CN110278706B

CN110278706B - 包含使用冠突曲霉菌株发酵的发酵大豆的提取物的皮肤美容改善用组合物

Info

Publication number: CN110278706B
Application number: CN201980000353.2A
Authority: CN
Inventors: 金旻智; 柳正镇; 张釉珍; 卢鈗花; 李敬银; 姜承贤; 朴明三
Original assignee: Cosmax Inc
Current assignee: Cosmax Inc
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2019-01-07
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-01-07
Also published as: KR102117218B1; CN110278706A; WO2019143055A1; KR20190088286A

Abstract

涉及一种皮肤美容改善用组合物。根据本发明一方面的皮肤美容改善用组合物包含使用冠突曲霉菌株发酵的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷，在皮肤保湿、增强皮肤屏障和皮肤再生方面具有优异的效果，而且不会刺激皮肤，因此可安全使用。

Description

包含使用冠突曲霉菌株发酵的发酵大豆的提取物的皮肤美容改善用组合物

技术领域

本发明涉及一种皮肤美容改善用组合物。

背景技术

表皮是皮肤的最外层，其是一种与外部环境经常接触的器官，并起着保护屏障的作用。在表皮的角质层中存在的皮肤屏障的作用在于抑制水和电解质的流失，并保护身体免受外部物质和化学物质的损害，而且防止细菌和病毒等渗入皮肤。角质层由死角质细胞所形成的蛋白和角质细胞之间存在的脂质所组成，其中，角质细胞间的脂质对维持皮肤屏障起着重要作用。

冠突曲霉(Aspergillus cristatus)是一种在作为中国后发酵茶(postfermented tea)的茯砖茶(Fuzhuan brick tea)中占优势的微生物，由于其形成如金花的孢子，因此也被中国人称为金花菌(Golden flower Fungus)。金花菌(A.cristatus)是一种不会产生致癌性真菌毒素的安全的菌株，其已经在砖茶生产中被使用了很长时间。另外，由于葛永怡(Yongyi Ge)等(2016)也报告了从茯砖茶分离的金花菌中未观察到真菌毒素基因的存在和表达，因此认定其是一种对人体安全的菌株。

大豆是化妆品原料之一，其使皮肤润泽，并有助于改善血液循环，从而具有赋予肌肤生机的作用。众所周知，在韩医中，大豆具有增强人体免疫力的效果，并可降低血压，补血和清除淤血并产生血液，而且可预防和改善肿瘤并防止衰老。因此，大豆已被用作化妆品的原料。

然而，尚未有对使用金花菌固体发酵的发酵大豆的研究。

发明内容

技术问题

根据本公开的一个方面，提供了一种皮肤美容改善用组合物，其包含使用冠突曲霉菌株使大豆发酵而得到的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷作为有效成分。

根据本公开的另一个方面，提供了一种改善皮肤状况的方法，其包括向个体施用有效量的包含使用冠突曲霉菌株使大豆发酵而得到的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷的组合物的步骤。

根据本公开的另一个方面，提供了一种包含使用冠突曲霉菌株使大豆发酵而得到的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷的组合物的用于制备皮肤状况改善剂的用途。

技术方案

根据本公开的一个方面，提供了一种皮肤美容改善用组合物，其包含使用冠突曲霉菌株发酵的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷作为有效成分。

所述皮肤美容改善或皮肤状况改善可以是皮肤保湿、增强皮肤屏障或皮肤再生。在一个实施例中，确认了包含使用冠突曲霉菌株使大豆发酵而得到的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷的组合物在皮肤保湿、增强皮肤屏障或皮肤再生方面效果优异。因此，所述包含发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷的组合物可用作皮肤保湿、增强皮肤屏障或皮肤再生的组合物。

术语“皮肤保湿”可以指保持皮肤水分或防止水分流失的任何作用。

术语"增强皮肤屏障"可以指增强位于皮肤最外侧并防止水分和营养流失的皮肤屏障的功能的任何作用。

术语“皮肤再生”可以指当皮肤的一部分损失时补充该部分或促进皮肤细胞增殖的任何作用。

术语“改善”可以指状况的缓解或至少减小与治疗相关的参数如症状程度的所有动作。

所述“冠突曲霉(Aspergillus cristatus)”是一种曲霉，其形成如金花的孢子，因此也被称为金花菌(golden flower fungus)。所述冠突曲霉可以从食物、土壤、海洋等中分离，但不限于此，例如，可以从作为中国后发酵茶(post fermented tea)的茯砖茶中分离。

在根据一个实施例的组合物中，所述菌株可以是冠突曲霉科丝美诗(Cosmax)-GF菌株(保藏号:KCCM11820P)。冠突曲霉科丝美诗-GF菌株是一种从中国制造的茯砖茶分离的新菌株，具体地，可以是一种通过包括如下步骤的方法分离的菌株:使用氯化钠(NaCl)溶液稀释茯砖茶的步骤；在添加了氯霉素(chloramphenicol)的马铃薯葡萄糖琼脂中培养稀释的茯砖茶的步骤；以及在琼脂中筛选形成金色菌落的菌株的步骤。所述氯化钠溶液可以是如下浓度的氯化钠溶液：0.50％(w/w)至0.99％(w/w)、0.60％(w/w)至0.95％(w/w)、0.70％(w/w)至0.90％(w/w)、0.80％(w/w)至0.90％(w/w)或0.84％(w/w)至0.86％(w/w)(例如，0.85％(w/w))。所述培养可以在20℃至40℃、25℃至40℃、25℃至35℃、27℃至35℃或28℃至32℃的温度下进行。所述培养可以进行10小时至100小时、20小时至90小时、30小时至80小时、40小时至70小时、48小时至65小时或48小时至60小时。

所述"大豆(soybean)"是双子叶植物蔷薇目豆科的植物，也被称为"黄豆"。所述大豆的种类可以是任何一种并没有限制，例如，可以使用各种品种如黑豆、鼠目太、褐豆、花豆及蓖麻子等，但不限于此。所述大豆可以是通过常规方法获得的大豆，例如，可以是购买在市场上销售的产品。所述大豆可以使用灭菌的大豆，灭菌方法可以通过本领域的常规方法进行。

在根据一个实施例的组合物中，所述发酵可以是固体发酵。术语“固体发酵”可以指通过将微生物接种到具有低水分的固体状态的原料来进行发酵。与现有的发酵方法如液体发酵方法或半固体发酵方法相比，固体发酵方法具有不被杂菌污染并且产品可以容易地回收的优点。

在根据一个实施例的组合物中，所述发酵大豆可以通过将冠突曲霉，具体而言，冠突曲霉孢子悬浮液接种到大豆来进行固体发酵。

在根据一个实施例的组合物中，通过所述发酵，可以由冠突曲霉的胞外酶(extracellular enzyme)将培养基质转化为功能性物质。所述胞外酶的种类可以包括，如碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、酯酶(Esterase(C4))、酯酶脂肪酶(EsteraseLipase(C8))、酸性磷酸酶(Acid phosphatase)、α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)、β-葡糖苷酶(beta-glucosidase)、N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶(N-acetyl-beta-glucosaminidase)和α-甘露糖苷酶(alpha-mannosidase)，但不限于此。因此，重要的是长时间保持从菌丝转化为孢子的阶段(phase)，其是在冠突曲霉的生命周期(life cycle)中酶的生物合成量的最高点。因此，为了最大化保持冠突曲霉的胞外酶表达高的阶段以及增加大豆的糖苷配基成分，可以选择适当的发酵温度、时间和湿度。

所述发酵大豆可以在25℃至40℃、25℃至35℃、28℃至35℃、30℃至35℃、31℃至34℃、32℃至34℃或33℃的温度下发酵。当发酵温度超过35℃时，由于菌株形成孢子所需的时间变少，因此酶的活性和表达量可能相对降低。相反，当发酵温度低于30℃时，由于酶反应速度减慢，因此糖苷配基功能性成分的转化速度可能降低。

所述发酵大豆可以是发酵以下时间得到的：10小时至100小时、20小时至100小时、20小时至90小时、30小时至90小时、30小时至80小时、40小时至80小时、40小时至70小时、48小时至65小时、50小时至65小时、55小时至65小时或60小时至65小时。可以根据发酵温度考虑菌丝的生长来适当选择发酵时间，以便在直至形成孢子前终止。

所述发酵大豆可以是在以下湿度条件下发酵得到的：10％至99.9％湿度、20％至99.9％湿度、30％至99.9％湿度、40％至99.9％湿度、50％至99.9％湿度、50％至90％湿度、60％至90％湿度、70％至90％湿度、75％至85％湿度或80％至85％湿度。当湿度低于75％时，菌株形成孢子的时间变少，酶的活性和表达量可能相对降低。相反，当湿度超过85％时，由于水分含量高而原料之间的空气循环率不好，因此作为绝对好氧菌株的冠突曲霉的生长会减慢，并且会增加发生由其他微生物引起的污染的概率。

例如，所述发酵大豆可以是在30℃至35℃下，在75％至85％湿度条件下发酵48小时至65小时得到的。

所述发酵大豆可以是发酵大豆整体、其一部分或由其衍生的材料。用于提取的所述发酵大豆可以是将发酵大豆整体、其一部分或由其衍生的材料磨碎或细切或者适当干燥而得到的。可以使用通过干燥而达到水分含量小于20％或小于15％(例如小于12％)的所述发酵大豆。

所述提取物可以使用亲水性溶剂(hydrophilic solvent)如醇、水或其组合来提取。所述醇可以是C1至C10的具有至少一个-OH基的化合物。所述醇可以是C1至C6的醇、C3至C6的多元醇。所述醇可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、正己醇或其混合物。所述溶剂可以是，例如水和醇的混合物，即醇水溶液。所述醇水溶液的醇浓度可以是1％(w/w)至100％(w/w),例如,1％(w/w)至99.5％(w/w)、10％(w/w)至100％(w/w)、20％(w/w)至100％(w/w)、30％(w/w)至100％(w/w)、40％(w/w)至100％(w/w)、50％(w/w)至100％(w/w)、60％(w/w)至100％(w/w)、70％(w/w)至100％(w/w)、75％(w/w)至100％(w/w)、60％(w/w)至90％(w/w)、60％(w/w)至80％(w/w)、65％(w/w)至75％(w/w)或70％(w/w)。所述醇水溶液可以是甲醇水溶液、乙醇水溶液或丁醇水溶液。在根据一个实施例的组合物中，所述提取物可以是乙醇提取物。

所述提取物可以是通过本领域的常规方法，如加热提取、加压提取、超声波提取、热水提取、回流冷却提取、亚临界提取或超临界提取等。

所述提取溶剂可以是发酵大豆的5(体积/重量)倍至15(体积/重量)倍，例如，可以是5(体积/重量)倍至13(体积/重量)倍、5(体积/重量)倍至11(体积/重量)倍、8(体积/重量)倍至15(体积/重量)倍、8(体积/重量)倍至13(体积/重量)倍、8(体积/重量)倍至11(体积/重量)倍或9(体积/重量)倍至11(体积/重量)倍。例如，可包括将0.5L至1.5L的所述提取溶剂添加到100g的所述发酵大豆整体、其一部分或由其衍生的材料中。

可以在如下温度下进行所述提取：4℃至70℃，例如，4℃至50℃、4℃至40℃、4℃至30℃、10℃至70℃、15℃至70℃、20℃至70℃、4℃至50℃、10℃至50℃、4℃至40℃、4℃至30℃、10℃至40℃、10℃至35℃、10℃至30℃或室温。

可以根据所选择的温度和提取方法适当地选择所述提取时间。例如，所述提取时间可以是1小时至3天、1小时至2天、1小时至1天、5小时至3天、5小时至2天、5小时至1天、10小时至3天、15小时至2天、15小时至36小时、18小时至30小时、1天至3天、1天至2天或24小时。

例如，可以将发酵大豆的粉末沉积在提取溶剂中2小时至4小时以进行超声波提取，或者加入溶剂并在室温下沉积24小时至72小时以进行提取。所述提取可以是一次以上的提取，例如，1次至5次、1次至4次、1次至3次、2次至5次或2次至4次的提取，每次提取可以以相同方法进行或以不同方法进行。

所述提取可以通过如过滤等已知方法来分离植物残渣和提取液。所述提取还可以包括通过已知方法如减压浓缩从所得提取液除去溶剂。所述提取还可以包括通过干燥如冻结干燥来将所得的提取物制备成干燥的提取物。

所述提取物的浓度可以包括1ppm至10000ppm、1ppm至1000ppm、1ppm至500ppm、10ppm至10000ppm、10ppm至1000ppm、10ppm至500ppm、50ppm至10000ppm、50ppm至1000ppm、50ppm至500ppm或50ppm至150ppm。

所述提取物的浓度可以包括0.001％(w/v)至80％(w/v)，例如，0.001％(w/v)至50％(w/v)、0.001％(w/v)至10％(w/v)、0.001％(w/v)至5％(w/v)、0.001％(w/v)至1％(w/v)、0.01％(w/v)至80％(w/v)、0.01％(w/v)至60％(w/v)、0.01％(w/v)至40％(w/v)、0.01％(w/v)至30％(w/v)、0.01％(w/v)至20％(w/v)、0.01％(w/v)至10％(w/v)、0.01％(w/v)至5％(w/v)或0.01％(w/v)至1％(w/v)。

根据一个实施例的组合物可以包括发酵大豆提取物的馏分代替发酵大豆提取物来作为有效成分。根据一个实施例的组合物可以进一步包括所述发酵大豆提取物的馏分。术语“馏分(fraction)"是指所述发酵大豆提取物被分成其一部分的成分的物质，即已经分馏的物质。所述馏分可通过溶剂分馏(fractionation)获得。所述溶剂分馏可以是将发酵大豆提取物与溶剂混合并分离存在于所述溶剂中的物质。所述馏分可以是将发酵大豆提取物悬浮在水中之后，依次使用二氯甲烷、乙酸乙酯、丁醇及水进行分馏而得到的二氯甲烷馏分、乙酸乙酯馏分、丁醇馏分或水馏分。

具体而言，所述二氯甲烷馏分可以是通过将所述发酵大豆提取物与水混合，并将混合物再次与二氯甲烷混合后静置一定的时间，然后分离二氯甲烷层，并从分离的二氯甲烷层分离馏分而得到的。馏分的分离可以包括从二氯甲烷层除去二氯甲烷。此外，所述乙酸乙酯馏分可以是通过将在分离所述二氯甲烷馏分后剩余的水再次与乙酸乙酯混合后静置一定的时间，然后分离乙酸乙酯层，并从分离的乙酸乙酯层分离馏分而得到的。馏分的分离可以包括从乙酸乙酯层除去乙酸乙酯。另外，所述丁醇馏分可以是通过将在分离所述乙酸乙酯馏分后剩余的水再次与丁醇混合后静置一定的时间，然后分离丁醇层，并从分离的丁醇层分离馏分而得到的。馏分的分离可以包括从丁醇层除去丁醇。所述分馏的条件，例如温度条件、压力条件、时间、使用的溶剂的量或浓度、搅拌等可以与关于所述用于制备所述发酵大豆提取物的提取的描述相同。所述分馏可以重复一次以上，例如1次至5次。

所述馏分的分离可以通过已知方法如过滤来完成。所述分馏还可以包括通过已知方法如减压浓缩从所得的馏分中除去溶剂。所述分馏还可以包括对所得的馏分进行浓缩和/或干燥。所述浓缩可以是减压浓缩。所述干燥可以包括减压干燥、煮干、喷雾干燥、室温干燥或冷冻干燥。

所述树胶(gum)可以指具有弹性的聚合物多糖类，其种类不受限制。在一个实施例中，所述树胶可以是选自由刺槐豆胶、***胶、茄替胶、刺梧桐胶(Karaya gum)、瓜尔豆胶、黄蓍胶、黄原胶、卡拉胶、甘露聚糖以及葡甘聚糖构成的组中的一者以上。在另一个实施例中，所述树胶可以是刺槐豆胶。

所述树胶的浓度可以包括1ppm至10000ppm、1ppm至5000ppm、1ppm至1000ppm、10ppm至10000ppm、10ppm至5000ppm、10ppm至1000ppm、50ppm至10000ppm、50ppm至5000ppm、50ppm至1000ppm、100ppm至10000ppm、100ppm至5000ppm、100ppm至1000ppm、200ppm至5000ppm、200ppm至1000ppm、300ppm至5000ppm、300ppm至1000ppm、400ppm至5000ppm、400ppm至1000ppm或400ppm至600ppm。

所述树胶的浓度可以包括0.001％(w/v)至80％(w/v)，例如，0.001％(w/v)至50％(w/v)、0.001％(w/v)至10％(w/v)、0.001％(w/v)至5％(w/v)、0.001％(w/v)至1％(w/v)、0.01％(w/v)至80％(w/v)、0.01％(w/v)至60％(w/v)、0.01％(w/v)至40％(w/v)、0.01％(w/v)至30％(w/v)、0.01％(w/v)至20％(w/v)、0.01％(w/v)至10％(w/v)、0.01％(w/v)至5％(w/v)或0.01％(w/v)至1％(w/v)。

所述"甘油葡糖苷(Glyceryl glucoside:2-GG)"可与"葡糖-甘油(Gluco-glycerol)"互换使用，并且可以指甘油和葡萄糖结合的物质。

所述甘油葡糖苷的浓度可以包括0.1ppm至1000ppm、0.1ppm至500ppm、0.1ppm至100ppm、0.1ppm至50ppm、1ppm至1000ppm、1ppm至500ppm、1ppm至100ppm、1ppm至50ppm、5ppm至1000ppm、5ppm至500ppm、5ppm至100ppm、5ppm至50ppm或5ppm至15ppm。

所述甘油葡糖苷的浓度可以包括0.0001％(w/v)至10％(w/v)，例如，0.0001％(w/v)至5％(w/v)、0.0001％(w/v)至1％(w/v)、0.005％(w/v)至10％(w/v)、0.005％(w/v)至5％(w/v)、0.005％(w/v)至1％(w/v)、0.001％(w/v)至10％(w/v)、0.001％(w/v)至5％(w/v)、0.001％(w/v)至1％(w/v)、0.001％(w/v)至0.1％(w/v)或0.001％(w/v)至0.01％(w/v)。

根据一个实施例的组合物可以是增加透明质酸合成酶3(HAS3)或水通道蛋白3(AQP3)的表达的组合物，具体地，通过增加HAS3或AQP3的表达来实现皮肤保湿效果的组合物。

根据一个实施例的组合物可以是通过改善皮肤表皮层来实现增强皮肤屏障效果的组合物。

根据一个实施例的组合物可以是促进成纤维细胞的增殖的组合物，具体地，可以是通过促进成纤维细胞增殖来实现皮肤再生效果的组合物。

根据一个实施例的组合物可以是通过长时间保持较高的皮肤水分度来实现皮肤保湿效果的组合物。

根据一个实施例的组合物可以包含有效量的所述提取物或包含所述提取物作为有效成分。所述有效量可以根据个体来适当选择。所述有效量可以根据包括以下项的因素以及在生理至医学领域中熟知的其他因素来决定：疾病至疾病状况的严重程度、个体的年龄、体重、健康、性别、个体的对提取物的敏感度、施用时间、施用途径和排出比率、施用期间、与所述组合物配合或同时使用的其他组合物。

根据一个实施例的皮肤美容改善用组合物还可以包括在化妆品学上、食品学上或药学上可接受的赋形剂或载体。所述载体可以是赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂或其组合。所述赋形剂可以是微晶纤维素、乳糖、低取代羟基纤维素或其组合。所述崩解剂可以是淀粉乙醇酸钠、无水磷酸氢钙或其组合。所述结合剂可以是聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羟丙基纤维素或其组合。所述润滑剂可以是硬脂酸镁、二氧化硅、滑石或其组合。

所述组合物的剂型可以制成非口服施用剂型。非口服施用剂型可以是注射剂或皮肤外用剂。皮肤外用剂可以是乳膏、凝胶、软膏、皮肤乳化剂、皮肤悬浮液、经皮传递性贴片、含药绷带、乳液或其组合。

所述皮肤外用剂可以根据需要适当混合通常用于化妆品或药物等的皮肤外用剂的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂以及各种皮肤营养剂等。

所述皮肤外用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属螯合剂、咖啡因、单宁、戊脉安、甘草提取物、光甘草定、大蓟果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等的糖类。

根据一个实施例的组合物可以是化妆品组合物。在这种情况下，提取物可制备为包括以下的剂型：化妆水(润肤液)、柔肤水、爽肤水、收敛剂(Astringent)、乳液、牛奶润肤露(milk lotion)、保湿乳液、营养液、按摩霜、营养霜、保湿霜、手霜、粉底、精华、营养精华、膜、肥皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、身体乳液、身体清洁液、悬浮液、凝胶、粉末、粘膏(paste)、面膜或片装面膜或喷雾组合物。可根据本领域常规方法制备此类剂型的组合物。所述化妆品组合物可以进一步包括保存剂、稳定剂、表面活性剂、溶剂、保湿剂、润肤剂、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、pH调节剂、有机和无机颜料、香料、冷感剂或止汗剂。在不损害本发明的目的和效果的范围内，本领域技术人员可以容易地选择诸如上述保湿剂等的附加成分的混合量，该混合量可以是基于组合物的总重量的0.001重量百分比至5重量百分比，具体而言，0.01重量百分比至3重量百分比。

根据一个实施例的组合物可以是食品组合物。在这种情况下，可以制备成本领域已知的常规保健食品的剂型。所述食品组合物可以制备为如散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮液、油剂、糖浆剂、浸渍剂、液剂、萃取剂等的一般剂型，并制备为肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、零食类、饼干类、比萨饼、拉面、其他面类、口香糖类、果冻、包括冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮剂、酒精饮料和维生素复合物的等任意的保健食品形式。为了将所述保健食品制成制剂，可以使用食品学上可接受的载体或添加剂，并且可以将本领域已知的任何载体或添加剂用于制备想要制备的剂型。作为所述添加剂，可以含有各种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，所述添加剂可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些添加剂成分可以单独使用或组合使用，添加剂的比例可以为基于组合物的总重量的0.001重量百分比至5重量百分比，具体地，0.01重量百分比至3重量百分比。

所述食品组合物中的所述提取物的含量可以根据使用目的(预防或改善)来适当地决定。通常，可以包括食品总重量的0.01重量百分比至15重量百分比，当作为饮料制造时，以100mL为基准，可以含有0.02g至10g的比例，具体地，0.3g至1g的比例。

所述饮料可以进一步包括所述提取物之外的其他成分，并且可以进一步包括通常用于饮料的各种香料或天然碳水化合物等。所述天然碳水化合物可以含有如单糖类(例如葡萄糖、果糖等)、二糖类(例如麦芽糖、蔗糖等)、多糖类(例如糊精、环式糊精等)的常规糖以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇。另外，香料可以含有天然香料(例如:奇异果甜蛋白(Thaumatin)、甜叶菊提取物等)及合成香料(例如:糖精、阿斯巴甜等)。所述天然碳水化合物的比例通常为每100mL饮料约1g至20g，具体地，约5g至12g。

根据一个实施例的组合物可以是药物组合物。具体而言，所述药物组合物可以是用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物。所述皮肤疾病可以是由皮肤屏障功能损伤引起的疾病、皮肤老化、皮肤伤口、皮肤疤痕或皮肤炎症。术语“预防”包括抑制疾病的发生。术语“治疗”包括抑制，减轻或消除疾病的发展。

所述皮肤屏障功能损伤可以指由于皮肤屏障功能的下降或损伤而在皮肤上出现的所有变化。例如，可以包括皮肤皱纹增加、干燥、皮肤炎、特应性皮肤炎、过敏性皮肤炎、痤疮等，但不限于此。根据一个实施例的药物组合物可以通过改善皮肤的表皮层来增强皮肤屏障功能，从而预防或治疗皮肤屏障功能损伤。

所述皮肤老化可以指随着年龄的增长在皮肤上出现的所有有形和无形的变化。例如，可以包括皮肤皱纹增加、干燥、伤口愈合能力下降、皮肤免疫功能下降，但不限于此。根据一个实施例的药物组合物可以通过增强皮肤屏障、保持皮肤水分、防止皮肤水分损失和皮肤再生等效果来预防或治疗皮肤老化。

所述皮肤伤口或皮肤疤痕可以指可以通过皮肤细胞再生、分化、增殖来再次维持所失去的连续性，或通过妨碍疤痕的胶原质合成并促进胶原质降解来改善或治愈的所有疾病。例如，可以包括如撞伤、擦伤、烫伤等的伤口和如肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩等的疤痕，但不限于此。根据一个实施例的药物组合物可以通过保持皮肤水分、防止皮肤水分损失和皮肤再生等效果来预防或治疗皮肤伤口或皮肤疤痕。

所述皮肤炎症疾病可以指因免疫刺激引起的所有疾病。例如，可以包括特应性皮肤炎、湿疹、脂溢性皮肤炎、牛皮癣、痤疮等，但不限于此。根据一个实施例的药物组合物可以通过保持皮肤水分、防止皮肤水分损失、增强皮肤屏障和皮肤再生等效果来预防或治疗皮肤炎症疾病。

根据一个实施例的组合物可以根据化妆品、食品或药物领域中的常规方法来制备。

另一方面提供了包括将所述组合物施用于个体的步骤的改善个体皮肤美容的方法。所述组合物与上述相同。

具体而言，所述方法可以是有效保持皮肤水分或防止个体水分损失的方法、增强个体皮肤屏障功能的方法或改善或促进个体皮肤再生的方法。

术语“施用的”、"导入的"及“移植的”可互换使用，并可以指实现根据一个实施例的组合物的至所需的部位的至少部分局部化的方法或根据路径的至个体内的根据一个实施例的组合物的布置。根据一个实施例的组合物的提取物或提取物成分的至少一部分可通过任何传送至活体中的期望位置的合适途径来施用。

施用是可通过本领域已知的方法来执行。施用可以通过例如静脉内、肌肉内、口服、经皮(transdermal)、粘膜、鼻内(intranasal)、气管内或皮下施用的途径，以任何方式直接向个体执行。所述施用可以全身或局部执行。

所述个体可以是哺乳动物，例如:人、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫。所述个体可以是需要改善皮肤美容如皮肤保湿、增强皮肤屏障或皮肤再生效果的个体。

所述施用可以是每天将发酵大豆提取物、树胶和甘油葡糖苷的组合按照以下量施用到每个个体：0.1mg至1000mg，例如，0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1,000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1,000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg或10mg至25mg。然而，施用量可以根据诸如制剂方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况、食物、施用时间、施用途径、***速度及反应灵敏性的因素来不同地处方，本领域技术人员将理解，可以考虑这些因素以适当调整施用量。施用次数可以是每天1次或在临床上可接受的副作用范围内2次或以上，关于施用部位，可以在一处或两处以上施用，并且每天或每2天至5天为间隔的总施用天数可以是在一次治疗时施用1天至30天。如有需要，可在适当的时间后重复相同的治疗。对于除人以外的动物，可以以每kg的施用量与人相同的施用量来施用，或者以目标动物与人的器官(心脏等)的体积比(例如，平均值)等换算所述施用量的量来施用。

有益效果

根据本公开一方面的皮肤美容改善用组合物包括使用冠突曲霉(A.cristatus)菌株发酵的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷，由于在皮肤保湿、增强皮肤屏障和皮肤再生方面具有优异的效果，而且不会刺激皮肤，因此可安全使用。

附图说明

图1是显示保湿因子HAS3和AQP3的信使核糖核酸(mRNA)相对水平(relativelevel)的图表。(-)：未处理组；透明质酸100ppm：透明质酸100ppm处理组；以及实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

图2显示用于确认在人造皮肤中AQP3表达增加效果的使用AQP3抗体的人工皮肤的免疫组织化学染色结果。(-)：未处理组；UVB+：UVB照射组；UVB+透明质酸100ppm：透明质酸100ppm处理组；UVB+实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

图3是用于确认在人造皮肤中的皮肤屏障改善效果的H&E染色结果。(-)：未处理组；透明质酸100ppm：透明质酸100ppm处理组；以及实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

图4作为确认皮肤细胞再生效果的结果，是拍摄在刮下细胞24小时后的细胞增殖程度的观察结果。(-)：未处理组；实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

图5作为确认皮肤细胞再生效果的结果，是确定根据小时(hr)的细胞数量的图表。(-)：未处理组；实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

图6是在涂敷剂型例1和比较剂型例1后根据时间比较皮肤水分程度(％)的图表。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例是为了描述本公开，本公开的范围不限于这些实施例。

实施例1：冠突曲霉(A.cristatus)菌株的分离和种属鉴定

使用0.85％(w/w)氯化钠溶液将在中国制造的茯砖茶10g适当地连续稀释后，涂抹在添加了氯霉素(chloramphenicol)的马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar:PDA,Himedia,印度,M1942)，然后培养30小时至60小时。在占优势的菌株中，筛选形成金色菌落的菌株并进行种属鉴定。委托了韩国查尔斯河试验室(Charles River LaboratoriesKorea)(股份公司)对菌株进行种属鉴定，并分析了内转录间隔区(Internal TranscribedSpacer(ITS2))部分。由于种属鉴定的结果显示菌株与冠突曲霉具有99.9％的相同性，因此用于本公开。所述分离的菌株命名为冠突曲霉科丝美诗-GF，并将其于2016年3月22日保存在韩国微生物保存中心，并且保藏号为KCCM11820P。

实施例2：发酵大豆和提取物的制备

通过使用在实施例1中分离的冠突曲霉使大豆固体发酵来制备发酵大豆，并制备发酵大豆的提取物。

具体而言，通过在市场上购买用于所述固体发酵的大豆后，对其进行洗涤和准备。经洗涤的大豆在121℃下灭菌30分钟。然后，将在马铃薯葡萄糖琼脂中培养的所述实施例1的冠突曲霉制备成孢子悬浮液，并将其放入灭菌大豆中，在33℃下和75％至85％的湿度下固体发酵60小时至65小时。将固体发酵的大豆在60℃下干燥至水分含量小于12％后将其磨碎。

将变成粉末的发酵大豆100g放入提取容器，并通过沉积在作为提取溶剂的1L的70重量百分比的乙醇水溶液中并在室温下静置24小时，来得到提取液。通过使用0.45μm膜过滤以3000rpm离心10分钟得到的上清液，来制备滤液。通过使用旋转式蒸发器对所述滤液进行减压浓缩，来得到9g至11g的浓缩提取物。

实施例3：皮肤美容改善用组合物的制备

通过将在所述实施例2中制备的提取物、刺槐豆胶(CAS号：9000-40-2，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))以及甘油葡糖苷(CAS号：22160-26-5,(股份公司)Genechem)以下表1的浓度与净化水混合，来制备皮肤美容改善用组合物。具体而言，包括的实施例2的提取物的浓度为100ppm，即，0.01％(w/v)，包括的刺槐豆胶的浓度为500ppm，即，0.05％(w/v)，包括的甘油葡糖苷的浓度为10ppm，即，0.001％(w/v)。

[表1]

编号	成分	浓度(ppm)
			1	实施例2的提取物	100
2	刺槐豆胶	500
			3	甘油葡糖苷	10

试验例1：确认保湿因子的表达增加效果

为了确认在实施例3中制备的组合物的保湿功能增加效果，进行了试验。

首先，将人角质形成细胞以5×10⁵的密度接种到6孔细胞培养皿后，在37℃和5％二氧化碳的培养基中培养24小时。然后，加入实施例3的组合物后再培养24小时，回收细胞并通过加入1ml的TRIZOL试剂(RNA提取试剂(RNA iso),达卡拉(DAKARA),日本)来分离RNA。使用仪器(Nanodrop 2000，赛默(Thermo),美国)来定量RNA后，通过在42℃下反应55分钟并在70℃下反应15分钟，来合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)(逆转录酶混合物(ReverseTranscriptase Mix),ELPIS生物技术,韩国)。合成的cDNA通过使用添加了作为目标蛋白质的透明质酸合成酶3(HAS3)、水通道蛋白3(AQP3)的模板以及作为花青染料的赛博格林(SYBR Green supermix,应用生物***(Applied Biosystems),美国)的混合物在实时(real-time)PCR仪(Step One Plus,应用生物***(Applied Biosystems),美国)进行实时聚合酶链反应，以最终评价HAS3和AQP3基因的表达程度。以下表2显示在实时PCR中使用的引物序列，实时PCR反应在如下的条件下执行40个周期：在94℃下聚合酶活化5分钟后，在95℃下聚合酶活化30秒，在54℃下聚合酶活化1分钟，在72℃下聚合酶活化1分钟。通过补正β-肌动蛋白基因来最终分析基因的表达量。作为比较例，使用了包括浓度为100ppm的透明质酸的净化水。

[表2]

如图1所示，与透明质酸100ppm处理组相比，实施例3的组合物处理组中的透明质酸合成酶3和水通道蛋白3的表达大大增加。因此，可以得知包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物具有优异的保湿效果。

试验例2:在人造皮肤上确认水分改善和皮肤屏障强化效果

为了确认在所述实施例3中制备的组合物的水分改善和皮肤屏障强化效果而进行了试验。

如下进行用于确认人造皮肤中的水分改善效果的试验。首先，通过对人造皮肤照射UVB，来减少水通道蛋白3。在人造皮肤上分别将实施例3的组合物和作为比较例的包括透明质酸100ppm的净化水处理3天。切割人造皮肤并固定在石蜡上。使用AQP3抗体进行了皮肤组织的免疫组织化学染色。

为了确认在人造皮肤上的皮肤屏障增强效果，进行了以下试验。在人造皮肤上分别将实施例3的组合物和作为比较例的包括透明质酸100ppm的净化水处理3天。切割人造皮肤并固定在石蜡上。为了确认人造皮肤的表皮层结构的变化而进行了试验。

图2显示用于确认在人造皮肤中的AQP3表达增加效果的使用AQP3抗体的人工皮肤的免疫组织化学染色结果。(-)：未处理组；UVB+:UVB照射组；UVB+透明质酸100ppm：透明质酸100ppm处理组；UVB+实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

如图2所示，确认了当处理实施例3的组合物时，因UVB降低的水通道蛋白3的表达增加，并且其效果比透明质酸100ppm处理组更优异。

图3显示用于确认在人造皮肤中的皮肤屏障改善效果的H&E染色结果。(-)：未处理组；透明质酸100ppm：透明质酸100ppm处理组；以及实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

如图3所示，与未处理组和透明质酸处理组相比，由于在实施例3的组合物处理组中的皮肤的表皮层得到较大改善，因此可以得知实施例3的组合物具有优异的皮肤屏障强化效果。

试验例3：确认细胞再生效果

为了确认在实施例3中制备的组合物的细胞再生效果，进行了试验。

首先，将人的成纤维细胞以2×10⁴的密度接种到96孔细胞培养皿后，在37℃和5％二氧化碳下的培养箱中培养24小时。使用细胞刮匙刮取培养的细胞中心后，添加所述实施例3的组合物，并培养24小时。使用长时间动态细胞观察及功能分析***(IncuCyte ZOOM)拍摄细胞增殖程度，并定量每小时的细胞量。

图4显示确认皮肤细胞再生效果的结果，并且是拍摄在刮下细胞24小时后的细胞增殖程度的观察结果。(-)：未处理组；实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

图5显示确认皮肤细胞再生效果的结果，并且是对根据小时(hr)的细胞数量进行定量的图表。(-)：未处理组；实施例3：包括发酵大豆、刺槐豆胶和甘油葡糖苷的组合物处理组。

如图4和图5所示，可以得知实施例3的组合物具有优异的皮肤细胞增殖效果。

剂型例1和比较剂型例1:化妆品组合物的制备

制备了包括所述实施例3的皮肤美容改善用组合物的剂型例1的化妆品组合物。制备了不包括所述实施例3的皮肤美容改善用组合物的比较剂型例1的化妆品组合物以作比较。下表3显示了剂型例1和比较剂型例1的化妆品组合物的具体成分和含量。

[表3]

试验例4：皮肤保湿力临床评估

临床评价了所述剂型例1和比较剂型例1的化妆品组合物的皮肤保湿力。

具体而言，向五名平均年龄为26.2岁的健康成年女性分别涂敷了所述剂型例1和比较剂型例1后，使用皮肤水分测试仪CM825(CK电子,德国)测量了保湿力。在测量保湿力时，首先测量试验部位(小臂内侧，22cm²)未涂敷时的水分度，然后将20μl产品涂敷在试验部位并使其吸收。然而，分别测量了3次涂敷产品前、2小时后、4小时后和8小时后的皮肤水分度。在使用3次测量值的平均值计算出皮肤水分量和变化率后，对测量结果与未涂敷值进行比较评价。

图6是在涂敷剂型例1和比较剂型例1后对根据小时的皮肤水分度(％)进行比较的图表。

如图6所示，由于在使用包括实施例3的组合物的剂型例1的产品时，显示出最优异的皮肤水分度，因此确认了该产品保湿力最高。

<110> 科丝美诗株式会社

<120> 包含使用冠突曲霉菌株发酵的发酵大豆的提取物的皮肤美容改善用组合物

<130> PX057993PCT

<150> KR 10-2018-0006644

<151> 2018-01-18

<160> 6

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HAS3-F 引物

<400> 1

cttaagggtt gcttgcttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HAS3-R 引物

<400> 2

gttcgtggga gatgaaggaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AQP3-F 引物

<400> 3

agacagcccc ttcaggattt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AQP3-R 引物

<400> 4

tcccttgccc tgaatatctg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-肌动蛋白-F 引物

<400> 5

ggccatctct tgctcgaagt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-肌动蛋白-R 引物

<400> 6

gagaccttca acaccccagc 20

Claims

1.一种皮肤美容改善用组合物，包含使用以保藏号KCCM11820P保存的冠突曲霉科丝美诗-GF菌株使大豆发酵而得到的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷作为有效成分。

2.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

所述皮肤美容改善是皮肤保湿、增强皮肤屏障或皮肤再生。

3.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

所述发酵是固体发酵。

4.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

所述发酵大豆是在30℃至35℃以及75％至85％湿度条件下发酵48小时至65小时而得到的。

5.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

所述提取物是C1-C6醇、水或其混合物的提取物。

6.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

所述提取物是乙醇提取物。

7.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

包含在所述皮肤美容改善用组合物中的所述提取物的浓度为0.001％(w/v)至10％(w/v)。

8.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

所述树胶是选自由刺槐豆胶、***胶、茄替胶、刺梧桐胶、瓜尔豆胶、黄蓍胶、黄原胶、卡拉胶、甘露聚糖以及葡甘露聚糖构成的组中的一者以上。

9.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

包含在所述皮肤美容改善用组合物中的所述树胶的浓度为0.001％(w/v)至10％(w/v)。

10.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

包括在所述皮肤美容改善用组合物中的所述甘油葡糖苷的浓度为0.0001％(w/v)至1％(w/v)。

11.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

所述皮肤美容改善用组合物增加透明质酸合成酶3(HAS3)或水通道蛋白3(AQP3)的表达。

12.如权利要求1所述的皮肤美容改善用组合物，其中，

所述皮肤美容改善用组合物是化妆品组合物、食品组合物或药物组合物。

13.一种包含使用以保藏号KCCM11820P保存的冠突曲霉科丝美诗-GF菌株使大豆发酵而得到的发酵大豆的提取物、树胶以及甘油葡糖苷的组合物的用于制备皮肤状况改善剂的用途。