的高产大球盖菇菌株S26(出菇早，产量高)和R10(一级菇比例高，不易开伞)。

2.获得孢子：

在实验田中，选择第一潮出菇、种菇八成熟，长势整齐、菇形端庄、原基出现时间短、菌帽厚、菌柄粗长的子实体。

在超净工作台内，将采摘的适宜用作亲本的子实体切去菌柄，弃置。菌褶向下置于无菌培养皿中，放置24h，获得孢子印。之后取出菌盖，盖上培养皿，标记好菌株的名称，用保鲜膜封口，孢子印备用。

3.单孢分离：

采用平板稀释分离法，在超净工作台中，用无菌滤纸条沾取无菌水，纸条润湿，蘸取孢子，移入带有无菌水的离心管中，充分混匀后此时的浓度记做a，再吸取100μL孢子液，注入装有900μL无菌水的离心管中，多次吸打，此时孢子液浓度为10^-1a，之后重复上述操作，在5个离心管中制得浓度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6a的稀释液，稀释时要注意枪头的更换，防止孢子液的浓度产生变化。将不同浓度的孢子液吸取100μL注入直径为9cm的平板培养基中涂布，每个浓度涂布3个平板，封口后记录数据。根据涂布后孢子萌发的结果选择合适的浓度为10^-4a。之后均在此浓度下涂布平板制得单个菌落。将培养皿置于26℃黑暗条件下培养，4d后孢子萌发，观察挑选发育匀称快速的单个菌落，在超净工作台中挑取孢子，转接于斜面培养基，纯化培养，初步得到单核菌株。

4.单核菌丝的鉴别

当单个孢子萌发的菌落生长至直径大于1cm时，挑取菌落边缘菌丝移至载玻片上，进行镜检，如果没有锁状联合，可初步推测其为单核菌丝，确定为单核菌丝后接入到斜面培养基进行纯化培养。

5.单核菌丝的杂交配对

将两个不同亲本的单核菌丝同时接种于平板培养基上，相距1.0cm-1.5cm，培养7d左右，待两菌丝接触后，挑取交界处的部分进行镜检，如发现锁状联合，立即将其转接于新的斜面培养基上，于25℃下培养7d-10d左右，挑出菌丝生长旺盛、菌落形态均匀的菌株，挑取少许菌丝放在显微镜下观察，鉴定确是双核菌丝后，进行PDA斜面试管扩大培养，通过杂交共获得228株杂交菌株，放入冰箱内保藏，留作筛选试验用。

6.杂交菌株的筛选：

6.1初筛：

(1)热激处理

将228株双核菌丝的平板培养基置全自动生化培养箱中，设置参数(38℃，24h)，结束后恢复26℃继续培养。用十字交叉法测量菌落半径，记录热激后的生长位置，计算菌丝恢复生长速率以及生长速率，以生长速率、菌落颜色以及菌丝粗壮程度为指标进行综合筛选。

试验结果：将菌落形态不均一、菌丝生长较弱、生长恢复速率慢于亲本的淘汰，最后筛选出49株优良的异核菌丝体，结果见表1。

表1：38℃热激筛选所得耐高温杂交菌丝生长情况

注：+长势一般 ++长势良好 +++长势旺盛

由表1可以看出，49株筛选得到菌株的菌落半径，RCM15(40号)菌落半径为13mm，在49株中最小。J7L1(17号)以35mm的菌落半径占第一位，其中2株小于15mm占比4.08％，13株在15～20mm占比26.53％，10株在20～25mm占比20.41％，13株在25～30mm占比26.53％，10株大于30mm占比20.41％。菌落半径分布比较均匀。排在前十位的是J6L8、J8L8、20、J2L8、J6L7、J7L5、L20、J5L4、J8L4、J8L3。

(2)杂交菌株的耐高温驯化

通过观察菌丝生长状况，将热激处理后筛选出的杂交菌株进行转接，每个菌株作为一个处理，每个处理3个重复，并以26℃恒温培养的杂交菌株为对照。将菌株置于全自动生化培养箱中，设置参数为(33℃，8h；26℃，16h)，培养14d。选取长势良好菌株转接，置于25℃下培养5d，重新置入生化培养箱中，设置参数为(38℃，8h；26℃，16h)，培养14d。剔除劣势菌株后，转接，培养。5d后置于全自动生化培养箱中，设置参数为(42℃，8h；26℃，16h)，培养14d。筛选出菌丝粗壮、洁白、长势良好、能够耐受42℃的菌株进行转接。

试验结果：

表2：耐高温驯化筛选得到杂交菌丝生长状况

注：+长势一般 ++长势良好 +++长势旺盛

如表2所示，经过耐高温循环驯化，以菌落平均半径、菌丝日平均生长速度、菌丝长势、菌丝颜色为指标综合筛选得到27株耐高温菌株。

菌落半径比较中，J8L4有最大菌落半径21mm，J8L7有最小菌落半径7mm。27株中有9株在15～20mm占比33.33％，15株在10～15mm占比55.56％，3株在5～10mm占比11.11％，大部分在10～15mm。前十位J8L4、J8L3、M1、J6L8、Y1、J8L7、L20、J6L4、J8L8、J2L8。

(3)拮抗试验

选育出的耐高温菌株与出发菌株(或两亲本)同时接种于培养皿中，相距20mm，每个处理重复3次，在26℃条件下培养，观察菌落交界处是否产生拮抗线。

试验结果：选育出的耐高温菌株与出发菌株(或两亲本)均有明显的拮抗现象。

(4)继代培养试验

选育出的耐高温菌株在26℃条件下进行继代培养，选取第5代、第10代、第15代作为验证对象。将新转接的菌株置于(26℃，16h；38℃，8h)循环下培养5d，计算菌丝生长速度，与初代菌丝生长速率作比较，结果见表3。

表3：耐高温菌株遗传稳定性试验结果

7.复筛：

(1)热激后杂交菌株二级种的恢复生长速率

对初筛得到的耐高温菌丝进行复筛。将杂交菌株与亲本菌株转接装有90％麦粒、8％木屑、2％石膏的25×200mm的试管中，等到菌丝完全定植后置于38℃培养箱中热激24h，在菌丝的生长位置作标记。热激后恢复25℃培养，测得菌丝的生长恢复速率。

实验结果如表4：

表4：热激处理后的菌株生长速率

从表4可以看出，J8L4在12株杂交菌株生长速率最快，高于出发菌株和其他杂交菌株，说明在二级栽培种中，J8L4也表现最优。

部分杂交菌株热激后恢复生长的实验图如图1所示，由图1可以看出，菌株J8L4与其他杂交菌株相比，在热激后，菌丝的生长速率更快，菌丝更加洁白粗壮，长势优于出发菌株和其他杂交菌株。

8.菌株遗传多样性及亲缘关系分析

经过初筛、复筛选取生长速率最快、长势最好、菌丝最粗壮、耐高温最强的8株菌株与亲本做SRAP分析，分析其亲缘关系远近。

(1)菌株活化、培养及DNA提取

在DNA提取前将10株大球盖菇菌株活化后接种到母种培养基上，26℃培养7d，取边缘生长旺盛的菌丝转接到新的母种培养基上复壮。复壮后的菌株再转接到铺有玻璃纸的母种培养基上，26℃恒温黑暗培养10d。每菌株刮取200mg新鲜菌丝，放入研钵中，倒入液氮迅速研磨成粉末，采用植物基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)根据操作步骤，提取总DNA，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像分析***中拍照，贮存于-20℃冰箱中备用。

(2)SRAP扩增反应体系及反应程序

SRAP扩增反应体系：反应体积25μL，其中2×Tap PCR Master Mix 12.5μL，100μmo1/L上、下游引物各1μL，模板为50ng/μL DNA1μL，用双蒸水补足体积。

SRAP扩增基准程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

取扩增产物7μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，同时以DNA Ladder Marker2000bp作为分子量标记，100V恒压电泳40～-60min，通过紫外凝胶成像***观察并拍照。

(3)SRAP引物筛选

采用Li et al.2001年发表的引物，由上海铂尚生物技术有限公司合成(表5)。正向引物16条(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16)，反向引物18条(SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.34)，采用Me-Em的组合表示方式共得到288对引物。选用3份大球盖菇DNA对288对引物进行筛选，将重复性好、强度较高、清晰可辨无争议、能体现菌株间差异的条带确认为标记条带，进行相应的统计和分析以筛选出最佳组合引物。

筛选结果：从288对引物中共筛选出38对重复性好、多态性比率高的引物。利用38对引物对10份大球盖菇基因组DNA进行SRAP扩增并电泳检测，共扩增出218个位点，其条带分子量大小在100-2000bp之间。其中多态性位点144个，多态性比率为66.1％，平均每对引物扩增出5.73个位点，平均多态性位点数为3.78个。

表5：SRAP引物序列

(4)SRAP电泳结果统计及处理分析

将相同引物PCR扩增产物中电泳迁移率一致的标记条带确认为同一条带，扩增阳性记录为“1”，扩增阴性记录为“0”，利用Excel把图形资料转换成数据资料，统计形成“0/1”表型数据矩阵，根据该数据矩阵统计计算出多态位点数、总位点数和多态位点比率P(Percentage of polymorp hic sites)，估算遗传分化的水平。

计算公式：P＝k/n(100％)

式中：P为多态性位点比率，k为多态性位点数，n为扩增位点数。

利用NTSY S-PC软件进行菌株间的非加权组平均法(UPGMA)聚类分析，生成遗传距离聚类图2。

由图2可以看出，当相似性系数为0.86时，10株耐高温菌株均被区别开，说明该10株耐高温菌株适合作为栽培试验的供试菌株。菌株M1、L20与其出发菌株S26聚在同一支上，菌株Y1、J8L3与出发菌株R10聚在一支，J8L7与J8L4聚在一支，J6L4、J6L8聚在一支，但亲缘关系均较远，说明与亲本差异明显，与出发菌株产生了一定差异，符合筛选要求。

本发明选择耐高温效果和高产特性最优的菌株J8L4进行生物保藏，菌株J8L4鉴定为大球盖菇菌株(Stropharia rugosoannulata)，命名为山农球盖3号。经测定，本发明选育的耐高温菌株(菌株编号为J8L4)的菌丝生长温度范围5～42℃，菌丝最适生长温度范围24～32℃，耐最高温度45℃；子实体形成温度范围10～35℃，子实体形成适宜温度范围18～30℃。

山农球盖3号热激后恢复生长实验图如图4所示。

菌株J8L4的保藏信息如下：

参据的生物材料(株)：山农球盖3号

分类命名：大球盖菇Stropharia rugosoannulata

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019.4.28.

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.17676。

实施例2：耐高温大球盖菇的栽培

1.母种的制备

将活化好的耐高温大球盖菇山农3号菌株接种到母种培养基中，置于26℃条件下恒温培养15d。

2.液体菌种的制备

将母种接种到装有100mL无菌液体培养基的锥形瓶中，每瓶接种7个直径5mm的菌饼，置于26℃恒温摇床中160r/min培养7d。

3.原种的制备

称取适量麦粒，加入2％生石灰浸泡12h，捞出漂洗1～2次后大火煮沸，煮至大部分麦粒透明无白心，立即倒入冷水中进行冷却。沥掉多余水分，加入2％麦麸和2％石膏搅拌均匀。用原种瓶分装麦粒，每瓶装入2/3麦粒，用透气封口膜封口。在126℃条件下灭菌120min，冷却后每瓶接入液体菌种20mL，置于26℃条件下培养，作为原种备用。

4.栽培种的制备

将栽培种培养基装入聚丙烯菌袋中在126℃条件下灭菌120min，冷却后接入原种置于26℃条件下培养30d备用。

5.建堆发酵

将预湿好的培养料混合均匀，建成底宽1.5m左右、顶宽0.8m左右、高1.5m左右，长度适宜的发酵堆。每隔20cm用直径8cm左右的竹篙打孔，以改善料堆的透气性，防止料堆中部和底部缺氧造成厌氧发酵。建堆过程中注意补水，使含水量在80％以上，建堆完成后用草帘或遮阳网遮盖保湿，必要时加盖塑料膜。每天测量料堆20cm左右处的温度，若覆盖塑料膜每天通风2～3次，增加膜下氧气含量。

料堆温度升到65℃左右，保持24h进行第1次翻堆。翻堆时注意将内外层料混匀，若发现料堆过干可补充适量澄清石灰水，其余操作同第1次建堆一致。待温度再次升至65℃左右后保持24d，进行第2次翻堆，建堆升温后经常检查培养料发酵情况，确保料堆无酸臭味，培养料松软、呈褐色时可用于播种。

6.大球盖菇栽培及管理

①播种播种前在整个栽培区洒上生石灰，料温降到30℃左右铺料播种，每平方米用种量为500g。每铺1层料点1层菌种，共3层料两层菌种，建成梯形堆，方便侧面覆土。播种后用直径4cm左右的木棒打孔，增加氧气含量。安装空气温湿度和土壤温湿度传感器，用以监测记录整个栽培期间的温度条件。

②覆土及覆盖物建堆播种后及时铺盖用石灰水浸泡过的稻草作为覆盖物，厚3cm左右。待菌丝长到发酵料2/3以上开始覆土，覆土材料选用晒好的表层土与草炭土1:1混合并加水润湿，使含水量保持20％～25％。覆土厚度3cm左右，覆土后重新打孔。

③发菌期管理发菌前期无需补水，播种20d后根据料堆情况酌情补水。补水时应时常注意料堆侧面的情况，控制水速及水量，防止侧面覆土被水冲走。发菌完成后，灌大水催菇，同时增大通风量，促进菌丝扭结形成原基。

④出菇期管理出菇期空气湿度维持在90％左右，天气晴朗时在中午前后及时喷水，少量多次，增加空气湿度及覆盖物湿度。空气温度过高时(超过30℃)及时通风喷水，确保菇体正常生长。

出菇期间应注意光照强度，必要时要及时加盖遮阳网，防止光照过强，引起灼伤，降低菇质。若光照太弱则影响原基形成分化，子实体颜色变浅，影响产量品质，根据天气及时控制大棚卷帘情况。出菇期间应该加强通风，降低二氧化碳浓度，良好的通风透光情况能够使子实体健壮，整齐度较高。

⑤病虫害防治大球盖菇整个栽培过程中无需使用农药，发菌期主要防治杂菌污染，若出现鬼伞、盘菌、粘菌等杂菌及时拔除即可，若发现局部感染青霉、绿霉或毛霉时及时将感染部位挖掉，并洒少量石灰，补充新土，拢平畦面。菌丝长满后及时悬挂黄板，引诱飞虫，防止菇蚊、菇蝇等的危害，同时使用糖醋液引诱果蝇、小地老虎等。

⑥采收及转潮管理当子实体基本成熟，菌幕尚未破裂时，及时采收。采收时一只手捏着菇脚轻轻转动然后向上提起，另一只手按在菇脚周围，稳固料面及土层，防止带动附近菇蕾。每次采收时间固定在16:00左右，此时经过午间高温期，温度逐渐回落，高温会促使子实体迅速成熟、开伞。此时采收统计一级菇产量可较准确反映大球盖菇子实体耐高温情况。

一潮菇采收结束后，清理菌床，补平覆土，停水养菌5～7d，待菌丝恢复后再灌大水，增大通风进行催菇。

实施例3：出菇试验

通过单孢杂交育种、耐高温驯化、初筛、复筛筛选出的耐高温菌株，经室内拮抗试验、继代培养等方法验证共得到8株耐高温菌株(J8L4、J8L3、J8L7、J6L8、J6L4、M1、Y1、L20)，对其进行栽培试验(栽培方法同实施例2)，以SM(国家认证品种)、S26(出发菌株)和R10(出发菌株)作为对照。

试验一：春暖棚出菇

2018年9月15日在春暖大棚内进行铺料播种，栽培时地温为26℃。栽培结束后及时安装空气、土壤温度传感器，测量春暖棚内温度，每小时记录一次温度数据，并制作大球盖菇栽培期间春暖棚内地温和气温变化曲线(图5)。菌种萌发、定植、发菌天数及各菌株产量和一级菇比例见表6和表7。

表6：春暖棚内大球盖菇菌丝生长时间统计

表7：春暖棚大球盖菇出菇情况及产量统计

由图5可以看出，春暖棚内温度随天气变化明显，气温波动较大，料温相对较为稳定。播种后4d内为菌种萌发和定植期，期间最高气温为44℃，平均气温为33.5℃，最高料温为37℃，平均料温为32℃。从表6和表7中可以看出，菌株J8L3、J8L4播种1d后萌发，3d吃料定植，其次为J8L7、J6L4、L20，播种后2d萌发，4d定植，吃料定植较慢的为SM(CK)、S26、R10、Y1，播种3d后萌发，5d定植。虽然所有菌株在5d内均萌发定植，但菌株SM、Y1菌丝萌发时间慢，且菌丝较为细弱，说明在以上栽培条件下该菌株的生长被抑制。菌株J8L3、J8L4，在播种初期便迅速萌发，说明在以上栽培条件没有抑制菌丝生长，其菌丝具有一定的耐高温能力。

播种第7d-40d为发菌期，期间最高气温为42℃，最高料温为36℃，平均料温基本维持在23℃以上。播种后第25d大部分菌丝长满料堆的2/3，此时进行了覆土。这一阶段料温较为稳定，在20-28℃之间，供试菌株中发菌最快的为菌株J8L4，仅25d就长满料堆，其次为J8L3，之后是35d长满料堆的J6L8、J8L7、J6L4、R10和S26，生长较慢的是Y1、M1，对照SM为38d，而且菌株SM(CK)、M1、L20有较多的鬼伞、泡质盘菌污染，说明其抗杂能力较弱。

播种后第41d-60d为第一潮出菇期，期间温差较大，播种后第60d后最低气温降至0℃左右，料温也逐渐降至15℃以下。这一阶段最高气温为30℃，平均气温为11℃，最高料温25℃，平均料温为19℃。发菌速度快慢与出菇时间早晚有一定的关系，供试菌株中出菇最早的是J8L4，其次为J8L3和J6L8，对照菌株第60d开始出菇。第一潮菇产量最高的为S20(5.02kg/m²)，其次为J8L3(3.93kg/m²)和M1(3.53kg/m²)，对照SM产量最低，为0.95kg/m²，原因可能是出菇时间较晚，之后料温降至10℃以下，不适合原基形成，产量偏低。播种后60d-150d料温基本低于12℃，各菌株均未出菇。

播种第150d-190d(第二年春季)为第二潮出菇期，期间最高气温为40℃，其中有40d气温高于25℃(每天维持3h以上)，料温最高为26℃；播种后第191d-210d为第三潮出菇期，期间最高气温为44℃，且基本每天至少有4h以上高于25℃的气温，此时料温最高为28.5℃，平均料温为24.5℃。春暖棚大球盖菇产量统计截止至2019年4月16日(211d)，此时春暖棚内最高气温基本在40℃以上，料温基本在25℃以上，菌株J8L4、J8L3和J6L8仍有较多的原基分化。此条件下第二、三潮菇产量最高的为J8L4(6.82kg/m²)，其次为J8L3(5.52kg/m²)和J8L7(5.42kg/m²)，产量最低的为L20(3.85kg/m²)和CK(4.38kg/m²)，出发菌株S26和R10产量分别为4.27kg/m²和3.48kg/m²。供试菌株中产量最高的为J8L4(11.84kg/m²)，生物学效率为70.27％。其次为J8L3和M1，转化率分别为66.23％和65.20％，生物学效率最低的是L20，仅21.71％。除大L20之外，所有耐高温菌株生物学效率均高于对照菌株(26.87％)。一级菇比例最高的是J8L4，为70.9％，远高于对照菌株(33.45％)，其次是菌株J8L3(63.59％)和J6L8(62.69％)。

由以上结果可以看出，菌株J8L4、J8L3菌丝和子实体耐高温表现最好，在料温30℃以上的条件下可以迅速萌发、定植，出菇期比对照提前10d以上，产量远高于对照，在后期气温30℃高温条件下子实体质量明显比对照好，在料温25℃高温条件下依旧有原基形成。

试验二：冬暖棚出菇

2018年10月15日在冬暖大棚内进行铺料播种，栽培时地温24℃。栽培结束后及时安装空气、土壤温度传感器，测量春暖棚内温度，每小时记录一次温度数据，并制作大球盖菇栽培期间春暖棚内地温和气温变化曲线(图6)。菌种萌发、定植、发菌天数及各菌株产量和一级菇比例见表8和表9。

表8：冬暖棚内大球盖菇菌丝生长时间统计

表9：冬暖棚大球盖菇出菇情况及产量统计

从图6可以看出，冬暖棚内最高气温和最高料温随天气情况变化较大，但平均气温和平均料温基本稳定。萌发、定植期(1d-5d)最高气温42℃，平均气温26℃，最高料温39℃，平均料温29℃。与春暖棚内大球盖菇萌发、定植时间类似，菌株J8L3和J8L4最早萌发定植。发菌期(7d-40d)最高气温42℃，最高料温为30℃，平均气温和平均料温在20℃左右，温度环境与春暖棚类似，菌株发菌速度也与春暖棚类似。发菌最快的是J8L4，播种后26d长满料堆，其次是J8L3 28d长满料堆，发菌最慢的是CK，播种后39d长满料堆。菌株CK和L20有大量盘菌污染，其余菌株未发现杂菌，说明菌株CK和L20抗杂能力差。播种后第25d大部分菌丝长满料堆的2/3，进行了覆土。

从第45d-65d为第一潮出菇期，最高气温34℃，有15d气温可在20℃以上维持5h。冬暖棚内出菇次序与春暖棚出菇次序相似，出菇最早的是J8L4，其次是J8L3和J6L8，出菇最晚的是菌株CK，播种后75d出菇。第81d-211d为冬暖棚内大球盖菇第二、三潮出菇期，从图中可以看出，这期间温度为上升趋势，最高气温可升至44℃以上，尤其是出菇后期最高气温基本维持在30℃以上，且持续时间较长。冬暖棚大球盖菇产量统计至2018年5月1日，此时最高气温在35℃以上，料温28℃以上，菌株J8L4、J8L3、J6L8仍有原基。总产量最高的菌株为J8L4，达到14.05kg/m²，为对照SM(6.46kg/m²)的2.2倍，其次为J8L3(12.94kg/m²)。一级菇比例最高的为J8L4(68.68％)，是SM(33.45％)的2.05倍。

由以上结果可以看出，冬暖棚内冬季温度适宜，可大幅度延长大球盖菇出菇期，总产量高于春暖棚。菌株J8L4菌丝和子实体耐高温表现最好，在料温35℃以上的条件下可以迅速萌发、定植，在后期气温30℃高温条件下子实体质量明显比对照好，在料温25℃高温条件下依旧有原基形成。

综合在春暖棚、冬暖棚两种环境下各菌株萌发、定植、发菌和出菇期以及子实体产量和质量情况可以看出，菌株J8L4菌丝耐高温能力较强，在30℃以上的条件下可以较快定植发菌，出菇期提前，一定程度上减少了营养流失，提高了产量，而且子实体在高温下不易开伞，一级菇比例高，质量明显优于对照。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 耐高温大球盖菇菌株及其应用

<130> 2019

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aggcggttgt caattgac 18

Claims

1.一株耐高温大球盖菇菌株Stropharia rugosoannulata，所述菌株的名称为山农球盖3号，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.17676。

2.权利要求1所述的耐高温大球盖菇菌株在作为亲本进行杂交育种中的应用。

3.栽培权利要求1所述的耐高温大球盖菇菌株得到的子实体。

4.培养权利要求1所述的耐高温大球盖菇菌株得到的菌丝体和/或孢子。

5.权利要求1所述的耐高温大球盖菇菌株的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的栽培方法，其特征在于，步骤(1)中，所述栽培种培养基由以下质量百分比的原料组成：

加水至栽培种培养基的含水量为75％。

7.根据权利要求5所述的栽培方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养料由以下质量百分比的原料组成：

加水至培养料的含水量为75％。

8.根据权利要求5所述的栽培方法，其特征在于，步骤(3)中，所述覆土材料由晒好的表层土和草炭土按重量比1:1混合并加水润湿制备而成。

9.权利要求3所述的子实体在食品加工中的应用。

10.一种食品，其含有权利要求1所述的耐高温大球盖菇菌株；

和/或：

所述菌株培育得到的菌丝体和/或子实体。