CN110174516A - 鹅细小病毒vp3蛋白抗原elisa检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

鹅细小病毒vp3蛋白抗原elisa检测试剂盒及检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒中包括：包被鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、纯化的鹅细小病毒VP3重组蛋白抗原标准品、HRP标记的抗鹅细小病毒VP3单克隆抗体、洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液、终止液以及抗原标准品。同时，本发明还公开了一种采用所述试剂盒准确定量检测样品中的鹅细小病毒VP3蛋白抗原的方法。本发明的试剂盒除具有ELISA试剂盒的优点外，还克服了抗原空间构象问题所致的特异性低和二抗问题所致的灵敏度等缺陷，显著提高了检测的特异性和灵敏度。

Description

鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒及检测方法和应用
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
鹅细小病毒，即小鹅瘟病毒，鹅细小病毒感染是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、急性、败血性传染病，主要侵害4-20日龄雏鹅和雏番鸭。雏鹅和雏番鸭以精神萎顿、食欲废绝和严重腹泻为特征性临床症状，以渗出性肠炎、全身急性败血病变为特征，小肠最后段狭窄处肠腔有栓子状物堵塞肠腔为剖解症状。目前，此病每年都有不同程度地流行，仍为养鹅业和集约化养殖番鸭的国家中最主要的传染病之一，对水禽养殖业造成严重损失。
目前虽然有不少的检测方法，例如琼脂扩散试验和琼脂扩散抑制试验，中和试验和动物保护试验，直接免疫荧光诊断法，免疫酶斑点法，但是尽管这些方法可以检测GPV，但存在操作繁琐，使用不方便，耗时长以及不易普及等缺陷。现有技术中，CN104833801B公开了一种检测小鹅瘟抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，该试剂盒采用双单抗结合技术检测GPV抗原，所述试剂盒至今未能市场化，且所述试剂盒制备程序繁琐，仅能定性检测小鹅瘟抗原的存在，不能满足针对疫苗产品中抗原含量的检测。为此急需研究一种高效、精准且定量检测GPV的方法。
发明内容
本发明为了提高检测的特异性和灵敏度，同时又能够满足针对样品中小鹅瘟VP3蛋白的定性和定量检测，提供了一种检测鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒，并提供了其检测方法和应用。
第一方面，本发明的目的在于提供一种鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA测试剂盒。其中，所述试剂盒包含：包被鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、纯化的鹅细小病毒VP3重组蛋白抗原标准品、HRP标记的抗鹅细小病毒VP3单克隆抗体、洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液以及终止液。其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白，所述酶底物A溶液含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液、酶底物B溶液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液。
本发明的优选方案中，所述的鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体为ProteinA柱纯化重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白作为抗原免疫实验兔后获得的高价血清所得，所述鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的包被量为0.01μg-0.5μg/孔。包被稀释液为pH为9.6的0.05ml/L的碳酸盐缓冲液。组成为每升碳酸盐缓冲液中含有1.59gNa2CO3和2.93g NaHCO3。
本发明的优选方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的牛血清自蛋白(BSA)或质量浓度为1-10％的脱脂奶粉的任一或其组合。
本发明的优选方案中，样品稀释液由质量浓度为0.1-10％BSA和含有0.01-1％ProClin 300的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。
本发明的优选方案中，所述样品稀释液的配制为：现配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，121℃20min高压灭菌冷却后加入0.1-10％BSA和含有0.01-1％ProClin 300，即得。
本发明的优选方案中，酶底物A溶液含有0.016％(质量浓度)双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠溶液的浓度为10g/L，pH为5.3；称取乙酸钠10g溶于1L纯化水，用乙酸调pH为5.3，再加入540μL浓度为30％H2O2。
所述酶底物B溶液为1.7mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB·HCl)溶液；称取0.47gTMB·HCl加入到1L pH为3.0的0.01mol/L的柠檬酸缓冲液里，完全溶解，即得。
本发明的优选方案中，所述终止液为1mol/L的H2SO4溶液。
本发明的优选方案中，所述洗涤液的配制纯化水即可。
本发明的优选方案中，所述显色液为等体积酶底物A溶液和酶底物B溶液混合，现用现配。
本发明的优选方案中，所述试剂盒内包含抗原标准品和阴性对照品，其中，抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白，至1μg/mL制成；阴性对照品的配制为用样品稀释液100倍稀释不含鹅细小病毒的鹅胚尿囊液配制而成。
本发明的优选方案中，所述试剂盒内所述重组GPV VP3蛋白的制备方法所述重组GPV VP3蛋白为扬州优邦生物药品有限公司研制的重组杆状病毒GPVP3/Bac株，通过培养宿主细胞，接种重组杆状病毒GPVP3/Bac株，表达GPV VP3蛋白后分离纯化重组杆状病毒GPVVP3蛋白。
本发明的一个优选方案中，重组杆状病毒GPV VP3蛋白灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有GPV VP3蛋白的细胞培养上清，再通过超速离心和氯化铯密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的VP3蛋白。
第二方面，本发明的目的在于提供一种使用所述抗原检测试剂盒的检测方法，具体实施步骤：
(1)将待检样品用样品稀释液按梯度稀释，将其加入包被抗鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的酶标板中，每孔加100μL，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔。
(2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干。
(3)每孔加入100μL HRP标记的抗鹅细小病毒VP3单克隆抗体，37℃育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干。
(4)每孔加入100μL显色液，避光显色5～10分钟后，每孔再加入50μL终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液和酶底物A溶液等体积混匀制得，注意现配现用。
(5)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD450nm。
(6)结果计算与判定。
其中，定性结果的判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值OD450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值OD450nm/CO值，其中，样品值>1为阳性；样品值≤1为阴性；或者，定量结果的判定：以2为底OD值的对数为X轴，以2为底标准品的浓度为Y轴，利用“EXCEL”软件获得线性曲线及方程式，参考品和样品OD值的带入RelPot 4.0计算出样品的浓度。
第三方面，本发明还提供了一种鹅细小病毒VP3蛋白ELISA抗原检测试剂盒用于检测鹅群鹅细小病毒感染或者小鹅瘟疫苗产品的应用。
本发明的优选方案中，所述的样品可以来自鹅群鹅细小病毒感染或者小鹅瘟疫苗产品，即小鹅瘟病毒感染的泄殖腔拭子、细胞适应毒、新鲜组织病料、鹅胚尿囊液、GPV疫苗抗原的任一种。来自小鹅瘟感染的泄殖腔拭子或者新鲜组织病料加入800μL样品稀释液中，反复冻融2次，使用之前瞬离10s，取上清使用；细胞适应毒，反复冻融细胞，使用之前瞬离10s，取上清使用；鹅胚尿囊液或者GPV亚单位疫苗抗原直接取样检测。
本发明所述的显色液酶底物B溶液为1.7mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液；显色液酶底物A溶液含有0.016％(质量浓度)双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠溶液的浓度为10g/L，pH为5.3。
本发明所述终止液为1mol/L的H2SO4溶液。
本发明所述洗涤液的配制纯化水即可。
本发明所述抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白，至1μg/ml制成。
本发明所述阴性对照品的配制为用样品稀释液100倍稀释不含鹅细小病毒的鹅胚尿囊液配制而成。
本发明所述空白对照液为样品稀释液。
除非另有说明，本发明所述液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明所述液体与固体之间的百分比时，所述的百分比为体积/重量百分比；本发明所述固体与液体之间的百分比时，所述的百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1.本发明提供的试剂盒采用杆状病毒表达的病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白研制的多克隆抗体包被酶标板作为捕获抗体、HRP标记的抗鹅细小病毒VP3单克隆抗体做显色抗体，进而组成用双夹心法酶联免疫吸附实验检测鹅细小病毒以及鹅细小病毒VP3重组蛋白。本发明的试剂盒除具有ELISA试剂盒的优点外，低还克服了抗原空间构象问题所致的特异性低和二抗问题所致的灵敏度等缺陷，显著提高了检测的特异性、灵敏度和可信度，最低检测到抗原标准品的浓度为4ng/ml。
2.本发明试剂盒中含有抗原标准品，可以检测到样品中GPV VP3蛋白的准确含量，特别适合用于GPV VP3基因亚单位疫苗的定量检测，能够规模化生产并应用。
附图说明
图1实施例2中纯化表达的GPV VP3蛋白(VLPs)电镜图片。
图2实施例3中试剂盒的制备工艺流程图。
图3实施例3中HRP酶标记抗鹅GPV VP3单克隆抗体与制得的GPV VP3重组蛋白westernblot分析图，其中，M：预染蛋白质Marker；1：HRP标记抗GPV VP3单克隆抗体。
图4实施例6中标准品绘制的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
实施例1 VP3蛋白的大量表达
1、将重组杆状病毒GPVP3/Bac株接种昆虫细胞Sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得F2代重组杆状病毒。
2、将上述F2代重组杆状病毒以MOI＝5～10的接种量接入昆虫细胞Sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得重组VP3蛋白。
3、将鉴定正确的重组病毒以MOI＝1～10的接毒量接种Sf9细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组VP3蛋白。
实施例2 VP3蛋白的纯化
取上述实施例1表达的未灭活的重组GPV VP3蛋白上清12000rpm/min离心30min后，去除细胞碎片，取上清液装入透析袋内(分子量8000-12000)，4℃条件下使用聚乙二醇6000包埋浓缩4倍，浓缩后转移30ml离心管中，30000rpm/min。4℃离心4h，弃去上清，用少量PBS将管底沉淀悬起，4℃过夜溶解后加氯化铯溶解均匀后10℃40000rpm/min离心24h。用注射器分别吸出可见的条带，经SDS-PAGE电泳确定目的条带并鉴定纯度，，用BCA定量确定蛋白含量，并且电镜扫描分析，见图1。少量分装，-70℃保存。
实施例3 ELISA试剂盒的制备
本发明所述ELISA试剂盒的制备流程见图2，具体制备方法包括以下步骤：
A.所述抗鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：
(1)将前述纯化的GPV VP3蛋白常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1：10000以上时，采集兔血，离心取得血清。
(2)将步骤(1)制得的兔血清通过Protein A柱纯化，制得纯化的抗GPV VP3蛋白的多克隆抗体。
(3)在步骤(2)制得的抗GPV VP3蛋白的多克隆抗体中加入50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。
B.用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞的步骤：
(1)将纯化的GPV VP3蛋白测定蛋白浓度，与小鼠GPV抗体阳性血清做方阵实验，确定GPV VP3蛋白的最佳包被浓度0.5ug/ml。
(2)按照GPV VP3蛋白的最佳包被浓度0.5ug/ml，与碳酸盐包被缓冲液混匀包被后封闭待用。
(3)取杂交瘤细胞上清37℃孵育1h，设置未免疫GPV病毒小鼠血清稀释1000倍作为阴性对照。免疫GPV病毒小鼠血清1000倍作为阳性对照。1h后洗涤，孵育羊抗鼠IgG酶标二抗(按说明书稀释)后洗涤显色。
(4)阴阳性对照成立，杂交瘤细胞上清效价按降序排列，选择阳性读值高的孔号。
(5)同时用超速离心获得的GPV尿囊液和阴性尿囊液分别包被板子，与上面方法其他步骤一致，在阴阳性对照成立的情况下，记录能与GPV全病毒反应，不与阴性尿囊液反应的孔号。
(6)记录与纯化的GPV VP3蛋白以及全病毒均反应，不与阴性尿囊液反应的孔号为候选孔。
C.用westernblot方法验证阳性杂交瘤细胞的步骤：
(1)将纯化的GPV VP3蛋白进行电泳，转印到NC膜上，按照泳道剪成条分别放置在皿内，进行封闭洗涤后待用。
(2)分别加入候选杂交瘤细胞上清，孵育后洗去，加入羊抗鼠IgG酶标二抗，洗涤后用沉淀型TMB显色。
(3)阴阳性成立条件下，记录在60KDa处出现条带的孔号为候选孔，结果如图3所示。
D.辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鹅细小病毒VP3蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：
(1)将鹅细小病毒鹅胚尿囊液超速离心取沉淀，用原体积的1/100的磷酸盐缓冲液溶解沉淀。与弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1：10000以上时，取脾细胞与SP2/0细胞以108：1.6×107的比例融合，用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法和westernblot进行阳性杂交瘤细胞的筛选，将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及分泌的抗GPV VP3蛋白的单克隆抗体。
(2)将步骤(1)的单抗细胞注射致敏过的Balb/c小鼠体内制备腹水，ProteinG柱纯化，得到纯化的抗GPV VP3蛋白的单克隆抗体，测定蛋白浓度。
(3)用改良的过碘酸钠氧化法对步骤(2)的制得的纯化的抗GPV VP3蛋白的单克隆抗体进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗GPV VP3蛋白的单克隆抗体。
(4)制得辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗GPV VP3蛋白的单克隆抗体与等体积的中性甘油混匀，测定工作浓度后，-20℃保存备用。
E.酶标板孔均匀包被抗GPV VP3蛋白的多克隆抗体，包被量为0.01ug-5ug/孔，包被缓冲液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，PH9.6，即1L溶液中含1.59g。
F.封闭液为质量浓度为1-10％的BSA或脱脂乳牛奶的仍以中或组合。
G.试剂盒中其他溶液的配制：
①样品稀释液：现配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，121℃20min高压灭菌冷却后加入0.1-10％BSA和含有0.01-1％ProClin 300，即得；
②洗涤液：配置的纯化水即可；
③酶底物A溶液含有0.016％(质量浓度)双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其配制称取乙酸钠10g溶于1L纯化水，用乙酸调pH为5.3，再加入540μL浓度为30％H2O2；
④酶底物B溶液为1.7mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB·HCl)溶液，其配制称取0.47gTMB·HCl加入到1L pH为3.0的0.01mol/L的柠檬酸缓冲液里，完全溶解；
⑤显色液，用酶底物B溶液和A溶液1:1现配现用的得；
⑥终止液：取54.3ml浓度为95％浓硫酸，加蒸馏水至1000ml，为1mol/L的H2SO4溶液，即得；
⑦抗原标准品：本发明所述抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白，至1μg/ml制成；
⑧阴性对照液：样品稀释液100倍稀释不含鹅细小病毒的鹅胚尿囊液配制而成；
⑨本发明所述空白对照液为样品稀释液。
实施例4 ELISA试剂盒定量检测疫苗抗原中所含VP3蛋白
(1)用包被缓冲液稀释纯化的捕获抗体兔抗GPV VP3蛋白多抗至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，洗涤3次甩干。
(2)上述酶标孔内加入1％BSA的PBST封闭液，每孔200μl，4℃过夜封闭，洗涤3次吹干，加干燥剂密封避光置于2-8℃保存。
(3)上述酶标孔内加入不同稀释度的抗原标准品和不同稀释度的待检样品，例如将待检试样用样品稀释液1:100稀释，每孔加100μL，同时设置阳性对照组，阴性对照组和空白对照组，其中阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔。37℃孵育1h，洗涤3次甩干。
(4)上述酶标孔内每孔加入检测抗体-HRP标记的抗GPV VP3蛋白的单克隆抗体，37℃孵育1h，洗涤3次甩干。
(5)显色液底物A液和底物A液等体积混匀，加入上述酶标孔100μl/孔，37℃显色5-10min。加入终止液50μl/孔。
(6)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD450nm。
定量结果的判定：以2为底OD值的对数为X轴，以2为底标准品的浓度为Y轴，获得线性曲线及方程式log2Y＝1.6399log2X-2.0273(R2＝0.9882、X：OD450nm平均值、Y：浓度)，将标准品和样品OD值带入RelPot 4.0计算出样品的浓度。
表1不同浓度的抗原标准品使用试剂盒检测结果
实施例5 ELISA试剂盒定量检测不同感染复数疫苗抗原中所含VP3蛋白
制备疫苗抗原时，使用3种不同MOI(0.01，0.1，1)接种，不同时间VP3蛋白通过ELISA定量检测。使用3种不同MOI(0.01，0.1，1)接种表达GPV VP3的重组杆状病毒，分别于接种后7-11天取样定量分析培养上清中的目的蛋白含量，结果见表2。
表2不同感染复数接种两种病毒蛋白表达量(μg/ml)分析
由VP3蛋白定量结果表明，使用生物反应器无血清悬浮培养表达GPV VP3蛋白，在最适MOI(MOI＝0.1)下，其表达量可达113ug/ml。在接种重组杆状病毒后9天达到最大值，即可收获。
实施例6特异性检测
按照实施例4所述的检测方法，利用实施例3制得的试剂盒分别检测小鹅瘟感染的尿囊液、ND感染的尿囊液、ALV H9感染的尿囊液、阴性尿囊液、杆状病毒GPV VP3蛋白表达液、杆状病毒其他蛋白表达液
将待检样品用稀释液1：100稀释后，每个稀释度加入包被兔抗GPV VP3蛋白多抗的酶标板孔内，各3孔，每孔100μl。同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。其中，阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔，检测结果见表3。
表3本发明试剂盒的特异性检测结果
由表3可见小鹅瘟感染的尿囊液为阳性，杆状病毒表达的GPV VP3蛋白为阳性；其他为阴性，可见本试剂盒可以特异性区分小鹅瘟、ND、ALV、H9、FAdV 4c、FAdV 8b。
实施例7灵敏度检测
按照实施例3所述的检测方法，利用实施例2制得的试剂盒检测不同稀释度的抗原标准品。
抗原标准品用样品稀释液稀释至原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列加入包被兔抗GPV VP3蛋白多抗的酶标板孔内，各3孔，每孔100μl。阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。检测结果见表4。
表4不同稀释度的抗原标准品检测结果
由表4可见，本发明的试剂盒的最低检测到抗原标准品的浓度为0.004ug/ml。
实施例8 ELISA试剂盒检测不同ELD50/0.2ml的小鹅瘟阳性尿囊液
按照实施例4所述的检测方法，利用实施例3制得的试剂盒检测不同ELD50/0.2ml的小鹅瘟阳性尿囊液。检验鹅胚阳性尿囊液使用3种不同102.0ELD50/0.2ml、104.0ELD50/0.2ml、106.0ELD50/0.2ml。鹅胚阳性尿囊液用样品稀释液稀释至原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128系列加入包被兔抗GPV VP3蛋白多抗的酶标板孔内，各3孔，每孔100μl。阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。检测结果见表5。
表5本发明试剂盒检测不同ELD50/0.2ml鹅胚尿囊液的结果
由表5可见，102.0ELD50/0.2ml、104.0ELD50/0.2ml、106.0ELD50/0.2ml三个梯度的鹅胚阳性尿囊液通过本发明测得数据存在极显著的正相关。ELD50/0.2ml越高，检测结果越高。不同ELD50/0.2ml的鹅胚阳性尿囊液的倍比稀释后测的结果有差异。总而言之，毒价在7812ELD50/0.2ml以上的GPV抗原可以被本发明试剂盒测出阳性。
对比例两种鹅细小病毒VP3蛋白ELISA检测试剂盒的比较研究
1、鹅细小病毒VP3蛋白ELISA抗原检测双单抗夹心试剂盒的制备：
(1)用包被缓冲液稀释纯化的捕获抗体抗GPV VP3蛋白单克隆抗体(与HRP标记的GPV VP3蛋白的单克隆抗体克隆号不同)至合适浓度0.01μg-0.5μg/ml。
(2)其他试剂的制备同实施例3和步骤同实施例4
2、本发明试剂盒与双单抗检测试剂盒的比较实验
将待检样品用稀释液1：100稀释后，加入包被兔抗GPV VP3蛋白多抗(或者抗GPVVP3蛋白单克隆抗体)的酶标板孔内，各3孔，每孔100μl。同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。其中，阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔。
从表6中可以看出本发明的试剂盒较双单抗检测试剂盒的样品检测OD450nm较高，可信度及灵敏度较强，更利于检测判断。
表6本发明试剂盒与双单抗试剂盒检测结果比较
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种鹅细小病毒VP3蛋白抗原ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗鹅细小病毒VP3单克隆抗体、洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液以及终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒(VLPs)的鹅细小病毒VP3蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的包被量为0.01μg-0.5μg/孔。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的牛血清白蛋白(BSA)或质量浓度为1-10％的脱脂奶粉的任一或其组合。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，样品稀释液由质量浓度为0.1-10％BSA和含有0.01-1％ProClin 300的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶底物A溶液含有质量浓度为0.016％的双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠溶液的浓度为10g/L，pH为5.3；所述酶底物B溶液为1.7mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液；所述终止液为1mol/L的H2SO4溶液。
6.一种使用权利要求1-5任一所述的试剂盒检测鹅细小病毒VP3蛋白抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待检样品用样品稀释液按梯度稀释，将其加入包被抗鹅细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体的酶标板中，每孔加100μL，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中阳性对照组加入原液、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128系列稀释的抗原标准品各100μL，阴性对照组加入100μL阴性对照液，空白对照组加入100μL样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；
(2)加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干；
(3)每孔加入100μL HRP标记的抗鹅细小病毒VP3单克隆抗体，37℃育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干；
(4)每孔加入100μL显色液，避光显色5-10分钟后，每孔再加入50μL终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液和酶底物A溶液等体积混匀制得；
(5)将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD450nm；
(6)结果计算与判定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)包括定性结果或定量结果的判定，其中所述定性结果的判定：Cut off(CO值)＝阴性对照光吸收值OD450nm×2.1倍，样品值＝样品光吸收值OD450nm/CO值，其中，样品值>1为阳性；样品值≤1为阴性；或者，定量结果的判定：以线性曲线及方程式计算样品浓度。
8.权利要求1-5任一所述试剂盒在检测鹅细小病毒感染或者小鹅瘟疫苗产品的应用。
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