CN111521786A - 一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法，其中，一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，包括以下步骤：S1：制备反应膜；S2：制备金结合物垫；S3：切割装配，反应膜上包被甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原和肺炎衣原体抗原形成六条检测线，反应膜上包被山羊抗鼠IgG多克隆抗体形成质控线。本发明提供的一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒可以同时检测样本中的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、肺炎支原体病毒和肺炎衣原体病毒六种呼吸道病毒，具有操作简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高等特点。

Description

一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明是一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法，属于体外诊断技术领域。
背景技术
呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。
呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸***器官所引起的感染性疾病，临床上根据感染发生的部位常分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。其中最常见的病菌包括甲型/乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体六种呼吸道疾病病原体。如何快速、准确的对呼吸道感染病原体进行检测，通过提高早期诊断率和扩大病原体检测应用范围，避免不必要的抗生素滥用，提高早期治愈率，防止病情恶化和加强呼吸道传染病防控是目前临床亟待解决的问题。
目前，临床实验室对呼吸道感染病原体检测的方法有多种，主要有培养法(包括细菌的分离培养和病毒的组织细胞培养)、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、利用PCR扩增技术的分子生物学诊断、基因芯片技术和快速胶体金检测等方法。经临床应用表明，不同的检测方法虽然都有一定的优点，但也存在着一定的局限性，快速区别出感染的病原体类型非常困难。
鉴于以上方法的不足，有必要开发出一种操作简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高，可以多通道同时检测多种呼吸道病原体，并且能够快速区别出感染的病原体类型的检测试剂盒。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题，本发明具有操作简便，成本低廉，特异性好，灵敏度高，可以多通道同时检测六种呼吸道病原体IgM抗体，快速区别出感染的病原体类型的优点。
为了实现上述目的，本发明提供了一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备反应膜
S1.1：将甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原和山羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释至一定浓度；
S1.2：将稀释后的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原溶液喷涂至反应膜上分别形成第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线、第六检测线；
S1.3：将稀释后的山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液喷涂在反应膜上形成质控线，干燥备用；
S2：制备金结合物垫
S2.1：制备胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
S2.2：将胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液调整至合适浓度，浸泡金结合物垫，铺金，干燥备用；
S3：切割装配
将反应膜、金结合物垫、粗纤维滤纸和样品垫装配至反应板上，切割形成检测条。
采用上述方案，在反应膜上包被甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原和肺炎衣原体抗原形成六条检测线，用于检测六种呼吸道病原体IgM抗体，从而判断感染的病原体类型，在反应膜上包被和山羊抗鼠IgG多克隆抗体形成质控线，用于判断检测结果的有效性，将鼠抗人IgM单克隆抗体与胶体金偶联，从而将鼠抗人IgM单克隆抗体进行标记。
优选的，步骤S1.1中，稀释前的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原、山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液浓度分别为2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、4.0-10.0mg/mL，稀释后的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原、山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液浓度分别为1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL。
采用上述方案，检测呼吸道病原体IgM抗体的准确性和灵敏度高。
优选的，步骤S1.2中，反应膜为硝酸纤维素膜。
采用上述方案，有利于滴加的样本在反应膜内流动，从而快速检测出呼吸道病原体的类型。
优选的，步骤S2.1中，胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
(1)使用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5-9.0；
(2)加入60.0μg/mL鼠抗人IgM单克隆抗体，搅拌40min；
(3)加入10％牛血清白蛋白溶液至溶液最终浓度为1％，搅拌15min；
(4)12000rpm/min，4℃，离心15min，弃去上清液；
(5)加入原体积的1/2体积的胶体金结合物稀释液，其中原体积以胶体金体积计算。
优选的，步骤(1)中，PH值为8.5。
优选的，步骤(5)中，胶体金结合物稀释液的制备方法为：将5.372g磷酸氢二钠、0.78g磷酸二氢钠、5.0g牛血清白蛋白、8.5g氯化钠和0.5g酪蛋白溶于1L去离子水中，搅拌均匀获得。
采用上述方案，胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与鼠抗人IgM单克隆抗体的正电荷通过静电作用结合，这种结合不影响鼠抗人IgM单克隆抗体的生物特性，牛血清蛋白溶液作为稳定剂，能够使胶体金与鼠抗人IgM单克隆抗体的结合的更牢固。
本发明提供了一种由上述制备方法制得的呼吸道病原体IgM抗体联合检测条，包括样品垫、金结合物垫、反应膜、反应板和粗纤维滤纸，所述样品垫、金结合物垫、反应膜、反应板和粗纤维滤纸依次搭接组成。
采用上述方案，设置第一检测线、第二检测线、第三检测线、第四检测线、第五检测线和第六检测线分别用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体的病原体IgM抗体，设置质控线用于判断检测结果是否有效，该检测条可以多通道同时检测六种呼吸道病原体IgM抗体，快速区别出感染的病原体类型，操作简单，使用方便。
本发明提供了一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测卡，包括上述检测条和放置检测条的卡体，所述卡体上设置有样品孔和检测孔，样品孔对准样品垫的位置，检测孔对准六条检测线和六条质控线的位置。
采用上述方案，样品孔用于滴加样本，检测孔用于观察检测线和质控线的变化。
本发明提供了一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒，包括上述检测卡和放置检测卡的盒体。
优选的，还包括取样滴管和样本稀释液，样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
采用上述方案，检测卡放置在试剂盒中，检测时，利用取样滴管吸取样本滴加至样品孔内，然后再加入样本稀释液，方便加样检测。
本试剂盒的原理为：采用胶体金免疫层析技术原理，在检测线上分别包被甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原，呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原和肺炎衣原体抗原，在质控线上包被山羊抗鼠IgG多克隆抗体，在金结合物垫上包被胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体。用于定性检测全血或血清(浆)样本中的呼吸道病原体IgM抗体。
检测病原体IgM抗体阳性样本时，样本中的病原体IgM抗体可与胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体结合，形成免疫复合物，由于层析作用免疫复合物及样本在反应膜内部流动。当免疫复合物经过检测线时与检测线上包被的相应抗原结合，形成“胶体金-鼠抗人IgM单克隆抗体-甲型流感病毒IgM抗体/乙型流感病毒IgM抗体/呼吸道合胞病毒IgM抗体/呼吸道腺病毒IgM抗体/肺炎支原体IgM抗体/肺炎衣原体IgM抗体-甲型流感病毒抗原/乙型流感病毒抗原/呼吸道合胞病毒抗原/呼吸道腺病毒抗原/肺炎支原体抗原/肺炎衣原体抗原”而凝集显色，剩余的胶体金标记鼠抗人IgM单克隆抗体与质控线包被的山羊抗鼠IgG多克隆抗体结合而凝集显色。检测阴性样本时，样本中不含呼吸道病原体IgM抗体，致使不能形成免疫复合物，则只能在质控线处显色。
本发明具有以下有益效果：本发明提供的一种呼吸道病原体IgM联合检测试剂盒能够快速，简便，不需特殊设备，多通道同时检测六种呼吸道病原体IgM抗体，快速区别出感染的病原体类型，整个操作时间仅需15-20分钟，并且具有较高的灵敏性与特异性，适用于临床检测，以及流行病学调查，现场普查等。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明检测条的立体图。
图2为本发明检测卡的立体图。
图中：1、反应板；2、样品垫；3、金结合物垫；4、反应膜；5、粗纤维滤纸；6、第一检测线；7、第二检测线；8、第三检测线；9、质控线；10、第四检测线；11、第五检测线；12、第六检测线；13、样品孔；14、检测孔。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备反应膜4
S1.1：将甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原和山羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释至一定浓度；
S1.2：将稀释后的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原溶液喷涂至反应膜4上分别形成第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8、第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12；
S1.3：将稀释后的山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液喷涂在反应膜4上形成质控线9，干燥备用；
S2：制备金结合物垫3
S2.1：制备胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
S2.2：将胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液调整至合适浓度，浸泡金结合物垫3，铺金，干燥备用；
S3：切割装配
将反应膜4、金结合物垫3、粗纤维滤纸5和样品垫2装配至反应板1上，切割形成检测条。
在反应膜4上包被甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原和肺炎衣原体抗原形成六条检测线，用于检测六种呼吸道病原体IgM抗体，从而判断感染的病原体类型，在反应膜4上包被和山羊抗鼠IgG多克隆抗体形成质控线9，用于判断检测结果的有效性，将鼠抗人IgM单克隆抗体与胶体金偶联，从而将鼠抗人IgM单克隆抗体进行标记。
步骤S1.1中，稀释前的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原、山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液浓度分别为2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、4.0-10.0mg/mL，稀释后的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原、山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液浓度分别为1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL，检测呼吸道病原体IgM抗体的准确性和灵敏度高。
步骤S1.2中，反应膜4为硝酸纤维素膜，有利于滴加的样本在反应膜4内流动，从而快速检测出呼吸道病原体的类型。
步骤S2.1中，胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
(1)使用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5-9.0；
(2)加入60.0μg/mL鼠抗人IgM单克隆抗体，搅拌40min；
(3)加入10％牛血清白蛋白溶液至溶液最终浓度为1％，搅拌15min；
(4)12000rpm/min，4℃，离心15min，弃去上清液；
(5)加入原体积的1/2体积的胶体金结合物稀释液，其中原体积以胶体金体积计算。
步骤(1)中，PH值为8.5。
步骤(5)中，胶体金结合物稀释液的制备方法为：将5.372g磷酸氢二钠、0.78g磷酸二氢钠、5.0g牛血清白蛋白、8.5g氯化钠和0.5g酪蛋白溶于1L去离子水中，搅拌均匀获得。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与鼠抗人IgM单克隆抗体的正电荷通过静电作用结合，这种结合不影响鼠抗人IgM单克隆抗体的生物特性，牛血清蛋白溶液作为稳定剂，能够使胶体金与鼠抗人IgM单克隆抗体的结合的更牢固。
步骤S2.2中鼠抗人IgM单克隆抗体稀释前的浓度为2.0-10.0mg/mL。
步骤S1.1中，山羊抗鼠IgG多克隆抗体包被前为无色透明液体，浓度为4.0-10.0mg/mL。较佳的，山羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为4.0mg/mL。
步骤S1.1中，甲型流感病毒抗原包被前为无色透明液体，浓度为2.0-10.0mg/mL。较佳的，甲型流感病毒抗原的浓度为2.0mg/mL。用聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，上样量为10μL时，该甲型流感病毒抗原显示为一条带。
步骤S1.1中，乙型流感病毒抗原包被前为无色透明液体，浓度为2.0-10.0mg/mL。较佳的，乙型流感病毒抗原的浓度为2.0mg/mL。用SDS-PAGE测定，上样量为10μL时，该乙型流感病毒抗原显示为一条带。
步骤S1.1中，呼吸道合胞病毒抗原包被前为无色透明液体，浓度为2.0-10.0mg/mL。较佳的，呼吸道合胞病毒抗原的浓度为2.0mg/mL。用SDS-PAGE测定，上样量为10μL时，该呼吸道合胞病毒抗原显示为一条带。
步骤S1.1中，呼吸道腺病毒抗原包被前为无色透明液体，浓度为2.0-10.0mg/mL。较佳的，呼吸道腺病毒抗原的浓度为2.0mg/mL。用SDS-PAGE测定，上样量为10μL时，该呼吸道腺病毒抗原显示为一条带。
步骤S1.1中，肺炎支原体抗原包被前为无色透明液体，浓度为2.0-10.0mg/mL。较佳的，肺炎支原体抗原的浓度为2.0mg/mL。用SDS-PAGE测定，上样量为10μL时，该肺炎支原体抗原显示为一条带。
步骤S1.1中，肺炎衣原体抗原包被前为无色透明液体，浓度为2.0-10.0mg/mL。较佳的，肺炎衣原体抗原的浓度为2.0mg/mL。用SDS-PAGE测定，上样量为10μL时，该肺炎衣原体抗原显示为一条带。
一种由上述制备方法制得的呼吸道病原体IgM抗体联合检测条，包括样品垫2、金结合物垫3、反应膜4、反应板1和粗纤维滤纸5，检测条由样品垫2、金结合物垫3、反应膜4、反应板1和粗纤维滤纸5依次搭接组成。
设置第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8、第四检测线10、第五检测线11和第六检测线12分别用于检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体的病原体IgM抗体，设置质控线9用于判断检测结果是否有效，该检测条可以多通道同时检测六种呼吸道病原体IgM抗体，快速区别出感染的病原体类型，操作简单，使用方便。
一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测卡，包括上述检测条和放置检测条的卡体，卡体上设置有样品孔13和检测孔14，样品孔13对准样品垫的位置，检测孔14对准六条检测线和六条质控线9的位置。
样品孔13用于滴加样本，检测孔14用于观察检测线和质控线9的变化。
一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒，包括上述检测卡和放置检测卡的盒体，还包括取样滴管和样本稀释液，样本稀释液为磷酸盐缓冲液，较佳的，磷酸盐缓冲液的浓度为20mM，PH值为7.4，检测卡放置在试剂盒中，检测时，利用取样滴管吸取样本滴加至样品孔13内，然后再加入样本稀释液，方便加样检测。
实施例2一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法
一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，包括以下步骤：
S1：制备反应膜4
S1.1：将甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原和肺炎衣原体抗原稀释至最佳包被浓度1.0mg/mL，将山羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释至最佳包被浓度2.0mg/mL，其中，包被稀释液为0.05M的磷酸盐缓冲液；
S1.2：用点膜机将稀释后的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原溶液喷涂至反应膜4上分别形成第一检测线6、第二检测线7、第三检测线8、第四检测线10、第五检测线11、第六检测线12，喷点量为0.1μL/mm；
S1.3：用点膜机将稀释后的山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液喷涂在反应膜4上形成质控线9，喷点量为0.1μL/mm，于37℃干燥3小时，并于室温保存，备用；
S2：制备金结合物垫3
S2.1：制备胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
S2.2：将胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液调整至最佳浓度10.0μg/mL，以1.5mL/条，浸泡金结合物垫3，铺金，37℃干燥3小时，并于室温保存，备用；
S3：切割装配
将反应膜4、金结合物垫3、粗纤维滤纸5和样品垫2装配至反应板1上，切割形成检测条。
步骤S2.1中，胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
(1)使用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5-9.0；
(2)加入60.0μg/mL鼠抗人IgM单克隆抗体，搅拌40min；
(3)加入10％牛血清白蛋白溶液至溶液最终浓度为1％，搅拌15min；
(4)12000rpm/min，4℃，离心15min，弃去上清液；
(5)加入原体积的1/2体积的胶体金结合物稀释液，其中原体积以胶体金体积计算。
步骤(1)中，PH值为8.5。
步骤(5)中，胶体金结合物稀释液的制备方法为：将5.372g磷酸氢二钠、0.78g磷酸二氢钠、5.0g牛血清白蛋白、8.5g氯化钠和0.5g酪蛋白溶于1L去离子水中，搅拌均匀获得。
实施例3一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒的检测方法
1、检测前准备：检验前将试剂盒和样本恢复至室温。实验湿度应小于60％，实验温度为18-30℃。
2、样本准备：全血为指尖采血或者采用静脉采血。全血样本采集后不做保存，即采即用。血清样本按常规方法由静脉采集。血浆样本可采用肝素、柠檬酸钠、EDTA进行处理。血清或血浆样本5天内测定的样本可放置4℃保存。样本放置在-20℃至少可保存3个月。样本避免溶血或反复冻融。混浊或有沉淀的样本应离心或过滤澄清后再检测。
3、检测条检测方法
(1)取出检测条，平置于台面上；
(2)取30.0μL血清或血浆样本，加到检测条指示箭头下端的加样处，再加样本稀释液270.0μL(约8-9滴)；
(3)15-20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。
(4)检测结果判定：
阴性：只在质控线9位置出现红色条带。
阳性：质控线9和检测线位置出现红色条带。
无效：质控线9位置没有出现红色条带。
4、试剂盒检测方法
(1)取出试剂盒平置在水平工作台面上，并做好样本标记；
(2)取30.0μL血清、血浆或60.0μL全血样本，直接加入到样品孔13中，再加样本稀释液270.0μL(约8-9滴)；
(3)15-20分钟内判读结果，20分钟后检验结果无效。
(4)检测结果判定：
阴性：只在质控线9位置出现红色条带。
甲型流感病毒IgM抗体阳性：质控线9和第一检测线6位置出现红色条带。
乙型流感病毒IgM抗体阳性：质控线9和第二检测线7位置出现红色条带。
呼吸道合胞病毒IgM抗体阳性：质控线9和第三检测线8位置出现红色条带。
呼吸道腺病毒IgM抗体阳性：质控线9和第四检测线10位置出现红色条带。
肺炎支原体IgM抗体阳性：质控线9和第五检测线11位置出现红色条带。
肺炎衣原体IgM抗体阳性：质控线9和第六检测线12位置出现红色条带。
无效：质控线9位置没有出现红色条带。
实施例4质控血清的制备
质控血清的制备方法：
1、质控血清的采集
(1)收集血清大于35mL(无明显溶血、黄疸、脂肪血或污染血清)；
(2)60℃加热1小时灭活；
(3)离心、过滤，除去沉淀物；
(4)稀释：需要稀释时，用正常人血清稀释；
(5)更换质控血清时，与被替换的原质控血清至少连续对照标定3次；
(6)分装、标识、保存：用1.5mL离心管分装，1mL/管，共42管，封口，贴签，-20℃冻存。
2、质控血清的鉴定
(1)呼吸道病原体IgM抗体联合阴性血清10份：阴性血清采集于健康献血员的血清，经市售呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒鉴定为阴性血清，选取10份作为抗体阴性质控血清。
(2)呼吸道病原体IgM抗体联合阳性血清30份：经市售呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒鉴定为呼吸道病原体IgM抗体联合阳性血清，分析检测结果，选择5份甲型流感病毒抗IgM抗体阳性血清、5份乙型流感病毒IgM抗体阳性血清、5份呼吸道合胞病毒IgM抗体强阳性血清，5份呼吸道腺病毒IgM抗体强阳性血清、5份肺炎支原体IgM抗体强阳性血清、5份肺炎衣原体IgM抗体强阳性血清共30份，作为抗体阳性质控血清。
(3)最低检出限指控血清：对其中5份弱阳性血清，其s/c值(样本值/cut-off值)为2.6左右进行系列稀释，当稀释至1:8时仍可检出，该系列血清为最低检出限血清。为保持今后最低检出限血清的一致性，在最低检出限血清原液选择时选择s/c值为2.6左右的弱阳性进行系列稀释，以保持批间一致性。
(4)精密性血清：选择5份呼吸道病原体IgM抗体弱阳性血清(s/c值为3.4左右)，作为精密性血清。
实施例5一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒有效性验证
采用上述方法制备的质控血清检测本发明呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒的有效性。
1、阴阳性符合率检测
(1)检测30份呼吸道病原体IgM抗体联合阳性指控血清，检测结果均为阳性。说明本发明呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒具有较好的阳性符合率。
(2)检测10份呼吸道病原体IgM抗体联合阴性指控血清，检测结果均为阴性。说明本发明呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒具有较好的阴性符合率。
2、灵敏度检测
最低检出限6份质控血清检测，最低检出限血清原液，按1:8稀释后检测，检测结果为阳性。说明本发明呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒灵敏度较好。
3、精密性检测
6份精密性血清，检测卡显色速度及强度一致，均一性无差别。说明本发明呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒精密性较好。
4、特异性检测
采用本发明呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒检测含内源性干扰物质和潜在交叉反应物质的样本，结果如下：
抗核抗体、抗线粒体抗体，抗双链DNA抗体、乙型肝炎病毒表面抗原抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒抗体、艾滋病毒抗体、戊型肝炎病毒IgG抗体、风疹病毒IgG抗体、肺炎支原体IgG抗体、肺炎衣原体IgG抗体和巨细胞病毒IgG抗体不会对本品造成干扰。说明本发明呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒特异性高。
5、稳定性检测
在长期稳定性实验过程中，4-30℃干燥避光保存14个月依然可以满足产品性能指标要求；加速稳定性实验过程中，37℃条件下，16天后检测结果依然可以满足产品性能指标要求。说明本发明呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒具有较好的稳定性。
本发明具有以下优点：
(1)广泛适用性：本试剂盒实行多通道同时检测，可以同时出现6个结果，将大大的提高检出率，而且IgM抗体同时检测可以辅助区分病原体感染类型，将大大的提高诊断治疗效率。
(2)检测快速简便：本试剂盒检测整体操作仅需15-20分钟，仅需滴加样本至样本垫，等待结果即可。并且无需特定的实验仪器辅助，不需要专业培训，适于临床、居家使用，可快速筛检病人，适于早期急性感染辅助诊断及流行病学调查等。
(3)较高的灵敏性与特异性：检测呼吸道病原体IgM抗体灵敏度质控，按要求稀释均能检出，而且各项目均不交叉，说明具有较高的灵敏性，并且仅对呼吸道病原体IgM阳性血清标本呈阳性，而对其他病原体感染的血清标本呈阴性结果，具有良好的特异性。
(4)较高的精密性：检测呼吸道病原体IgM抗体精密度质控，主阳性项检测条显色速度及强度一致，而且它各项目反应为阴性不交叉，各检测条显色速度及强度一致，均一性无差别，说明具有良好的精密性。
(5)良好的稳定性：4-30℃干燥避光保存14个月，或37℃条件下保存14天，仍符合检测标准。
可见，本发明提供的一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒能够快速、简便、不需特殊设备、多通道同时检测六种呼吸道病原体IgM抗体，分区检测干扰小，快速区别出感染的病原体类型，整个操作时间仅需15-20分钟，并且具有较高的灵敏性与特异性，适用于临床检测，以及流行病学调查，现场普查等。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备反应膜(4)
S1.1：将甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原和山羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释至一定浓度；
S1.2：将稀释后的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原溶液喷涂至反应膜(4)上分别形成第一检测线(6)、第二检测线(7)、第三检测线(8)、第四检测线(10)、第五检测线(11)、第六检测线(12)；
S1.3：将稀释后的山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液喷涂在反应膜(4)上形成质控线(9)，干燥备用；
S2：制备金结合物垫(3)
S2.1：制备胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液；
S2.2：将胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液调整至合适浓度，浸泡金结合物垫(3)，铺金，干燥备用；
S3：切割装配
将反应膜(4)、金结合物垫(3)、粗纤维滤纸(5)和样品垫(2)装配至反应板(1)上，切割形成检测条。
2.根据权利要求1所述的一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，其特征在于，步骤S1.1中，稀释前的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原、山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液浓度分别为2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、2.0-10.0mg/mL、4.0-10.0mg/mL，稀释后的甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、呼吸道腺病毒抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原、山羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液浓度分别为1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，其特征在于，步骤S1.2中，反应膜(4)为硝酸纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，其特征在于，步骤S2.1中，胶体金标记的鼠抗人IgM单克隆抗体溶液的制备方法包括以下步骤：
(1)使用0.1M碳酸钾溶液调节胶体金pH值至8.5-9.0；
(2)加入60.0μg/mL鼠抗人IgM单克隆抗体，搅拌40min；
(3)加入10％牛血清白蛋白溶液至溶液最终浓度为1％，搅拌15min；
(4)12000rpm/min，4℃，离心15min，弃去上清液；
(5)加入原体积的1/2体积的胶体金结合物稀释液，其中原体积以胶体金体积计算。
5.根据权利要求4所述的一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，PH值为8.5。
6.根据权利要求4所述的一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测条的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，胶体金结合物稀释液的制备方法为：将5.372g磷酸氢二钠、0.78g磷酸二氢钠、5.0g牛血清白蛋白、8.5g氯化钠和0.5g酪蛋白溶于1L去离子水中，搅拌均匀获得。
7.一种如权利要求1-6任一所述的制备方法制得的呼吸道病原体IgM抗体联合检测条，其特征在于，包括样品垫(2)、金结合物垫(3)、反应膜(4)、反应板(1)和粗纤维滤纸(5)，所述样品垫(2)、金结合物垫(3)、反应膜(4)、反应板(1)和粗纤维滤纸(5)依次搭接组成。
8.一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测卡，其特征在于，包括权利要求7所述的检测条和放置检测条的卡体，所述卡体上设置有样品孔(13)和检测孔(14)，样品孔(13)对准样品垫的位置，检测孔(14)对准六条检测线和六条质控线(9)的位置。
9.一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的检测卡和放置检测卡的盒体。
10.根据权利要求9所述的一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒，其特征在于，还包括取样滴管和样本稀释液，样本稀释液为磷酸盐缓冲液。
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