CN107727854A - 一种鸡传染性支气管炎病毒蛋白芯片抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种鸡传染性支气管炎病毒蛋白芯片抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鸡传染性支气管炎病毒蛋白芯片抗体检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括：(1)用重组表达的IBV非结构蛋白5制备的IBV nsp5蛋白芯片；(2)用抗体稀释液稀释的IgY酶标抗体溶液；(3)20×TBST浓缩洗涤液；(4)血清稀释液；(5)阳性对照样品：抗IBV nsp5鸡血清；(6)阴性对照样品：阴性SPF鸡血清；(7)底物化学发光液：化学发光液A和发光底物液B；(8)TMB显色液。本发明提供的IBV蛋白芯片抗体检测试剂盒，以非结构蛋白nsp5作为抗原，可提供具有与进口商品化试剂盒高符合率的特性，而且成本大大降低，检测更加快速、敏感性更高、操作简便。

Description

一种鸡传染性支气管炎病毒蛋白芯片抗体检测试剂盒及其 应用
技术领域
本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及一种鸡传染性支气管炎病毒蛋白芯片抗体检测试剂盒的开发及其应用。
背景技术
鸡的传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis Virus,IBV)引起的鸡急性、高度接触性的呼吸道和生殖道传染病。鸡传染性支气管炎病毒具有多种血清型和多组织嗜性，自1931年最早报道呼吸型IB以来，随后报道了肾型、肠型、生殖道型、腺胃型等传染性支气管炎，至今已经报道的血清型达30余种，近年来新的血清型和变异株仍不断出现，并且各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用，给本病的防治带来很大的困难，给养殖业带来巨大的损失，该病是全世界广泛流行的对养鸡业危害最严重的呼吸道传染病之一。
疫苗免疫是预防和控制IB发生的最有效方法，而免疫后抗体水平的高低反映实际的疫苗免疫效果，直接关系到免疫鸡群对鸡传染性支气管炎病毒的抵抗力。因此，快速、准确地诊断IB，检测鸡群中抗体水平，对于了解鸡群中IB的流行情况、适时调整免疫程序，有效防制IB都有至关重要的作用。在IBV抗体检测方面，酶联免疫吸附试验(ELISA)由于其简单、快速、敏感、经济和适于大规模使用的特点在临床上得到广泛应用。然而，仅有美国IDEXX公司生产的商品化试剂盒比较稳定可靠，主要用于国内大型养鸡场中IBV抗体水平的抽检以及研发部门开发同类型新产品的比对试验。由于进口试剂比较昂贵，限制了该试剂盒在国内的广泛使用。本研究将开展的蛋白芯片抗体检测技术，具有敏感性高、特异性强、检测方法快速、价格便宜等特点。
IBV非结构蛋白相对于结构蛋白的基因序列具有较高的保守性，涉及抗原表位的突变概率较低。所以利用IBV非结构蛋白作为抗原检测IBV血清抗体，具有对不同血清型，或者不同组织嗜性的毒株均有通用性的潜力。非结构蛋白5(nsp5)是一种蛋白水解酶，具有高度的保守性，其在多聚蛋白pp1a和pp1ab的水解中非常重要，也被叫做主要蛋白酶Mpro。前期，本实验室已经建立了以IBV nsp5为抗原的ELISA抗体诊断方法。然而，基于iPDMS(initiator integrated poly(dimethysiloxane),iPDMS)为蛋白芯片膜，进行IBV抗体检测的诊断方法还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，为临床鸡的传染性支气管炎(Infectious bronchitis,IB)的诊断和抗体水平的检测提供经济实用可靠的检测工具。
本发明的另一目的在于提供一种非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法。
为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
一种鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：
(1)用重组表达的IBV非结构蛋白5制备的IBV nsp5蛋白芯片；
(2)用抗体稀释液稀释的IgY酶标抗体溶液，所述的IgY酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY抗体；
(3)20×TBST浓缩洗涤液：终体积百分含量为0.05％(v/v)Tween-20的TBS，pH7.4；
(4)血清稀释液：含1％(v/v)犊牛血清，1％(g/100ml)酪蛋白，0.5％(g/100ml)蔗糖,0.2％(g/100ml)聚乙烯吡咯烷酮和0.5％(v/v)Tween-20的0.01M PBS，pH7.4；
(5)阳性对照样品：抗IBV nsp5鸡血清；
(6)阴性对照样品：阴性SPF鸡血清；
(7)底物化学发光液：化学发光液A和发光底物液B；
(8)TMB显色液。
上述的鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，其在于，用所述重组表达的IBV非结构蛋白5制备IBV nsp5蛋白芯片的过程为：将重组的IBV nsp5蛋白按1mg/mL的量溶解在含有30％(v/v)乙腈的水溶液中，然后用点样缓冲液稀释抗原至工作浓度，点样仪点样到常规膜或者白膜，制备IBV nsp5蛋白芯片，真空干燥包装，4℃保存备用；所述的常规膜为iPDMS常规膜。所述的点样缓冲液为：0.3M PB,0.2％(v/v)甘油,0.01％(v/v)Triton和1.5％(g/100ml)甘露醇。
上述的鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，其在于，采用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.2mg/mL；采用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.1mg/mL。
上述的鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，其在于，所述的抗体稀释液为0.2MPBS缓冲液，pH 7.4；所述IgY酶标抗体溶液的稀释倍数1:20000或1:2000。
上述的试剂盒在鸡传染性支气管炎抗体检测中的应用。
一种非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法，包括如下步骤：
(1)IBV nsp5蛋白芯片的制备：将重组的IBV nsp5蛋白按1mg/mL的量溶解在含有30％(v/v)乙腈的水溶液中，然后用点样缓冲液稀释抗原至工作浓度，点样仪点样到常规膜或者白膜，制备IBV nsp5蛋白芯片，真空干燥包装，4℃保存备用；所述的常规膜为iPDMS常规膜；
(2)IBV nsp5蛋白芯片的润洗：用洗涤液润洗后，弃掉洗涤液；
(3)待检血清孵育：
用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片：加入100μl/孔用血清稀释液以600倍稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照；37℃，500rpm，震荡孵育1h，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片：加入100μl/孔用血清稀释液以100倍稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照；37℃，500rpm，震荡孵育5min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
(4)二抗孵育：
用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片：二抗最终使用浓度为1:20000，每孔加入100μl抗体稀释液稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY二抗，37℃，500rpm，震荡孵育30min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片：二抗最终使用浓度为1:2000，每孔加入100μl抗体稀释液稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY二抗，37℃，500rpm，震荡孵育5min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
(6)化学发光：对于常规膜制备的IBV nsp5蛋白芯片，每孔加入15μl等比例混合的化学发光液A和发光底物液B，利用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪采集发光信号；
显色：对于白膜制备的IBV nsp5蛋白芯片，每孔加入50μl TMB显色液，显色5分钟后，弃显色液，洗涤液冲洗干净，肉眼观察检测结果；
(7)结果判定：
常规膜化学发光法：利用GenePix Pro 6.0软件采集每个点的化学发光强度，并计算其信噪比值(SNR)；信噪比的计算公式为：SNR＝(待测样品化学发光强度—阴性质控化学发光强度)/阴性质控化学发光强度；若SNR≥2则判为阳性，反之则为阴性；
白膜显色法：用肉眼观察显色情况，除了阳性质控点为蓝色外，其它点如果显色，则判断为阳性，如果没有显色则判断为阴性，如果显色但颜色很淡，则判断为弱阳。
上述的非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法，其步骤(1)中采用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.2mg/mL；采用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.1mg/mL。
上述的非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法，其在于：利用AmershamImager 600超灵敏多功能成像仪采集发光信号时的曝光时间为2min。
上述的非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法，其中的试剂配方为：
所述的点样缓冲液为：0.3M PB,0.2％(v/v)甘油,0.01％(v/v)Triton和1.5％(g/100ml)甘露醇。
所述的洗涤液为含0.05％(v/v)Tween-20的TBS；
所述的血清稀释液为含1％(v/v)犊牛血清，1％(g/100ml)酪蛋白，0.5％(g/100ml)蔗糖,0.2％(g/100ml)聚乙烯吡咯烷酮和0.5％(v/v)Tween-20的0.01M PBS，pH7.4；
所述的抗体稀释液为0.2M PBS缓冲液，pH 7.4。
本发明所述IBV nsp5的蛋白芯片抗体检测试剂盒的最优选技术方案为：
(1)用重组表达的IBV非结构蛋白5(nsp5)制备的48孔蛋白芯片反应板，五块常规膜，或五块白膜；
(2)用抗体稀释液(0.2M PBS缓冲液，pH 7.4)稀释的IgY酶标抗体溶液(1:20000或1:2000倍稀释)，体积分别为10mL。所述酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgY抗体；
(3)20×TBST浓缩洗涤液：终体积百分含量为0.05％Tween-20的TBS，pH7.4，体积200mL；
(4)血清稀释液：(含1％犊牛血清,1％酪蛋白,0.5％蔗糖,0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.5％Tween-20的0.01M PBS)，pH7.4，体积200mL；
(5)阳性对照样品：抗IBV nsp5鸡血清，体积0.5mL；
(6)阴性对照样品：阴性SPF鸡血清，体积0.5mL；
(7)底物化学发光液，化学发光液A，发光底物液B，各体积2mL；
(8)TMB显色液，体积3.5mL；
上述试剂盒的使用方法，最优选技术方案包括以下步骤：
(1)IBV nsp5蛋白芯片的制备：
重组的IBV nsp5蛋白经BCA蛋白检测试剂盒测定浓度后，-20℃保存备用；在十万级洁净的房间进行蛋白微阵点样。将重组的IBV nsp5蛋白按1mg/mL的量溶解在含有30％乙腈水溶液中，然后用点样缓冲液(0.3M PB,0.2％甘油,0.01％Triton和1.5％甘露醇)稀释抗原至工作浓度，点样到iPDMS常规膜或者白膜。制备48孔蛋白芯片，真空干燥包装，4℃保存备用；采用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.2mg/mL；采用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.1mg/mL。
(2)IBV nsp5蛋白芯片的润洗：用洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
(3)待检血清孵育：
用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片：加入100μl/孔用血清稀释液以600倍稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照。37℃，500rpm，震荡孵育1h，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片：加入100μl/孔用稀释液以100倍稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照。37℃，500rpm，震荡孵育5min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
(4)二抗孵育：
用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片：二抗最终使用浓度为1:20000，每孔加入100μl用0.2M PBS缓冲液(pH 7.4)稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY二抗，37℃，500rpm，震荡孵育30min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液
用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片：二抗最终使用浓度为1:2000。每孔加入100μl用0.2M PBS缓冲液(pH 7.4)稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY二抗，37℃，500rpm，震荡孵育5min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
(6)化学发光：对于常规膜制备的IBV nsp5蛋白芯片，每孔加入15ul等比例混合的化学发光液A和发光底物B(Thermo产品)，利用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪采集发光信号。
显色：对于白膜制备的IBV nsp5蛋白芯片，每孔加入50ul TMB显色液，显色5分钟后，弃显色液，洗涤液冲洗干净，肉眼观察检测结果。
(7)结果判定：
常规膜化学发光法：利用GenePix Pro 6.0软件采集每个点的化学发光强度，并计算其信噪比值(SNR)。信噪比的计算公式为：SNR＝(待测样品化学发光强度-阴性质控化学发光强度)/阴性质控化学发光强度。若SNR≥2则判为阳性，反之则为阴性。
白膜显色法：用肉眼观察显色情况，除了阳性质控点为蓝色外，其它点如果显色，则判断为阳性，如果没有显色则判断为阴性，如果显色但颜色很淡，则判断为弱阳。
本发明所提供的试剂盒：1.范围广谱，针对所有的IBV血清型都能反应。2.检测敏感性高、特异性和重复性好。3.试剂盒检测样本的价格便宜。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的IBV蛋白芯片抗体检测试剂盒，以非结构蛋白nsp5作为抗原，可提供具有与进口商品化试剂盒高符合率的特性，而且成本大大降低，检测更加快速、敏感性更高、操作简便。
本研究是国内外首次用IBV非结构蛋白作为抗原组装的蛋白芯片抗体检测试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染IBV、监测鸡群的免疫状态或雏鸡母源抗体水平。为临床上IBV大规模抗体监测、流行病学调查以及IB的防控提供了一种新的有效的检测手段。
附图说明
图1最佳点样浓度的优化
其中，a不同包被抗原浓度的SNR值；b不同包被抗原浓度的P/N值
图2血清稀释倍数的优化
其中，a不同血清稀释浓度的SNR值；b不同血清稀释浓度的P/N值
图3检测临界值的确定
具体实施方式
下面结合实施例和附图作进一步说明。应该理解这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[实施例1]抗原的制备
IBV nsp5的基因经RT-PCR方法扩增获得后，将其克隆到原核表达载体pEGX-4T-1中，转化大肠杆菌；筛选携带IBV nsp5基因的重组菌，在IPTG诱导下大量表达与GST融合的nsp5重组蛋白；利用GSTrap FF亲和层析柱纯化，获得提纯后的IBV nsp5重组蛋白，洗脱后获得的蛋白取样进行SDS-PAGE分析。纯化的重组蛋白GST-nsp5分子量大小为60KD，具有很高的纯度。保存于-20℃备用。(鸡传染性支气管炎病毒nsp5ELISA抗体检测试剂盒及其应用。国家发明专利申请号：201610239101.3，申请公布号：CN 105785049 A，申请公布日：2016.07.20)
[实施例2]阴阳性血清的制备和筛选
1.IBV nsp5阴阳性血清的制备
取3月龄SPF鸡4只，随机平均分成两组，其中两只用实施例1制备的纯化的GST-nsp5蛋白进行免疫，制备阳性血清；另外两只作为阴性对照。具体免疫过程如下：
将纯化的GST-nsp5蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，按照1mg/只的剂量在鸡颈部皮下进行首免。之后，每间隔两周，取与首免等量的GST-nsp5蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后，进行二免和三免。三免后10天用nsp5-ELISA测定血清抗体水平，达到要求后颈动脉放血，收集的血液于37℃放置1h或4℃静置过夜，3000rpm离心10min分离血清，分装后-70℃保存，即为IBV-nsp5阳性血清。阴性组鸡，采取同样的方法采血，分离血清，用nsp5-ELISA验证为IBV-nsp5抗体阴性后，分装-70℃保存，即为IBV-nsp5阴性血清。
2.临床血清的筛选
用IDEXX的传染性支气管炎抗体检测试剂盒筛选临床IBV阳性和阴性血清样品。具体做法完全按照试剂盒操作说明书进行。结果184份临床血清中142份为IBV阳性，42份为IBV阴性。
[实施例3]IBV蛋白芯片检测条件的优化
1.IBV蛋白芯片反应的基本程序
(1)蛋白芯片的制备：
重组的IBV nsp5蛋白经BCA蛋白检测试剂盒测定浓度后，-20℃保存备用，在十万级洁净的房间进行蛋白微阵点样。将重组的IBV nsp5蛋白按1mg/mL的量溶解在含有30％(v/v)乙腈水溶液中，然后用点样缓冲液稀释抗原至工作浓度，点样到iPDMS常规膜或者白膜。制备48孔蛋白芯片。真空干燥包装，4℃保存备用；
所述的点样缓冲液为：0.3M PB,0.2％(v/v)甘油,0.01％(v/v)Triton和1.5％(g/100ml)甘露醇。
(2)IBV nsp5蛋白芯片板从4℃取出放置室温，用洗涤液润洗3次；
所述的洗涤液为含0.05％(v/v)Tween-20的TBS，即TBST。
(3)待检血清孵育：
对于用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片：加入100μl/孔用血清稀释液以600倍稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照。37℃，500rpm，震荡孵育1h，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
对于用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片：加入100μl/孔用血清稀释液以100倍稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照。37℃，500rpm，震荡孵育5min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
所述的血清稀释液为含1％(v/v)犊牛血清，1％(g/100ml)酪蛋白，0.5％(g/100ml)蔗糖,0.2％(g/100ml)聚乙烯吡咯烷酮和0.5％(v/v)Tween-20的0.01M PBS，pH7.4；
(4)二抗孵育：
对于用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片：二抗最终使用浓度为1:20000，每孔加入100μl 0.2M PBS缓冲液(PH7.4)稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY二抗，37℃，500rpm，震荡孵育30min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
对于用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片：二抗最终使用浓度为1:2000，每孔加入100μl0.2M PBS缓冲液(PH7.4)稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY二抗，37℃，500rpm，震荡孵育5min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
(5)化学发光：
对于常规膜制备的IBV nsp5蛋白芯片：每孔加入15μl等比例混合的化学发光液A和发光底物液B(Thermo产品)，利用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪采集发光信号。
显色：对于白膜制备的IBV nsp5蛋白芯片，每孔加入50ul TMB显色液，显色5分钟后，弃显色液，洗涤液冲洗干净，肉眼观察检测结果。
(6)结果判定：
常规膜化学发光法：利用GenePix Pro 6.0软件采集每个点的化学发光强度，并计算其信噪比值(SNR)。信噪比的计算公式为：SNR＝(待测样品化学发光强度-阴性质控化学发光强度)/阴性质控化学发光强度。若SNR≥2则判为阳性，反之则为阴性。
白膜显色法：用肉眼观察显色情况，除了三个阳性质控点为蓝色外，其它点如果显色，则判断为阳性，如果没有显色则判断为阴性，如果显色但颜色很淡，则判断为弱阳。
2.IBV蛋白芯片常规膜反应条件的优化
以上述的基本程序为基础，对IBV nsp5蛋白芯片的反应条件进行优化。
(1)常规膜蛋白点样浓度和血清稀释倍数的选择
在48孔蛋白芯片反应板上采用方阵法优化，蛋白芯片每个孔内分别点0.4mg/mL，0.2mg/mL，0.1mg/mL和0.05mg/mL的IBV nsp5蛋白，48孔板纵排分别将阳性和阴性血清作1:300、1:600、1:1200、1:2400、1:4800和1:9600稀释。蛋白芯片反应后采集发光信号，分析数据，选取P/N值最大为优化的最终条件。经分析，当抗原包被浓度为0.2μg/mL，待检血清稀释倍数为1:600时，P/N值最大。
(2)常规膜酶标抗体工作浓度的选择
在确定的最佳抗原点样浓度和血清稀释倍数基础上，将酶标二抗分别作1:2000、1:20000、1:40000稀释，进行酶标抗体浓度优化，选择P/N值最大的酶标抗体稀释倍数为最佳工作浓度。当酶标抗体稀释倍数为1:20000，P/N值最大。
(3)常规膜读取数据曝光时间的选择
加入化学发光显色液后，利用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪采集发光信号，分别选取不同的曝光时间30s、1min、2min、3min，采集发光信号,并对不同曝光时间的发光强度进行数据处理，选择背景值低于3000且阴性样品SNR值小于2的曝光时间为最佳曝光时间。
因此，最终确定的最佳反应条件为：抗原包被浓度为0.2mg/mL，待检血清稀释倍数为1:600，酶标抗体稀释倍数为1:20000；待检血清和酶标二抗反应时间分别为60min和30min，曝光时间为2min。
(4)白膜蛋白芯片点样浓度、血清稀释倍数、二抗稀释倍数的选择
根据常规膜的优化条件，在48孔蛋白芯片反应板上采用方阵法优化白膜的点样浓度、血清稀释倍数、二抗稀释浓度，蛋白芯片每个孔内分别点0.4mg/mL，0.2mg/mL，0.1mg/mL的IBV nsp5蛋白，48孔板纵排分别将阳性和阴性血清作1:20、1:50、1:100、1:200稀释，酶标二抗稀释倍数分别为1:2000和1:10000。蛋白芯片反应后，肉眼观察并分析，当抗原包被浓度为0.1mg/mL、待检血清稀释倍数为1:100、酶标二抗稀释倍数为1:2000时，观察效果最好。
[实施例4]常规膜蛋白芯片检测临界值的确定
用优化的蛋白芯片反应体系对经IDEXX公司的IBV试剂盒检测的184份临床样本进行检测，并利用GenePix Pro 6.0软件对结果进行分析，分别计算各份血清的SNR值，找到蛋白芯片检测结果和IDEXX-IBV试剂盒的阴、阳性检测结果最大程度符合的临界点(SNR值)，以此作为蛋白芯片检测方法阴、阳性判定的临界标准。
184份血清样品的蛋白芯片检测结果如图1所示。IDEXX-IBV试剂盒检测为IBV阳性血清(142份)的蛋白芯片的SNR值在1.82-23.59之间；IDEXX-IBV试剂盒检测为IBV阴性血清(42份)的蛋白芯片的SNR值在0.01-1.964之间。当取SNR＝2时，蛋白芯片方法相对于IDEXX-IBV试剂盒的敏感性、特异性和准确性分别为98.59％、100％和98.91％(表1)。综合考虑两者的符合度，取2作为阴、阳性血清的临界值最理想。即当某一血清样品经IBV-nsp5蛋白芯片检测的SNR值大于等于2则判为IBV抗体阳性，反之则判为阴性。
表1蛋白芯片方法与IDEXX-IBV试剂盒的敏感性符合率、特异性和准确性的符合率
临界值SNR 敏感性％ 特异性％ 准确性％
>1.940 98.59 95.24 98.91
>1.962 98.59 97.62 98.91
>2 98.59 100 98.91
>2.635 97.89 100 98.3
[实施例5]重复性试验
1.批内重复性试验
用同一批次纯化的GST-nsp5蛋白制备的蛋白芯片分别检测10份阳性血清和5份阴性血清，重复试验3次。对于常规膜，分别计算每个样品的SNR值的平均值(X)、标准差(SD)和变异系数(CV)，确定nsp5蛋白芯片同批抗原的变异系数范围。同批抗原检测的10份血清和5份阴性血清的SNR值变异系数界于0.8-18.63％之间(表2)，表明抗原的批内重复性较好。对于白膜，肉眼观察，试验结果与提供的阳性血清和阴性血清的背景完全相符。
表2同一批抗原包被板批内重复性试验
2.批间重复性试验
用不同批次纯化的GST-nsp5蛋白制备蛋白芯片，对上述10份阳性血清和5份阴性血清进行3次重复试验。对于常规膜，分别计算每个样品的SNR值的平均值(X)、标准差(SD)和变异系数(CV)，确定nsp5蛋白芯片不同批次抗原的变异系数范围。不同批次抗原检测的10份血清和5份阴性血清的S/P值变异系数界于1.89％-18.01％之间(表3)，表明抗原的批间重复性好。对于白膜，肉眼观察，试验结果与提供的阳性血清和阴性血清的背景完全相符。
表3不同批抗原包被板批间重复性试验
[实施例6]IBV nsp5蛋白芯片方法的特异性
分别将鸡新城疫病毒(NDV)阳性血清，禽流感病毒(AIV)阳性血清和传染性法氏囊病毒(IBDV)阳性血清作最佳稀释，进行蛋白芯片检测，同时设立IBV阳性和阴性血清对照，以此确定IBV蛋白芯片的特异性。对于常规膜，检测结果显示上述血清的SNR值均小于2，结果均为阴性，表明重组抗原与上述血清不存在交叉反应，具有较好的特异性。对于白膜检测结果，上述血清均没有显色，而阴阳性对照成立。
[实施例7]IBV nsp5蛋白芯片试剂盒有效性验证
取126份临床血清样品，分别用IBV nsp5蛋白芯片方法和nsp5ELISA试剂盒(鸡传染性支气管炎病毒nsp5ELISA抗体检测试剂盒及其应用.国家发明专利申请号：201610239101.3，申请公布号：CN 105785049 A，申请公布日：2016.07.20)平行检测，比较IBV nsp5蛋白芯片与nsp5ELISA试剂盒的敏感性、特异性和符合率。nsp5ELISA试剂盒检测方法参照其说明书进行。结果表明：对于常规膜，IBV nsp5蛋白芯片的阳性检出率为96.77％(180/186)，阴性检出率3.22％(6/186)；而nsp5ELISA试剂盒的阳性检出率为91.40％(170/186)，阴性检出率为8.6％(16/186)；对于白膜，IBV nsp5蛋白芯片的阳性检出率为90.32％(168/186)，阴性检出率9.68％(18/186)；以上数据表明，本研究所建立的IBV nsp5化学发光法蛋白芯片比nsp5ELISA具有更高的敏感性，可视化快速检测具有较高的敏感性和特异性，且可在15分钟内完成。而相对于用纯化的病毒粒子作为包被抗原的IDEXX试剂盒，本研究所建立的IBV nsp5蛋白芯片使用在大肠杆菌中重组表达的蛋白作为包被抗原更为经济和实用。

Claims (9)

1.一种鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：
(1)用重组表达的IBV非结构蛋白5制备的IBV nsp5蛋白芯片；
(2)用抗体稀释液稀释的IgY酶标抗体溶液，所述的IgY酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY抗体；
(3)20×TBST浓缩洗涤液：终体积百分含量为0.05％Tween-20的TBS，pH7.4；
(4)血清稀释液：含1％犊牛血清，1％酪蛋白，0.5％蔗糖,0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.5％Tween-20的0.01M PBS，pH7.4；
(5)阳性对照样品：抗IBV nsp5鸡血清；
(6)阴性对照样品：阴性SPF鸡血清；
(7)底物化学发光液：化学发光液A和发光底物液B；
(8)TMB显色液。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，其特征在于：用所述重组表达的IBV非结构蛋白5制备IBV nsp5蛋白芯片的过程为：将重组的IBV nsp5蛋白按1mg/mL的量溶解在含有30％乙腈的水溶液中，然后用点样缓冲液稀释抗原至工作浓度，点样仪点样到常规膜或者白膜，制备IBV nsp5蛋白芯片；
所述的点样缓冲液为：0.3M PB,0.2％甘油,0.01％Triton和1.5％甘露醇。
3.根据权利要求2所述的鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，其特征在于：采用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.2mg/mL；采用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的抗体稀释液为0.2M PBS缓冲液，pH 7.4；所述IgY酶标抗体溶液的稀释倍数1:20000或1:2000。
5.权利要求1～4中任一所述的试剂盒在鸡传染性支气管炎抗体检测中的应用。
6.一种非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)IBV nsp5蛋白芯片的制备：将重组的IBV nsp5蛋白按1mg/mL的量溶解在含有30％乙腈的水溶液中，然后用点样缓冲液稀释抗原至工作浓度，点样仪点样到常规膜或者白膜，制备IBV nsp5蛋白芯片；
(2)IBV nsp5蛋白芯片的润洗：用洗涤液润洗后，弃掉洗涤液；
(3)待检血清孵育：
用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片：加入100μl/孔用血清稀释液以600倍稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照；37℃，500rpm，震荡孵育1h，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片：加入100μl/孔用血清稀释液以100倍稀释的待检血清，同时设置阳性和阴性血清对照；37℃，500rpm，震荡孵育5min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
(4)二抗孵育：
用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片：二抗最终使用浓度为1:20000，每孔加入100μl抗体稀释液稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY二抗，37℃，500rpm，震荡孵育30min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片：二抗最终使用浓度为1:2000，每孔加入100μl抗体稀释液稀释的HRP标记的羊抗鸡IgY二抗，37℃，500rpm，震荡孵育5min，洗涤液润洗3次后，弃掉洗涤液；
(6)化学发光：对于常规膜制备的IBV nsp5蛋白芯片，每孔加入15μl等比例混合的化学发光液A和发光底物液B，利用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪采集发光信号；
显色：对于白膜制备的IBV nsp5蛋白芯片，每孔加入50μl TMB显色液，显色5分钟后，弃显色液，洗涤液冲洗干净，肉眼观察检测结果；
(7)结果判定：
常规膜化学发光法：利用GenePix Pro 6.0软件采集每个点的化学发光强度，并计算其信噪比值(SNR)；信噪比的计算公式为：SNR＝(待测样品化学发光强度—阴性质控化学发光强度)/阴性质控化学发光强度；若SNR≥2则判为阳性，反之则为阴性；
白膜显色法：用肉眼观察显色情况，除了阳性质控点为蓝色外，其它点如果显色，则判断为阳性，如果没有显色则判断为阴性，如果显色但颜色很淡，则判断为弱阳。
7.根据权利要求6所述的非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法，其特征在于：步骤(1)中采用常规膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.2mg/mL；采用白膜制备IBV nsp5蛋白芯片时，所述抗原的工作浓度为0.1mg/mL。
8.根据权利要求6所述的非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法，其特征在于：利用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪采集发光信号时的曝光时间为2min。
9.根据权利要求6所述的非诊疗目的的鸡传染性支气管炎抗体检测方法，其特征在于：
所述的点样缓冲液为：0.3M PB,0.2％甘油,0.01％Triton和1.5％甘露醇。
所述的洗涤液为含0.05％Tween-20的TBS；
所述的血清稀释液为含1％犊牛血清，1％酪蛋白，0.5％蔗糖,0.2％聚乙烯吡咯烷酮和0.5％Tween-20的0.01M PBS，pH7.4；
所述的抗体稀释液为0.2M PBS缓冲液，pH 7.4。
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