CN110186886B - 水体中微囊藻毒素mc-lr浓度的反演方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水体中微囊藻毒素MC‑LR浓度的反演方法,包括:以水样中铜绿微囊藻胞外有机物归一化的特征荧光峰强度作为自变量,水样中归一化的微囊藻毒素MC‑LR浓度为因变量构建一元线性反演方程,其中,特征荧光峰强度和微囊藻毒素MC‑LR浓度均以水样中叶绿素a浓度进行归一化处理;取待检测的水样,测量水样中铜绿微囊藻胞外有机物的三维激发发射矩阵荧光光谱,获得铜绿微囊藻胞外有机物的特征荧光峰强度,然后代入一元线性反演方程中,获得微囊藻毒素MC‑LR的浓度。本方法无需样品前处理,可实现微囊藻毒素MC‑LR浓度的快速在线监测,以铜绿微囊藻胞外有机物特征荧光峰强度作为构建方程的变量,为反演方法提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及水体环境检测,尤其涉及一种水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法。
背景技术
大量微囊藻毒素MC-LR进入水体,严重威胁饮用水安全。微囊藻毒素MC-LR主要由水体中的铜绿微囊藻产生。目前,常规的浓度检测方法分为生物检测法、物理化学检测法、生物化学检测法、分子生物学检测法,各检测方法水样本前处理繁琐、耗时长、成本高,无法实现快速在线监测。而反演方法可以利用与MC-LR浓度高度相关的影响因子构建反演模型,间接反应水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的变化。众多研究学者利用水体中营养物质浓度(如氮、磷等)、温度、溶解氧等影响因子建立多元线性回归方程,对微囊藻毒素MC-LR浓度进行反演,但其浓度与各影响因子在不同时间、不同地点具有不同的相互关系。因此,反演模型无法通用。
发明内容
发明目的:针对现有技术中的问题,本发明提供了一种水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,不需复杂的前处理,变量采用来源铜绿微囊藻生理代谢的胞外有机物。
技术方案:本发明所述的水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,包括:
(1)以水样中铜绿微囊藻胞外有机物归一化的特征荧光峰强度作为自变量,水样中微囊藻毒素归一化的MC-LR浓度为因变量,构建一元线性反演方程,其中,特征荧光峰强度和微囊藻毒素MC-LR浓度均以水样中叶绿素a浓度进行归一化处理;
(2)取待检测的水样,测量水样中铜绿微囊藻胞外有机物的三维激发发射矩阵荧光光谱,获得铜绿微囊藻胞外有机物的特征荧光峰强度;
(3)将步骤(2)获得的所述特征荧光峰强度代入构建好的一元线性反演方程中,获得微囊藻毒素MC-LR的浓度。
具体的,步骤(1)中,一元线性反演方程的构建方法包括:
(a)取水样;
(b)参照标准方法,对水样中的微囊藻毒素MC-LR的含量进行测定;
(c)提取水样中的铜绿微囊藻胞外有机物,测量水样中铜绿微囊藻胞外有机物的三维激发发射矩阵荧光光谱,获得铜绿微囊藻胞外有机物的特征荧光峰强度;
(d)对水样中的藻类叶绿素a浓度进行测定;
(e)对铜绿微囊藻胞外有机物的特征荧光峰强度和微囊藻毒素MC-LR浓度以叶绿素a浓度进行归一化处理;
(f)以归一化的特征荧光峰强度作为自变量,归一化的微囊藻毒素MC-LR浓度为因变量,建立一元线性反演方程。
构建一元线性反演方程时,步骤(b)中所述的标准方法是指其他不同较为可靠的检测方法,例如可以采用国标GB/T20466-2006方法。
根据与藻细胞结合的紧密程度,水体中类蛋白、类腐殖质等胞外有机物组分可分为结合态(bEOM)和溶解态(dEOM)胞外有机物,其与微囊藻毒素MC-LR主要来源于铜绿微囊藻的生理代谢过程,且释放规律相似。
步骤(c)中,胞外有机物的提取方法包括:取水样于0~6℃离心,得沉淀和上清液,所述上清液用孔径0.22~0.45μm滤膜过滤,滤液为溶解态胞外有机物溶液;用水冲洗滤膜后再与所述沉淀混合,60~70℃加热20~30min,离心后,上清液用孔径0.22~0.45μm滤膜过滤,滤液为结合态胞外有机物溶液。上述离心时,可在8000~9000g离心5~10min。在步骤(2)中,对于待检测水样,也采用该方法进行提取,提取后进行三维荧光光谱检测。
步骤(c)中,三维荧光光谱测量时,参数设定如下:激发波长扫描范围:220~660nm,发射波长扫描范围:240~700nm。在步骤(3)中,对于待检测水样,也采用该参数进行三维荧光光谱检测。
步骤(c)中或者步骤(2)中,获得荧光光谱需进行数据预处理,一般需消除瑞利散射和拉曼散射后,获取特征荧光峰强度。
步骤(c)中,对于溶解态胞外有机物,特征荧光峰选自荧光峰S、T、A或C,对于结合态胞外有机物,特征荧光峰选自荧光峰D、T或C,其中荧光峰A代表紫外类腐殖质,荧光峰C代表可见光腐殖质,激发波长为250~260nm,发射波长为380~460nm;荧光峰S代表低激发波长类色氨酸,激发波长为220~230nm,发射波长为320~350nm;荧光峰T代表高激发波长类色氨酸,激发波长为270~280nm,发射波长为320~350nm;荧光峰D代表低激发波长类色氨酸,激发波长为220~230nm,发射波长为300~310nm。上述特征峰均可以构建一元线性反演方程,其中以结合态胞外有机物的荧光峰T构建的方程反演效果最好。待检测水样的所需获取的特征荧光峰强度与方程相对应。
对水样中的藻类叶绿素a浓度进行测定时,可采用“湖泊富营养化调查规范”方法。
叶绿素a归一化的各特征荧光峰强度与微囊藻毒素MC-LR浓度呈极显著相关,利用各特征荧光峰强度建立MC-LR浓度的一元线性反演方程如下表,可选择其中任意一个使用,一元线性反演方程中,CbEOMD代表bEOM中荧光峰D的强度,CbEOMT代表bEOM中荧光峰T的强度,CbEOMC代表bEOM中荧光峰C的强度,CdEOMS代表dEOM中荧光峰S的强度,CdEOMT代表dEOM中荧光峰T的强度,CdEOMA代表dEOM中荧光峰A的强度,CdEOMC代表dEOM中荧光峰C的强度,Cchla代表水样中叶绿素a的浓度,单位为μg·L-1,CMC-LR代表水样中微囊藻毒素MC-LR的浓度,μg·L-1:
有益效果:
本发明水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,利用三维激发发射矩阵荧光光谱技术建立微囊藻毒素MC-LR的一元线性反演方程,该技术不需要对水体样品进行复杂的预处理过程,检测快速。
本发明以铜绿微囊藻胞外有机物特征荧光峰强度作为构建方程的变量,为反演方法提供了一种新的思路,且铜绿微囊藻胞外有机物与藻体本身生长代谢有关,可避免采用易受外界环境变化的氮、磷、温度、溶解氧等因子,准确度和稳定性更好。
经叶绿素a归一化处理后,铜绿微囊藻胞外有机物的特征荧光峰与微囊藻毒素MC-LR的浓度高度相关,通过决定系数、均方根误差和均方根相对误差3个指标评价本发明方法构建的回归方程,反演效果好,其中结合态高激发波长类色氨酸荧光峰T的反演效果最好,其决定系数、均方根误差、均方根相对误差分别为0.841、0.579μg·L-1、37.10%,反演方程的回归系数相对集中,便于在实际应用中进行不断调节,以获得最好的反演效果。
附图说明
图1为太湖铜绿微囊藻溶解态胞外有机物的三维荧光光谱图;
图2为太湖铜绿微囊藻结合态胞外有机物的三维荧光光谱图;
图3为dEOM各荧光峰反演的MC-LR浓度与实测浓度变化趋势比较;
图4为bEOM各荧光峰反演的MC-LR浓度与实测浓度变化趋势比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐明本发明。
水体中微囊藻毒素MC-LR的检测方法,包括:
(1)取样:铜绿微囊藻爆发期,在无锡太湖的监测点用取样器在水下20~30cm取1L水样,取样数量为31个。随机抽取9个样本作为待反演样本,其他样本用于构建反演方程。
(2)参照国标GB/T20466-2006方法,利用安捷伦1200液相色谱仪对水样样品中微囊藻毒素MC-LR的含量进行测定,用于反演方程的建立以及反演检测;
(3)提取水样中的铜绿微囊藻胞外有机物:将铜绿微囊藻的胞外有机物分为dEOM(溶解态胞外有机物)和bEOM(结合态胞外有机物)两部分,提取方法为:取5mL水样在4℃条件下9000g离心10min,取上清液用孔径0.45μm醋酸纤维膜过滤保存,滤液用于测定dEOM;取5mL超纯水冲洗醋酸纤维膜并与上步离心的离心沉积物混合,在70℃水浴中加热20min,经4℃条件下9000g离心10min,取上清液用0.45μm醋酸纤维膜过滤保存,滤液用于测定bEOM。
(4)获取水样中铜绿微囊藻胞外有机物的三维荧光光谱(三维激发发射矩阵荧光光谱)数据:利用日立F-7000荧光分光光度计分别测量每个水样的溶解态胞外有机物或者结合态胞外有机物的三维荧光光谱,参数设定如下:激发波长扫描范围:220~660nm,发射波长扫描范围:240~700nm,激发波长步长和扫描波长步长分别为10nm和2nm,激发狭缝和发射狭缝均为5nm,扫描速度为12000nm/min,光电倍增管电压700V,光谱不校正。对三维荧光光谱数据矩阵,通过数值置零消除瑞利散射的影响,同时以Milli-Q超纯水光谱数据扣除空白,以消除拉曼散射的影响。
(4)参照金相灿,屠清瑛主编的《湖泊富营养化调查规范》对每个水样的藻类叶绿素a浓度进行测定并根据叶绿素a浓度对样本进行分段。
(5)对各荧光峰强度和微囊藻毒素MC-LR浓度以叶绿素a浓度进行归一化处理。MC-LR浓度和叶绿素a浓度的单位均为μg·L-1。
(6)利用SPSS软件,以归一化的荧光峰强度作为自变量,归一化的MC-LR浓度为因变量,建立一元线性回归方程;
(7)根据决定系数、均方根误差和均方根相对误差3个指标评价回归方程。
图1、图2分别为太湖铜绿微囊藻溶解态胞外有机物(dEOM)、结合态胞外有机物(bEOM)的三维荧光光谱图。dEOM三维光谱图中4个较强的荧光峰分别为荧光峰S(Ex/Em:230/320)、T(Ex/Em:280/330)、A(Ex/Em:270/440)、C
(Ex/Em:350/440),其中荧光峰S、T分别代表的是低激发波长类色氨酸荧光峰、高激发波长类色氨酸荧光峰,与蛋白、氨基酸、多肽等物质有关,结构中含有芳环氨基酸,主要来源于藻细胞的分泌以及后续的生物降解;荧光峰A、C代表的是紫外区类腐殖质荧光峰、可见区类腐殖质荧光峰,与类富里酸和类腐殖酸等组分相关,结构中含有羧基、羟基和酚羟基等,一般被认为是藻细胞释放的胞外有机物经腐殖化作用形成的。bEOM中除了荧光峰T、A、C之外,还出现了一个中心激发波长220nm,发射波长300nm的类酪氨酸荧光峰D,来源与类色氨酸相似,其荧光峰位置受微环境影响较小。水体中主要荧光峰位置见表1。
表1.水体中主要荧光峰位置
对各主要荧光峰强度分别与MC-LR浓度进行相关性分析,结果见表2,各荧光峰强度与MC-LR浓度均无明显的相关性,各荧光峰不能直接作为回归分析的自变量。因此,以叶绿素a浓度对各荧光峰强度和MC-LR浓度进行归一化处理,除bEOM中荧光峰A之外,其他各荧光峰归一化的荧光峰强度与MC-LR浓度呈极显著相关(表3)。
表2太湖铜绿微囊藻各荧光峰强度与MC-LR浓度的相关性
表3太湖铜绿微囊藻归一化的各荧光峰强度与MC-LR浓度的相关性
利用与MC-LR浓度高度相关的bEOM和dEOM各荧光峰建立一元线性反演方程,结果见表4,一元线性反演方程中,CbEOMD代表bEOM中荧光峰D的强度,CbEOMT代表bEOM中荧光峰T的强度,CbEOMC代表bEOM中荧光峰C的强度,CdEOMS代表dEOM中荧光峰S的强度,CdEOMT代表dEOM中荧光峰T的强度,CdEOMA代表dEOM中荧光峰A的强度,CdEOMC代表dEOM中荧光峰C的强度,Cchla代表水样中叶绿素a的浓度,单位为μg·L-1,CMC-LR代表水样中微囊藻毒素MC-LR的浓度,μg·L-1。
表4太湖微囊藻毒素MC-LR浓度的一元线性反演方程
根据决定系数、均方根误差和均方根相对误差3个指标评价表4构建的回归方程,结果如表5、表6、表7。图3、图4分别为各荧光峰反演的MC-LR浓度与实测浓度变化趋势比较,各荧光峰反演的MC-LR浓度与实测浓度变化趋势基本一致。其中dEOM荧光峰S、T和bEOM荧光峰D、T反演的MC-LR浓度与实测浓度的决定系数R2分别为0.722、0.663、0.744、0.841,均方根误差为0.761μg·L-1、0.806μg·L-1、0.715μg·L-1、0.579μg·L-1,均方根相对误差分别为50.35%、52.19%、47.11%、37.10%(表5、表6、表7)。其中,bEOM荧光峰T的反演效果最好,采样期第14、20、24、29、30天的实测值与反演浓度值较接近,实测值分别为:0.58μg·L-1、2.07μg·L-1、3.87μg·L-1、0.72μg·L-1、0.69μg·L-1,对应反演浓度值为:0.62μg·L-1、2.18μg·L-1、2.92μg·L-1、0.79μg·L-1、0.67μg·L-1。而dEOM荧光峰A、C和bEOM荧光峰C反演的第2个样本浓度值偏差较大,导致其决定系数降低,均方根误差和均方根相对误差升高。排除第2个样本,其反演浓度与实测浓度的决定系数分别上升至0.697、0.739、0.505,均方根误差均降低至1μg·L-1以下,而均方根相对误差分别降低了39.96%,48.87%,14.97%。
表5 MC-LR反演浓度与实测浓度的决定系数
表6 MC-LR反演浓度与实测浓度的均方根误差
表7 MC-LR反演浓度与实测浓度的均方根相对误差
Claims (6)
1.一种水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,其特征在于,包括:
(1)以水样中铜绿微囊藻胞外有机物归一化的特征荧光峰强度作为自变量,水样中微囊藻毒素归一化的MC-LR浓度为因变量,构建一元线性反演方程,其中,特征荧光峰强度和微囊藻毒素MC-LR浓度均以水样中叶绿素a浓度进行归一化处理;
(2)取待检测的水样,测量水样中铜绿微囊藻胞外有机物的三维激发发射矩阵荧光光谱,获得铜绿微囊藻胞外有机物的特征荧光峰强度;
(3)将步骤(2)获得的所述特征荧光峰强度代入构建好的一元线性反演方程中,获得微囊藻毒素MC-LR的浓度;
所述一元线性反演方程选自下表中任意一个,一元线性反演方程中,CbEOMD代表bEOM中荧光峰D的强度,CbEOMT代表bEOM中荧光峰T的强度,CbEOMC代表bEOM中荧光峰C的强度,CdEOMS代表dEOM中荧光峰S的强度,CdEOMT代表dEOM中荧光峰T的强度,CdEOMA代表dEOM中荧光峰A的强度,CdEOMC代表dEOM中荧光峰C的强度,Cchla代表水样中叶绿素a的浓度,单位为μg·L-1,CMC-LR代表水样中微囊藻毒素MC-LR的浓度,μg·L-1:
2.根据权利要求1所述的水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,其特征在于,步骤(1)中,一元线性反演方程的构建方法包括:
(a)取水样;
(b)参照标准方法,对水样中的微囊藻毒素MC-LR的含量进行测定;
(c)提取水样中的铜绿微囊藻胞外有机物,测量水样中铜绿微囊藻胞外有机物的三维激发发射矩阵荧光光谱,获得铜绿微囊藻胞外有机物的特征荧光峰强度;
(d)对水样中的藻类叶绿素a浓度进行测定;
(e)对铜绿微囊藻胞外有机物的特征荧光峰强度和微囊藻毒素MC-LR浓度以叶绿素a浓度进行归一化处理;
(f)以归一化的特征荧光峰强度作为自变量,归一化的微囊藻毒素MC-LR浓度为因变量,建立一元线性反演方程。
3.根据权利要求1所述的水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,其特征在于,步骤(1)或步骤(2)中,铜绿微囊藻胞外有机物为溶解态胞外有机物或结合态胞外有机物;对于溶解态胞外有机物,特征荧光峰选自荧光峰S、T、A或C,对于结合态胞外有机物,特征荧光峰选自荧光峰D、T或C,其中荧光峰A代表紫外类腐殖质,荧光峰C代表可见光腐殖质,荧光峰S代表低激发波长类色氨酸,荧光峰T代表高激发波长类色氨酸,荧光峰D代表低激发波长类色氨酸。
4.根据权利要求1所述的水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,其特征在于,胞外有机物的提取方法包括:取水样于0~6℃离心,得沉淀和上清液,所述上清液用孔径0.22~0.45μm滤膜过滤,滤液为溶解态胞外有机物溶液;用水冲洗滤膜后再与所述沉淀混合,60~70℃加热20~30min,离心后,上清液用孔径0.22~0.45μm滤膜过滤,滤液为结合态胞外有机物溶液。
5.根据权利要求1或2所述的水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,其特征在于,步骤(2)或步骤(c)中,三维激发发射矩阵荧光光谱测量时,参数设定如下:激发波长扫描范围:220~660nm,发射波长扫描范围:240~700nm。
6.根据权利要求1或2所述的水体中微囊藻毒素MC-LR浓度的反演方法,其特征在于,三维激发发射矩阵荧光光谱数据消除瑞利散射和拉曼散射后,获取特征荧光峰强度。
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