CN109444306A - 一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-lr的方法 - Google Patents

一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-lr的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素‑LR的方法，具体涉及一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素‑LR的方法，属于水环境监测技术或农业监测技术领域。本发明基于微囊藻毒素‑LR能够在紫外光照射下激发出荧光的特点，通过对样品进行过滤、富集、洗脱、浓缩定容，采用高效液相荧光色谱方法实现水体中微囊藻毒素‑LR的快速、准确、高效的检测，对水体污染情况的监测、治理和保护都具有指导意义。

Description

一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法
一、技术领域
本发明属于水环境监测技术或农业监测技术领域，具体涉及水体中微囊藻毒素-LR的一种高效液相荧光色谱检测方法。
二、背景技术
微囊藻毒素(Microcystins，MCs)，是由蓝藻门中铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、颤藻等发生水化所产生的一类环状七肽毒素代谢物，目前已发现90多个异构体组成，具有强致癌性，长期饮用富含高浓度MCs的水可能诱发肝癌，MCs还可以通过食物链进行生物富集，对人体造成损伤，具有持久性生物污染，其中微囊藻毒素MC-LR(L代表亮氨酸，R代表精氨酸)为毒性最强、分布最广的一种构型。随着污染状况的不断加剧，蓝藻水华现象在全球范围内的湖泊、河流、水库中频繁发生，水体中产生的微囊藻毒素严重威胁着水质和食品安全，这已成为国内外普遍关注的卫生和环境问题。MCs化学性质稳定，目前自来水厂传统的处理工艺(如：沉淀、过滤、加氯)不能将其去除，鉴于MCs污染的普遍性和较强的毒性，水体中MC-LR的含量已被多国作为衡量水质等级的重要指标参数，世界卫生组织和我国《生活饮用水卫生标准》均规定了地表水源地、生活饮用水MCs(以MC-LR为代表)的浓度不得高于1.0μg/L。
目前，常用检测MC-LR的方法主要有化学检测法、免疫测定法和生物测定法。化学检测法主要包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳(CE)、液相色谱/质谱分析法(LC/MS)等。这些检测方法均利用MCs的物化性质结合灵敏的光电技术进行分析测定，虽然也取得了不错的测定效果，但存在仪器设备运行成本高、前处理复杂耗时、回收率不高等不足。免疫测定法利用抗体对抗原的特异性识别原理来对各种毒素进行检测，方法灵敏度高但特异性不强，抗体与毒素易发生交叉反应，有时会出现假阳性反应，对毒素类型鉴别不佳，应用范围有限。生物测定法通常用小鼠口腔灌喂或腹腔注射评价MCs的毒性，该方法操作简单、直观，但不能区分毒素的异构体且定量不够准确、工作量大。由于MC-LR属于单环七肽有机分子，其基本分子结构为大环并间隔双键，含羰基、氨基、酰胺基等官能团，具有热稳定性好、在激发光照射下能激发分子发出荧光的特点，其本身具备高效液相荧光色谱检测的条件。天然水体中MCs含量很低，因此水样应通过富集、浓缩后才能定量分析，而高效液相色谱法(HPLC)具有良好的分离能力，结果准确，重现性好，而荧光检测器能够准确灵敏的对激发出的荧光进行检测。
因此，建立一种灵敏度高，定性准确，回收率和重现性良好，操作快捷简便、结果可靠的测定水体中微囊藻毒素-LR的方法，对水体污染情况的监测、治理和保护都具有指导意义。
三、发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，该方法基于微囊藻毒素-LR分子在激发光照射下能够激发出特定荧光、热稳定性好等理化特征，在寻找和确定出最优激发光波长和发射光波长的前提下，结合固相萃取法对水样进行过滤、富集、洗脱和浓缩等前处理，并优化高效液相色谱检测条件对水体中微囊藻毒素-LR进行快速、高灵敏的检测。本发明技术方案的具体步骤如下：
(1)制备标准液购买微囊藻毒素-LR标准溶液，微囊藻毒素-LR浓度标准值为20μg/mL。
制备标准储备溶液：准确移取1000μL的微囊藻毒素-LR标准溶液(20μg/mL)于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，该贮备液中含微囊藻毒素-LR的浓度为2.0mg/L，摇匀，0℃～4℃以下保存，一周内有效，备用。
制备标准工作溶液：将微囊藻毒素-LR的标准贮备液用甲醇稀释至1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、250.00μg/L等6个浓度。此标准工作溶液临用时现配。
(2)水样的预处理取水样1000mL，并将水样过0.45μm的水系滤膜，待固相萃取。
(3)活化分离柱用甲醇5～15mL、流速2.0～5.0mL/min，预洗分离柱，再用5～15mL水、流速2.0～5.0mL/min，活化分离柱，并确保不让分离柱流干。
(4)样品的富集将预处理的1000mL水样以5～15mL/min的流速过已活化好的分离柱进行样品富集。
(5)干燥分离柱先用2～10mL水以5～15mL/min流速淋洗分离柱后，再用5～15mL20％甲醇以2～10mL/min流速再次淋洗分离柱，最后用10～30mL高纯氮气以10～30mL/min流速气推分离柱，并氮吹分离柱10～50min，使分离柱干燥。
(6)样品洗脱与浓缩：注射泵采用0.1％三氟乙酸甲醇溶液1～5mL、流速10～30mL/min进行清洗，再用0.1％三氟乙酸甲醇5～15mL、流速1～5mL/min洗脱分离柱，再将洗脱液过无水硫酸钠柱进行脱水干燥，最后用氮气5～15mL、流速10～30mL/min气推分离柱，并收集洗脱液。将收集的洗脱液在温度为35℃～45℃条件下浓缩，氮吹浓缩至1.0mL，并过0.45μm的有机滤膜，待高效液相色谱仪测定。
(7)测定色谱测定条件为：采用SHIMPACKCLC-ODS(规格：150mm×6.0mm,5.0μm)色谱柱，荧光检测器的激发波长(λex)范围为249～254nm，发射波长(λem)范围为293～298nm。流动相为甲醇(0.05％三氟乙酸)：水(0.05％三氟乙酸)＝(55～65)：(35～45)(V/V)，流速0.8～1.2mL/min，柱温30～50℃，进样量10μL。
所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，分离柱为C18分离柱，预洗甲醇体积为10mL、流速3.0mL/min，活化水体积为10mL、流速3.0mL/min。
所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，样品富集过分离柱的上样流速为10mL/min。
所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，分离柱干燥淋洗水体积为5mL、流速10mL/min，所用20％的甲醇体积为10mL、流速5mL/min，气推分离柱干燥所用的氮气体积为20mL、流速20mL/min，继续氮吹分离柱时间为25min。
所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，样品洗脱过程中注射泵清洗用0.1％三氟乙酸甲醇溶液体积为2mL、流速20mL/min，分离柱洗脱用0.1％三氟乙酸甲醇溶液体积为10mL、流速2mL/min；气推分离柱所用的N2体积为10mL、流速20mL/min。
所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，洗脱液的浓缩温度为40℃。
所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，样品测定过程中荧光检测器的激发波长λex＝251nm，发射波长λem＝296nm。
所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，流动相体积比为0.05％三氟乙酸甲醇溶液:0.05％三氟乙酸水溶液＝60:40，流速1.0mL/min，柱温40℃。
本发明达到的有益效果：
(1)本发明基于微囊藻毒素-LR的独特分子结构特点，在荧光检测器条件下探索其最佳检测激发波波长和发射波波长，微囊藻毒素-LR受激发发出的荧光与其他物质的荧光很容易区分开来，能够很好的避免背景干扰，有效避免了假阳性的问题，检测灵敏度高。
(2)本发明提供的检测方法采用固相萃取技术对水样中的微囊藻毒素-LR有效富集，可以很大程度上提高了微囊藻毒素-LR的回收率，分析效率高、成本较低。
四、附图说明
图1为λEx＝238nm，不同Em波长下的响应值示意图；
图2为λEm＝296nm，不同Ex波长下的响应值示意图；
图3为λEx＝251nm，不同Em波长下的响应值示意图；
图4为饮用水添加回收色谱图；
图5为地表水添加回收色谱图；
图6微囊藻毒素-LR的标准色谱图；
图7微囊藻毒素-LR线性关系图。
五、具体实施方式
1、制备标准液 购买微囊藻毒素-LR标准溶液，微囊藻毒素-LR浓度标准值为20μg/mL。
制备标准储备溶液：准确移取1000μL的微囊藻毒素-LR标准溶液(20μg/mL)于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，该贮备液中含微囊藻毒素-LR的浓度为2.0mg/L，摇匀，0℃～4℃以下保存，一周内有效，备用。
制备标准工作溶液：将微囊藻毒素-LR的标准贮备液用甲醇稀释至1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、250.00μg/L等6个浓度。此标准工作溶液临用时现配。
2、水样的预处理取水样1000mL，并将水样过0.45μm的水系滤膜，待固相萃取。
3、活化分离柱先用10mL甲醇以3.0mL/min的流速预洗C18柱，使溶剂流净，再用10mL水以3.0mL/min的流速活化C18柱，在活化过程中，不要让分离柱流干。
4、样品的富集将预处理的1000mL水样以10mL/min的流速过已活化好的C18柱进行样品富集。
5、干燥分离柱先用5mL水以10mL/min流速淋洗C18柱后，再用10mL20％甲醇以5mL/min流速再次淋洗C18柱，最后用20mL高纯氮气以20mL/min流速气推吹C18柱，并氮吹C18柱25min，使柱干燥。
6、样品洗脱与浓缩先用2mL含有0.1％三氟乙酸的甲醇以20mL/min的流速清洗注射泵，再用10mL含有0.1％三氟乙酸的甲醇以2mL/min的流速洗脱C18柱，洗脱液再过无水硫酸钠柱，收集洗脱液，最后用10mL氮气以20mL/min的流速气推C18柱，并收集洗脱液。将收集的洗脱液在40℃条件下，氮吹浓缩至1.0mL，并过0.45μm的有机滤膜，待高效液相色谱仪测定。
7、测定色谱测定条件为
色谱柱：SHIMPACKCLC-ODS，(150mm×6.0mm，5.0μm)；或性能相当者。检测器：荧光检测器；λex＝251nm，λem＝296nm。
流动相：甲醇(0.05％三氟乙酸)：水(0.05％三氟乙酸)＝60：40(V/V)。
流速：1.0mL/min。柱温：40±1℃。进样量：10μL。
本发明的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法通过微囊藻毒素-LR的激发/发射波长，和对饮用水、地表水两种样品进行准确度、精密度以及该方法的检出限、定量下限的确定进行方法确认。
一、荧光检测波长的确定
采用液相色谱荧光检测器的光谱扫描技术，通过对微囊藻毒素-LR标准溶液的激发光谱和发射光谱进行扫描，从而确定出检测微囊藻毒素-LR的最佳激发波波长和发射波波长。首先由GB/T5750.8-2006.13微囊藻毒素(高压液相色谱法)推荐的紫外吸收波238nm作为激发波长(Ex＝238nm)，对不同发射波长Em(Em＝263-400nm)进行全扫描检测,微囊藻毒素-LR响应值最大时的发射波长Em为296nm(图1)；
然后将寻得的296nm作为发射波长(Em＝296nm)，对不同激发波长Ex(Ex＝220-300nm)进行全扫描检测,微囊藻毒素-LR响应值最大时的激发波长Ex为251nm(图2)；
最后再将寻得的251nm作为最佳激发波长(Ex＝251nm)，再次对不同发射波长Em(Em＝276-400nm)进行全扫描检测，验证性寻得微囊藻毒素-LR响应值最大时的发射波长Em为296nm(图3)。通过对光谱图进行分析，最终确定微囊藻毒素-LR的激发/发射波长为λex＝251nm/λem＝296nm。
二、准确度和精密度
1、分别量取24份饮用水水样品各1000mL，其中6份作为样品空白，其余18份样品中添加微囊藻毒素-LR标准溶液，分别做3个添加水平0.10、0.50、1.00μg/L。
(1)水样的预处理取水样1000mL，并将水样过0.45μm的水系滤膜，待固相萃取。
(2)活化分离柱先用10mL甲醇以3.0mL/min的流速预洗C18柱，使溶剂流净，再用10mL水以3.0mL/min的流速活化C18柱，在活化过程中，不要让分离柱流干。
(3)样品的富集将预处理的1000mL水样以10mL/min的流速过已活化好的C18柱进行样品富集。
(4)干燥分离柱先用5mL水以10mL/min流速淋洗C18柱后，再用10mL20％甲醇以5mL/min流速再次淋洗C18柱，最后用20mL高纯氮气以20mL/min流速气推吹C18柱，并氮吹C18柱25min，使柱干燥。
(5)样品洗脱与浓缩先用2mL含有0.1％三氟乙酸的甲醇以20mL/min的流速清洗注射泵，再用10mL含有0.1％三氟乙酸的甲醇以2mL/min的流速洗脱C18柱，洗脱液再过无水硫酸钠柱，收集洗脱液，最后用10mL氮气以20mL/min的流速气推C18柱，并收集洗脱液。将收集的洗脱液在40℃条件下，氮吹浓缩至1.0mL，并过0.45μm的有机滤膜，待高效液相色谱仪测定。
(6)测定色谱测定条件为
色谱柱：SHIMPACKCLC-ODS，(150mm×6.0mm，5.0μm)；或性能相当者。
检测器：荧光检测器；λex＝251nm，λem＝296nm。
流动相：甲醇(0.05％三氟乙酸)：水(0.05％三氟乙酸)＝60：40(V/V)。
流速：1.0mL/min。柱温：40±1℃。进样量：10μL。
按照上述分析方法萃取、净化，并按照上述色谱条件进行检测，平均回收率和精密度如表1，饮用水添加回收色谱图如图4。
表1饮用水中微囊藻毒素-LR的添加回收率与精密度结果
2、分别量取24份地表水水样品各1000mL，其中6份作为样品空白，其余18份样品中添加微囊藻毒素-LR标准溶液，分别做3个添加水平0.10、0.50、1.00μg/L。
(1)水样的预处理取水样1000mL，并将水样过0.45μm的水系滤膜，待固相萃取。
(2)活化分离柱先用10mL甲醇以3.0mL/min的流速预洗C18柱，使溶剂流净，再用10mL水以3.0mL/min的流速活化C18柱，在活化过程中，不要让分离柱流干。
(3)样品的富集将预处理的1000mL水样以10mL/min的流速过已活化好的C18柱进行样品富集。
(4)干燥分离柱先用5mL水以10mL/min流速淋洗C18柱后，再用10mL20％甲醇以5mL/min流速再次淋洗C18柱，最后用20mL高纯氮气以20mL/min流速气推吹C18柱，并氮吹C18柱25min，使柱干燥。
(5)样品洗脱与浓缩先用2mL含有0.1％三氟乙酸的甲醇以20mL/min的流速清洗注射泵，再用10mL含有0.1％三氟乙酸的甲醇以2mL/min的流速洗脱C18柱，洗脱液再过无水硫酸钠柱，收集洗脱液，最后用10mL氮气以20mL/min的流速气推C18柱，并收集洗脱液。将收集的洗脱液在40℃条件下，氮吹浓缩至1.0mL，并过0.45μm的有机滤膜，待高效液相色谱仪测定。
(6)测定色谱测定条件为
色谱柱：SHIMPACKCLC-ODS，(150mm×6.0mm，5.0μm)；或性能相当者。
检测器：荧光检测器；λex＝251nm，λem＝296nm。
流动相：甲醇(0.05％三氟乙酸)：水(0.05％三氟乙酸)＝60：40(V/V)。
流速：1.0mL/min。柱温：40±1℃。进样量：10μL。
按照上述分析方法萃取、净化，并按照上述色谱条件进行检测，平均回收率和精密度如表2，地表水添加回收色谱图如图5。
表2地表水中微囊藻毒素-LR的添加回收率与精密度
三、检出限和定量下限
1、制备标准液购买微囊藻毒素-LR标准溶液，微囊藻毒素-LR浓度标准值为20μg/mL。
制备标准储备溶液：准确移取1000μL的微囊藻毒素-LR标准溶液(20μg/mL)于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，该贮备液中含微囊藻毒素-LR的浓度为2.0mg/L，摇匀，0℃～4℃以下保存，一周内有效，备用。
制备标准工作溶液：将微囊藻毒素-LR的标准贮备液用甲醇稀释至1.00、5.00、10.00、50.00、100.00、250.00μg/L等6个浓度。此标准工作溶液临用时现配。
2、配制1.0μg/L的微囊藻毒素-LR标准溶液，分别以3倍和10倍信噪比(S/N)计算方法的检出限和定量下限。
3、测定色谱测定条件为
色谱柱：SHIMPACKCLC-ODS，(150mm×6.0mm，5.0μm)；或性能相当者。
检测器：荧光检测器；λex＝251nm，λem＝296nm。
流动相：甲醇(0.05％三氟乙酸)：水(0.05％三氟乙酸)＝60：40(V/V)。
流速：1.0mL/min。柱温：40±1℃。进样量：10μL。
待仪器稳定后首先将不同浓度的微囊藻毒素-LR标准溶液分别进样，微囊藻毒素-LR的标准色谱图如图6，然后分别以色谱峰面积(y)为纵坐标，以浓度(x)为横坐标作图，即为微囊藻毒素-LR的标准曲线如图7。最后以3倍和10倍信噪比(S/N)计算方法的检出限和定量下限如表3，微囊藻毒素-LR的方法检出限为0.008μg/L，定量下限为0.028μg/L，均低于GB3838-2002规定的控制标准值1.0μg/L。因此本发明提供的检测方法对微囊藻毒素-LR在水中的检测具有样品前处理过程操作简单，灵敏、快速的特点，其准确度、灵敏度达到水质分析监测的要求，适用于测定水环境中微囊藻毒素-LR的含量，具有重要的应用价值。
表3微囊藻毒素-LR的方法检出限与定量下限
其中：检出限(3倍)＝3*Nd*C*V/(20*H)；定量下限(10倍)＝10*Nd*C*V/(20*H)。

Claims (8)

1.一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，是利用微囊藻毒素-LR分子受激发光照射能够发射出特定荧光、热稳定性好等理化特征，在寻找和确定出最优激发光波长和发射光波长的前提下，结合固相萃取法对水样进行过滤、富集、洗脱和浓缩等前处理，并优化高效液相色谱检测条件对水体中微囊藻毒素-LR进行快速、高灵敏的检测；具体步骤如下：
步骤一、水样的预处理
取水样1000mL，并将水样过0.45μm的水系滤膜，待固相萃取；
步骤二、活化分离柱
用甲醇5～15mL、流速2.0～5.0mL/min预洗分离柱，再用5～15mL水、流速2.0～5.0mL/min活化分离柱，并确保不让分离柱流干；
步骤三、样品富集
将预处理的1000mL水样以5～15mL/min的流速过已活化好的分离柱进行样品富集；
步骤四、干燥分离柱
先用2～10mL水以5～15mL/min流速淋洗分离柱后，再用5～15mL 20％甲醇以2～10mL/min流速再次淋洗分离柱，最后用10～30mL高纯氮气以10～30mL/min流速气推分离分离柱，并氮吹分离柱10～50min，使分离柱干燥；
步骤五、样品洗脱与浓缩
注射泵采用0.1％三氟乙酸甲醇溶液1～5mL、流速10～30mL/min进行清洗，再用0.1％三氟乙酸甲醇5～15mL、流速1～5mL/min洗脱分离柱，再将洗脱液过无水硫酸钠柱进行脱水干燥，最后用氮气5～15mL、流速10～30mL/min气推分离柱，并收集洗脱液；将收集的洗脱液在温度为35℃～45℃条件下浓缩，氮吹浓缩至1.0mL，并过0.45μm的有机滤膜，待高效液相色谱仪测定；
步骤六、测定
色谱测定条件为：采用SHIM PACK CLC-ODS色谱柱，荧光检测器的激发波长范围为249～254nm，发射波长范围为293～298nm；流动相为甲醇(0.05％三氟乙酸)：水(0.05％三氟乙酸)＝(55～65)：(35～45)(V/V)，流速0.8～1.2mL/min，柱温30～50℃，进样量10μL。
2.根据权利要求1所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，分离柱为C18分离柱，预洗甲醇体积为10mL、流速3.0mL/min，活化水体积为10mL、流速3.0mL/min。
3.根据权利要求1所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，权利要求1所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，样品富集过分离柱的上样流速为10mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，分离柱干燥淋洗水体积为5mL、流速10mL/min，所用20％的甲醇体积为10mL、流速5mL/min，气推分离柱干燥所用的氮气体积为20mL、流速20mL/min，继续氮吹分离柱时间为25min。
5.根据权利要求1所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，样品洗脱过程中注射泵清洗用0.1％三氟乙酸甲醇溶液体积为2mL、流速20mL/min，分离柱洗脱用0.1％三氟乙酸甲醇溶液体积为10mL、流速2mL/min；气推分离柱所用的N2体积为10mL、流速20mL/min。
6.根据权利要求1所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，洗脱液的浓缩温度为40℃。
7.根据权利要求1所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，样品测定过程中荧光检测器的激发波长λex＝251nm，发射波长λem＝296nm。
8.根据权利要求1所述的一种高效液相荧光色谱法检测水中微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于，流动相体积比为0.05％三氟乙酸甲醇溶液:0.05％三氟乙酸水溶液＝60:40，流速1.0mL/min，柱温40℃。
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