CN102613054A - 一种提高烟草抗寒、抗病能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高烟草抗寒、抗病能力的方法。它包括：育苗：利用漂浮育苗法进行烟草育苗，在填充有基质的泡沫漂浮孔穴育苗盘中，在烟草种子播种部位下方2～3cm处接种菌根真菌，保证烟草单株含90～150个菌根真菌孢子，然后播种烟草种子，培养，生长出烟草幼苗；在烟草幼苗移栽前2周内，接种溶磷菌液体菌剂2～5次，每次每株烟草幼苗接种量为103～105个溶磷菌，移栽时，在移栽的穴中平铺含有0.5×109～1×109个溶磷菌的溶磷菌固体菌剂，然后移栽烟草幼苗，覆土，然后对烟草幼苗进行常规栽培管理。按照本发明的方法对烟草进行处理，烟草不仅在抗寒性、抗病能力得到了提高，而且同时能够改善烟草的营养和生长。
Description
技术领域：
本发明属于农业微生物应用领域，具体涉及一种提高烟草抗寒、抗病能力的方法。
背景技术：
烟草烤烟是我国主要的经济作物之一，是卷烟工业最重要的基础原料。烤烟栽培实行区域集中和高度统一的生产管理制度，随着种植集约化程度较高，制烟土壤进一步恶化，尤其是连作障碍现象日益严重。由于卷烟是特殊的消费品，对质量的要求很高，其品质直接关系到烟农收益。土壤质量不仅会影响烟草的产量，而且会影响烟草品质使烟草受到“等级”的限制，并进一步制约烟农收益提高。
目前我国烟草种植土传病害发生严重，连作造成烟地土壤质量下降，每年因病虫害减产1.4亿公斤，占烤烟总产量的7％以上。其中华南地区烟草种植过程中烟草移栽期受冷害影响，制约着烟草生产迟缓、发育不良。广东省烤烟生产主要集中在粤北和粤东地区，种植集约化程度较高，连作障碍现象严重，烟草生产受到严重制约。同时为了提高烟草的抗冷害，目前生产上主要采用覆膜方式进行，但是烟草移苗栽培是主要的栽培方式，因此对覆膜和移栽栽培存在很大矛盾。
目前的研究已表明，接种菌根真菌能够提高烟草等植物对氮、磷、钾等元素吸收，降低对重金属吸收和抗寒性能，已引起较广泛的学术兴趣。但是由于菌根真菌不能直接离体培养，严重制约了菌根真菌在烟草上的应用，目前将菌根真菌与烟草接种育苗是烟草菌根化的首选方式，但是菌根化烟草的大田效果往往明显小于盆栽试验的效果，菌根真菌在大田中作用不十分突出，表明菌根真菌在根际微生物态环境中独立贡献作用较低，必须与其他微生物共同作用。
虽然通过筛选合适的烟草品种，调节烟草生长过程中水分、温度或其他栽培等条件也可以提高烟草正常生长，但是品种的选育往往需要较长时间，不能满足当前烟草实际生产需要。而且在现有的烟草研究，菌根真菌可以提高烟草抗旱、降低重金属吸收研究报道；对于单一菌根真菌或溶磷细菌在盆栽条件下能够提高烟草生长或营养元素吸收，但是大田效果效果往往并不理想。对于两种微生物菌剂互作在提高烟草生长或抗病、抗寒性也未见报道；而菌根真菌和溶磷细菌在提高烟草生长、抗寒、抗病能力的微生物菌剂接种技术还未见报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种方法简单、成本较低，不但可以降低磷肥施用量，还能促进烟草生长，提高烟草抗寒、抗病能力的提高烟草抗寒、抗病能力的方法。
本发明首先利用育苗装置培养菌根真菌和烟草幼苗共生，再将菌根烟草幼苗移栽栽培，在烟草幼苗移栽前，利用溶磷菌液体菌剂接种，移栽时再一次接种溶磷菌固体菌剂，以使菌根烟苗与溶磷菌建立共生关系，在生长阶段调控根际微生物环境，可以促进菌根烟草与溶磷菌共生关系的建立，提高菌根真菌的侵染状况，可大大提高烟草高效活化与利用土壤难溶性磷素资源，促进烟草抗抗病、抗低温能力，从而实现本发明的目的。
本发明的提高烟草抗寒、抗病能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)育苗：利用漂浮育苗法进行烟草育苗，在填充有基质的泡沫漂浮孔穴育苗盘中，在烟草种子播种部位下方2～3cm处接种菌根真菌，保证烟草单株含90～150个菌根真菌孢子，然后播种烟草种子，培养，生长出烟草幼苗；
(b)在烟草幼苗移栽前2周内，接种溶磷菌液体菌剂2～5次，每次每株烟草幼苗接种量为103～105个溶磷菌，移栽时，在移栽的穴中平铺含有0.5×109～1×109个溶磷菌的溶磷菌固体菌剂，然后移栽烟草幼苗，覆土，然后对烟草幼苗进行常规栽培管理。
所述的菌根真菌优选为丛枝菌根真菌，进一步优选为摩西球囊霉(Glomus mosseae)。接种的是摩西球囊霉固体菌剂，其制备方法属于本领域的常规方法，具体方法为：以过筛的河沙为基质，经高温灭菌后，自然状态下放置7-10天，然后装两公斤放入盆中，接种100g摩西球囊霉菌原种，拌匀，加入基质重量20-30％的自来水，播种高粱和大葱的种子，保持正常生长，六个月后即可得到被摩西球囊霉侵染的宿主植物和含有摩西球囊霉孢子、根外菌丝的基质；把高粱和大葱地上部分剪去，剪碎根段，并与含有摩西球囊霉孢子、根外菌丝的基质混匀，即制得摩西球囊霉固体菌剂。
所述的在烟草种子播种部位下方2～3cm处接种菌根真菌，具体为将摩西球囊霉固体菌剂与草炭基质按照体积比为1∶13～18的比例混合均匀，然后再接种烟草种子播种部位下方2～3cm处，保证烟草单株含90～150个菌根真菌孢子，然后播种烟草种子，使泡沫漂浮孔穴育苗盘的下半部分浸入水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把水首先更换成1/10强度的霍格兰(Hoagland)营养液，然后一周后换成1/4强度的霍格兰(Hoagland)营养液，每1-2周更换一次1/4强度的霍格兰(Hoagland)营养液，直至移栽。
所述的溶磷菌为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。
所述的溶磷菌液体菌剂是指利用液体培养基培养的含有溶磷菌的菌剂，其优选为产碱假单胞菌液体菌剂，其制备方法为：在每700～1300ml含有4.0～7.0g碳酸钙的麦麸浸汁(pH6.0～7.5)中，接入产碱假单胞菌，常规条件下培养24h，而得到产碱假单胞菌液体菌剂。经过24h培养后，每毫升菌液的菌数达到0.5×109-9×109个。
所述的溶磷菌固体菌剂是指含有溶磷菌的固体状物，其优选为产碱假单胞菌固体菌剂，其制备方法为将上述产碱假单胞菌液体菌剂按照每ml与25～50g含有1～5g的麦麸的土壤混合而得到产碱假单胞菌固体菌剂，所述的在移栽的穴中平铺含有0.5×109～1×109个溶磷菌的溶磷菌固体菌剂优选为在每穴浇水100ml，待穴中无水后，接种产碱假单胞菌固体菌剂25～50g，含0.5×109～1×109个产碱假单胞菌。
经过盆栽试验和田间中试示范试验验证，烟草接种菌根真菌和溶磷细菌能显著改善烤烟磷营养，增强了烟草的抗氧化酶活性，减轻细胞膜脂过氧化程度，稳定了细胞膜结构，降低了细胞膜渗透性，能显著提高移栽后烟草幼苗的早期抗寒性，减轻低温的伤害，对广东省粤北、粤东地区的烤烟生产有重要意义，移栽期可以提前10～20天，在抗寒性方面起到非常明显的作用。与不接种按常规种植的烟草相比，本发明能够提高烟草生物量9-12％，略微提高或显著提高烟草产量，可以降低磷肥施用量10～15％，烟草生产达到高产优质的基本要求。采用本方法对烟草的青枯病防治效果可以达到18-26％。
因此通过在烟草幼苗上接种菌根真菌，使烟草幼苗菌根化，菌根化的烟草幼苗再接种溶磷菌，使烟草根系与，菌根真菌和溶磷菌，建立共生关系，在生长阶段利用根际微生物互作，溶磷菌与菌根真菌在菌根周围共同作用，能够活化更多难溶性磷，改善根际微生态环境，提高了烟草获取养分的能力，提高菌根真菌的侵染状况，可大大提高烟草高效活化与利用土壤难溶性磷素资源，能够改善后期烟草生长和营养元素的获取能力，增强了烟草根系抵抗外界其他病原微生物侵染的能力，降低了青枯病的发生率，控制了烟草侵染性病害发生率，从而达到控制烟草连作障碍的功效，从而有效的提高了烟草抗病、抗低温能力。本发明的方法，工艺简单，便于操作，因而易于进行工厂化烟草育苗生产。
本发明中使用的产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)和摩西球囊霉(Glomus mosseae)为现有技术中公开的菌株。其中产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)已经在文献中公开记载(参考文献：Jing Lü，Li Fan，Chen Sangfeng，Li jilun.The secretion of lecithinase of Psedumononas alcaligenes S2was via type II secretion pathway.Chinese Science Bulletin，2005，50(16)：1731-1736)；摩西球囊霉(Glomus mosseae)已经在文献中公开记载(参考文献：Xiaodong Ding & Xinhua Sui & Fang Wang & Junhua Gao & Xinhua He & Fusuo Zhang&Juncheng Yang & Gu Feng.Synergistic interactions between Glomus mosseae and Bradyrhizobium japonicum in enhancing proton release from nodules and hyphae.Mycorrhiza，2012，22：51-58)，上述两微生物本申请人也持有，并且保证可以在本发明申请日起20年内向公众提供。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、摩西球囊霉固体菌剂的制备方法：以过筛的河沙为基质，经高温灭菌后(每次121℃高压蒸汽灭菌45min)，自然状态下放置8天，然后装两公斤放入盆中，接种100g摩西球囊霉菌原种，拌匀，加入基质重量25％的自来水，播种高粱和大葱的种子，保持正常生长，六个月后即可得到被摩西球囊霉菌侵染的宿主植物和含有摩西球囊霉菌孢子、根外菌丝的基质；把高粱和大葱地上部分剪去，剪碎根段，并与含有摩西球囊霉菌孢子、根外菌丝的基质混匀，即制得摩西球囊霉固体菌剂。每克摩西球囊霉固体菌剂含有40个摩西球囊霉孢子。
将此摩西球囊霉固体菌剂按照体积比1∶13与草炭基质混合均匀，而得到菌根烟草接种剂。
2、产碱假单胞菌液体菌剂的制备：培养基：每1000ml麦麸浸汁中含有5g碳酸钙(CaCO3)，pH 6.5；将产碱假单胞菌接种到1000ml上述培养基中，200rpm，28℃，培养24小时，得到产碱假单胞菌液体菌剂，每毫升菌液的菌数达到1.0×109个/mL。
3、产碱假单胞菌固体菌剂的制备：将上述产碱假单胞菌液体菌剂按每ml产碱假单胞菌液体菌剂与30g土壤(含有1g的麦麸)混合均匀，即得产碱假单胞菌固体菌剂。
利用漂浮育苗法进行烟草育苗，在填充有基质的泡沫漂浮孔穴育苗盘中，在烟草种子播种部位下方2～3cm处接种菌根烟草接种剂，保证烟草单株含90～150个摩西球囊霉菌孢子，然后播种烟草种子，使泡沫漂浮孔穴育苗盘的下半部分浸入水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把水首先更换成1/10强度的霍格兰(Hoagland)营养液，然后一周后换成1/4强度的霍格兰(Hoagland)营养液，每周更换一次1/4强度的霍格兰(Hoagland)营养液，直至移栽。
在烟草幼苗移栽前2周开始，第3天和第7天在烟草幼苗根系部位各接种一次产碱假单胞菌液体菌剂，每次每株烟草幼苗接种量为5×104个产碱假单胞菌，移栽时，在移栽穴中每穴浇水100ml，待穴中无水后，接种产碱假单胞菌固体菌剂30g，含1×109个产碱假单胞菌，在移栽的穴中平铺产碱假单胞菌固体菌剂，然后移栽烟草幼苗，覆土，然后对烟草幼苗常规栽培管理。
接种效果：
按照上述方法，在广东省多个烟草产地的田间中试示范试验，其结果如表1所示。从表1可以看出，相对于对照(不接种摩西球囊霉和产碱假单胞菌)，烟草接种摩西球囊霉和产碱假单胞菌显著提高烟叶叶绿素和超氧化歧化酶含量，从而减轻了细胞膜脂过氧化程度，稳定了细胞膜结构，降低了细胞膜渗透性，可以显著提高移栽后烟草幼苗的早期抗寒性，减轻低温的伤害，对广东省粤北、粤东地区的烤烟生产有重要意义，因此其移栽期可以提前10-20天，在抗寒性方面起到非常明显的作用。本发明的方法能够提高烟草生物量9～12％，因此能略有提高或显著提高烟草产量，可以降低磷肥施用量10～15％，烟草生产达到高产优质的基本要求。采用本方法对烟草的青枯病防治效果可以达到18-26％。
表1：接种摩西球囊霉和产碱假单胞菌对烟草生长发育以及青枯病防治的效果
实施例2：
1、摩西球囊霉固体菌剂的制备方法：以过筛的河沙为基质，经高温灭菌后(每次121℃高压蒸汽灭菌45min)，自然状态下放置7天，然后装两公斤放入盆中，接种100g摩西球囊霉菌原种，拌匀，加入基质重量20％的自来水，播种高粱和大葱的种子，保持正常生长，六个月后即可得到被摩西球囊霉菌侵染的宿主植物和含有摩西球囊霉菌孢子、根外菌丝的基质；把高粱和大葱地上部分剪去，剪碎根段，并与含有摩西球囊霉菌孢子、根外菌丝的基质混匀，即制得摩西球囊霉固体菌剂。每克摩西球囊霉固体菌剂含有40个摩西球囊霉孢子。
将此摩西球囊霉固体菌剂按照体积比1∶18与草炭基质混合均匀，而得到菌根烟草接种剂。
2、产碱假单胞菌液体菌剂的制备：培养基：每700ml麦麸浸汁中含有4g碳酸钙(CaCO3)，pH 7.5；将产碱假单胞菌接种到700ml上述培养基中，200rpm，28℃，培养24小时，得到产碱假单胞菌液体菌剂，每毫升菌液的菌数达到1.0×109个/mL。
3、产碱假单胞菌固体菌剂的制备：将上述产碱假单胞菌液体菌剂按每ml产碱假单胞菌液体菌剂与25g土壤(含麦麸5g)混合均匀，即得产碱假单胞菌固体菌剂。
利用漂浮育苗法进行烟草育苗，在填充有基质的泡沫漂浮孔穴育苗盘中，在烟草种子播种部位下方2～3cm处接种菌根烟草接种剂，保证烟草单株含90～150个摩西球囊霉菌孢子，然后播种烟草种子，使泡沫漂浮孔穴育苗盘的下半部分浸入水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把水首先更换成1/10强度的霍格兰(Hoagland)营养液，然后一周后换成1/4强度的霍格兰(Hoagland)营养液，每2周更换一次1/4强度的霍格兰(Hoagland)营养液，直至移栽。
在烟草幼苗移栽前2周开始，第2、4、6、8、10天，在烟草幼苗根系部位各接种一次产碱假单胞菌液体菌剂，每次每株烟草幼苗接种量为1×105个产碱假单胞菌，移栽时，在移栽穴中每穴浇水100ml，待穴中无水后，接种产碱假单胞菌固体菌剂25g，含1×109个产碱假单胞菌，在移栽的穴中平铺产碱假单胞菌固体菌剂，然后移栽烟草幼苗，覆土，然后对烟草幼苗常规栽培管理。
接种效果：
按照上述方法，经过大田试验验证，相对于对照(不接种摩西球囊霉和溶磷菌)，烟草接种摩西球囊霉和溶磷菌提高烟草生物量10％，降低磷肥施用率10％，显著提高烟叶叶绿素和超氧化歧化酶含量，从而减轻了细胞膜脂过氧化程度，稳定了细胞膜结构，降低了细胞膜渗透性，可以显著提高移栽后烟草幼苗的早期抗寒性，减轻低温的伤害，其移栽期可以提前15天，在抗寒性方面起到非常明显的作用。采用本方法对烟草的青枯病防治效果可以达到20-24％。
实施例3：
1、摩西球囊霉固体菌剂的制备方法：以过筛的河沙为基质，经高温灭菌后(每次121℃高压蒸汽灭菌45min)，自然状态下放置10天，然后取两公斤装入盆中，接种100g摩西球囊霉菌原种，拌匀，加入基质重量30％的自来水，播种高粱和大葱的种子，保持正常生长，六个月后即可得到被摩西球囊霉菌侵染的宿主植物和含有摩西球囊霉菌孢子、根外菌丝的基质；把高粱和大葱地上部分剪去，剪碎根段，并与含有摩西球囊霉菌孢子、根外菌丝的基质混匀，即制得摩西球囊霉固体菌剂。每克摩西球囊霉固体菌剂含有40个摩西球囊霉孢子。
将此摩西球囊霉固体菌剂按照体积比1∶15与草炭基质混合均匀，而得到菌根烟草接种剂。
2、产碱假单胞菌液体菌剂的制备：培养基：每1300ml麦麸浸汁中含有7g碳酸钙(CaCO3)，pH 6.0；将产碱假单胞菌接种到1300ml上述培养基中，200rpm，28℃，培养24小时，得到产碱假单胞菌液体菌剂，每毫升菌液的菌数达到0.5×109个/mL。
3、产碱假单胞菌固体菌剂的制备：将上述产碱假单胞菌液体菌剂按每ml产碱假单胞菌液体菌剂与50g土壤(含有3g麦麸)混合均匀，即得产碱假单胞菌固体菌剂。
利用漂浮育苗法进行烟草育苗，在填充有基质的泡沫漂浮孔穴育苗盘中，在烟草种子播种部位下方2～3cm处接种菌根烟草接种剂，保证烟草单株含90～150个摩西球囊霉菌孢子，然后播种烟草种子，使泡沫漂浮孔穴育苗盘的下半部分浸入水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把水首先更换成1/10强度的霍格兰(Hoagland)营养液，然后一周后换成1/4强度的霍格兰(Hoagland)营养液，每10天更换一次1/4强度的霍格兰(Hoagland)营养液，直至移栽。
在烟草幼苗移栽前2周开始，第7、10天、14天在烟草幼苗根系部位各接种一次产碱假单胞菌液体菌剂，每次每株烟草幼苗接种量为1×103个产碱假单胞菌，移栽时，在移栽穴中每穴浇水100ml，待穴中无水后，接种产碱假单胞菌固体菌剂50g，含0.5×109个产碱假单胞菌，在移栽的穴中平铺产碱假单胞菌固体菌剂，然后移栽烟草幼苗，覆土，然后对烟草幼苗常规栽培管理。
接种效果：
按照上述方法，经过大田试验验证，相对于对照(不接种摩西球囊霉和溶磷菌)，烟草接种摩西球囊霉和溶磷菌提高烟草生物量10％，降低磷肥施用率12％，显著提高烟叶叶绿素和超氧化歧化酶含量，从而减轻了细胞膜脂过氧化程度，稳定了细胞膜结构，降低了细胞膜渗透性，可以显著提高移栽后烟草幼苗的早期抗寒性，减轻低温的伤害，其移栽期可以提前18天，在抗寒性方面起到非常明显的作用。采用本方法对烟草的青枯病防治效果可以达到21-24％。
Claims (7)
1.一种提高烟草抗寒、抗病能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)育苗：利用漂浮育苗法进行烟草育苗，在填充有基质的泡沫漂浮孔穴育苗盘中，在烟草种子播种部位下方2～3cm处接种菌根真菌，保证烟草单株含90～150个菌根真菌孢子，然后播种烟草种子，培养，生长出烟草幼苗；
(b)在烟草幼苗移栽前2周内，接种溶磷菌液体菌剂2～5次，每次每株烟草幼苗接种量为103～105个溶磷菌，移栽时，在移栽的穴中平铺含有0.5×109～1×109个溶磷菌的溶磷菌固体菌剂，然后移栽烟草幼苗，覆土，然后对烟草幼苗进行常规栽培管理。
2.根据权利要求1所述的提高烟草抗寒、抗病能力的方法，其特征在于，所述的菌根真菌为丛枝菌根真菌。
3.根据权利要求2所述的提高烟草抗寒、抗病能力的方法，其特征在于，所述的丛枝菌根真菌为摩西球囊霉(Glomus mosseae)，接种的是摩西球囊霉固体菌剂，其制备方法为：以过筛的河沙为基质，经高温灭菌后，自然状态下放置7～10天，然后装两公斤放入盆中，接种100g摩西球囊霉菌原种，拌匀，加入基质重量20～30％的自来水，播种高粱和大葱的种子，保持正常生长，六个月后即可得到被摩西球囊霉侵染的宿主植物和含有摩西球囊霉孢子、根外菌丝的基质；把高粱和大葱地上部分剪去，剪碎根段，并与含有摩西球囊霉孢子、根外菌丝的基质混匀，即制得摩西球囊霉固体菌剂。
4.根据权利要求3所述的提高烟草抗寒、抗病能力的方法，其特征在于，所述的在烟草种子播种部位下方2～3cm处接种菌根真菌具体为将权利要求3所述的摩西球囊霉固体菌剂与草炭基质按照体积比为1∶13～18的比例混合均匀，然后再接种烟草种子播种部位下方2～3cm处，保证烟草单株含90～150个菌根真菌孢子，然后播种烟草种子，使泡沫漂浮孔穴育苗盘的下半部分浸入水中，待种子出苗后间苗，每孔留苗1棵，并把水首先更换成1/10强度的霍格兰营养液，然后一周后换成1/4强度的霍格兰营养液，每1-2周更换一次1/4强度的霍格兰营养液，直至移栽。
5.根据权利要求1所述的提高烟草抗寒、抗病能力的方法，其特征在于，所述的溶磷菌为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。
6.根据权利要求5所述的提高烟草抗寒、抗病能力的方法，其特征在于，所述的溶磷菌液体菌剂为产碱假单胞菌液体菌剂，其制备方法为：在每700～1300ml含有4.0～7.0g碳酸钙的麦麸浸汁(pH 6.0～7.5)中，接入产碱假单胞菌，常规条件下培养24h，而得到产碱假单胞菌液体菌剂。
7.根据权利要求6所述的提高烟草抗寒、抗病能力的方法，其特征在于，所述的溶磷菌固体菌剂为产碱假单胞菌固体菌剂，其制备方法为将权利要求6所述的产碱假单胞菌液体菌剂按照每ml与25～50g含有1～5g的麦麸的土壤混合而得到产碱假单胞菌固体菌剂，所述的在移栽的穴中平铺含有0.5×109～1×109个溶磷菌的溶磷菌固体菌剂具体为在每穴浇水100ml，待穴中无水后，接种产碱假单胞菌固体菌剂25～50g，含0.5×109～1×109个产碱假单胞菌。
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